Kolorimetrické stanovení koncentrace proteinů

Praktikum z experimentálních metod biofyziky a chemické fyziky I
RNDr. Eva Urbánková, FÚUK
Kolorimetrické stanovení koncentrace proteinů
Pro stanovení koncentrace proteinů se používá několika metod využívajících absorpci světla (UV/VIS) - jak
přímo proteinů, tak po některé z barevných reakcí (kolorimetrické metody).
Při přímém měření absorpce není třeba užívat standart pro srovnání, ale je třeba znát extinkční koeficient při
dané vlnové délce. Metoda je proto výhodnější pro čisté proteiny než pro jejich směsi. Absorbance se dá měřit
buď při 280 nm (absorpce aromatických aminokyselin) nebo při 200 nm (absorpce peptidových vazeb).
Všechny příměsi absorbující na daných vlnových délkách budou ovlivňovat výsledky měření, stejně jako
konformace proteinu, pH, iontová síla a další vlivy. Měření absorpce se využívá u čistých proteinů nebo u
výstupů z chromatografických kolon (např. HPLC - moderní HPLC přístroje umožňují snímání UV
absorpčního spektra pro každou frakci).
Vzorce pro přímé UV stanovení:
c (mg/mL) = 1.55 A280 - 0.76 A260
c (mg/mL) = (A235 - A280)/2.51
c (mg/mL) = (A224 - A233)/5.01
c (mg/mL) = A205 [27 + 120 (A280/A205)]
Při znalosti aminokyselinového složení je možné spočíst extinkční koeficient proteinu e280. Podmínkou je
přítomnost tryptofanu nebo tyrosinu v molekule (1).
e280 = nTrp.5500 + nTyr.1490 + nCys.125 (M-1.cm-1)
Kolorimetrické metody jsou složitější na provedení, vyžadují paralelní měření standartu, ale je možné je použít
i na směsi proteinů neznámého složení. Vzhledem k tomu, že jsou také závislé na složení proteinu, je vždy
třeba uvádět, jaký standart byl použit. Výběr metody se řídí několika kritérii - ekonomickou náročností,
složitostí a délkou provedení, citlivostí, náročností na množství vzorku, interferujícími příměsemi. Například
metoda Lowryho je poměrně složitá na provedení a vyžaduje 40 min inkubaci. Bradfordova metoda je citlivější
a stačí 5 min inkubace, ale proteiny s nízkým obsahem argininu jsou podceněny. Obecně vzato, popsané
metody jsou vždy přesnější pro směsi proteinů než pro čisté proteiny (pokud nepoužíváme jako standart protein
totožný s určovaným).
Lowryho metoda
Lowryho metoda(2) vylepšuje méně citlivou biuretovou metodu. První složkou je biuretové činidlo, druhou
složkou činidlo Folin-Ciocalteau 1 . Biuretová metoda je založena na chelataci měďnatého iontu imidovými
strukturami polypeptidového řetězce v alkalickém pH. Vzniká červený(/fialový) komplex. Folin-Ciocalteauovo
činidlo obsahuje kyseliny fosfomolybdenové a fosfowolframové, které se redukují tyrosinovými zbytky
proteinů a barví se modře. Metoda je citlivá na změny v pH, pH reakční směsi by mělo být drženo v mezích 10
- 10.5.
Lowryho metoda je citlivá na nízké koncentrace proteinu. Její nevýhoda je úzký interval pH reakční směsi, ve
kterém je použitelná. Použití malých objemů vzorku (relativně vůči objemu reakční směsi) umožňuje tuto
nevýhodu odstranit. Látky, které interferujjí s Lowryho metodou jsou aminokyseliny, některé pufry, lipidy,
cukry, soli, nukleové kyselny, sulfhydrylové reagenty, ammoniové ionty, thiolové sloučeniny. Tyto látky je
nutno před měřením odstranit (např. vysrážením proteinů a následnou centrifugací).
1
Čti [folin-čikolto].
1
Praktikum z experimentálních metod biofyziky a chemické fyziky I
RNDr. Eva Urbánková, FÚUK
Pracovní úkol:
Určete koncentraci vzorků proteinu, které dodá vyučující. Jako standart použijte definovaný roztok BSA (0.2
mg/ml). Srovnejte Lowryho metodu a přímé měření absorbance pro vzorek BSA (bovine serum albumine).
Pracovní postup:
Stanovení proteinů dle Lowryho (zjednodušený protokol)2
Roztok Mix. (30 ml.)
0.6 ml 1% CuSO4
0.6 ml 2 % Na,K tartarátu (vínan sodno-draselný)
28.8 ml 2% Na2CO3 v 0,1 M NaOH
Folinovo činidlo - rozředit 1:1 vodou (neplýtvejte!)
Standartní křivka:
Napipetujte do eppendorfek (každý vzorek 2x)
H2O
albumin (BSA, 0.2 mg/ml)
200 μl
0 μl
150
50
100
100
50
150
0
200
Postup:
1. Podle odhadu koncentrace proteinů (dodá vyučující) určete, kolik vzorku pipetovat. Pro každý
protein udělejte asi 5 vzorků. Do všech vzorků přidejte destilovanou vodu na celkový objem 200 μl.
Od každého vzorku zkuste několik koncentrací (minimálně v dubletech!)
2. Připravte MIX roztok,do každé zkumavky přidejte 1 ml a vortexujte.
3. Nechte 15 min inkubovat.
4. Přidejte100 μl Folinova činidla (zředěného 1:1) a vortexujte.
5. Nechte 30 min inkubovat
6. Měřte absorbanci při 700 nm proti vzorku bez albuminu.
7. Zpracujte kalibrační křivku a vypočtěte koncentrace měřených vzorků.
8. U vybraného vzorku BSA změřte absorpční spektrum v rozmezí 200-300 nm. Použijte vzorce
uvedené v úvodu a srovnejte výsledky.
2
Existuje mnoho modifikací metody - některé protokoly vyžadují inkubace v přesně definované teplotě, jiné využívají detergenty
(např. SDS), nebo předčištění vzorku vysrážením proteinů (TCA, trichloroacetic acid). Námi použitý protokol je relativně jednoduchý
a nedoporučuji ho v této formě používat při "opravdové" experimentální praxi.
2
Praktikum z experimentálních metod biofyziky a chemické fyziky I
RNDr. Eva Urbánková, FÚUK
Úloha č. 3
Kolorimetrické stanovení koncentrace proteinů
Skupina:
Datum:
Standartní křivka
roztok BSA:
mg/ml
č.
BSA
ul
BSA
mg
OD 700 nm
vzorek
napipetováno
ul
OD 700 nm
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
Vzorky:
1
2
3
č.
11
12
13
14
15
16
17
18
19
20
3
Praktikum z experimentálních metod biofyziky a chemické fyziky I
RNDr. Eva Urbánková, FÚUK
Srovnání jednotlivých metod:
Stanovení Citlivost Přesnost
Interference
0 – 1 mg
Aminoskupiny
[Např. (NH4)2SO4]
Biuret
Lowry
Bradford
BCA
Vysoká,
nezávislá na
aminokyselinovém složení
0 – 0.1 mg Částečně
závislá na
aminokyselinovém složení
0 – 0.01 mg Závislá na
aminokyselinovém složení
0 – 0.05 mg Většinou
nezávislá na
aminokyselinovém složení
Kyseliny, chelátory
(EDTA), reduktanty
(DTT, phenol),
(NH4)2SO4
Detergenty
(SDS, Triton X100,
mýdlo)
Redukující látky (2merkaptoethanol,
DTT), chelátory
(EDTA)
(převzato z www.biochemie.upol.cz/stranky/vyuka/bam/KBCBAMStanoveniproteinu08-09.ppt)
Literatura:
http://www.ruf.rice.edu/~bioslabs/methods/protein/protein.html
1. Pace, C. N., Vajdos, F., Fee, L., Grimsley, G., and Gray, T. (1995) Protein Sci 4, 2411-2423
2. LOWRY, O. H., Rosenbrough, N. J., FARR, A. L., and RANDALL, R. J. (1951) J Biol. Chem. 193, 265275
4