disermed

Univerzita Karlova v Praze
Přírodovědecká fakulta
Katedra genetiky a mikrobiologie
DIZERTAČNÍ PRÁCE
Rezistence k makrolidům, linkosamidům a streptograminům
u koaguláza negativních stafylokoků v ČR
Mgr. Gabriela Novotná
Praha 2007
1
Tato dizertační práce byla vypracována v Mikrobiologickém ústavu Akademie věd České republiky v
Laboratoři biologie sekundárního metabolismu pod odborným vedením Ing. Jiřího Janaty, CSc. v
období říjen 2000 - září 2007.
Práce vznikla za podpory Grantové agentury Univerzity Karlovy (148/2005/B-Bio/PřF), Grantové
agentury ČR (GA204/04/0801), Grantové agentury Akademie věd ČR (IAA600200519) a Ministerstva
školství, mládeže a tělovýchovy ČR (1M06011)
Prohlašuji, že jsem předloženou práci vypracovala samostatně a použila jen prameny, které cituji a
uvádím v seznamu použité literatury.
Dále prohlašuji, že tato práce, ani její podstatná část, nebyla předložena k získání jiného titulu
V Praze, září 2007
.......................................
Mgr. Gabriela Novotná
2
Především bych chtěla poděkovat svému školiteli Ing. Jiřímu Janatovi, CSc. za vedení práce,
odborné diskuze, cenné rady a kritické připomínky.
Dále děkuji RNDr. Petru Petrášovi za konzultace týkající se diagnostiky koaguláza negativních
stafylokoků a MVDr. Otu Melterovi, Ph.D. za pomoc při genotypizování izolátů S. haemolyticus. Anně
Matuškové děkuji za praktické rady při práci s rekombinantní DNA a s heterologními proteiny.
Děkuji též všem ostatním členům laboratoře Biologie sekundárního metabolismu, kteří svými
radami a pomocí přispěli ke vzniku této práce. Spolustolovníkům v jídelně MBÚ děkuji za příjemné
chvilky.
Velký dík pak patří mému Alešovi za to, že to se mnou vydržel.
3
Obsah
I. ÚVOD
6
II. LITERÁRNÍ ÚVOD
8
1. Koaguláza negativní stafylokoky - nozokomiální infekce, rezistence a terapeutické možnosti.
9
2. Makrolidy, linkosamidy a streptograminy (MLS)
2.1. Makrolidy
2.2. Linkosamidy
2.3. Streptograminy
12
12
14
15
3. Mechanismy rezistence k makrolidům, linkosamidům a streptograminům u stafylokoků
3.1. Změna zásahového místa
3.1.1. MLSB rezistence - methylace 23S rRNA v pozici A2058
3.1.2. PhLOPSA rezistence - methylace 23S rRNA v pozici A2503
3.1.3. Rezistence k MLS antibiotikům mutacemi v zásahovém místě
3.2. Inaktivace MLS antibiotik
3.2.1. Inaktivace makrolidů
3.2.2. Inaktivace linkosamidů
3.2.3. Inaktivace streptograminů A
3.2.4. Inaktivace streptograminů B
3.3. Transportní rezistence
3.3.1. ABC-transportéry
3.3.2. Rezistence k MLS antibiotikům = 2. třída ABC proteinů
3.3.3. Jedná se skutečně o transport?
3.3.4. Regulace: atenuace translace nebo terminace transkripce?
17
17
17
20
20
21
21
22
22
23
23
24
24
27
27
4. Frekvence MLS rezistencí u CoNS a klinický význam jednotlivých rezistenčních mechanismů
29
4.1. Rezistence k makrolidům a linkosamidům
29
4.2. Inducibilní rezistence
31
4.3. Rezistence ke streptograminům
31
4.4. Mobilní elementy nesoucí MLS rezistenční geny
33
III.VÝSLEDKY
34
1. Rozšíření mechanismů rezistence k makrolidům a linkosamidům u methicilin rezistentních
koaguláza negativních stafylokoků v České republice a výskyt neznámého mechanismu
rezistence k linkosamidům
35
2. Nová varianta proteinu streptograminové rezistence, Vga(A)LC, ze Staphylococcus
haemolyticus se změnou substrátové specifity směrem k linkosamidům
36
3. In vitro účinnost telithromycinu a quinupristinu/dalfopristinu proti methicilin rezistentním
koaguláza negativním stafylokokům s definovaným rezistenčním genotypem
37
4. Sekvenční analýza okolí rezistenčního genu msr(A) u S. haemolyticus (data pro
připravovanou publikaci)
38
IV. DISKUZE
46
V. REFERENCE
51
4
Zkratky
Seznam zkratek:
ABC protein
ARE rodina
CLI
(ATP-binding casette) ATP-vazebný protein
(antibiotic resistance) rodina ABC proteinů
klindamycin
cMLSB
CoNS
CSLI
DDM
ERY
konstitutivní MLSB rezistence
koaguláza negativní stafylokoky
Clinical Standard Laboratory Institute
disková difúzní metoda
erythromycin
iMLSB
IR
IS
ISLE
LIN
inducibilní MLSB rezistence
invertovaná repetice
inzerční sekvence
inzerčním sekvencím podobný element
linkomycin
LSA
rezistence k linkosamidům a streptograminům A
MLSB
rezistence k makrolidům linkosamidům a streptograminům B
MSB
PFGE
rezistence k makrolidům a linkosamidům
pulzní gelová elektroforéza
rezistence k florfenikolům, linkosamidům, oxazolidinonům
pleuromutilinům a streptograminům A
Pristinamycin IIA
quinupristin a dalfopristin
streptograminy A
streptograminy B
Státní ústav pro kontrolu léčiv
telithromycin
levá terminální invertovaná repetice
PhLOPSA
PIIA
Q/D
SgA
SgB
SÚKL
TEL
TIRL
CFU
RBS
TIRR
TM doména
(ribosom binding site) vazebné místo pro ribozóm
pravá terminální invertovaná repetice
transmembránová doména
5
ÚVOD
I. ÚVOD
6
ÚVOD
Na počátku dvacátého století byly infekce celosvětově hlavní příčinou úmrtí. Teprve s nástupem
antibiotické éry významně klesla mortalita způsobená bakteriálními infekcemi. Všeobecně se
předpokládalo, že problém infekčních chorob je objevem antibiotik definitivně vyřešen. Při slyšení v
Kongresu v r. 1969 hlavní lékař zdravotnických zařízení USA William H. Stewart prohlásil: „Přišel čas
uzavřít kapitolu infekčních nemocí.“ (44). Protože existující spektrum antibiotik bylo v té době pro
kontrolu infekčních chorob dostatečné, obrátila se pozornost farmaceutických firem na výzkum
lukrativnějších skupin léčiv zaměřených na léčbu chronických chorob. Za posledních třicet let tak byla
na trh uvedena pouze dvě skutečně nová antibiotika linezolid a daptomycin (139, 191). V souvislosti s
celosvětovým nárůstem používání antibiotik se však u mikroorganismů začaly objevovat a hromadit
rezistence k těmto látkám. Zatím ke každé skupině antibiotik, která byla do roku 2004 uvedena na trh,
se časem u patogenních mikroorganizmů objevil rezistenční mechanismus, který je důvodem řady
terapeutických selhání (94). Enormní a často neuvážené používání antibiotik vedlo k selekci
multirezistentních baktérií, zejména v nemocnicích kde jsou ideální podmínky pro jejich vznik a šíření.
Ve Spojených státech byla zaznamenána rezistence alespoň k jednomu antibiotiku u 70% původců
nosokomiálních infekcí (90). Dokonce i vankomycin používaný pouze jako antibiotikum poslední volby
zejména proti problematickým methicilin rezistentním stafylokokům ztrácí svoji účinnost. V roce 1997
byly objeveny první částečně rezistentní kmeny Staphylococcus aureus (61). O dva roky později byl
dokonce popsán první klinický případ plně vankomycin rezistentního kmene tohoto původce vážných
postoperačních infekcích (16). Methicilin rezistentní stafylokoky jsou běžně rezistentní i k ostatním
beta-laktamům, gentamicinu. 80% z nich je také rezistentní alespoň k jednomu z pěti následujících
antibiotik: erythromycinu, klindamycinu, cotrimoxazolu, ciprofloxacinu a tetracyklinu. Zatímco biologie
a způsob šíření methicilin rezistentních kmenů Staphylococcus aureus (MSRA) byly podrobně
studovány jak ve světě tak i na území ČR (114, 115), rezistence u koaguláza negativních stafylokoků
(CoNS) je prostudována jen okrajově. Přitom právě tyto blízce příbuzné mikroorganismy mohou sloužit
jako zdroj nových rezistenčních determinant pro klinicky významnější patogen. Mimoto jsou CoNS
důležitým infekčním agens u hospitalizovaných imunokomprimovaných pacientů a stejně tak u
pacientů s intravenózními katétry.
V roce 1996 byl v rámci rozsáhlé epidemiologické studie rezistence k methicilinu Národní referenční
laboratoří pro stafylokoky shromážděn soubor 2234 klinických izolátů stafylokoků (1315 izolátů S.
aureus a 919 izolátů CoNS). Hlavním záměrem epidemiologické studie, která byla realizována
Národní referenční laboratoří pro antibiotika, bylo zmapovat klonální strukturu methicilin rezistentních
izolátů Staphylococcus aureus na území ČR (113-115). My jsme využili tutéž sbírku izolátů pro
studium mechanismů rezistence k makrolidům a linkosamidům u methicilin rezistentních CoNS.
Protože jsme mezi izoláty zjistili neobvyklou distribuci rezistenčních mechanismů a také jsme objevili
nový rezistenční fenotyp naznačující přítomnost doposud neznámé rezistenční determinanty rozhodli
jsme se pokračovat v podrobnějším studiu těchto jevů. Výsledky studia jsou shrnuty ve třech přijatých
a jedné připravované publikaci, které jsou prezentovány v předkládané disertační práci. Uplatněním
postupů klinické mikrobiologie, molekulární biologie i bakteriální genetiky jsme se pokusili o ucelený
pohled na problematiku vzniku a šíření rezistencí k antibiotikům u klinicky významných
mikroorganizmů
7
II. LITERÁRNÍ ÚVOD
8
LITERÁRNÍ ÚVOD
Koaguláza negativní stafylokoky
1.
Koaguláza
negativní
stafylokoky
-
nozokomiální
infekce,
rezistence a terapeutické možnosti.
Koaguláza negativní stafylokoky (CoNS) patří mezi nejčastěji izolované mikroorganismy v
laboratořích klinické mikrobiologie. Vzhledem ke své všudypřítomnosti a relativně nízké virulenci byly
dlouho považovány za klinicky nevýznamné kontaminanty klinických vzorků. Avšak postupem času
začaly být CoNS vnímány jako důležité etologické agens nozokomiálních infekcí a nyní patří dokonce
mezi nejčastější příčinu infekcí u hospitalizovaných pacientů s intravenózními katétry a u
imunokomprimovaných pacientů. Podle studie National Nosocomial Infections Surveillance System
byly v letech 1990-1999 CoNS nejčastějšími pozorovanými patogeny (37,7 %, v porovnání s 12,6 %
pro S. aureus) izolovanými z infekcí krevního řečiště na jednotkách intenzivní péče (189). Jejich
význam jako etiologické agens nozokomiálních infekcí je dán zejména výskytem na površích lidského
těla ve velkých koncentracích, až 103 - 106 CFU/cm2 (82), dále pak selekcí, která je výsledkem
používání širokospektrých antibiotik v nemocnicích, schopností adherovat a tvořit biofilm na površích
intravaskulárních katétrů a jiných lékařských nástrojů a relativně nízkými nutričními nároky (137).
Protože až 85 % izolátů CoNS je výsledkem kontaminace, zejména při odběru krve, je velmi
problematické odlišení takovýchto kontaminací od skutečných původců infekcí krevního řečiště (195).
Pokud je tentýž mikroorganismus alespoň dvakrát po sobě izolován z nezávislých hemokultur, může
být považován za původce infekce. U katétrové infekce je nutný průkaz stejného mikroorganismu z
hemokultury a kultury z povrchu katétru. Pro druh S. epidermidis je pro potvrzení nutné kromě
druhové identifikace také ověření totožnosti kmene jeho typizací (81). Mezi nejčastěji izolované
stafylokokové izoláty v Evropě v letech 2002-2004 patřily tyto druhy: S. epidermidis, S. haemolyticus,
S. hominis, S. capitis, S. warnerii, S. xylosis (156). Jednotlivé druhy CoNS se liší svojí virulencí. Velké
zastoupení izolátů identifikovaných jako infekční agens bylo pozorováno u S. lugundensis (91 % z
celkového počtu izolátů tohoto druhu) a S. saprophyticus (88 %), naproti tomu poměr klinicky
významných izolátů ke kontaminantům byl menší u S. epidermidis (52 %) a S. haemolyticus (11 %)
(180). Tyto dva posledně zmíněné druhy však často tvoří většinu (až 90 %) všech CoNS izolátů.
Zatímco patogenita druhu S. epidermidis je spojena zejména se schopností adheze a tvorby biofilmu
na polymerních površích zdravotnického materiálu, u podstatně virulentnějších druhů S. lugdunensis a
S. schleiferi, které způsobují agresivní a až život ohrožující infekce, jsou patogenní mechanismy
podobné těm z S. aureus (produkce clumping faktoru a termostabilní DNásy (189)). S. saprophyticus
je významným oportunním patogenem způsobujícím infekce močových cest. Specifická afinita k
uroepitealním buňkám je dána řadou povrchových proteinů typických pro tento druh.
Problémem nozokomiálních infekcí je vysoký výskyt kmenů mnohočetně rezistentních k
antibiotikům. Stejně jako u S. aureus je hlavním problémem infekcí způsobených CoNS rezistence k
oxacilinu. Zatímco u S. aureus se rezistence vyskytuje u necelých 30 %, u CoNS to je až 77 %
rezistentních izolátů (Tab. 1.1.). Navíc rezistence k oxacilinu s sebou nese výrazně vyšší podíl
rezistence k dalším antibiotikům. Kromě všech β-laktamů jsou oxacilin-rezistentní CoNS často
rezistentní také k erythromycinu (72,7 %), ciprofloxacinu (67,5 %), levofloxacinu (62,9 %),
9
LITERÁRNÍ ÚVOD
Koaguláza negativní stafylokoky
trimethoprim-sulfamethoxazolu (47,4 %) a klindamycinu (32,5 %). Naopak některá novější antibiotika
vankomycin
a
teikoplanin
(glykopeptidy),
quinupristin/dalfopristin
(streptograminy),
linezolid
(oxazilidony) a daptomycin (lipopeptidy) si zachovávají dobrou účinnost, a jsou tedy považovány za
antibiotika poslední volby pro léčbu nozokomiálních stafylokokových infekcí (Tab. 1.2.).
Tab.1.1. Evropský průměr četností rezistence k oxacilinu u CoNS a S. aureus. Data převzata z rozsáhlých
studií SENTRY antimicrobial surveillance programme.
Izolovány v
letech:
1997-1999
2002-2004
2005
CoNS
Oxacilin
Počet rezistentní
izolátů
(%)
2068
73,1
1942
77
941
71,5
S. aureus
Oxacilin
Počet rezistentní
izolátů
(%)
3477
26,9
(35)
4842
26,7
(156)
2746
29,1
(157)
Reference:
Nicméně i k těmto antibiotikům se u stafylokoků vyvíjí rezistence. Rezistence ke
glykopeptidům u klinických izolátů byla poprvé pozorována již v roce 1979 a 1983 u S. epidermidis
(175) a v roce 1986 u S. haemolyticus (168). Teprve v roce 1997 byly objeveny částečně rezistentní
kmeny S. aureus (61) a o dva roky později byl dokonce popsán první klinický případ plně vankomycin
rezistentního kmene tohoto původce vážných postoperačních infekcí (16). Mechanismus intermediární
glykopeptidové rezistence u stafylokoků je způsoben strukturními změnami v buněčné stěně,
konkrétně zvýšením počtu vazebných míst pro vankomycin. To má za následek jeho "vychytání" ještě
před navázáním do zásahového místa, jímž je prekurzor buněčné stěny (59). Rezistence k vysokým
hladinám glykopeptidů je u stafylokoků způsobena získáním enterokokového shluku genů vanA, které
kódují alternativní část biosyntetické dráhy buněčné stěny (194). Také mechanismy rezistence ke
streptograminům jsou poměrně dobře prostudovány. I přes dlouholeté používání streptograminových
antibiotik ve veterinární praxi si kombinace streptograminů A a B quinupristin/dalfopristin zachovává
dobrou účinnost. A to díky synergistickému účinku obou antibiotik, který je zachován i přes získání
rezistence k jednomu ze streptograminů (25). Linezolid a daptomycin jsou prvními zástupci dvou
nových skupin antibiotik oxazilidonů a cyklických lipopeptidů. Mechanismus antibakteriálního účinku
oxazolidinových antibiotik spočívá v jejich vazbě na 50S podjednotku bakteriálního ribozómu v
peptidyl-tRNA vazebném místě P, což zabraňuje vazbě molekuly fMet-tRNA a tvorby iniciačního
komplexu (176). Rezistence k linezolidu u S. aureus je popisována ojediněle a to v souvislosti s
dlouhodobou linezolidovou léčbou a přítomností cizorodých materiálů (133). Výskyt rezistence u
CoNS se dle různých surveillančních programů pohybuje pod 0,1 %, avšak lokálně může být i vyšší a
to díky šíření linezolid-rezistentních klonů v nemocničním prostředí (138). Daptomycin je proti CoNS,
včetně oxacilin rezistentních izolátů, neúčinnějším z výše popsaných "nových" antibiotik. Jeho
mechanismus účinku spočívá ve vazbě na membránu a tvorbě pórů propustných pro ionty, následná
depolarizace membrány způsobuje narušení energetického metabolismu buňky a její smrt. Doposud
bylo popsáno pouze pár ojedinělých případů daptomycin-rezistentních klinických izolátů S. aureus, u
nichž se rezistence vyvinula během antibiotické léčby (101, 105).
10
LITERÁRNÍ ÚVOD
Koaguláza negativní stafylokoky
Tab.1.2. Četnosti rezistencí k antibiotikům u klinických izolátů CoNS a S. aureus citlivých nebo
rezistentních k oxacilinu v Evropě. Data z rozsáhlých studií SENTRY antimicrobial surveillance
programme
Organismus
Koaguláza negativní stafylokoky
Oxacilin citlivé (počet izolátů)
Erythromycin
Ciprofloxacin
Tetracyklin
Levofloxacin
Trimethoprim-sulfamethoxazol
Klindamycin
Rifampin
Chloramfenikol
Vankomycin
Teikoplanin
Quinupristin-Dalfopristin
Linezolid
Daptomycin
Oxacilin rezistentní (počet izolátů)
Erythromycin
Ciprofloxacin
Tetracyklin
Levofloxacin
Trimethoprim-sulfamethoxazol
Klindamycin
Rifampin
Chloramfenikol
Vankomycin
Teikoplanin
Quinupristin-Dalfopristin
Linezolid
Daptomycin
1997-1999a
Rezistentní (%)
2002-2004b
2005c
(556)
30,6
10,1
15,8
9,7
2,7
6,3
0
0,4
(1512)
72
50,5
22,2
47,9
15,1
24,5
0
0,5
-
(447)
28
8,7
16,2
7,8
11
3,8
0
0
0
0
0
(1495)
70,5
63,9
17,4
58,7
49,1
36,6
0
0,6
0,5
0
0
(268)
44
11,9
10,4
8,2
4,5
2,6
2,6
0
0
0
0
0
(673)
72,7
67,5
62,9
47,4
32,5
13,4
13
0
0,6
0,4
0
0
a
Diekema, DJ a kol., 2001 (35)
Sader, HS a kol., 2006 (156)
c
Sader, HS a kol., 2007(157)
b
11
LITERÁRNÍ ÚVOD
Makrolidy, linkosamidy a streptograminy
2. Makrolidy, linkosamidy a streptograminy (MLS)
Makrolidy, linkosamidy a streptograminy jsou chemicky velmi různorodé antibakteriální látky,
které mají podobný mechanismus účinku spočívající ve vazbě antibiotika na velkou podjednotku
bakteriálního ribozómu. V souvislosti s tím se vyvinuly i některé společné mechanismy rezistence
bakterií k těmto antibiotikům. Producenty těchto látek jsou mikroorganismy rodu Streptomyces spp.
Biologická aktivita těchto tří skupin látek je také velice podobná.
2.1. Makrolidy
V letech 1999-2005 byly makrolidy třetí nejpoužívanější skupinou antibiotik v České republice
a jejich spotřeba stále stoupá (SÚKL). Tyto antibiotika jsou tvořena 14-, 15-, nebo 16-členným
laktonovým kruhem nesoucím jeden nebo více cukrů a několik dalších substitucí. Nejznámějším
zástupcem makrolidů je erythromycin A (Obr.2.1.), který byl zaveden do klinické praxe již v roce 1952.
Od té doby bylo vyvinuto několik generací makrolidů lišících se schopností indukovat rezistenci,
rozšířeným spektrem účinku a lepší stabilitou v kyselém prostředí (198) (Tab. 2.1.). Tyto antibiotika
jsou účinná hlavně proti grampozitivním kokům.
Tab.2.1. Přehled vlastností nejčastěji používaných makrolidových antibiotik.
Generace
Velikost
laktonového
kruhu
Název
antibiotika
erythromycin
1. generace
14 členný
oleandomycin
spiramycin
2. generace
16 členný
tylosin
karbomycin A
Saccharopolyspora
erythraea
Streptomyces
antibioticus
Streptomyces
ambofaciens
Streptomyces
fradiae
Streptomyces
thermotolerans
klarithromycin
semisyntetický
roxithromycin
semisyntetický
15 členný
azithromycin
semisyntetický
14 členný
telithromycin
semisyntetický
14 členný
3. generace
4. generace
(ketolidy)
Producent
Charakteristické vlastnosti
indukce rezistence, malá
stabilita v kyselém prostředí
neindukují rezistenci, malá
stabilita v kyselém prostředí
indukují rezistenci, vylepšená
stabilita v kyselém prostředí,
širší antimikrobiální spektrum
také proti mykobakteriím a
chlamydiím.
neindukují rezistenci, dobrá
stabilita v kyselém prostředí,
účinné i proti některým
erythromycin rezistentním
kmenům
12
LITERÁRNÍ ÚVOD
Makrolidy, linkosamidy a streptograminy
Obr. 2.1. Chemické struktury některých
streptograminových antibiotik (PubChem, NCBI)
makrolidových,
linkosamidových
a
Mechanismus účinku makrolidů spočívá ve vazbě antibiotika na velkou ribozomální
podjednotku v blízkosti peptidyltransferasového místa, čímž inhibuje proteosyntézu (197). Avšak
detailní mechanismus inhibice nebyl ještě zcela objasněn. Nedávno publikované krystalové struktury
velké podjednotky ribozómu s navázanými antibiotiky potvrdily již dřívější biochemické analýzy vazby
makrolidů na ribozóm (14, 51, 52, 162). Důležitým místem pro vazbu je interakce C5 mono- nebo
disacharidového postranního řetězce 14-, 15- a 16-členných makrolidů s dusíkovými bázemi
nukleotidů v pozicích A2058 a A2059 v doméně V molekuly 23S rRNA (E. coli číslování). Toto místo je
pro vazbu antibiotik klíčové a vysvětluje, proč mutace či modifikace v tomto místě způsobují rezistenci
k makrolidům. Na vazbě makrolidů se podílejí také ribozomální proteiny L4 a L22, což opět vysvětluje,
proč mutace v těchto proteinech způsobují částečnou rezistenci (46).
U makrolidů byly popsány čtyři různé mechanismy inhibice proteosyntézy: 1) Inhibice
13
LITERÁRNÍ ÚVOD
Makrolidy, linkosamidy a streptograminy
prodlužování nascentního peptidu, 2) Stimulace disociace peptidyl-tRNA z ribozómu 3) Inhibice tvorby
peptidové vazby a 4) zabránění správného složení velké ribozomální podjednotky. Všechny tyto
mechanismy přispívají k celkovému účinku makrolidů. Nejdůležitější mechanismus inhibice
pravděpodobně souvisí s vazbou makrolidů do tunelu, který vytváří velká podjednotka ribozómu (Obr.
2.2. a 2.3.). Dříve se předpokládalo, že tento tunel je pouze inertní struktura, kterou prochází právě
syntetizovaný peptid, avšak nyní se zdá, že jde o dynamickou strukturu ovlivňující průběh
proteosyntézy. Ačkoli je tento tunel relativně široký, obsahuje dvě zúžení, která jsou tvořena proteiny
L4 a L22. Makrolidy vázající se do tohoto zúžení tak můžou blokovat cestu pro rostoucí peptid.
2.2. Linkosamidy
Tato skupina antibiotik zahrnuje linkomycin a jeho semisyntetické deriváty (Obr. 2.1.).
Linkomycin byl poprvé izolován v roce 1963 z kmene Streptomyces lincolnensis var. lincolnensis
(106). Skládá se ze dvou stavebních jednotek, cukerné (methylthiolinkosaminid) a aminokyselinové
(derivát prolinu), spojených amidovou vazbou. Jedinými používanými antibiotiky této skupiny v klinické
praxi jsou linkomycin a mnohem účinnější klindamycin. Klindamycin je semisyntetický derivát
připravený chlorací linkomycinu na sedmém uhlíku aminocukerné části. Derivátem klindamycinu je
pirlimycin, který je používán výhradně ve veterinární medicíně.
Mechanismus účinku linkosamidů je stejný jako u makrolidů a je způsoben disociací peptidyltRNA z ribozómu. Rozdíl spočívá ve vzdálenosti místa vazby antibiotika od peptidyltransferasového
místa, a tedy i v délce disociovaného nascentního peptidu (Obr. 2.2.) (182). Kromě grampozitivních
koků jsou linkosamidy účinné také proti anaerobním bakteriím.
14
LITERÁRNÍ ÚVOD
Makrolidy, linkosamidy a streptograminy
Obr. 2.2. Struktura 50S podjednotky v
komplexu s analogem peptidyl-tRNA a s
různými MLS antibiotiky.
Z obrázku je patrná různá vzdálenost antibiotik
od peptidyltransferasového místa, konkrétně od
dusíku N3 adeninu v pozici A2451(adenin ČEVENĚ, N3 - ŽLUTĚ) V tabulce je vzdálenost
vyjádřená v Å. Různá vzdálenost antibiotika od
peptidyltransferasového místa se projevuje v
různé délce peptidu disociujícího z ribozómu
účinkem antibiotika. V experimentu byly použity
dvě různé mRNA: MS mRNA a erm mRNA
kódující různé polypeptidy (délka disociujících
peptidů hlavní frakce je zvýrazněná v tabulce
tlustě). ZELENÉ - nukleotidy A2058, A2059 a
A2062 23S rRNA, které jsou důležité pro vazbu
makrolidových antibiotik MODŘE A ŽLUTĚ proteiny L4 a L22 tvořící zúžení tunelu. a) 50S
podjednotka v komplexu s analogem tRNA b) - f)
50S podjednotka s navázanými antibiotiky.
ČERVENĚ případně i FIALOVĚ, A ČERNĚ (jsou
pro odlišení zvýrazněny jednotlivé struktury
sloučenin). Struktura 50S podjednotky v komplexu
s pristinamycinem IA (SgB) chybí, avšak shodná
velikost disociovaného peptidu s erythromycinem
naznačuje podobné místo vazby na ribozóm
Převzato z Tenson et al, 2003 (182)
2.3. Streptograminy
Streptograminy jsou přírodní látky produkované mikroorganismy rodu Streptomyces. Tuto
skupinu antibiotik tvoří dva typy látek, streptograminy A (polysaturované cyklické peptidy, SgA) a
streptograminy B (cyklické hexadepsipeptidy, SgB), které jsou současně produkovány jednou bakterií
v přibližném poměru 7:3 (134). Jednotlivě mají SgA a SgB bakteriostatické účinky proti grampozitivním
kokům, avšak při společném působení obou látek vykazují silný baktericidní efekt (67). Ačkoli byly
streptograminy objeveny již v roce 1950, v klinické praxi nebyly příliš hojně využívány. Donedávna byl
užíván pouze pristinamycin (kombinace pristinamycinu IA a pristinamycinu IIA), a to pouze ve Francii
pro léčbu stafylokokových infekcí. Klinický význam těchto antibiotik vzrostl až s vývojem
semisyntetických derivátů dalfopristinu (streptogramin A) a quinupristinu (streptogramin B), které jsou
15
LITERÁRNÍ ÚVOD
Makrolidy, linkosamidy a streptograminy
podávány jako alternativní antibiotikum proti vankomycin rezistentním grampozitivním kokům. V
současné době je testován nový semisyntetický derivát XRP2868, který vykazuje až čtyřikrát větší
účinnost in vitro než kombinace dalfopristinu a quinupristinu (38).
Streptogramin A se váže do peptidyltransferasového místa ribozómu, pouze pokud zde není
navázána aminoacyl-tRNA, a blokuje tak její navázání. Navíc vazba streptograminu A způsobuje
konformační změny velké ribozomální podjednotky tak, že zvyšuje aktivitu streptograminu B a to více
jak 100-krát (188). Streptogramin B naopak zabraňuje podobně jako makrolidy a linkosamidy
prodlužování peptidu tím, že zabrání jeho prostupu tunelem (Obr. 2.3.). na rozdíl od streptograminu A
je streptogramin B schopen se k ribozómu vázat ve všech stadiích translace.
Obr. 2.3. Struktura dalfoprisitinu a quinupristinu navázaných na velkou 50S
podjednotku bakteriálního ribozómu. A) Elektronová densita dalfopristinu a
quinupristinu navázaných na ribozóm B) Pozice dalfopristinu, quinupristinu a
peptidyl-tRNA. Na obrázku je dobře vidět zablokování zúžení tunelu
quinupristinem.
Převzato z Mukhtar et al., 2005 (119)
16
LITERÁRNÍ ÚVOD
Mechanismy rezistence
3.
Mechanismy
rezistence
k
makrolidům,
linkosamidům
a
streptograminům u stafylokoků
Tři základní mechanismy rezistence k MLS antibiotikům byly popsány u stafylokoků: Změna
zásahového místa může být způsobena jednak posttranskripční modifikací 23S rRNA, jednak
mutacemi v 23S rRNA nebo v ribozomálních proteinech. Jiným mechanismem je inaktivace antibiotika
buď jeho modifikací navázáním jiné sloučeniny, nebo jeho degradací. Třetím mechanismem je aktivní
transport antibiotika ven z buňky.
3.1. Změna zásahového místa
Tento mechanismus rezistence úzce souvisí s místem vazby a mechanismem účinku
antibiotik. Protože se vazebná místa MLS antibiotik z velké části překrývají, také rezistence
způsobená změnou zásahového místa je společná. V některých případech se může rezistence
překrývat i s dalšími skupinami antibiotik, jež se váží na ribozóm a inhibují translaci.
3.1.1. MLSB rezistence - methylace 23S rRNA v pozici A2058
Nejčastějším typem rezistence k MLS antibiotikům je posttranskripční modifikace 23S rRNA,
způsobená S-adenosylmethionin-dependentní methyltransferasou. Enzym methyluje adenin v pozici
A2058 (E. coli číslování), která je esenciální pro vazbu antibiotik na ribozóm (86, 196-198). Methylace
probíhá pouze během krátkého časového úseku během sestavování velké podjednotky, kdy je 23S
rRNA přístupná enzymu. Sestavený ribozóm již nemůže být substrátem pro methyltransferasu, neboť
molekula 23S rRNA je uložená hluboko uvnitř velké podjednotky (174). Modifikace na adeninu stericky
brání vazbě antibiotika do svého zásahového místa. Protože se vazebná místa pro makrolidy,
linkosamidy a streptograminy B překrývají, je tento mechanismus rezistence pro tyto antibiotika
společný a je označován jako MLSB rezistence.
Existují dva základní typy methyltransferas. Prvním typem jsou monomethyltransferázy, jejichž
příkladem jsou Lmr(B) u producenta linkomycinu Streptomyces lincolnensis (135), Crl u producenta
celesticetinu Streptomyces caelestis (29) nebo Lrm u Streptomyces lividans (73). Druhým typem jsou
dimethyltransferasy, např. Erm(E) u producenta erythromycinu Saccharopolyspora erythrea nebo
Erm(C) u stafylokoků. Zatímco monomethylace adeninu udílí rezistenci k vysokým koncentracím (>
1000 µg/ml) linkosamidů a nižším koncentracím (50-200 µg/ml) erythromycinu, tylosinu a
karbomycinu, dimethylace způsobuje rezistenci k vysokým koncentracím (> 1000 µg/ml) všech pěti
antibiotik (28, 29).
3.1.1.2. Regulace MLSB rezistence
Geny erm kódující methyltransferasu mohou být exprimovány konstitutivně, nebo inducibilně
za přítomnosti subinhibičních koncentrací induktoru. Inducibilní MLSB rezistence (iMLSB) byla poprvé
popsána u Staphylococcus sp. v roce 1956, šest let po zavedení erythromycinu do klinické praxe (66).
Účinnými induktory exprese iMLSB rezistence jsou pouze 14-členné a 15-členné makrolidy.
17
LITERÁRNÍ ÚVOD
Mechanismy rezistence
Neindukující 16-členné makrolidy, ketolidy, linkosamidy a streptograminy zůstávají i nadále účinné
(197). Konstitutivní MLSB rezistence (cMLSB) byla poprvé popsána až v roce 1972. V důsledku
používání neindukujících 16-členných makrolidů došlo k selekci konstitutivních mutant, které jsou
rezistentní ke všem makrolidům, linkosamidům a streptograminům typu B (198). Fenotypový projev
iMLSB rezistence lze pozorovat diskovým indukčním testem. Vedle disku s neindukujícím antibiotikem
je položen disk s induktorem (erythromycinem) ve vzdálenosti max. 20 mm. Difúze erythromycinu
směrem k disku s neindukujícím antibiotikem indukuje expresi erm genů, což se projeví tvorbou
Obr. 3.1. Diskový indukční test.
E - erythromycin (15 ug)
DA - klindamycin (2 ug)
inhibiční zóny deformované do tvaru písmene "D" (Obr. 3.1.) (40).
Mechanismem regulace genové exprese MLSB rezistence je atenuace translace (37), která je
řízena regulační oblastí předcházející oblast strukturního genu. Mechanismus byl poprvé popsán pro
gen erm(C) nesený na plazmidu pE194 (64). Sekvence před genem obsahuje dvě Shine-Dalgarno
(SD) sekvence pro dva otevřené čtecí rámce. První, SD-1 oblast, slouží pro přepis 14-aminokyselin
dlouhého kontrolního peptidu a SD-2 pro přepis genu erm(C). Díky 4 invertovaným repeticím, které
tvoří vlásenky, může tato kontrolní oblast zaujímat dva konformační stavy, neaktivní konformaci I a
aktivní konformaci II (Obr. 3.2.). Při nepřítomnosti vhodného induktoru se párují repetice 1 + 2 a
repetice 3 + 4. Vlásenka vzniklá párováním repetic 3 a 4 brání vazbě ribozómu v oblasti SD-2 a
přepisu genu erm(C). V této neaktivní konformaci je SD-1 volně přístupná pro ribozómy, což umožňuje
konstitutivní přepis kontrolního peptidu kódovaného úsekem I. Jakmile je přítomen vhodný induktor,
který se naváže na ribozóm přepisující kontrolní peptid, ribozóm se zastaví, což způsobí přeskupení
konformace I do konformace II. Tímto přeskupením se uvolní repetice 4 a odkryje SD-2. Volná
Shine-Dalgarno sekvence oblasti 2 umožní nasednutí funkčních ribozómů a přepis genu erm(C).
Zároveň se prodlouží životnost mRNA, což je pravděpodobně způsobeno stojícími ribozómy, které
chrání transkript před degradací RNasou (158). Jestli je antibiotikum induktorem či ne, závisí na
struktuře atenuátoru (112), avšak doposud není úplně jasné, jakým mechanismem je tato specifita
indukce způsobena. Pro zastavení ribozómu ve správném místě, které způsobí změnu konformace, je
kritická interakce mezi makrolidem, kontrolním peptidem a ribozómem. Bylo zjištěno, že pro správnou
18
LITERÁRNÍ ÚVOD
Mechanismy rezistence
funkci kontrolního peptidu atenuátoru genu erm(C) jsou esenciální 4 aminokyseliny, IFVI (197).
Podobná sekvence aminokyselin byla nalezena u E. coli ve specifických malých peptidech
kódovaných tzv. minigeny na 23S rRNA (183). Tyto peptidy udílejí nízkou hladinu rezistence k různým
makrolidovým antibiotikům mechanismem "bottle brush", kdy nascentní peptid interaguje v
ribozomálním tunelu s antibiotikem a aktivně jej odstraňuje ze svého vazebného místa (120, 184).
Obr. 3.2. Alternativní konformace mRNA
inducibilně exprimovaného genu erm(C) z
plazmidu pE194.
Konformace mRNA v nepřítomnosti A), nebo v
přítomnosti B) erythromycinu. RBS, vazebné
místo pro ribozóm; LP, kontrolní peptid; ORF,
otevřený čtecí rámec; 1, 2, 3, a 4, invertované
repetice. Zelená a červená čára, kódující
sekvence.
Převzato z Depardieu et al., 2007 (34)
Podobná interakce pravděpodobně probíhá také během syntézy kontrolního peptidu.
Exprese genů erm(A) a erm(B) je regulována stejným mechanismem atenuace translace jako
gen erm(C), avšak struktura regulačních oblastí těchto genů je mnohem složitější (62, 120).
Ačkoli mechanismem regulace exprese iMLSB rezistence je ve většině případů výše popsaná
atenuace translace, regulace exprese genu erm(K) z Bacillus licheniformis je řízena mechanismem
atenuace transkripce. Regulační oblast před genem erm(K) obsahuje, podobně jako kontrolní oblast
pro gen erm(C), ribozomální vazebné místo pro otevřený čtecí rámec kódující 14 aminokyselin dlouhý
kontrolní peptid. Také tato oblast se může vyskytovat ve dvou konformacích. Konformace vzniklá za
nepřítomnosti induktoru dává vznik dvěma ρ-nezávislým transkripčním terminačním faktorům, které
předčasně ukončí transkripci mRNA genu erm(K). Za přítomnosti induktoru dojde k přeskupení
kontrolní oblasti, které umožní přepsání terminačních faktorů a syntézu celé délky mRNA kódující
rezistenční methyltransferasu (85).
Konstitutivní exprese MLSB rezistence vyplývá z narušení sekundární struktury mRNA. V
laboratorních podmínkách byly kultivací iMLSB rezistentních kmenů za přítomnosti neindukujícího
antibiotika vyselektovány konstitutivní mutanty s různými delecemi (30, 87), duplikacemi (95, 129) či
bodovými mutacemi (163). Konstitutivní mutanty byly získány kultivací v přítomnosti téměř všech
neindukujících MLSB antibiotik, zahrnující karbomycin, tylosin, linkomycin, klindamycin, ketolidy
telithromycin a ABT-773 či streptogramin B, quinupristin. Quinupristinem však bylo možné selektovat
konstitutivní rezistenci pouze v nepřítomnosti dalfopristinu (163). Regulační oblasti genů erm(A) a
19
LITERÁRNÍ ÚVOD
Mechanismy rezistence
erm(C) u konstitutivně rezistentních klinických izolátů vykazují tytéž změny, které byly pozorovány
během selekce konstitutivních mutant in vitro. Delece v regulační oblasti byly nalezeny u konstitutivně
rezistentních klinických izolátů S. epidermidis a S. aureus (87, 164, 199). Bodové mutace byly
nalezeny v atenuátoru před genem erm(A) u S. aureus (199) a tandemové duplikace v atenuátoru
genu erm(C) u klinických izolátů S. aureus, S. saprophyticus a S. equorum a v atenuátoru genu
erm(A) u S. aureus (57, 96, 129, 164, 200).
3.1.1.3. erm geny u stafylokoků
Během posledních třiceti let bylo popsáno velké množství adenin-N6-methyltransferas jak u
producentů antibiotik, kteří se takto chrání před účinky produkovaného antibiotika, tak i u širokého
spektra klinicky významných mikroorganismů (147). U stafylokoků byly doposud nalezeny tyto erm
geny: erm(A), erm(B), erm(C), erm(33), erm(F) a erm(Y). Zatímco první tři zmíněné geny erm(A, B, C)
jsou pro stafylokoky typické, ostatní byly detekovány ojediněle spíše jako důsledek intenzivního
horizontálního genového přenosu mezi mikroorganismy.
Geny erm(A) (120) a erm(C) (48, 64), jejichž nukleotidové sekvence jsou ze 62 % identické,
jsou nejčastějšími nositeli MLSB rezistence u klinických izolátů stafylokoků. Zatímco erm(A) převládá u
S. aureus, gen erm(C) je dominantní u CoNS. Gen erm(B) (160) je typický pro zvířecí stafylokokové
izoláty a v klinické praxi je detekován jen ojediněle (39). Gen erm(33) ze S. scurii je zajímavým
příkladem možné rekombinace mezi erm geny (konkrétně mezi erm(C) a erm(A)), která vede k plně
funkčnímu proteinu (169). Gen erm(Y) byl popsán na plazmidu pMS97 z S. aureus, který nese i další
dva geny makrolidové rezistence, msr(A) a mph(C) (108). Nukleotidová sekvence tohoto genu je z 81
% identická se sekvencí genu erm(T) z Lactobacillus reuteri a ze 77 % se sekvencí stafylokokového
genu erm(C).
3.1.2. PhLOPSA rezistence - methylace 23S rRNA v pozici A2503
Methyltransferasa Cfr byla popsána teprve nedávno u S. sciuri a S. simulans během
surveillanční studie florfenikolové rezistence u stafylokoků ze zvířat (77, 170). Rezistence je
způsobená methylací adeninu v pozici A2503 (79), která se nachází v oblasti peptidyl-tRNA
vazebného místa (místo P). Modifikace v této pozici interferuje s vazbou mnohem různorodější
skupiny antibiotik než je tomu u Erm methyltransferas. Bylo prokázáno, že gen cfr snižuje citlivost k
florfenikolům (chloramfenikol, florfenikol), linkosamidům, oxazolidinonům (linezolid), pleuromutilinům
(tiamulin, valnemulin) a ke streptograminům A (PhLOSA rezistence; (97)). Studie uvádí, že tento gen
byl během rozsáhlé surveillanční studie zvířecích stafylokokových izolátů nalezen pouze u 6 kmenů.
Avšak již byl také izolován klinický methicilin rezistentní S. aureus, který nese tento cfr gen udílející
rezistenci k antibiotikům poslední volby pro léčbu multirezistentních grampozitivních koků (78).
3.1.3. Rezistence k MLS antibiotikům mutacemi v zásahovém místě
Mutace na ribozómu zabraňující vazbě MLS antibiotik mohou vznikat jednak na ribozomálních
proteinech a jednak na 23S rRNA. Mutace v proteinu L4 přímo ovlivňují vazbu antibiotika (47). Mutace
v proteinu L22 působí nepřímo tak, že vlivem této mutace dojde k rozšíření ribozomálního tunelu a
20
LITERÁRNÍ ÚVOD
Mechanismy rezistence
nascentní peptid tak může "proklouznout" vedle navázaného antibiotika (43). Zatímco mutace v
proteinech se vyskytují poměrně často, mutace v genu pro 23S rRNA způsobující rezistenci jsou
vzácnější (178). Důvodem je nutnost nahromadění mutací v jednotlivých kopiích genu pro ribozomální
RNA. Proto je tato rezistence významná pouze u mikroorganismů s nízkým počtem kopií genu pro
23S rRNA jako třeba u Helicobacter pylori nebo Mycobacterium sp., které mají pouze dvě kopie rrn
operonu. Naproti tomu druhy rodu Staphylococcus můžou mít až šest kopií genu pro 23S rRNA na
buňku. I přes takto velký počet byla u S. aureus popsána rezistence k MLSB antibiotikům způsobená
mutacemi A2058G, A2058T, A2059G ve třech nebo čtyřech operonech z šesti. U jednoho izolátu této
studie byly mutace v genu pro 23S rRNA kombinovány s mutacemi v proteinu L22. Tento izolát byl
rezistentní také ke kombinaci quinupristin/dalfopristin (140). Jiné izoláty S. aureus získané během
léčby streptograminovou kombinací quinupristin/dalfopristin se staly k tomuto antibiotiku rezistentní
pouze díky mutacím v proteinu L22 (100).
3.2. Inaktivace MLS antibiotik
Zatímco rezistence způsobená změnou zásahového místa postihuje široké spektrum
antibiotických látek vázajících se do stejného místa účinku, rezistence způsobená inaktivací antibiotika
je specifická pro úzkou skupinu chemicky podobných látek. U MLS antibiotik můžeme rozlišit
rezistenci způsobenou inaktivací makrolidů (M-rezistence), linkosamidů (L-rezistence), streptograminů
A (SgA-rezistence) nebo inaktivací streptograminů B (SgB-rezistence).
3.2.1. Inaktivace makrolidů
Doposud byly popsány dva mechanismy inaktivace makrolidů, modifikace fosforylací a
inaktivace hydrolytickým štěpením laktonového kruhu. Oba tyto rezistenční mechanismy jsou typické
pro gramnegativní tyčinky a k makrolidové rezistenci u stafylokoků přispívají spíše okrajově.
U E. coli byly popsány dva typy makrolid 2'-fosfotransferas. První, Mph(2')I, je kódovaná
genem mph(A) a inaktivuje 14- a 15-členné makrolidy a ketolidy efektivněji než 16-členné makrolidy
(70, 129). Druhá fosfotransferasa, Mph(2')II, kódovaná genem mph(B), nevykazuje žádnou
substrátovou preferenci (83). Navzájem tyto dva enzymy vykazují 37% identitu aminokyselinových
sekvencí, a pouze gen mph(B) inaktivoval makrolidy po přenosu do heterologního hostitele S. aureus
(122). Gen mph(B) má podobný obsah GC párů jako je v chromozómu stafylokoků, je tedy možné, že
odtud gen původně pochází. U stafylokoků byl nalezen gen mph(C), jehož proteinový produkt je
podobný fosfotransferase Mph(B) (49% identita, (108)). Tento gen byl identifikován na plazmidu
pMS97 společně s rezistenčními geny msr(A') a erm(Y). Analýza exprese této trojice genů odhalila, že
exprese genu mph(C) na tomto plazmidu závisí na upstream lokalizovaném genu msr(A) (109).
Experimenty s přenosem genu mph(C) do citlivého S. aureus RN4220 potvrdily toto pozorování, jehož
příčina nebyla zatím objasněna (70). Gen mph(C) byl detekován v klinických či zvířecích izolátech
různých studií buď v těsné blízkosti genu msr(A) (98, 179), nebo samostatně, udílející pouze střední
hladinu rezistence k erythromycinu (MIC = 2-16 mg/l) (98, 165).
Na rozdíl od fosforylace, inaktivace erythromycinu hydrolýzou laktonového kruhu postihuje
pouze 14- a 15-členné makrolidy, nikoli však ketolidy a 16-členné makrolidy (15, 19). U E. coli, byly
21
LITERÁRNÍ ÚVOD
Mechanismy rezistence
nalezeny dva typy esteráz kódované geny ere(A) nebo ere(B) (12, 130). Jejich aminokyselinové
sekvence vykazují velmi malou podobnost (25% identita). Také obsah G+C párů genu ere(B) (36 %)
se výrazně liší od ere(A) (50 %) a také od GC obsahu v chromozómu E. coli (50 %). To naznačuje, že
gen ere(B) je exogenního původu a byl získán pravděpodobně od grampozitivních koků (12).
Přítomnost genu ere u stafylokoků byla prokázána pouze v jednom případě. V roce 1996 byl popsán
kmen S. aureus nesoucí gen ere(B) spolu s genem msr(A) (202). Tento kmen inaktivoval 14- a 16členné nikoli však 15-členné makrolidy, čímž se fenotypově lišil od exprese ere(B) genu v E. coli.
3.2.2. Inaktivace linkosamidů
Inaktivace linkosamidů fosforylací nebo nukleotidylací hydroxylové skupiny na pozici 3 byla
popsána u různých druhů rodu Streptomyces (11, 102). U klinických a zvířecích izolátů je inaktivace
linkosamidů
způsobena
jejich
adenylací
linkosamid-O-nukleotidyltransferasou.
Dvě
nukleotidyltransferasy lišící se 14 aminokyselinovými zbytky byly poprvé popsány u S. haemolyticus a
S. aureus a jsou kódovány geny lnu(A) nebo lnu(A') (26, 27). Dalších pět variant genů lnu bylo
popsáno u grampozitivních (lnu(C), lnu(B), (1, 24) a gramnegativních mikroorganismů (lnu(F) a
lnu(AN2); (58, 192). Proteiny kódované geny lnu(AN2) a lnu(C) vykazují 50-52% a 26% identitu
aminokyselinových sekvencí s proteiny Lnu(A) ze stafylokoků. Naopak protein Lnu(B) je podobný
pouze proteinu Lnu(F) z E. coli (34,9 % identity aminokyselinových sekvencí). Ačkoli proteinové
produkty lnu genů inaktivují oba linkosamidy, udílejí významnou rezistenci pouze k linkomycinu (1,
88). To je pravděpodobně způsobeno vyšší účinností klindamycinu, jenž je schopen buňky usmrtit
ještě před tím než je zcela inaktivován. Výjimkou je gen lnu(F) u E. coli, který udílí rezistenci také ke
klindamycinu.
3.2.3. Inaktivace streptograminů A
Streptograminy A jsou modifikovány O-acetyltransferasami, které přenáší acetyl z
acetylkoenzymu A na sekundární hydroxyl antibiotika. Tento hydroxyl je v kontaktu s 23S rRNA v
pozici G2505 (E. coli číslování) a jeho acetylace znemožní vazbu antibiotika na ribozóm (53). Několik
acetyltransferas kódovaných geny vat (virginiamycin A acetyltransferasa) bylo doposud identifikováno
u klinických a zvířecích izolátů stafylokoků a enterokoků (Tab. 3.1.). Aminokyselinové sekvence těchto
enzymů jsou vysoce podobné sekvencím kódovaných na chromozómech dalších mikroorganismů což
naznačuje jejich velké rozšíření (Tab. 3.1.).
22
LITERÁRNÍ ÚVOD
Mechanismy rezistence
Tab. 3.1. Porovnání aminokyselinových sekvencí virginamycin A acetyltransferas ze stafylokoků a
enterokoků a příklady podobných sekvencí z genomů jiných mikroorganismů.
Mikroorganismus
S. aureus
S. cohnii
Bacillus cereus
ATCC10987
Enterococcus faecum
Enterococcus faecum
S. aureus
Desulfitobacterium
hafniense Y51
Clostridium botulinum F
str. Langeland
Acetyltransferasa
Vat(A)
Vat(C)
Identita
100 %
70 %
Podobnost
Lokalizace
Reference
100 %
plazmid pIP680 (8)
85 %
plazmid pIP1714 (6)
AAS41570.1
Vat(D)
Vat(E)
Vat(B)
62 %
61 %
58 %
53 %
80 %
77 %
chromozóm
plazmid
72 %
plazmid
GenBank
(143)
(54)
(4)
BAE82934.1
54 %
71 %
chromozóm
GenBank
ABS40829.1
52 %
71 %
chromozóm
GenBank
3.2.4. Inaktivace streptograminů B
Streptograminy B jsou inaktivovány intramolekulárními lyasami, které linearizují cyklický
depsipeptid štěpením esterové vazby, čímž je zrušena bioaktivní konformace nutná pro vazbu
antibiotika na ribozóm (118). U stafylokoků byly popsány dva geny vgb(A) (7) a vgb(B) (6) kódující
lyasy, jejichž aminokyselinové sekvence jsou z 67 % identické. Navíc bylo prokázáno, že enzymy Vgb
jsou součástí velké rodiny streptogramin B lyas, které jsou přítomné nejenom v rezistentních klinických
izolátech, ale také v chromozómu mnoha bakterií, jež mohou sloužit jako zdroj rezistenčních genů pro
klinicky významné stafylokoky (Tab. 3.2.). Konkrétně byly v nukleotidové databázi vytipovány ortologní
geny z chromozómu Streptomyces coelicolor a Bordetella pertusis, jejichž aktivita štěpení
streptograminů B byla prokázána expresí v heterologním hostiteli E. coli (118).
Tab. 3.2. Porovnání aminokyselinových sekvencí lyasy Vgb(A) ze Staphylococcus aureus se sekvencemi
dostupnými v GenBank databázi použitím BLAST(tblastn).
protein ID
AAA98349.1
AF24088.1
ABR35734.1
AAU21870.1
AAU39223.1
CAB88456.1
CAM02658.1
identita
Staphylococcus aureus Vgb(A)
100 %
Staphylococcus cohnii Vgb(B)a
67 %
Clostridium beijerinckii NCIMB 8052
53 %
Bacillus licheniformis ATCC 14580
51 %
Bacillus licheniformis DSM 13
51 %
Streptomyces coelicolor A3(2)a
41 %
Saccharopolyspora erythraea
NRRL2338
42 %
CAE30921.1
Bordetella bronchiseptica strain RB50
41 %
Bordetella pertussis strain Tohama Ia CAE40592.1
39 %
ABM12711.1
Mycobacterium vanbaalenii PYR-1
38 %
a
Inaktivační aktivita těchto proteinů byla testována v E. coli (118)
a
podobnost
100 %
82 %
70 %
69 %
69 %
59 %
62 %
57 %
56 %
56 %
plazmid pIP680
plazmid pIP1714
genom
genom
genom
genom
genom
genom
genom
genom
3.3. Transportní rezistence
Mikrobiální transportní mechanismy zprostředkovávající rezistenci k antibiotikům lze rozdělit
do pěti rodin (142). Mezi sekundární transportéry, využívající pro export toxických látek protonový
gradient, patří: MFS (major facilitator superfamily) rodina proteinů, RND (resistance-nodulationdivision) rodina proteinů, SMR (small multidrug resistance) rodina proteinů a MATE (multidrug and
23
LITERÁRNÍ ÚVOD
Mechanismy rezistence
toxic compound extrusion) rodina proteinů. Z nich u grampozitivních mikroorganismů byly detekovány
pouze dvě rodiny (MFS a SMR). MFS rodina zahrnuje tyto transportéry MLS antibiotik: Mfe ze
streptokoků (161), LmrP z Lactococcus lactis (141) a MdeA z S. aureus (65), Lmr(A) ze Streptomyces
lincolnensis (205).
Superrodina ABC-proteinů (ATP-binding casette) zahrnuje transportéry, které získávají energii
pro export z hydrolýzy ATP. Tato rodina zahrnuje kromě klasických transportérů také skupinu, která se
významně podílí na rezistenci k MLS antibiotikům u stafylokoků, avšak u které, jak bude zmíněno
níže, nebyl transportní mechanismus zcela prokázán.
3.3.1. ABC-transportéry
Obecně ABC transportéry vyžadují pro svoji funkci dvě hydrofilní cytoplazmatické domény,
které váží a hydrolyzují ATP, a dvě hydrofobní transmembránové (TM) domény, které jsou většinou
složeny ze šesti transmembránových α-helixů. Hydrofilní doména, označovaná také jako NBD
(nukleotid binding domain), má dva typické motivy Walker A a Walker B (190), které jsou společné pro
všechny ATPasy plus další konzervované motivy charakteristické pro ABC transportéry: konzervovaná
sekvence společná pro všechny ABC transportéry (ABC transporter signature motif), konzervovaná
oblast obsahující aromatické aminokyseliny (Tyr-loop), konzervovaná glutaminová smyčka (Gln-loop)
a konzervovaná histidinová smyčka (His-loop). Walker A, nebo-li fosfát vazebná smyčka, je oblast
bohatá na glycin se strukturou: GXXGXGK(S,T), kde X je libovolná aminokyselina. Kromě ABCtransportérů se tento motiv nachází také u ostatních ATP- nebo GTP-vazebných proteinů. Walker B
motiv vázající hořčík je hydrofobní oblast s několika nabitými aminokyselinami s touto strukturou:
hhhhD(D,E,S)(P,A) kde h je hydrofobní aminokyselina. Jednotlivé domény mohou být syntetizovány
jako samostatné proteiny nebo mohou být fúzovány v multidoménové peptidy kódované jedním
genem. U ABC proteinů jiné než transportní funkce TM doména chybí. Na základě fylogenetické
analýzy sekvencí ABC proteinů lze rozlišit tři třídy (32). 1. třída zahrnuje většinu známých transportérů,
které mají NDB doménu a TM doménu fúzovanou v jeden polypeptid. 2. třída zahrnuje rezistenční
proteiny a proteiny účastnící se jiných buněčných procesů než je transport. Tato třída proteinů má
fúzované dvě NBD domény a postrádá transmembránovou doménu. 3. třída obsahuje proteiny závislé
na vazebném proteinu (BPD, binding protein dependent) většinou s importní funkcí.
3.3.2. Rezistence k MLS antibiotikům = 2. třída ABC proteinů
ABC proteiny udílející rezistenci k MLS antibiotikům spadají do třídy 2 a patří mezi ně proteiny
producentů MLS antibiotik i proteiny udílející rezistenci k těmto antibiotikům u klinicky významných
mikroorganismů a zejména pak u stafylokoků. Jak bylo zmíněno výše, tato fylogenetická třída ABC
proteinů má dvě fúzované NBD domény, avšak postrádá jakoukoli TM doménu. Kromě rezistenčních
proteinů, které tvoří tzv. ARE podrodinu (antibiotic resistance), jsou do této skupiny řazeny i proteiny
účastnící se regulace translace (elongační faktor hub EF-3 (68) nebo proteiny GCN1 a GCN20.
Podílejí se na regulaci proteosyntézy skrze regulaci fosforylace eukaryotického iniciačního faktoru
eIF2 (104), u mnoha dalších proteinů této skupiny zůstává funkce nejasná.
24
LITERÁRNÍ ÚVOD
Mechanismy rezistence
3.3.2.1. Msr(A) - rezistence k makrolidům a streptograminům B
Přítomnost ABC proteinu Msr(A) je druhou nejčastější příčinou rezistence k makrolidům u
stafylokoků. Msr(A) udílí rezistenci k 14- a 15-členným makrolidům a po indukci snižuje citlivost také
ke ketolidům a streptograminům B (MSB rezistence). Mechanismus této rezistence byl poprvé popsán
u S. epidermidis (150, 151) a u S. aureus (111). 488 aminokyselin dlouhý peptid obsahuje dvě ATPvazebné domény a postrádá jakoukoli transmembránovou doménu. NDB domény jsou separovány
nezvykle dlouhým mezerníkem, který je bohatý na glutamin a ostatní polární aminokyseliny, což je
typické pro tzv. Q-linker - flexibilní spojku mezi doménami, jež propojuje rozdílné, ale interagující
domény proteinů, které se často vyskytují u prokaryotických dvousložkových regulačních a signál
transdukujících systémů (203). Ačkoli gen msr(A) nekóduje žádnou transmembránovou doménu,
přenos pouze tohoto genu do citlivého kmene S. aureus RN4220 byl dostatečný pro expresi
rezistence k erythromycinu. Navíc buňky S. aureus RN4220 produkující Msr(A) akumulovaly méně
radioaktivně značeného antibiotika než buňky bez Msr(A), což by mohlo svědčit o aktivním exportu
antibiotika ven z buňky. Na základě tohoto pozorování bylo předpovězeno, že tento transportní protein
pravděpodobně využívá pro svoji funkci TM doménu přítomnou v recipientním kmeni (150).
Downstream od genu msr(A) byly na původním plazmidu pUL5050 z S. epidermidis nalezeny dva
geny, které by mohly být součástí předpokládaného transportního systému. Gen stpA kóduje ATPvazebnou doménu a gen smpA kóduje hydrofobní transmembránovou doménu. Tyto geny byly
hybridizačně potvrzeny také u všech 35 MSB rezistentních CoNS analyzovaných v této studii. Navíc
velmi podobné geny, stpC a smpC byly nalezeny v chromozómu recipientního erythromycin citlivého
S. aureus RN4220. Inaktivace těchto genů však neměla žádný vliv na schopnost msr(A) udílet MSB
rezistenci (149). Mechanismus funkce Msr(A) zůstává i nadále nejasný. Kromě stafylokoků byl gen
msr(A) identifikován v mnoha dalších rodech grampozitivních i gramnegativních mikroorganismů:
Streptococcus spp., Enterococcus spp., Corynebacterium spp. a Pseudomonas spp. Tyto geny
vykazovaly navzájem 99 - 100% identitu (127).
V chromozómu Enterococcus faecium byl objeven gen msr(C) kódující protein, jehož
aminokyselinová sekvence vykazovala 42% identitu s Msr(A). Pokud byl tento gen inaktivován u E.
faecium, citlivost k MSB antibiotikům se snížila pouze nepatrně (172). Avšak pokud byl tento gen
přenesen do citlivého S. aureus RN4220, udílel vysoké hladiny rezistence k MSB antibiotikům (145).
Gen msr(D) byl objeven jako součást velkého chromozomálního genetického elementu v
Streptococcus pneumoniae kódující také dva MDR transportéry makrolidů Mef(E) a Mef(A).
Aminokyselinová sekvence Msr(D) je ze 75 % identická s Msr(A) a ze 78 % identická s Msr(C). Tento
protein v S. pneumonie udílel pouze nízkou hladinu rezistence k 14-členným makrolidům a ketolidům
(10) a po přenosu do S. aureus RN4220 citlivost k MSB antibiotikům výrazně nesnižoval (145).
3.3.2.2. Vga proteiny - rezistence k streptograminům A (a linkosamidům)
Proteiny Vga(A), Vga(A)v a Vga(B) byly původně objeveny jako rezistenční determinanty
udílející rezistenci k streptograminům A u stafylokoků. Stejně jako Msr(A) patří do rodiny ARE
proteinů, pro kterou je typická přítomnost dvou NBD domén a absence transmembránové domény.
Aminokyselinové sekvence proteinů Vga(A) a Vga(B) jsou si navzájem z 48.3 % identické a s
25
LITERÁRNÍ ÚVOD
Mechanismy rezistence
proteinem Msr(A) jsou identické z 35,2 % a 34,4 %. Typický Q-linker bohatý na glutamin lze nalézt u
proteinu Vga(B), avšak protein Vga(A) má poměr glutaminů stejný v celé délce polypeptidu.
Schopnost těchto proteinů udílet rezistenci k MLS antibiotikům byla porovnávána po přenosu
do citlivých recipientů S. aureus RN4220 a S. epidermidis BM3302 (69). Proteiny Vga(A) a Vga(A)v
byly schopny udílet kromě rezistence ke streptograminům A také nízkou hladinu rezistence k
linkomycinu. Protein Vga(B) udílel nízkou hladinu rezistence ke streptograminu A avšak podstatně
zvýšenou rezistenci ke kombinaci streptograminů A a B. Kromě toho byla pozorována různá
schopnost Vga proteinů udílet rezistenci v závislosti na hostiteli: v S. epidermidis BM3302 dosahovaly
minimální inhibiční koncentrace vyšších hodnot než u S. aureus RN4220. Naše práce (124) popisuje
novou variantu genu, vga(A)LC, která udílí střední hladinu rezistence k oběma linkosamidům (MICLIN =
32 mg/l a MICCLI = 8 mg/l) u S. haemolyticus, avšak po přenosu do heterologního S. aureus RN4220
dosahovaly minimální inhibiční koncentrace hodnot nižších, které však zůstaly vyšší v porovnání s
genem vga(A).
3.3.2.3. Ostatní rezistenční proteiny ARE rodiny
Další dva proteiny příbuzné s Msr(A) a udílející přirozenou rezistenci k linkosamidům a
streptograminům byly nalezeny při analýze ABC transportních systémů ze sekvenovaných genomů E.
faecalis a B. subtilis. U E. faecalis, který je
na rozdíl od ostatních druhů enterokoků přirozeně
rezistentní linkosamidům a streptograminům A (LSA rezistence), byl nalezen gen lsa, jehož inaktivací
došlo ke zvýšení citlivosti ke klindamycinu, dalfopristinu (streptogramin A) a ke kombinaci
quinupristin/dalfopristin. Současně komplementací delece (zavedením genu lsa na plazmidu) byl
rezistenční fenotyp obnoven (172, 173). Protein Lsa z E. faecalis je z 42 % podobný proteinu Msr(C) a
z 41 % podobný proteinu Vga(A). U dvou izolátů E. faecalis citlivých k oběma linkosamidům a ke
quinupristinu/dalfopristinu byly v genu lsa nalezeny bodové mutace vedoucí k předčasnému ukončení
translace (36) Gen lsa byl přítomen ve všech LS rezistentních izolátech E. faecalis a zároveň nebyl
detekován v žádném z izolátů ostatních enterokokových druhů (173).
Na plazmidu pSCFS1 z S. sciuri byl objeven gen lsa(B) kódující protein, který je z 41 %
identický s proteinem Lsa. Přenosem do citlivého S. aureus RN4220 bylo prokázáno, že tento protein
udílí rezistenci ke klindamycinu. Potenciální rezistence k streptograminům A nebyla v tomto případě
testována (77). Velká podobnost proteinu Lsa(B) s předpokládaným ABC transportérem z B. anthracis
(82% identita) naznačuje, že další příbuzné proteiny, které pravděpodobně udílejí rezistenci k MLS
antibiotikům, jsou obecně rozšířeny u grampozitivních baktérií.
Další protein, který snižuje citlivost k linkosamidům a streptograminům A byl charakterizován v
genomu Bacillus subtilis. Protein Vml(R) vykazuje 33% identitu s Vga(A). Exprese tohoto genu je
inducibilní a je pravděpodobně řízena předčasnou terminací transkripce v nepřítomnosti antibiotika
(126).
Velkou podskupinou ARE rodiny jsou ABC proteiny vyskytující se v biosynthetických shlucích
producentů MLS antibiotik (Tab. 3.3. (116)). Analýza aminokyselinových sekvencí těchto proteinů
odhalila překvapivou souvislost počtu aminokyselin mezi Walker A a B motivy v druhé ABC doméně a
26
LITERÁRNÍ ÚVOD
Mechanismy rezistence
substrátovou specifitou proteinu: u všech makrolidových transportérů je vzdálenost mezi oběma
konzervovanými Walker motivy konstantní (Tab. 3.3. (116)).
Tab. 3.3. Přehled ABC transportérů ARE rodiny z producentů antibiotik (převzato z (116))
Antibiotikum
Karbomycin
Spiramycin
Tylosin
Oleandomycin
Linkomycin
Frenolicin
Virginiamycin
Produkční organizmus
rodu Streptomyces
S. thermotolerans
S. ambofaciens
S. fradiae
S. antibioticus
S. lincolnensis
S. roseofulvus
S. viginiae
Protein
Car(A)
Srm(B)
Tlr(C)
Ole(B)
Lmr(C)
Fnr(D)
Var(M)
Průkaz
rezistence
ano
ano
ano
ano
ano
netestováno
netestováno
Vzdálenost mezi
Walker motivya
149/100
148/100
145/100
144/100
119/113
131/117
122/102
Reference
(166)
(166)
(152)
(128)
(135)
AF05832
(76)
a
Počet aminokyselin mezi konzervovaným lysinem ve Walker A motivu a kys. asparagovou v motivu Walker B u
obou domén oddělené lomítkem.
3.3.3. Jedná se skutečně o transport?
Rezistenční proteiny ARE rodiny ABC transportérů postrádají transmembránovou doménu, a
ačkoli u Vga(A) byla potvrzena membránová lokalizace (69), nebyl doposud identifikován žádný
interagující membránový protein. Nelze tedy vyloučit ani jiný mechanismus funkce, kterým tyto
proteiny udílejí rezistenci k MLS antibiotikům. Za důkaz aktivního effluxu erythromycinu proteinem
Msr(A) je považována snížená akumulace radioaktivně značeného antibiotika uvnitř rezistentních
buněk v porovnání s buňkami citlivými. Avšak tento zdánlivý efflux lze interpretovat i jiným způsobem.
Erythromycin vstupuje pasivní difúzí do buněk, kde se navázáním na ribozómy akumuluje (144).
Přidáním neznačeného antibiotika k buňkám saturovaným (C14)-erythromycinem, dochází ke
kompetici o vazebné místo a k uvolnění (C14)-erythromycinu, který difunduje po směru koncentračního
gradientu ven z buňky (144). Podobný efekt by mohl být způsoben také zabráněním vazby antibiotik
na ribozóm nebo aktivním odstraněním antibiotika z vazebného místa, což by mohly být alternativní
mechanismy funkce proteinů ARE rodiny (80, 144). Tuto hypotézu potvrzuje také fylogenetická
analýza ABC transportérů, podle níž tyto rezistenční proteiny spadají do stejné skupiny jako
eukaryotické ABC proteiny účastnící se kontroly iniciace translace a elongace (80). Navíc je velmi
zajímavá korelace specifity ARE rezistenčních proteinů s překrývajícími se vazebnými místy MLS
antibiotik, konkrétně specifita proteinů Msr(A), Msr(C) a Msr(D) k makrolidům a streptograminům B a
proteinů Vga, Lsa, Vml(R) k linkosamidům a streptograminům A.
Zda ARE proteiny interagují s membránovým proteinem a aktivně transportují antibiotika ven
z buňky, či zda zabraňují vazbě antibiotika na ribozóm (nebo jej z ribozómu odstraňují), zůstává
předmětem dalších výzkumů.
3.3.4. Regulace: atenuace translace nebo terminace transkripce?
U genů msr(A), msr(C), msr(D), vml(R), byla pozorována inducibilní exprese v závislosti na
přítomnosti indukujícího antibiotika – erythromycinu (u genů msr) nebo linkomycinu a virginiamycinu M
(u vml(R)) (10, 126, 145, 150). U některých dalších genů kódujících rezistenční ABC proteiny lze
identifikovat upstream sekvence vykazující některé rysy regulačních oblastí jiných rezistenčních genů.
27
LITERÁRNÍ ÚVOD
Mechanismy rezistence
Na základě strukturní podobnosti regulační oblasti genu msr(A) s regulační oblastí genu
MLSB rezistence erm(C) bylo předpovězeno, že inducibilní exprese je řízena mechanismem atenuace
translace (150), avšak toto tvrzení nebylo nikdy experimentálně potvrzeno. Regulační oblast msr(A)
(320 bp) obsahuje promotor, čtyři invertované repetice a dvě ribozomální vazebná místa. Jedno před
samotným genem msr(A) a druhé před sekvencí kódující osmiaminokyselinový peptid. Narušení
sekundární struktury regulační oblasti vede stejně jako v případě genů erm ke konstitutivní expresi
(145). Podobná kontrolní oblast se nachází u genu msr(C) z E. faecium (172). Regulační oblast genu
msr(D) obsahuje RBS předcházející sekvenci kódující šestiaminokyselinový peptid a sadu 4
invertovaných repetic,,avšak žádná z repetic nepřekrývá RBS. Navíc konsensus -10 a -35 sekvence
promotoru překrývají místo kódující domnělý kontrolní peptid, před kterým naopak žádný promotor
nalezen nebyl. Není tedy pravděpodobné, že by gen msr(D) byl regulován stejným mechanismem jako
msr(A) a msr(C) (145). Důvodem může být to, že je tento gen trasnkripčně spojen s upstream
lokalizovaným rezistenčním genem mef(E) (33). Struktura podobná erm(C) atenuátoru byla popsána
také před genem lsa(B) ze S. sciuri. Regulační oblast obsahuje dva čtecí rámce pro krátké peptidy (26
a 7 aminokyselin), první dvojice invertovaných repetic leží v sekvenci pro 26-aminokyselinový peptid.
Druhá sada IR částečně zasahuje do sekvence kódující kratší peptid a zahrnuje v sobě také RBS
(77).
U genu vml(R) byl prokázán odlišný mechanismus regulace inducibilní exprese, který je
založený na předčasné terminaci transkripce. Bylo zjištěno, že 225 nukleotidů dlouhá 5'
nepřepisovaná oblast genu vml(R) obsahuje několik invertovaných repetic, u nichž jedna tvoří ρnezávislý terminátor. Pokud není přítomno indukující antibiotikum, dochází k předčasnému ukončení
transkripce právě v místě tohoto terminátoru lokalizovaného před genem. V přítomnosti induktoru
dochází k částečnému pročtení tohoto terminátoru a transkripce může být ukončena až v místě
druhého ρ-nezávislého terminátoru umístěného za strukturním genem. Terminátor doprovází druhá
vlásenka, jejíž 3' konec je schopen se párovat s 5' koncem terminátoru a vytvářet tak alternativní
sekundární strukturu. Avšak delece této vlásenky nemá žádný vliv na regulaci exprese rezistence
(126). Přestože přesný mechanismus indukce rezistence není stále objasněn, na základě strukturní
podobnosti s regulačními oblastmi ostatních genů je možné, že by tento mechanismus indukce mohl
být pro tyto příbuzné geny společný.
28
LITERÁRNÍ ÚVOD
Frekvence MLS rezistencí
4. Frekvence MLS rezistencí u CoNS a klinický význam jednotlivých
rezistenčních mechanismů
4.1. Rezistence k makrolidům a linkosamidům
Dle různých studií se četnost rezistence k erythromycinu u CoNS pohybuje mezi 21,5 - 44 %
klinických izolátů citlivých k oxacilinu a mezi 66 - 72% u oxacilin rezistentních. Také četnost rezistence
ke klindamycinu je nižší u oxacilin citlivých izolátů (2,8 - 14 %) než u oxacilin rezistentních CoNS, kde
se poměr klindamycin rezistentních izolátů pohybuje v rozmezí 32,5 - 52,6 % (35, 156, 157).
U S. aureus je rezistence k makrolidům a linkosamidům v naprosté většině případů
způsobena přítomností genů erm(A) nebo erm(C) udílející konstitutivní nebo inducibilní MLSB
rezistenci. Rezistence MSB způsobená genem msr(A) nebo inaktivační rezistence geny mph(C) nebo
lnu(A) jsou u S. aureus vzácné (13, 50, 92, 93).
I u CoNS převládá MLSB rezistence, třebaže ostatní typy rezistence jsou přítomny častěji než
u S. aureus. Jednotlivé rezistenční mechanismy a jejich kombinace lze předpovědět diskovým
indukčním testem použitím ERY, LIN a CLI disku (Obr. 4.1.) (40, 123). Diskovou indukční metodou
byly první MSB rezistentní izoláty (rezistence k erythromycinu avšak citlivost ke klindamycinu; Obr.4.1.
- MSB) detekovány ještě před objasněním genetické podstaty této transportní rezistence. Mezi 78 ERY
rezistentními CoNS bylo nalezeno 11 kmenů (14 %) s tímto fenotypem (74). Četnost genu msr(A) se v
různých studiích pohybuje od 6 % u S. epidermidis, (103) až po 41 % u CoNS, (39). V naší studii (123)
gen msr(A) dokonce převažuje nad erm geny (53 % vs. 43 %). Fenotypově se však MSB rezistence
projevuje v daleko menší míře než je četnost genu msr(A) a to proto, že gen msr(A) bývá často
přítomen spolu s geny erm, které překrývají fenotypový projev MSB rezistence svým dominantním
fenotypem. Ve studii (93) byl gen msr(A) přítomen u 35 ze 150 izolátů, ale pouze u 19 z nich nebyl
detekován v přítomnosti erm genů. V naší studii byl msr(A) detekován spolu s erm geny u 16 z
celkového počtu 52 msr(A) pozitivních izolátů (123). MLSB rezistence u CoNS je způsobena geny
erm(C) a erm(A), gen erm(A) však bývá přítomen pouze v malém procentu erythromycin rezistentních
izolátů: 7,5 %, (39); 3 % (201); 4,8 %, (103). V některých studiích však byla četnost erm(A) o něco
vyšší: 27.2 % izolátů CoNS ve studii (92) a 18 % izolátů ve studii (93). Gen erm(B), typický pro
streptokoky a enterokoky, se u stafylokoků vyskytuje zejména u zvířecích izolátů, (39) u lidí byl
detekován pouze v ojedinělých případech (92, 93, 103). Inaktivační rezistence byla u stafylokoků
dlouhou dobu na okraji pozornosti, proto existuje pouze omezený počet studií dokumentující výskyt
genů lnu(A) (inaktivace linkomycinu) nebo mph(C) (inaktivace makrolidů) u stafylokoků. Ačkoli je
význam těchto rezistencí díky svému specifickému účinku na úzkou skupinu antibiotik spíše minoritní,
jejich četnost v některých populacích CoNS není zcela zanedbatelná. Ve studii (93) byl gen lnu(A)
(dříve linA) detekován pouze u 4,6 % stafylokoků rezistentních alespoň k jednomu MLS antibiotiku.
Avšak v naší studii (123) byl gen lnu(A) detekován ve 24 % všech izolátů CoNS rezistentních k
erythromycinu, linkomycinu nebo klindamycinu. Ve studii (98) se lnu(A) vyskytoval u 8 z 31 (29 %)
erythromycin
nebo
pirlimycin
(linkosamid)
rezistentních
CoNS
z
mastitidy
krav.
29
LITERÁRNÍ ÚVOD
Frekvence MLS rezistencí
Typ rezistence
ERY
LI
CL
cMLSB
(MSB + LSA)
Obr.
4.1
Předpověď
fenotypově
dominantních rezistenčních mechanismů a
jejich kombinací diskovým indukčním
testem
LIN, linkomycin; CLI, klindamycin; ERY,
erythromycin; cMLSB, konstitutivní rezistence k
makrolidům, linkosamidům a streptograminům;
iMLSB, inducibilní rezistence k makrolidům,
linkosamidům a streptograminům B; MSB,
rezistence k makrolidům a streptograminům B;
L rezistence k linkomycinu; LSA, rezistence k
linkosamidům a streptograminu A.
iMLSB
MSB
L
LSA
iMLSB + L
MSB + L
Gen mph(C) byl poprvé detekován u stafylokoků na plazmidu pMS97 v těsné blízkosti upstream
lokalizovaného genu msr(A) (108). Tyto geny byly nalezeny v těsném sousedství také v mnoha
dalších studií u klinických izolátů ((45, 179) nebo u zvířecích izolátů (98, 165). V klinické studii z
Německa byl gen mph(C) detekován u 37,9 % erythromycin rezistentních kmenů, vždy v kombinaci
buď s genem msr(A) (24,5 %) či erm(C) (12 %) (45).
CoNS jsou většinou hodnoceny jako homogenní skupina nehledě na druhovou skladbu, jež
může být ovlivněna parametry výběru studovaného souboru: výběr rezistentních kmenů, klinická
relevance izolátů, typ klinického vzorku atd. Druhové zastoupení pak může ovlivnit četnosti
rezistenčních genů. Tak například MSB rezistence bývá nejčastěji detekována u druhů S.
haemolyticus, S. hominis nebo u S. cohnii (39, 45, 74, 93, 123). Podrobnější studie zabývající se
rezistenčními charakteristikami jednotlivých druhů však chybí.
30
LITERÁRNÍ ÚVOD
Frekvence MLS rezistencí
4.2. Inducibilní rezistence
Stafylokokové izoláty s inducibilním genem erm(A) nebo erm(C) jsou rezistentní k 14-členným
(klarithromycin, dirithromycin, erythromycin a roxithromycin) a 15-členným (azithromycin) makrolidům,
které jsou účinnými induktory. Naopak, neindukující ketolidy (telithromycin), 16-členné makrolidy
(josamycin, midecamycin, miocamycin, rokitamycin, spiramycin a tylosin), linkosamidy (linkomycin,
klindamycin, pirlimycin) a streptograminy B (pristinamycin IA a quinupristin) zůstávají aktivní. cMLSB
rezistence se vyvinula z iMLSB rezistence v důsledku selekčního tlaku neindukujících antibiotik. U
klinických izolátů CoNS se výskyt konstitutivní MLSB rezistence pohybuje mezi 25 a 41 %
erythromycin rezistentních kmenů (41, 45, 50, 93, 167). Přestože byla několikrát prokázána selekce
spontánních konstitutivních mutant in vivo během léčby klindamycinem, není úplně jasné, zda léčba
inducibilní rezistence neindukujícím antibiotikem představuje skutečné riziko. Existuje pouze několik
popsaných případů klinického selhání při léčbě infekcí způsobených inducibilně rezistentními kmeny
neindukujícím antibiotikem. Nicméně i přes úspěšnou léčbu takovýchto infekcí neindukujícím
antibiotikem je vytvářen nežádoucí tlak na selekci konstitutivních mutant. V roce 2004 byl diskový
indukční test doporučen laboratoří CSLI (Clinical Standard Laboratory Institute) pro detekci iMLSB
rezistence u stafylokoků. Izoláty vykazující inducibilní rezistenci ke klindamycinu jsou dle doporučení
CSLI interpretovány jako rezistentní (121). Tatáž interpretace platí také pro ostatní neindukující
antibiotika.
4.3. Rezistence ke streptograminům
Díky synergistickému účinku streptograminu A a B, vyžaduje rezistence k jejich kombinaci u
stafylokoků získání rezistence ke SgA avšak ne nezbytně získání rezistence ke SgB (3, 56).
Přítomnost obou typů rezistencí v jednom izolátu však nemusí vždy znamenat rezistenci ke kombinaci
(50, 93). Také in vivo selekce izolátů rezistentních ke quinupristinu-dalfopristinu (QD) v
experimentálním modelu králičí endokarditidy souvisela se selekcí rezistence k jednotlivým
komponentám (204). Do nedávné doby byl ze streptograminů v klinické praxi používán pouze
pristinamycin (kombinace pristinamycinu IIA a pristinamycinu IA), který byl dlouhá léta používán pro
kontrolu stafylokokových infekcí ve francouzských nemocnicích. Studie týkající se rozšíření Sg
rezistence u stafylokoků se tedy omezovaly pouze na tuto zemi, kde se četnost rezistence k
pristinamycinu v jednotlivých nemocnicích pohybuje mezi 0 - 44 % (56). Dvě studie sledovaly
zastoupení genů streptograminové rezistence u většího souboru SgA rezistentních izolátů (3, 56).
První studie zahrnuje 126 klinických izolátů stafylokoků izolovaných ve francouzských nemocnicích v
letech 1975-1993, z nichž 36 S. aureus a 20 CoNS izolátů bylo rezistentních k pristinamycinu IIA
(SgA) (3). V té době nebyly známy některé rezistenční geny, a tak informace o jejich výskytu v tomto
souboru byly postupně doplněny (5, 55). U PIIA rezistentních izolátů S. aureus byla nejpočetnější
trojkombinace genů vat(B), vga(B) a vga(A)v, která se vyskytovala u 20 z 36 izolátů (62,5 %). Všechny
izoláty s touto kombinací tří SgA rezistenčních genů byly rezistentní k pristinamycinu nehledě na
rezistenci k SgB, která nebyla přítomna u 8 izolátů citlivých také k makrolidům. Druhým nejčastějším
genem byl gen vga(A), který se nacházel u 8 izolátů (25 %). U šesti z nich byl vga(A) přítomen spolu s
31
LITERÁRNÍ ÚVOD
Frekvence MLS rezistencí
dvojkombinací SgA a SgB rezistenčních genů vat(A) a vgb(A). Tyto izoláty byly rezistentní k SgA, SgB
a také k jejich kombinaci.
U PIIA rezistentních CoNS byl nejpočetnějším genem vga(A), který se nacházel téměř u všech
(95 %) izolátů. U čtyřech z nich byl přítomen s dvojkombinací vat(A) a vgb(A). Jediný izolát bez genu
vga(A) obsahoval dvojkombinaci vat(B), vga(B) a byl rezistentní k MLSB antibiotikům a pristinamycinu.
Trojkombinace genů vga(A), vat(A) a vgb(A) udílela rezistenci k pristinamycinu nezávisle na
přítomnosti cMLSB rezistence. Gen vga(A) udílel vyšší hladiny rezistence k pristinamycinu (MIC = 2-8
mg/l) pouze u izolátů současně rezistentních k MLSB antibiotikům.
Druhá studie zahrnuje 62 klinických PIIA rezistentních izolátů S. aureus z francouzských
nemocnic izolovaných v letech 1981-2000 (56). V této druhé studii, která neobsahuje CoNS, se gen
vga(A) vyskytoval pouze u jednoho izolátu, který byl rezistentní k pristinamycinu. Tento izolát byl
současně konstitutivně MLSB rezistentní. Nejpočetnějším byl gen vga(A)v, který byl nalezen u 37
izolátů (59,7 %), u 15 z nich byl přítomen spolu s geny vat(A) a vga(B). Pokud byl vga(A)v přítomen
sám, záleželo na přítomnosti cMLSB rezistence, zda byly tyto izoláty rezistentní také k pristinamycinu.
Všechny vga(A)v pozitivní izoláty až na jeden byly rezistentní také k linkomycinu. Druhou
nejpočetnější byla dvojkombinace genů vat(A) a vgb(A) přítomna u 26 izolátů (42 %) a udílející
rezistenci ke streptograminové kombinaci nehledě na přítomnost cMLSB rezistence. Souhrnný přehled
častých kombinací genů streptograminové rezistence a jejich schopnost udílet rezistenci k
pristinamycinu v závislosti na citlivosti k MLSB antibitokům je uveden v tabulce 4.1.
Tab. 4.1. Přehled častých kombinací Sg rezistenčních genů a schopnost udílet rezistenci k pristinamycinu
v závisloti na citlivosti k MLSB antibiotikům
a
Zjištěný genotyp
Na pozadí fenotypu
Rezistence k
V
Gen nebo
Druh
Citace
pristinamycinu
Mechanismus kombinaci
kombinace
cMLSB LIN SgA SgB
(MIC mg/l)
rezistence
s dalším
genů
genem
S.
+
+
+
+ (16)
(3, 56)
epidemidis
vat(B),
inaktivace SgA
vga(B)
a efflux SgA
vga(A)v
+
+
+
+
+ (8-32)
(3, 56)
S. aureus
vga(A)v
+
+
+ (2-4)
(3, 56)
S. aureus
vat(A),
vgb(A)
inaktivace SgA
a inaktivace
SgB
+
+
+
+
-
+
+
+
S. aureus
(3, 56)
(56)
S. aureus
S. aureus,
vga(A)
+/+
+
+ (8-32)
(3)
CoNS
+
+
(1-2)
CoNS
(3)
vga(A)
efflux SgA
S. aureus,
+
+
+
+ (4)
(3)
CoNS
+
+
+
+
+
(56)
S.aureus
vga(A)v
efflux SgA
+
+
(56)
S.aureus
a Přítomnost rezistence je značena plusem; cMLSB, konstitutivní rezistence k makrolidům linkosamidům a
streptograminům B; LIN, rezistence k linkomycinu; SgA, rezistence ke streptograminu A; SgB, rezistence ke
streptograminu B
Teprve až po zavedení quinupristin/dalfopristinu do klinické praxe je streptograminová
rezistence sledována celosvětově. Dle různých surveillančních studií je výskyt Q/D rezistentních
izolátů prozatím velmi nízký (0-5 %, viz. kap. 1 literárního úvodu). Ve studii z Kanady (75) se mezi 658
32
LITERÁRNÍ ÚVOD
Frekvence MLS rezistencí
klinickými izoláty CoNS rezistence ke Q/D vyskytovala u 15 izolátů (2,3 %). Z toho bylo 9 izolátů
identifikováno jako S. cohnii. V jiné studii byly u tohoto druhu identifikovány dva nové rezistenční geny
vat(C) a vgb(B), které nebyly doposud nalezeny v izolátech jiných druhů (6). Je tedy možné že za
tento nezvykle vysoký výskyt Q/D rezistentních izolátů je zodpovědná tato, pravděpodobně druhově
specifická, dvojice rezistenčních genů. V Koreji byla rezistence ke quinupristinu/dalfopristinu nalezena
častěji u klinických izolátů S. aureus (26 %) než u izolátů CoNS 9,1 % (92). Naopak v Řecku nebyla
rezistence ke Q/D nelezena u žádného z 350 izolátů S. aureus avšak mezi 500 izoláty CoNS bylo
nalezeno 10 izolátů S. hominis rezistentních k nízkým hladinám Q/D (MIC=1-3 mg/l). U všech těchto
QD rezistentních izolátů byl nalezen gen vga(A) spolu s konstitutivně exprimovaným genem erm(A)
(136).
4.4. Mobilní elementy nesoucí MLS rezistenční geny
Gen erm(C) byl poprvé popsán na 3,7 kb velkém plazmidu pE194 (63). Častěji je však gen
kódován na plazmidu o velikosti cca 2,5 kb nebo jeho kratších konstitutivních variant (185, 201).
Prototypem plazmidu této velikosti je plazmid pNE131, který byl poprvé popsán u S. epidermidis. Oba
tyto typy plazmidů jsou řazeny mezi malé nekonjugativní, mnohakopiové plazmidy replikující se
mechanismem valivé kružnice (RC plazmidy), které mohou být přenášeny mobilizací se spolu
přítomnými konjugativními plazmidy (89). Strukturně podobné plazmidy byly popsány také u
stafylokoků zvířecího původu, což naznačuje jejich všeobecné rozšíření a také možný přenos
rezistence mezi lidskými a zvířecími izoláty (96).
Gen erm(A) je asociován s transpozonem Tn554 (6,7 kb), který současně nese rezistenci ke
spektinomycinu (17, 120). Primární inzerční místo, att554, bylo lokalizováno ve specifické oblasti na
chromozómu (84), byly však detekovány i kmeny se dvěma (S. aureus) a více (u CoNS) inzerty (185,
186). Transpozon Tn554 může být lokalizován také na konjugativních plazmidech (187) a je také
součástí chromozomální kazety methicilinové rezistence typu II (71).
Gen msr(A) byl lokalizován buď na velkých (20 - 30 kb) plazmidech (107, 110, 111, 150) u S.
epidermidis a S. aureus, nebo na chromozómu u S. hominis (148). U S. haemolyticus JCSC1435 je
gen msr(A) součástí plazmidu integrovaného do chromozómu (179).
Gen lnu(A) je obvykle nesen na malých (2,3 - 4 kb) plazmidech replikujících se mechanismem
valivé kružnice (RC plazmidy) (26, 27, 99). Devět různých, avšak příbuzných plazmidů bylo popsáno v
izolátech CoNS z klinické mastitidy krav (99). Devět vysoce podobných lnu(A) genů (92,8 - 100 %
identity) je obklopeno přímými repeticemi, které tvoří kazetu. Ta je pravděpodobně volně přenositelná
mezi různými plazmidy rodiny pC194. To vysvětluje, proč jsou tyto velmi příbuzné geny neseny na
plazmidech s rep geny, které navzájem vykazují 47,9 až 100 % identity. Stejné přímé repetice byly
nalezeny i na stafylokokových plazmidech nesoucí jiné rezistenční geny (20, 21, 23).
33
III.VÝSLEDKY
34
VÝSLEDKY
Makrolidová a linkosamidová rezistence v ČR
1. Rozšíření mechanismů rezistence k makrolidům a linkosamidům u methicilin
rezistentních koaguláza negativních stafylokoků v České republice a výskyt
neznámého mechanismu rezistence k linkosamidům
Cíle: Cílem práce bylo analyzovat rozšíření mechanismů rezistence k makrolidům a
linkosamidům u klinických izolátů methicilin rezistentních koaguláza negativních stafylokoků (CoNS)
izolovaných v České republice.
Metody: Celkem 919 klinických izolátů CoNS bylo shromážděno během roku 1996 v sedmi
českých nemocnicích a zasláno do Státního zdravotního ústavu, kde byly izoláty druhově
identifikovány. Citlivost k antibiotikům byla testována diskovou difúzní metodou (DDM) a diskovým
indukčním testem. Přítomnost rezistenčních genů erm(A), erm(C), msr(A), lnu(A)/lnu(A)' byla
testována Southern blot hybridizací EcoRI štěpené celkové DNA se specifickými sondami značenými
digoxigeninem. Izoláty S. haemolyticus pozitivní na gen msr(A) byly genotypizovány pulzní gelovou
elektroforézou (PFGE) SmaI restrikčních fragmentů.
Výsledky: Z celkového počtu bylo 98 izolátů (S. haemolyticus n=62, S. epidermidis n=27, S.
hominis n=5, S. capitis n=3, S. warnerii n=1) současně rezistentních k oxacilinu a alespoň k jednomu z
následujících antibiotik: erythromycin, linkomycin a klindamycin. Přestože rezistence k makrolidům a
linkosamidům bývá často zkřížená, více jak polovina z 98 izolátů zůstala, dokonce i za indukčních
podmínek, citlivá alespoň k jednomu z testovaných antibiotik. Tomu odpovídaly i výsledky genetické
analýzy, jež potvrdily vysoký výskyt rezistenčních genů msr(A) (53 %) a lnu(A) 30 % udílejících
rezistenci pouze k některým MLS antibiotikům. Neobvyklá byla také přítomnost více genů v jednom
izolátu. Obvzláště kombinace genů msr(A) a lnu(A), která částečně fenotypově napodobuje přítomnost
genů erm, byla frekventovaná. Distribuce rezistenčních genů byla druhově specifická. Vysoký výskyt
genu msr(A) byl typický pro S. haemolyticus (u 43 z 62 izolátů) zatímco u izolátů S. epidermidis
převládala přítomnost genů erm (u 16 z 27 izolátů). msr(A) pozitivní izoláty S. haemolyticus tvořily
poměrně heterogenní skupinu co se týče místa izolace, rezistenčního genotypu a msr(A)
hybridizačních profilů. Heterogenita izolátů, která byla potvrzena také PFGE genotypizací, vylučuje
klonální šíření této rezistence během outbreaku. Zcela nový rezistenční fenotyp (citlivost k
erythromycinu a rezistence k oběma linkosamidům), který byl pozorován u deseti klonálně příbuzných
izolátů S. haemolyticus, u nichž nebyl detekován žádný z testovaných rezistenčních genů, nasvědčuje
přítomnosti nového rezistenčního mechanismu.
35
VÝSLEDKY
Nový rezistenční protein Vga(A)LC
2.
Nová
varianta
proteinu
streptograminové
rezistence,
Vga(A)LC,
ze
Staphylococcus haemolyticus se změnou substrátové specifity směrem k
linkosamidům
Cíle: Otestovat potenciální mechanismy nové rezistence k linkosamidům u klinických izolátů
S. haemolyticus rezistentních k oběma linkosamidům avšak citlivých k erythromycinu, u kterých nebyl
nalezen žádný odpovídající rezistenční gen, a určit genetickou podstatu této rezistence.
Metody: Přítomnost mutací ve vazebném místě linkosamidů byla testována PCR amplifikací a
sekvenací relevantních úseků na 23S rRNA. Inaktivace linkomycinu byla testována použitím citlivého
mikroorganismu. Proteiny příbuzné ABC rezistenčním proteinům byly vyhledávány použitím
degenerovaných PCR primerů navržených podle konzervovaných úseků této rodiny proteinů.
Souvislost nalezených sekvencí s rezistenčním fenotypem byla prokázána hybridizací s DNA
rezistentních a citlivých izolátů. Konstrukty kódující Vga proteiny a jejich hybridní varianty byly
transformovány do citlivého S. aureus RN4220, kde byla porovnávána schopnost udílet rezistenci k
linkosamidům a streptograminům. Minimální inhibiční koncentrace antibiotik byly stanoveny agarovou
diluční metodou. Radioaktivně značený linkomycin byl připraven enzymaticky s využitím proteinu
LmbJ katalyzujícím methylaci N-demethyllinkomycinu v závěrečném kroku biosyntézy linkomycinu.
Akumulace [3H]-linkomycinu v buňkách byla měřena scintilačně.
Výsledky: Experimentálně byla vyloučena chromozomální a inaktivační rezistence.
Degenerovanými PCR primery byl nalezen a osekvenován kandidátní gen vga(A)LC kódující ABC
protein, jenž se od proteinu Vga(A), udílející rezistenci ke streptograminům A, liší pouze sedmi
aminokyselinovými záměnami. Tento gen byl přítomen pouze v izolátech rezistentních k oběma
linkosamidům a streptograminu A. Porovnáním obou proteinů v hostiteli citlivém k antibiotikům byl
prokázán rozdíl ve schopnosti udílet rezistenci k linkosamidům. Vliv aminokyselinových záměn na
substrátovou specifitu proteinů Vga(A) a Vga(A)LC byl dále testován. Mutační analýzou byl
identifikován shluk čtyř aminokyselin v centrální části proteinu zodpovědný za rozdílný fenotypový
projev. Měřením akumulace [3H]-linkomycinu bylo prokázáno, že mechanismus linkosamidové
rezistence u S. haemolyticus je identický s mechanismem popsaným u rezistenčního proteinu Msr(A),
udílející rezistenci vůči makrolidům a streptograminům............................................................................
36
VÝSLEDKY
Účinnost telithromycinu a quinupristinu/dalfopristinu
3. In vitro účinnost telithromycinu a quinupristinu/dalfopristinu proti methicilin
rezistentním koaguláza negativním stafylokokům s definovaným rezistenčním
genotypem
Cíle: Otestovat účinnost nově zavedených antibiotik telithromycinu (TEL, ketolid) a
quinupristinu/dalfopristinu (Q/D, streptograminy) proti dříve charakterizovaným klinickým izolátům
methicilin rezistentních koaguláza negativních stafylokoků se zřetelem na specifický výskyt jinde spíše
minoritních rezistenčních mechanismů, jejich kombinací a obzvláště pak se zřetelem na přítomnost
nového rezistenčního genu vga(A)LC udílejícího rezistenci k linkosamidům a streptograminu A u S.
haemolyticus (124).
Metody: V této studii bylo zahrnuto 88 klinických izolátů koaguláza negativních stafylokoků
pocházejících ze sbírky fenotypově a geneticky charakterizovaných izolátů rezistentních k makrolidům
a/nebo linkosamidům (123). Citlivost k TEL a QD byla testována diskovou difúzní metodou (DDM) a
indukčním diskovým testem s použitím erythromycinu jako induktoru. Rezistence k TEL za indukčních
podmínek byla testována DDM v přítomnosti subinhibičních koncentrací erythromycinu v médiu.
Minimální inhibiční koncentrace (MIC) pro Q/D byly stanoveny E testem a MIC pro PIIA agarovou
diluční metodou. Citlivosti k antibiotikům byly vyhodnocovány dle kritérií CSLI (31). Přítomnost
rezistenčních genů mph(C) a vga(A)/vga(A)LC byla detekována PCR amplifikací ze specifických
primerů. Totožnost vga(A) varianty byla ověřena osekvenováním PCR produktu.
Výsledky: Citlivost k telithromycinu u testovaného souboru byla ovlivněna stejnými
rezistenčními mechanismy jako rezistence k erythromycinu. TEL byl plně aktivní pouze proti všem 15
erythromycin senzitivním izolátům a naopak všech 73 erythromycin rezistentních izolátů bylo buď
konstitutivně rezistentních k TEL (13 izolátů s konstitutivním genem erm), nebo u nich byla
detekována deformovaná inhibiční zóna znamenající indukci rezistence (u 25 izolátů s inducibilním
genem erm a u 35 izolátů s genem msr(A)). Nicméně, úroveň rezistence k TEL udílená genem msr(A)
byla i za indukčních podmínek hraniční. Inaktivační gen mph(C) byl nalezen u všech 21 testovaných
izolátů (16 S. haemolyticus a 5 S. epidermidis) v sousedství genu msr(A).
Pokud byla pro testování citlivosti ke Q/D použita DDM, nebyl detekován žádný rezistentní
izolát. Avšak pokud byl pro testování použit E test, 18 izolátů bylo intermediárně rezistentních (MIC =
1-3 mg/l) ke Q/D a dva byly dokonce rezistentní (MIC = 8 mg/l). Všechny tyto izoláty byly současně
rezistentní ke streptograminu A a obsahovaly geny vga(A) (1 izolát) nebo gen vga(A)LC (19 izolátů).
MIC pro Q/D byla vyšší (3-8 mg/l) u izolátů rezistentních současně ke streptograminu B než u izolátů k
tomuto antibiotiku citlivých (MIC = 0,5-2 mg/l). Kromě S. haemolyticus byl gen vga(A)LC nalezen u S.
epidermidis a S. warnerii, což naznačuje jeho rozšíření.
Q/D byl účinnější než TEL díky synergistickému účinku Q/D, který byl zachován i přes získání
rezistence k jedné složce streptograminu, a také díky nízkému výskytu rezistence ke streptograminu
A. Nesprávná identifikace izolátů rezistentních k nízkým koncentracím Q/D může přispět k šíření
rezistence ke streptograminu A.
37
VÝSLEDKY
Analýza okolí genu msr(A)
4. Sekvenční analýza okolí rezistenčního genu msr(A) u S. haemolyticus (data
pro připravovanou publikaci)
V publikaci (123) jsme charakterizovali zastoupení mechanismů rezistence k makrolidům a
linkosamidům u klinických izolátů methicilin rezistentních CoNS izolovaných v českých nemocnicích
během roku 1996. Soubor studovaných izolátů byl vybrán na základě zkřížené rezistence alespoň k
jednomu z následujících antibiotik: erythromycin, linkomycin a klindamycin. V souboru byla nalezena
velmi neobvyklá převaha jinde spíše minoritních genů msr(A) a lnu(A). Neobvyklá byla také častá
přítomnost více genů v jednom izolátu. Jedním z faktorů ovlivňujícím toto v porovnání s jinými studiemi
netypické rozložení rezistenčních genů může být převaha izolátů S. haemolyticus (63 % všech
izolátů). S. haemolyticus je velmi často mnohočetně rezistentní k antibiotikům a má vyšší podíl
methicilin rezistentních izolátů v porovnání s obvykle dominantním S. epidermidis. Mimoto byla u
tohoto druhu pozorována vyšší četnost MSB rezistence udílené genem msr(A) (45, 74, 93, 123).
Selekce methicilin rezistentních izolátů, současně rezistentních alespoň k jednomu z testovaných MLS
antibiotik, je tedy nejspíš důvodem převahy S. haemolyticus a současně také genu msr(A) v našem
souboru. Nicméně i mezi izoláty ostatních druhů byla četnost msr(A) vyšší než bývá uváděno v
literatuře.
Gen msr(A) byl přítomen u 43 z 62 izolátů S. haemolyticus (69 %) tvořících velmi heterogenní
skupinu co se týče velikostí EcoRI fragmentů hybridizujících se sondou specifickou pro msr(A) a počtu
různých genotypů pozorovaných PFGE analýzou SmaI restrikčních fragmentů (123). Tato pozorování
vylučují klonální rozšíření izolátů s genem msr(A) během outbreaku a jsou nejspíš důsledkem
horizontálního šíření genu msr(A) mezi izoláty S. haemolyticus. Cílem této práce bylo lokalizovat a
identifikovat mobilní element(y) nesoucí gen msr(A) a objasnit tak příčinu neobvykle velkého rozšíření
tohoto genu u S. haemolyticus v České republice a také příčinu diverzity msr(A) hybridizačních profilů.
Gen msr(A) je většinou kódován chromozomálně
Hybridizací neštěpené celkové DNA a plazmidové DNA se sondou specifickou pro gen msr(A)
jsme zjistili, že rezistenční gen je s výjimkou dvou izolátů kódován chromozomálně. Southern blot
analýza SmaI štěpené genomické DNA dělené pulzní gelovou elektroforézou ukázala, že gen je ve
všech případech lokalizován na stejném fragmentu o velikosti přibližně 35 kb (Obr. 5.1.). Pouze u
dvou izolátů byl gen msr(A) nalezen na velkém plazmidu.
Okolí chromozomálně lokalizovaného genu msr(A) u KM45
Pro sekvenční analýzu okolí chromozomálně kódovaného genu msr(A) jsme vybrali kmen
KM45, který zastupuje nejpočetnější hybridizační profil, kdy msr(A) sonda hybridizuje s EcoRI
fragmentem o velikosti 5 kb. Kraje ClaI restrikčního fragmentu obsahujícího gen msr(A) byly po
vložení do vektoru pBluescript II SK+ sekvenovány z univerzálních vektorových primerů. Sekvence
obou konců byly identické s chromozomální sekvencí kmene S. haemolyticus JCSC1435 (mezi
nukleotidy 2333473-2338226) jehož genom byl nedávno osekvenován (přístupové č. AP006716).
Tento úsek je součástí plazmidu πSh1 integrovaného v chromozómu JCSC1435 (lokusy SH2296 -
38
VÝSLEDKY
Analýza okolí genu msr(A)
SH2326) (179). Identické uspořádání genů v celé oblasti odpovídající plazmidu πSh1 a také jeho
umístění v genomu bylo pro kmen KM45 potvrzeno PCR mapováním (Obr. 5.2.B). V této oblasti (22
kb) se nachází 30 otevřených čtecích rámců (ORF), mezi nimiž lze identifikovat 10 genů se známou
nebo hypotetickou funkcí (Obr. 5.2.A.):
Geny smp a stp kódující předpokládanou hydrofobní transmembránovou doménu a ATP
vazebný protein jsou lokalizovány těsně před genem msr(A). Umístění těchto genů v sousedství
msr(A) bylo popsáno na plazmidech z S. aureus a S. epidermidis nebo na chromozómu u S. hominis
(110, 148). Původně se předpokládalo, že produkty těchto genů, jejichž homology (85 % a 65 %
identity) byly nalezeny i u citlivého S. aureus RN4220, interagují s Msr(A) a tvoří tak funkční
transportní systém. Inaktivace těchto genů v S. aureus RN4220 však neměla vliv na schopnost msr(A)
udílet rezistenci v tomto hostiteli (149).
1
2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16
1
2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16
48.5 kb
23.1 kb
Obr. 5.1. PFGE SmaI restrikčních profilů a hybridizace se sondou specifickou
pro gen msr(A).
Dráhy 1a 16 Low range PFG marker, dráhy 2, 9 a 15 CCM7296 negativní kontrola,
dráha 14 izolát bez msr(A), dráhy 3-8 a 10,11 a13 izoláty s msr(A) na chromozómu,
dráha 12 izolát s msr(A) na plazmidu
Těsně za genem msr(A) je lokalizován rezistenční gen mph(C) kódující enzym inaktivující
makrolidy. Tato fosfotransferasa MPH(2')II je totožná s Mph(C) kódovanou na plazmidu pSR1
(AF167161), kde se nachází stejně jako u JCSC1435 v těsném sousedství genu msr(A), a je téměř
identická (jedna aminokyselinová záměna) s fosfotransferasou ze Stenotrophomonas maltophilia (9).
Kromě plazmidu pSR1, kde jsou geny msr(A) a mph(C) odděleny 97bp dlouhou nekódující oblastí, se
tato dvojice sousedících genů nachází také na plazmidu pMS97 z S. aureus. V tomto případě oba dva
geny odděluje nekódující oblast o velikosti 341bp (108). Proteinové produkty genů msr(A) a mph(C)
se od proteinů z S. haemolyticus JCSC1435 liší 7 a 4 aminokyselinami (98% identita).
Geny binR a sin lokalizované downstream od dvojice msr(A)-mph(C) kódují stafylokokovou
resolvasu a rekombinasu, obě z velké rodiny serinových rekombinas, jež jsou důležité pro horizontální
přenos u grampozitivních baktérií. Geny binR a sin jsou mezi stafylokoky hojně rozšířeny a často jsou
asociovány s transpozonem Tn552 nesoucí geny pro ß-laktamasu a s geny rezistence ke kvartérním
amoniovým sloučeninám (131, 132, 154, 171).
39
VÝSLEDKY
Analýza okolí genu msr(A)
Na 3´konci plazmidu πSh1 se nacházejí gen kadmiové rezistence cadD, jeho regulátor cadX a
inzerční sekvence IS431 (nebo IS257) kódující transposasu.
Na 5´konci integrovaného plazmidu je gen (lokus SH2296) pro replikační protein RC rodiny
(rolling circle) plazmidů, které bývají často integrovány ve velkých konjugativních plazmidech (18).
První polovina rep genu je zkrácena 147bp dlouhou sekvencí, jež je vysoce homologní s ISLE39
(insertion sequence like element) z S. aureus SH39 (95% identita) (2) a z S. epidermidis RP62A (94%
identita). Tento element má, podobně jako inzerční sekvence (IS), na obou koncích invertované
repetice (IR) avšak na rozdíl od IS nekódují žádnou transposasu. Nepřesná převrácená kopie ISLE39
se nalézá na témže integrovaném plazmidu mezi lokusy SH2321 a SH2322. Oba elementy mají 21bp
dlouhé IR jejichž část (16bp) je totožná s IR inzerční sekvence IS431. ISLE elementy, jež byly
nalezeny v různých stafylokokových izolátech by mohly být pozůstatky inzerčních sekvencí avšak není
také vyloučeno, že se tyto elementy můžou účastnit mobilizace sekvencí, jež obklopují (22).
Okolí genu msr(A) u izolátů s jiným msr(A) hybridizačním profilem
Přestože bylo prokázáno, že gen msr(A) je u všech izolátů nesen na chromozómu ve stejném
místě, msr(A) specifická sonda hybridizovala s různými velikostmi EcoRI fragmentů DNA 43 msr(A)pozitivních izolátů (123). Abychom zjistili, co je důvodem této diverzity, vybrali jsme 14 izolátů lišících
se svým EcoRI hybridizačním a PFGE profilem (Tab. 5.1.). Tyto izoláty byly podobně jako KM45
podrobeny PCR mapování. Produkty amplifikace, které se svou velikostí lišily od velikosti
předpovězené ze sekvence S. haemolyticus JCSC1435, byly sekvenovány. Mezi izoláty bylo nalezeno
několik rozdílů v uspořádání oblasti, která je jinak vysoce homologní s plazmidem πSh1 (Obr. 5.2.C).
Tab. 5.1. Výběr izolátů pro PCR mapování okolí genu msr(A) a PCR produkty lišící se od JCSC1435
Izolát
Původní
označení
a
izolátu
KM45
1032UL
KM71
KM49
KM33
KM30
SmaI restrikční
profil
Detekované rezistenční geny
Velikost EcoRI
fragmentu
hybridizujícího s msr(A)
b
sondou
PCR produkty lišící se
od JCSC1435 (kb)
B2
msr(A), lnu(A)
5 kb
33OL
A2
msr(A), erm(C)
7,7 kb
mph(C)-sin (1,4)
1065UL
A3
msr(A), erm(C), lnu(A)
4,7 kb
mph(C)-sin (3,8)
78BB
A5
msr(A), lnu(A), vga(A)LC
5 kb
argS-isle39 (2,8)
65OL
A5
erm(C), msr(A), vga(A)LC
5 kb
argS-isle39 (2,8)
KM57
141KV
B5
msr(A), lnu(A)
5 kb
KM36
111KR
C
msr(A)
11 kb
KM89
155OL
D
msr(A)
7,2 kb
binR-EcoRI (3,8)
KM78
88OL
F
msr(A)
3,5 kb
plazmid
KM35
103OL
I
msr(A)
7,2 kb
binR-EcoRI (3,8)
KM2
131UL
L1
msr(A), erm(C)
7,2 kb
binR-EcoRI (3,8)
KM37
15OL
L2
msr(A), lnu(A)
7,2 kb
binR-EcoRI (3,8)
KM27
32UL
nd
msr(A), lnu(A), vga(A)LC
5 kb
argS-isle39 (2,8)
KM38
33KR
T2
msr(A)
7,2 kb
binR-EcoRI (3,8)
KM50
1079UL
U
msr(A)
7,2 kb
binR-EcoRI (3,8)
KM88
14KR
X
msr(A)
3,5 kb
plazmid
KM68
233OL
Y
msr(A)
5 kb
c
c
mph(C)-sin (3,8)
a
Zkratka označuje město, v němž byl klinický izolát získán: BB - Brno, KR - Praha, KV - Praha, OL - Olomouc, UL
- Ústí nad Labem
b
Velikosti fragmentů byly stanoveny pomocí programu AIDA (Advanced Image Data Analyzer, v.3.28)
c
Tyto PCR produkty se od JCSC1435 nelišily svojí velikostí, ale nukleotidovou sekvencí
40
VÝSLEDKY
Analýza okolí genu msr(A)
41
VÝSLEDKY
Analýza okolí genu msr(A)
Amplifikace s použitím primerů 13F a 14R (Obr. 5.2.) velmi dobře odrážela pozorované
hybridizační typy. Zatímco u kmenů s msr(A) hybridizujícím EcoRI fragmentem o velikosti 5 kb byl
amplifikován produkt o velikosti 1,4 kb, což odpovídá sekvenci S. haemolyticus JCSC1435, u kmenů s
msr(A) hybridizujícím EcoRI fragmentem o velikosti 7,2 kb byl amplifikován PCR produkt o velikosti
3,8 kb (Tab. 5.1.). Sekvenací produktů izolátů KM2 a KM50 jsme zjistili inzerci levé poloviny
transpozonu Tn552 (binL-tnpA-tnpB-TIRL), který se vložil downstream od genu sin namísto genu binR
(Obr. 5.2.C). Tímto vložením došlo k rekonstrukci plazmidu Tn5404.
Použitím stejné dvojice primerů však nedošlo k žádné amplifikaci u izolátů KM49 (4,7kb EcoRI
fragment), KM71 (7,7kb EcoRI fragment) a KM36 (15kb EcoRI fragment). Odpovídající DNA úseky
jsme u těchto izolátů s úspěchem amplifikovali použitím dvojice primerů 9F a 15R, specifických pro
geny mph(C) a sin (Obr. 5.2.). Velikost PCR produktů pro izoláty KM49, KM36 byla stejná (3,8 kb) jako
pro JCSC1435. Sekvenací obou produktů jsme zjistili stejné uspořádání genů mph(C), binR a sin jako
u JCSC1435, avšak oba PCR produkty se lišily v nukleotidových sekvencích genů binR a sin, včetně
jejich okolí (Obr. 5.3.). Velikost PCR produktu z kmene KM71 byla pouze 1,6kb a sekvence ukázala
absenci pravé části transpozonu Tn5404 a genu binR. Touto delecí se formuje uspořádání genů
msr(A)-mph(C)-sin, jež je identické s uspořádáním těchto genů na plazmidu pSR1 (AF167161).
Nicméně sekvence genu sin u KM71 je totožná se sekvencí z JCSC1435.
Další odlišnosti v uspořádání msr(A) oblasti na chromozómu byly nalezeny u izolátů KM27,
KM30 a KM33. PCR amplifikací z primerů 1F a 2R došlo k amplifikaci 2,8kb velkého PCR produktu
namísto předpokládaných 1,3 kb, což bylo způsobeno vložením inzerční sekvence ISSha1 do lokusu
SH2295. Inzerční sekvence je ohraničená osminukleotidovými přímými repeticemi, jež jsou výsledkem
duplikace cílového místa během integrace této inzerční sekvence z ISL3 rodiny (193).
Plazmid nesoucí gen msr(A)
Pro analýzu okolí genu msr(A) neseného na plazmidu jsme vybrali kmen KM88, který
obsahoval pouze jediný plazmid. Konce BsaBI/HindIII fragmentu, obsahujícího gen msr(A), byly po
vložení do vektoru sekvenovány z univerzálních vektorových primerů. Sekvence obou konců
fragmentu byly totožné s úsekem plazmidu pSR1 z S. aureus (3417-8591bp). Shodné uspořádání
genů tnpIS431, msr(A), mph(C) a sin bylo v tomto fragmentu potvrzeno sekvenováním z primerů
navržených uvnitř fragmentu. Nukleotidové sekvence genů msr(A) a mph(C) jsou téměř totožné s
geny z JCSC1435, v genu msr(A) byla nalezena pouze jediná nukleotidová záměna, která se
projevuje také na úrovni proteinu. Geny pro rekombinasu Sin jsou si podobné méně: 87% identita na
úrovni DNA a 95% identita na proteinové úrovni.
Kromě fragmentu s genem msr(A) jsme do vektoru vložili i některé další BsaBI/HindIII nebo
HindIII fragmenty plazmidu p88 a jejich konce jsme opět sekvenovali z univerzálních primerů. Ačkoli
nebyl osekvenován celý plazmid, z částí sekvencí (Tab. 5.2.), které odpovídají několika různým
stafylokokovým plazmidům, vyplývá, že p88 je složeným plazmidem, který vznikl kointegrací celých
nebo částí plazmidů zprostředkovanou IS431 (označována také IS257). Tyto IS jsou lokalizovány na
krajích integrovaných plazmidů (18, 91).
42
VÝSLEDKY
Analýza okolí genu msr(A)
Tab. 5.2. Výsledky BLAST analýzy sekvenovaných částí plazmidu p88
Vložený úsek
(kb)
Sekvenováno z
primeru (bp)
Úsek sek.
fragmentu
M13F (1009)
263-591
žádná významná podobnost
591-1009
pSR1 1-419 (100 %)
1-263
HindIII/HindIII
(2,8)
Nejlepší výsledek BLAST
analýzy (% identity)
Pořadí genů
v celém
vloženém
fragmentua
(5'-3')
GenBank
přístupové
číslo
Reference, poznámky
pSR1 3420-3682 (100 %)
1-582
pSR1 1274-1855 (100 %)
tnp431, orf1,
ofr2, tnp431
AF167161
S. aureus
CP000028
S. epidermidis RP62A
genom
repC, tet, pre
CP000045
Staphylococcus aureus
subsp. aureus COL
(pT181 bývá součástí
mozaikových plazmidů, a
také SCCmec kazety typu
III)
úsek nic
nekóduje
SAU73027
sekvence Tn5405 mezi
aphA-3 and IS1182right
tnp
AY028780
M13R (876)
BsaBI/HindIII
(5)
HindIII/HindIII
(3,5)
BsaBI/HindIII
(2)
HindIII/HindIII
(2,3)
HindIII/HindIII
(2,3)
583-876
pSR1 2894-3187 (100 %)
M13R (950)
1-950
pSR1 3417-4366(100 %)
M13F (936)
1-636
pSR1 7656-8591 (100 %)
1-301
pSERP 16804-17104 (99 %)
295-907
pSERP 17180-17792 (100 %)
M13F (915)
1-915
pSERP 19546-20461 (100 %)
M13F (945)
1-945
pSERP 23181-24125 (98 %)
M13R (958)
1-958
pSERP 24166-25123 (99 %)
M13R (860)
1-860
pT181 818-1677 (100 %)
M13F (872)
1-872
pT181 2039-3177 (99 %)
M13F (982)
1-982
Tn5405 402-1383 (99 %)
1-680
Tn5405 1802-2480 (99 %)
tnp431,
msr(A),
mph(C), sin
M13R (907)
tnp431, rep,
spm, rlx, mob,
tnp431
M13R (974)
681-974
pST6 (200-494) 100 %
tnp431 100 % i s dalšími
plazmidy
a
Pokud délka úseku mezi osekvenovanými konci vložených fragmentů plazmidu p88 odpovídala vzdálenostem v
sekvenci z databáze, byl vložený fragment považován za celistvý.
Hlavním zdrojem variability msr(A) oblasti je aktivita resolvasy a transposasy
Mezi 15 izoláty jsme PCR mapováním a sekvenováním nalezli 6 různých typů uspořádání
okolí genu msr(A). U pěti z nich byla variabilita soustředěna do oblasti genů binR a sin (Obr. 5.2. a
5.3). Jak již bylo zmíněno, resolvasa Bin a rekombinasa Sin patří do velké rodiny serinových
rekombinas. Regulace rekombinace je spojená s vysokým stupněm topologické selektivity. Tyto
rekombinasy působí v rekombinačních místech (res site), jež jsou uspořádána jako přímé repetice v
rámci jednoho plazmidu. Selektivita je pravděpodobně dána formováním katalyticky aktivní synapse
tvořené rekombinasami a dalšími regulačními proteiny navázanými v oblasti res místa (153).
Rekombinační místo pro bin (resbin) má tři vazebná místa, místo křížení molekuly (resbin site I), které je
tvořeno nepřesnou invertovanou repeticí a další dvě místa pro navázání dalších dimerů resolvás
(resbin siteII a III) (159). Rekombinační místo pro sin (ressin) má pouze dvě vazebná místa (ressin site I
a II) a stejně jako u resbin je místo štěpení DNA uprostřed nepřesných invertovaných repetic v místě
ressin site I (155).
43
VÝSLEDKY
Analýza okolí genu msr(A)
Obr. 5.3. Porovnání sekvencí rekombinačních míst genů bin a sin a jejich okolí u JCSC1435 a izolátů s odlišným
uspořádáním v tomto úseku msr(A) oblasti. První řádek: sekvence u JCSC1435; nukleotidová sekvence genů a
terminálních invertovanýh repetic je vynechána. Sekvence, jež tvoří rekombinační místa ressin a resbin, jsou zvýrazněny
tlustě. Neúplné palindromy uvnitř rekombinačních míst jsou podtrženy a místo rekombinace je vyznačeno lomítkem. U
ostatních sekvencí jsou zobrazeny pouze nukleotidové záměny v nekódujících oblastech a identita nukleotidových
sekvencí genů (%). U sekvence izolátu KM50 jsou zeleně vyznačeny jediné dvě nukleotidové záměny uvnitř TIRRa a
přerušovanou čárou je vyznačena vložená sekvence odpovídající levé části Tn552. Sekvence mezi TIRRa a TIRLa
odpovídá transpozonu Tn5404. Sekvence izolátu KM71 a plazmidu pSR1 mezi rekombinačními místy ressin site I chybí.
Červeně s černě zvýrazněnými záměnami uvnitř je vyznačená zdvojená sekvence pravého ramena ressin site I.
Z porovnání sekvencí úseků lišících se u jednotlivých izolátů (Obr. 5.3.) jsou patrná místa, kde
pravděpodobně došlo k rekombinacím, jež mají za následek většinu rozdílů nalezených v msr(A)
oblasti. Všechny sekvence na obrázku 5.3. jsou identické až do místa rekombinace v ressin site I. U
izolátu KM71 a plazmidu pSR1 (a pravděpodobně také u p88), které nemají resolvásu binR pokračuje
sekvence pravým ramenem ressin site I a dále pak sekvencí odpovídající ressin site II a genem sin. U
sekvence JCSC1435 a izolátů KM36 a KM49 je v tomto místě vložen úsek pravého ramena ressin siteI,
avšak na něj nenavazuje ressin site II, ale terminální invertovaná repetice TIRRa a otevřené čtecí
rámce orfB a orfA, jež jsou součástí transpozonu Tn5404. Dále pak sekvence pokračuje
rekombinačním místem pro resolvásu resbin. V místě resbin site I došlo pravděpodobně k resolvasou
řízené rekombinaci, jež má za následek odlišné sekvence genů binR a pravděpodobně také sin u
izolátů KM36 a KM49. Za genem binR následuje úsek, jenž je v obrázku 5.3. označen jako ∆ressin site
I, u kterého levé rameno palindromu chybí podobně jako u plazmidu pI9789, u kterého byla
nefunkčnost tohoto ressin místa s chybějícím levým ramenem prokázána (155). U izolátu KM50, který
se od JCSC1435 liší vložením levé poloviny transpozonu Tn552, začínají rozdíly teprve až v genu
binL (Obr. 5.3.), který je z 94 % identický s binR. V genomu JCSC1435 se vyskytují dvě binL
resolvasy, které jsou s binL z izolátu KM50 identické. První, v pozici JCSC1435 1826963-1826434, je
44
VÝSLEDKY
Analýza okolí genu msr(A)
součástí kompletního transpozonu Tn552 a s rekombinačním místem resbinR je identická až k místu
rekombinace (resbinR site I). Druhá, v pozici JCSC1435 261884-2618311, je součástí sekvence
transpozonu Tn5404. Kompletní transpozon Tn5404 je na vnějších okrajích ohraničen 7 bp dlouhou
přímou repeticí (AGTAACT), jež vznikla zdvojením místa inzerce transpozonu (Obr. 5.3.), stejné
inzerční místo pro Tn552 bylo pozorováno v chromozómu Entereococcus faecalis CH116 (146, 155).
Shrnutí výsledků:
•
Gen msr(A) byl u 41 izolátů lokalizován na chromozómu ve společném místě, pouze u dvou
izolátů byl gen lokalizován na plazmidu.
•
Oblast chromozomálně kódovaného genu msr(A) je u všech patnácti podrobněji studovaných
izolátů (Tab. 5.1.) vysoce homologní s plazmidem πSh1, integrovaným v genomu S.
haemolyticus JCSC1435 izolovaného v Japonsku (179).
•
Uspořádání genů na tomto plazmidu je konzervovaným souborem jednotlivých genových
motivů, jehož menší fragmenty byly odděleně popsány v několika dřívějších studiích.
•
Rozdíly v msr(A) hybridizačních profilech jsou dány výhradně variabilitou v úseku kódujícím
resolvasu Bin a rekombinasu Sin.
•
Nalezli jsme pět různých typů uspořádání msr(A) oblastí, které se liší od JCSC1435 tímto:
i) vložením části transpozonu Tn552 (typ KM50; 7,2kb msr(A) hybridizující fragment)
ii) delecí části transpozonu Tn5404 (typ KM71; 7,7kb msr(A) hybridizující fragment)
Oba tyto blízce příbuzné transpozony náleží do rodiny Tn21. Preferenčními místy vkládání
těchto transpozonů jsou rekombinační místa ressin a resbin, jsou proto označovány jako "ressite hunters" (117).
iii) sekvencí genů binR a sin, včetně jejich okolí (typ KM36; 11kb msr(A) hybridizující fragment
a typ KM49, 4,6kb msr(A) hybridizující fragment), jenž je pravděpodobně důsledkem
rekombinace v místě resbin.
iv) vložením ISSha1 do stejného místa, jež leží za 5' koncem plazmidu πSh1 (typ KM27; 5kb
msr(A) hybridizující fragment). Všechny izoláty s touto IS (KM27, KM30 a KM33) náleží
stejnému hybridizačnímu typu jako JCSC1435
•
Okolí genu msr(A) na plazmidu p88 je identické s plazmidem pSR1 izolovaným z S. aureus a
uspořádání genů msr(A)-mph(C)-sin je totožné s msr(A) okolím u izolátu KM71.
45
IV. DISKUZE
46
DISKUZE
Ve třech přijatých a jedné připravované publikaci jsou shrnuty výsledky studia mechanismů
rezistence k makrolidům, linkosamidům a streptograminům u methicilin rezistentních koaguláza
negativních stafylokoků. Pilotní práce (123) definovala soubor rezistentních klinických izolátů z ČR, u
něhož byl stanoven rezistenční profil na fenotypové i genové úrovni. Velmi neobvyklá distribuce
rezistenčních genů a pozorování nového rezistenčního fenotypu, jenž implikuje přítomnost doposud
neznámé rezistenční determinanty, byly důvodem v pokračování výzkumu tohoto tématu. Výsledkem
bylo objevení nové varianty rezistenčního ABC proteinu Vga(A)LC s rozšířeným substrátovým
spektrem, u kterého jsme určili aminokyseliny zodpovědné za tuto změnu v substrátové specificitě
(124). Dále jsme charakterizovali mobilní elementy nesoucí dominantní rezistenční gen msr(A)
kódující protein ze stejné rodiny ABC proteinů jako Vga(A)LC (Novotná, v přípravě). Poslední publikace
(125) využívá tento z hlediska MLS rezistencí detailně prostudovaný souboru izolátů CoNS k
otestování účinnosti nových antibiotik telithromycinu a quinupristinu/dalfopristinu na pozadí
rezistenčního profilu charakteristického pro ČR.
Z klinického hlediska je převaha rezistenčních mechanismů udílející rezistenci pouze k
některým MLS antibiotikům velmi zajímavá, dochází totiž k dělení původně společné MLSB rezistenční
skupiny: v testovaném souboru bylo dokonce i za indukčních podmínek pouze 44 % izolátů
rezistentních ke všem třem testovaným antibiotikům. To znamená, že alespoň některé z MLS
antibiotik zůstává účinné proti více jak polovině izolátů CoNS. Otázkou je, zda je toto v jiných zemí
zcela neobvyklé rozložení rezistenčních mechanismů mezi methicilin-rezistentními CoNS typické pro
Českou republiku (či region střední či východní Evropy), nebo zda došlo k lokálnímu šíření (outbreaku)
klonů s těmito typy rezistence. Prvotní MSB rezistentní izoláty CoNS (S. hominis, S. cohnii) s genem
msr(A) byly izolovány v Československu v roce 1976 (39) a první S. aureus s tímto genem byl
izolován v Maďarsku v roce 1977 (72). Také inaktivace linkosamidů byla poprvé pozorována u izolátů
S. aureus a S. intermedius zvířecího původu z Československa (49, 88). Je tedy možné, že se tyto
rezistenční mechanismy vyvinuly právě v tomto regionu. Důvodem však také může být intenzivní
výzkum stafylokoků Prof. Václavem Hájkem, působícím na Palackého univerzitě v Olomouci, který
mnohé z těchto raných rezistentních stafylokoků izoloval.
Klonálnímu šíření rezistence nasvědčuje fakt, že většina msr(A) pozitivních izolátů (43 z 52) a
více jak polovina lnu(A) pozitivních izolátů (19 z 29) byla identifikována jako S. haemolyticus. Zároveň
S. haemolyticus jasně převažoval (63 %) ve výběru methicilin-rezistentních izolátů se zkříženou
rezistencí k MLS antibiotikům, přestože v původním souboru 919 izolátů byl nejčastějším druhem S.
epidermidis. Genotypizace izolátů S. haemolyticus však tuto hypotézu potvrdila pouze velmi omezeně:
Mezi 46 erythromycin rezistentními izoláty bylo pozorováno 34 rozdílných genotypů, z nichž pouze
některé se dle klasifikace Tenover et al. (181) zdají být klonálně příbuzné (nepublikovaná data). Díky
své schopnosti akumulovat rezistence, bývá S. haemolyticus často rezistentní k mnoha antibiotikům, a
dokonce i první methicilin a glykopeptid rezistentní izoláty náležely tomuto druhu (42, 60). Sekvenace
genomu S. haemolyticus JCSC1435 odhalila přítomnost velkého množství funkčních inzerčních
sekvencí (IS), jež jsou důvodem extrémní plasticity genomu zlepšující jeho adaptabilitu na prostředí
hostitelského organizmu včetně získávání odolnosti k mnoha antibakteriálním látkám (179).
47
DISKUZE
Gen msr(A) byl u naprosté většiny našich izolátů lokalizován na chromozómu v rámci
integrovaného plazmidu, stejně jako u sekvenovaného kmene JCSC1435 (179). Tento plazmid
postrádá geny kódující mobilizační proteiny a nelze u něj nalézt ani žádné struktury charakteristické
pro transpozon nebo chromozomální kazetu, které by naznačovaly možný mechanismus
horizontálního přenosu msr(A)-mph(C) lokusu. Otázkou tedy je, zda se msr(A) šíří horizontálním
přenosem, anebo pouze klonálně. Jednou z možností horizontálního šíření je mobilizace pomocí v
genomu hojně se vyskytujících IS, jejichž přítomnost v okolí msr(A)-mph(C) lokusu by mohla způsobit
přenesení genů do konjugativního plazmidu. Tomu nasvědčuje přítomnost msr(A)-mph(C) na
mozaikovém plazmidu u dvou izolátů v naší sbírce a také přítomnost inzerčních sekvencí IS431
upstream od genů cadD a cadX a ISha1 u kmenů KM27, 30 a 33. V tomto předpokládaném procesu
mobilizace by se mohla uplatňovat také nalezená dvojice ISLE39 elementů. Alternativně, podobnou
funkci může mít i rekombinasa sin, která se jako jediná vyskytuje v sousedství msr(A)-mph(C) i na
obou plazmidech. Není však vyloučeno, že k takovýmto událostem dochází pouze výjimečně a že je
tato oblast relativně stabilní součástí jinak velmi tvárného genomu. Tomu nasvědčuje fakt, že
JCSC1435, který byl izolován v Japonsku v roce 2000 má identickou msr(A) oblast s některými izoláty
získanými v České republice v roce 1996 a naopak, že v rámci epidemiologicky příbuzných izolátů
existují rozdíly. Jednotlivé genové motivy byly nalezeny v mnoha stafylokokových izolátech v různých
studiích: kombinace genů smp-stp-msr(A) byla nalezena na plazmidu S. epidermidis a v chromozómu
S. hominis (148), tatáž kombinace genů navíc se sekvencí upstream od msr(A), byla nalezena u
izolátů S. aureus (110). Kombinace genů msr(A)-mph(C)-sin se vyskytuje na plazmidu pSR1
(AF167161) a dvojice genů msr(A)-mph(C) na plazmidu pMS97 z S. aureus (108) a také v mnoha
dalších izolátech (45, 179). Téměř identická kombinace genů mph(C)-sin byla dokonce nalezena u
gramnegativní Stenotrophomonas maltophilia (9). Až do sekvenace genomu JCSC1435 nebyla
publikována jediná sekvence kódující všechny tyto geny. Analýza širšího okolí genu msr(A) v těchto
izolátech by byla zapotřebí, aby bylo možné shrnout, zda je uspořádání genů smp-stp-msr(A)-mph(A)sin opakující se součástí mobilních elementů nesoucích gen msr(A). Eventuálně jestli se do ostatních
stafylokokových druhů a i do jiných rodů šíří pouze jednotlivé části této oblasti náhodně.
Identita sekvence části plazmidu p88 obsahující IS431-msr(A)-mph(C)-sin s úsekem na
plazmidu pSR1 z S. aureus a to včetně rekombinasy, která je hlavním zdrojem variability v msr(A)
oblasti izolátů v souboru, je dokladem přímé spojitosti přenosu msr(A) a mph(C) rezistenčních genů
mezi těmito druhy. Multirezistentní S. haemolyticus tak může sloužit jako zdroj rezistencí pro
virulentnější S. aureus, což by mohlo mít vliv i na vyšší podíl genu msr(A) u izolátů tohoto druhu.
Avšak mezi stovkou methicilin rezistentních S. aureus izolovaných v českých nemocnicích v letech
2000-2002 byly nalezeny pouze dva msr(A) pozitivní izoláty (113).
Teprve vyšetření aktuálního souboru klinických izolátů CoNS může potvrdit, zda je výskyt
"alternativních" mechanismů udílejících rezistenci pouze k některým MLS antibiotikům v České
republice stále významný. Se stoupající spotřebou makrolidů a linkosamidů (Obr. 6.1.) lze obecně
očekávat nárůst rezistence k těmto antibiotikům, otázkou však je, jaké rezistenční mechanismy se u
CoNS uplatňují. V případě, že by byl výskyt alternativních rezistencí u CoNS stále aktuální, má velký
význam v klinické praxi rutině testovat citlivost k MLS antibiotikům diskovým indukčním testem (Obr.
48
DISKUZE
4.1.). Použití disků s oběma linkosamidy, linkomycinem a klindamycinem, umožní identifikovat
inaktivaci linkomycinu, která by v případě použití pouze doporučené kombinace disků s
erythromycinem a klindamycinem (40, 121) zůstala skrytá.
Díky tomu, že výběr studované sbírky CoNS nebyl omezen pouze na erythromycin rezistentní
izoláty, jako u většiny podobných studií, podařilo se zachytit i 10 izolátů S. haemolyticus rezistentních
k oběma linkosamidům, avšak citlivých k erythromycinu, u kterých jsme později charakterizovali novou
rezistenční determinantu vga(A)LC udílející rezistenci k linkosamidům a streptograminům A (124).
Později se ukázalo, že tento gen je kromě těchto deseti izolátů přítomen také u dalších 9 erythromycin
rezistentních izolátů S. haemolyticus, S. epidermidis a S. warnerii, u nichž byla LSA rezistence
částečně maskována přítomností jiných rezistenčních determinant.
Obr. 6.1 Porovnání spotřeby MLS antibiotik v letech 1989 - 2005a
3,5
2005
DDD/1000/db
3
2003
2001 2002
1999
2,5
1995
1996
1997
1998
2004
2000
2
1994
1,5
1993
1
0,5
1989 1990 1991 1992
0
a
b
údaje z let 1989-1998 převzaty z (177), údaje z let 1999-2005 poskytnuty SÚKL
spotřeba je uváděna v počtu doporučených denních dávek na 1000 obyvatel za jeden den
Spolu s genem vga(A) nalezeným u jednoho izolátu S. epidermidis je to celkem 20 izolátů
rezistentních ke streptograminu A. Ačkoli z tohoto počtu byly pouze dva izoláty rezistentní ke
kombinaci streptograminů quinupristin/dalfopristin, je toto číslo alarmující, zejména proto, že izoláty
pocházejí z doby, kdy v humánní medicíně streptograminy nebyly v České republice používány.
Důvodem relativně vysokého počtu může být selekční tlak linkosamidů na gen vga(A)LC s
pozměněnou substrátovou specifitou a nebo používání virginiamycinu jako přídavku do krmných
směsí. Intravenózní quinupristin/dalfopristin je vzhledem ke své dobré účinnosti i proti erythromycin
rezistentním izolátům vynikající alternativou proti rezistentním stafylokokům, navíc je v současné době
testován nový orální derivát, který in vitro vykazuje až čtyřnásobně vyšší účinnost dokonce i proti
izolátům s rezistenčními geny (38). Lze tedy očekávat nárůst spotřeby těchto antibiotik, který se
projeví zvýšeným selekčním tlakem na streptograminovou rezistenci. Do budoucna bude proto
nezbytné zahrnout mezi sledované MLS rezistence také ty, které jsou specifické pro streptograminy.
49
DISKUZE
Vzhledem k možnému selhání testování citlivosti ke kombinaci quinupristin/dalfopristin diskovým
difúzním testem (125, 136) by bylo užitečné v klinické praxi testovat citlivost také k jednotlivým
komponentám.
Nově nalezený rezistenční protein Vga(A)LC se od proteinu Vga(A) udílejícího rezistenci ke
streptograminu A liší pouhými sedmi aminokyselinami. Porovnáním rezistenčního profilu obou variant
proteinů v citlivém hostiteli jsme prokázali, že protein Vga(A)LC udílí vyšší hladiny rezistence k oběma
linkosamidům. Avšak hodnoty MIC nedosahovali hodnot naměřených v původním hostiteli, což by
mohlo naznačovat potřebnost další komponenty systému. Nelze však vyloučit ani další rezistenční
determinanty. Přestože chybí přímý důkaz, spočívající v inaktivaci genu vga(A)LC a s tím spojenou
ztrátou LSA fenotypu, domníváme se, že je tento rezistenční gen plně zodpovědný za linkosamidovou
rezistenci u těchto izolátů. Tomu nasvědčuje úplná korelace LSA rezistenčního fenotypu s přítomností
genu vga(A)LC a stejné průběhy akumulace radioaktivně značeného linkomycinu v buňkách LSA
rezistentního S. haemolyticus s genem vga(A)LC a erythromycinu v buňkách s genem msr(A) (110),
který kóduje protein ze stejné rodiny ARE ABC transportérů. Navíc posun v substrátové specifitě
směrem k linkosamidům není překvapivý vzhledem k existenci několika dalších proteinů s překrývající
se specifitou k linkosamidům a streptograminu A, která pravděpodobně souvisí s překryvem
ribozomálním vazebným místem těchto antibiotik (80) a kap.3.3.3.
Porovnáváním hybridních proteinů odvozených od Vga(A)LC a Vga(A) jsme zjistili, že pouze
čtyři ze sedmi aminokyselinových zbytků, kterými se oba proteiny liší, jsou zodpovědné za změnu
substrátové specifity (124). Tyto čtyři aminokyseliny jsou nahloučené v krátkém úseku 15
aminokyselin situovaných v oblasti spojující obě ATP vazebné domény. To naznačuje, že tato část by
mohla být zodpovědná za rozpoznání a vazbu substrátu. V současné době je připravovaná nová sada
mutantních proteinů Vga(A) a Vga(A)LC s bodovými mutacemi kombinujícími výše zmíněnou čtveřici
aminokyselin, což by mělo dále upřesnit jejich konkrétní význam v určení substrátové specifity. Dvojice
téměř identických proteinů Vga(A) a Vga(A)LC s odlišnou substrátovou specifitou je ideálním modelem
pro studium mechanismu funkce ARE rodiny rezistenčních proteinů, jež se díky sekvenačním
genomovým projektům rychle rozrůstá.
50
V. REFERENCE
51
REFERENCE
1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
8.
9.
10.
11.
12.
13.
14.
15.
16.
17.
18.
19.
20.
21.
Achard, A., C. Villers, V. Pichereau, and R. Leclercq. 2005. New lnu(C) gene conferring
resistance to lincomycin by nucleotidylation in Streptococcus agalactiae UCN36. Antimicrob
Agents Chemother 49:2716-9.
Alam, M. M., N. Kobayashi, N. Uehara, and N. Watanabe. 2003. Analysis on distribution and
genomic diversity of high-level antiseptic resistance genes qacA and qacB in human clinical
isolates of Staphylococcus aureus. Microb Drug Resist 9:109-21.
Allignet, J., S. Aubert, A. Morvan, and N. el Solh. 1996. Distribution of genes encoding
resistance to streptogramin A and related compounds among staphylococci resistant to these
antibiotics. Antimicrob Agents Chemother 40:2523-8.
Allignet, J., and N. el Solh. 1995. Diversity among the gram-positive acetyltransferases
inactivating streptogramin A and structurally related compounds and characterization of a new
staphylococcal determinant, vatB. Antimicrob Agents Chemother 39:2027-36.
Allignet, J., and N. El Solh. 1997. Characterization of a new staphylococcal gene, vgaB,
encoding a putative ABC transporter conferring resistance to streptogramin A and related
compounds. Gene 202:133-8.
Allignet, J., N. Liassine, and N. el Solh. 1998. Characterization of a staphylococcal plasmid
related to pUB110 and carrying two novel genes, vatC and vgbB, encoding resistance to
streptogramins A and B and similar antibiotics. Antimicrob Agents Chemother 42:1794-8.
Allignet, J., V. Loncle, P. Mazodier, and N. el Solh. 1988. Nucleotide sequence of a
staphylococcal plasmid gene, vgb, encoding a hydrolase inactivating the B components of
virginiamycin-like antibiotics. Plasmid 20:271-5.
Allignet, J., V. Loncle, C. Simenel, M. Delepierre, and N. el Solh. 1993. Sequence of a
staphylococcal gene, vat, encoding an acetyltransferase inactivating the A-type compounds of
virginiamycin-like antibiotics. Gene 130:91-8.
Alonso, A., P. Sanchez, and J. L. Martinez. 2000. Stenotrophomonas maltophilia D457R
contains a cluster of genes from gram-positive bacteria involved in antibiotic and heavy metal
resistance. Antimicrob Agents Chemother 44:1778-82.
Ambrose, K. D., R. Nisbet, and D. S. Stephens. 2005. Macrolide efflux in Streptococcus
pneumoniae is mediated by a dual efflux pump (mel and mef) and is erythromycin inducible.
Antimicrob Agents Chemother 49:4203-9.
Argoudelis, A. D., J. H. Coats, and S. A. Mizsak. 1977. Microbial transformation of
antibiotics. Clindamycin ribonucleotides. J Antibiot (Tokyo) 30:474-87.
Arthur, M., D. Autissier, and P. Courvalin. 1986. Analysis of the nucleotide sequence of the
ereB gene encoding the erythromycin esterase type II. Nucleic Acids Res 14:4987-99.
Azap, O. K., H. Arslan, F. Timurkaynak, G. Yapar, E. Oruc, and U. Gagir. 2005. Incidence
of inducible clindamycin resistance in staphylococci: first results from Turkey. Clin Microbiol
Infect 11:582-4.
Ban, N., P. Nissen, J. Hansen, P. B. Moore, and T. A. Steitz. 2000. The complete atomic
structure of the large ribosomal subunit at 2.4 A resolution. Science 289:905-20.
Barthelemy, P., D. Autissier, G. Gerbaud, and P. Courvalin. 1984. Enzymic hydrolysis of
erythromycin by a strain of Escherichia coli. A new mechanism of resistance. J Antibiot
(Tokyo) 37:1692-6.
Bartley, J. 2002. First case of VRSA identified in Michigan. Infect Control Hosp Epidemiol
23:480.
Bastos, M. C., and E. Murphy. 1988. Transposon Tn554 encodes three products required for
transposition. Embo J 7:2935-41.
Berg, T., N. Firth, S. Apisiridej, A. Hettiaratchi, A. Leelaporn, and R. A. Skurray. 1998.
Complete nucleotide sequence of pSK41: evolution of staphylococcal conjugative
multiresistance plasmids. J Bacteriol 180:4350-9.
Biskri, L., and D. Mazel. 2003. Erythromycin esterase gene ere(A) is located in a functional
gene cassette in an unusual class 2 integron. Antimicrob Agents Chemother 47:3326-31.
Bjorland, J., M. S. Bratlie, and T. Steinum. 2007. The smr gene resides on a novel plasmid
pSP187 identified in a Staphylococcus pasteuri isolate recovered from unpasteurized milk.
Plasmid 57:145-55.
Bjorland, J., T. Steinum, M. Sunde, S. Waage, and E. Heir. 2003. Novel plasmid-borne
gene qacJ mediates resistance to quaternary ammonium compounds in equine
Staphylococcus aureus, Staphylococcus simulans, and Staphylococcus intermedius.
Antimicrob Agents Chemother 47:3046-52.
52
REFERENCE
22.
23.
24.
25.
26.
27.
28.
29.
30.
31.
32.
33.
34.
35.
36.
37.
38.
39.
40.
41.
Bjorland, J., T. Steinum, M. Sunde, S. Waage, S. Sviland, H. Oppegaard, and E. Heir.
2006. Deletion of pT181-like sequence in an smr-encoding mosaic plasmid harboured by a
persistent bovine Staphylococcus warneri strain. J Antimicrob Chemother 57:46-51.
Bjorland, J., M. Sunde, and S. Waage. 2001. Plasmid-borne smr gene causes resistance to
quaternary ammonium compounds in bovine Staphylococcus aureus. J Clin Microbiol
39:3999-4004.
Bozdogan, B., L. Berrezouga, M. S. Kuo, D. A. Yurek, K. A. Farley, B. J. Stockman, and
R. Leclercq. 1999. A new resistance gene, linB, conferring resistance to lincosamides by
nucleotidylation in Enterococcus faecium HM1025. Antimicrob Agents Chemother 43:925-9.
Bozdogan, B., and R. Leclercq. 1999. Effects of genes encoding resistance to
streptogramins A and B on the activity of quinupristin-dalfopristin against Enterococcus
faecium. Antimicrob Agents Chemother 43:2720-5.
Brisson-Noel, A., and P. Courvalin. 1986. Nucleotide sequence of gene linA encoding
resistance to lincosamides in Staphylococcus haemolyticus. Gene 43:247-53.
Brisson-Noel, A., P. Delrieu, D. Samain, and P. Courvalin. 1988. Inactivation of
lincosaminide antibiotics in Staphylococcus. Identification of lincosaminide Onucleotidyltransferases and comparison of the corresponding resistance genes. J Biol Chem
263:15880-7.
Buriankova, K., F. Doucet-Populaire, O. Dorson, A. Gondran, J. C. Ghnassia, J. Weiser,
and J. L. Pernodet. 2004. Molecular basis of intrinsic macrolide resistance in the
Mycobacterium tuberculosis complex. Antimicrob Agents Chemother 48:143-50.
Calcutt, M. J., and E. Cundliffe. 1990. Cloning of a lincosamide resistance determinant from
Streptomyces caelestis, the producer of celesticetin, and characterization of the resistance
mechanism. J Bacteriol 172:4710-4.
Catchpole, I., and K. G. Dyke. 1990. A Staphylococcus aureus plasmid that specifies
constitutive macrolide-lincosamide-streptogramin B resistance contains a novel deletion in the
ermC attenuator. FEMS Microbiol Lett 57:43-7.
CLSI. 2007. Performance standards for antimicrobial susceptibility testing; Seventeenth
informational supplement M100-S17. Clinical and Laboratory Standards Institute, 940 West
Valley Road, Suite 1400, Wayne, Pennsylvania 19087-1898.
Dassa, E., and P. Bouige. 2001. The ABC of ABCS: a phylogenetic and functional
classification of ABC systems in living organisms. Res Microbiol 152:211-29.
Del Grosso, M., R. Camilli, F. Iannelli, G. Pozzi, and A. Pantosti. 2006. The mef(E)carrying genetic element (mega) of Streptococcus pneumoniae: insertion sites and association
with other genetic elements. Antimicrob Agents Chemother 50:3361-6.
Depardieu, F., I. Podglajen, R. Leclercq, E. Collatz, and P. Courvalin. 2007. Modes and
modulations of antibiotic resistance gene expression. Clin Microbiol Rev 20:79-114.
Diekema, D. J., M. A. Pfaller, F. J. Schmitz, J. Smayevsky, J. Bell, R. N. Jones, and M.
Beach. 2001. Survey of infections due to Staphylococcus species: frequency of occurrence
and antimicrobial susceptibility of isolates collected in the United States, Canada, Latin
America, Europe, and the Western Pacific region for the SENTRY Antimicrobial Surveillance
Program, 1997-1999. Clin Infect Dis 32 Suppl 2:S114-32.
Dina, J., B. Malbruny, and R. Leclercq. 2003. Nonsense mutations in the lsa-like gene in
Enterococcus faecalis isolates susceptible to lincosamides and Streptogramins A. Antimicrob
Agents Chemother 47:2307-9.
Dubnau, D. 1984. Translational attenuation: the regulation of bacterial resistance to the
macrolide-lincosamide-streptogramin B antibiotics. CRC Crit Rev Biochem 16:103-32.
Dupuis, M., and R. Leclercq. 2006. Activity of a new oral streptogramin, XRP2868, against
gram-positive cocci harboring various mechanisms of resistance to streptogramins. Antimicrob
Agents Chemother 50:237-42.
Eady, E. A., J. I. Ross, J. L. Tipper, C. E. Walters, J. H. Cove, and W. C. Noble. 1993.
Distribution of genes encoding erythromycin ribosomal methylases and an erythromycin efflux
pump in epidemiologically distinct groups of staphylococci. J Antimicrob Chemother 31:211-7.
Fiebelkorn, K. R., S. A. Crawford, M. L. McElmeel, and J. H. Jorgensen. 2003. Practical
disk diffusion method for detection of inducible clindamycin resistance in Staphylococcus
aureus and coagulase-negative staphylococci. J Clin Microbiol 41:4740-4.
Fokas, S., S. Fokas, M. Tsironi, M. Kalkani, and M. Dionysopouloy. 2005. Prevalence of
inducible clindamycin resistance in macrolide-resistant Staphylococcus spp. Clin Microbiol
Infect 11:337-40.
53
REFERENCE
42.
43.
44.
45.
46.
47.
48.
49.
50.
51.
52.
53.
54.
55.
56.
57.
58.
59.
60.
61.
62.
Froggatt, J. W., J. L. Johnston, D. W. Galetto, and G. L. Archer. 1989. Antimicrobial
resistance in nosocomial isolates of Staphylococcus haemolyticus. Antimicrob Agents
Chemother 33:460-6.
Gabashvili, I. S., S. T. Gregory, M. Valle, R. Grassucci, M. Worbs, M. C. Wahl, A. E.
Dahlberg, and J. Frank. 2001. The polypeptide tunnel system in the ribosome and its gating
in erythromycin resistance mutants of L4 and L22. Mol Cell 8:181-8.
Garrett, L. 1995. The coming plaque: Newly emerging diseases in a world out of balance.
Penguin.
Gatermann, S. G., T. Koschinski, and S. Friedrich. 2007. Distribution and expression of
macrolide resistance genes in coagulase-negative staphylococci. Clin Microbiol Infect 13:77781.
Gaynor, M., and A. S. Mankin. 2005. Macrolide antibiotics: binding site, mechanism of action,
resistance. Frontiers in Medicinal Chemistry 2:21-35.
Gregory, S. T., and A. E. Dahlberg. 1999. Erythromycin resistance mutations in ribosomal
proteins L22 and L4 perturb the higher order structure of 23 S ribosomal RNA. J Mol Biol
289:827-34.
Gryczan, T. J., G. Grandi, J. Hahn, R. Grandi, and D. Dubnau. 1980. Conformational
alteration of mRNA structure and the posttranscriptional regulation of erythromycin-induced
drug resistance. Nucleic Acids Res 8:6081-97.
Hajek, V. 1976. Staphylococcus intermedius, a new species isolated from animals. Int. J.
Syst. Bacteriol. 26:401-408.
Hamilton-Miller, J. M., and S. Shah. 2000. Patterns of phenotypic resistance to the
macrolide-lincosamide-ketolide-streptogramin group of antibiotics in staphylococci. J
Antimicrob Chemother 46:941-9.
Hansen, J. L., J. A. Ippolito, N. Ban, P. Nissen, P. B. Moore, and T. A. Steitz. 2002. The
structures of four macrolide antibiotics bound to the large ribosomal subunit. Mol Cell 10:11728.
Harms, J., F. Schluenzen, R. Zarivach, A. Bashan, S. Gat, I. Agmon, H. Bartels, F.
Franceschi, and A. Yonath. 2001. High resolution structure of the large ribosomal subunit
from a mesophilic eubacterium. Cell 107:679-88.
Harms, J. M., F. Schlunzen, P. Fucini, H. Bartels, and A. Yonath. 2004. Alterations at the
peptidyl transferase centre of the ribosome induced by the synergistic action of the
streptogramins dalfopristin and quinupristin. BMC Biol 2:4.
Haroche, J., J. Allignet, S. Aubert, A. E. Van Den Bogaard, and N. El Solh. 2000. satG,
conferring resistance to streptogramin A, is widely distributed in Enterococcus faecium strains
but not in staphylococci. Antimicrob Agents Chemother 44:190-1.
Haroche, J., J. Allignet, C. Buchrieser, and N. El Solh. 2000. Characterization of a variant
of vga(A) conferring resistance to streptogramin A and related compounds. Antimicrob Agents
Chemother 44:2271-5.
Haroche, J., A. Morvan, M. Davi, J. Allignet, F. Bimet, and N. El Solh. 2003. Clonal
diversity among streptogramin A-resistant Staphylococcus aureus isolates collected in French
hospitals. J Clin Microbiol 41:586-91.
Hauschild, T., P. Luthje, and S. Schwarz. 2006. Characterization of a novel type of MLSB
resistance plasmid from Staphylococcus saprophyticus carrying a constitutively expressed
erm(C) gene. Vet Microbiol 115:258-63.
Heir, E., B. A. Lindstedt, T. M. Leegaard, E. Gjernes, and G. Kapperud. 2004. Prevalence
and characterization of integrons in blood culture Enterobacteriaceae and gastrointestinal
Escherichia coli in Norway and reporting of a novel class 1 integron-located lincosamide
resistance gene. Ann Clin Microbiol Antimicrob 3:12.
Hiramatsu, K. 2001. Vancomycin-resistant Staphylococcus aureus: a new model of antibiotic
resistance. Lancet Infect Dis 1:147-55.
Hiramatsu, K. 1998. Vancomycin resistance in staphylococci. Drug Resist Updat 1:135-50.
Hiramatsu, K., H. Hanaki, T. Ino, K. Yabuta, T. Oguri, and F. C. Tenover. 1997. Methicillinresistant Staphylococcus aureus clinical strain with reduced vancomycin susceptibility. J
Antimicrob Chemother 40:135-6.
Horinouchi, S., W. H. Byeon, and B. Weisblum. 1983. A complex attenuator regulates
inducible resistance to macrolides, lincosamides, and streptogramin type B antibiotics in
Streptococcus sanguis. J Bacteriol 154:1252-62.
54
REFERENCE
63.
64.
65.
66.
67.
68.
69.
70.
71.
72.
73.
74.
75.
76.
77.
78.
79.
80.
81.
82.
83.
84.
Horinouchi, S., and B. Weisblum. 1982. Nucleotide sequence and functional map of pE194,
a plasmid that specifies inducible resistance to macrolide, lincosamide, and streptogramin
type B antibodies. J Bacteriol 150:804-14.
Horinouchi, S., and B. Weisblum. 1980. Posttranscriptional modification of mRNA
conformation: mechanism that regulates erythromycin-induced resistance. Proc Natl Acad Sci
U S A 77:7079-83.
Huang, J., P. W. O'Toole, W. Shen, H. Amrine-Madsen, X. Jiang, N. Lobo, L. M. Palmer,
L. Voelker, F. Fan, M. N. Gwynn, and D. McDevitt. 2004. Novel chromosomally encoded
multidrug efflux transporter MdeA in Staphylococcus aureus. Antimicrob Agents Chemother
48:909-17.
Chabbert, Y. 1956. Antagonisme in vitro entre l'erythromycine et la spiramycine. Ann Inst
Pasteur (Paris) 90:787-90.
Chabbert, Y. A., and P. Courvalin. 1971. [Synergism of antibiotic components of the
streptogramin group]. Pathol Biol (Paris) 19:613-9.
Chakraburtty, K. 2001. Translational regulation by ABC systems. Res Microbiol 152:391-9.
Chesneau, O., H. Ligeret, N. Hosan-Aghaie, A. Morvan, and E. Dassa. 2005. Molecular
analysis of resistance to streptogramin A compounds conferred by the Vga proteins of
staphylococci. Antimicrob Agents Chemother 49:973-80.
Chesneau, O., K. Tsvetkova, and P. Courvalin. 2007. Resistance phenotypes conferred by
macrolide phosphotransferases. FEMS Microbiol Lett 269:317-22.
Ito, T., Y. Katayama, K. Asada, N. Mori, K. Tsutsumimoto, C. Tiensasitorn, and K.
Hiramatsu. 2001. Structural comparison of three types of staphylococcal cassette
chromosome mec integrated in the chromosome in methicillin-resistant Staphylococcus
aureus. Antimicrob Agents Chemother 45:1323-36.
Janosi, L., and E. Ban. 1982. Presented at the 12th International Congress of
Chemotherapy, Florence, Italy, 1981.
Jenkins, G., M. Zalacain, and E. Cundliffe. 1989. Inducible ribosomal RNA methylation in
Streptomyces lividans, conferring resistance to lincomycin. J Gen Microbiol 135:3281-8.
Jenssen, W. D., S. Thakker-Varia, D. T. Dubin, and M. P. Weinstein. 1987. Prevalence of
macrolides-lincosamides-streptogramin B resistance and erm gene classes among clinical
strains of staphylococci and streptococci. Antimicrob Agents Chemother 31:883-8.
John, M. A., C. Pletch, and Z. Hussain. 2002. In vitro activity of quinupristin/dalfopristin,
linezolid, telithromycin and comparator antimicrobial agents against 13 species of coagulasenegative staphylococci. J Antimicrob Chemother 50:933-8.
Kawachi, R., T. Akashi, Y. Kamitani, A. Sy, U. Wangchaisoonthorn, T. Nihira, and Y.
Yamada. 2000. Identification of an AfsA homologue (BarX) from Streptomyces virginiae as a
pleiotropic regulator controlling autoregulator biosynthesis, virginiamycin biosynthesis and
virginiamycin M1 resistance. Mol Microbiol 36:302-13.
Kehrenberg, C., K. K. Ojo, and S. Schwarz. 2004. Nucleotide sequence and organization of
the multiresistance plasmid pSCFS1 from Staphylococcus sciuri. J Antimicrob Chemother
54:936-9.
Kehrenberg, C., and S. Schwarz. 2006. Distribution of florfenicol resistance genes fexA and
cfr among chloramphenicol-resistant Staphylococcus isolates. Antimicrob Agents Chemother
50:1156-63.
Kehrenberg, C., S. Schwarz, L. Jacobsen, L. H. Hansen, and B. Vester. 2005. A new
mechanism for chloramphenicol, florfenicol and clindamycin resistance: methylation of 23S
ribosomal RNA at A2503. Mol Microbiol 57:1064-73.
Kerr, I. D., E. D. Reynolds, and J. H. Cove. 2005. ABC proteins and antibiotic drug
resistance: is it all about transport? Biochem Soc Trans 33:1000-2.
Kim, S. D., L. C. McDonald, W. R. Jarvis, S. K. McAllister, R. Jerris, L. A. Carson, and J.
M. Miller. 2000. Determining the significance of coagulase-negative staphylococci isolated
from blood cultures at a community hospital: a role for species and strain identification. Infect
Control Hosp Epidemiol 21:213-7.
Kloos, W. E., and T. L. Bannerman. 1994. Update on clinical significance of coagulasenegative staphylococci. Clin Microbiol Rev 7:117-40.
Kono, M., K. O'Hara, and T. Ebisu. 1992. Purification and characterization of macrolide 2'phosphotransferase type II from a strain of Escherichia coli highly resistant to macrolide
antibiotics. FEMS Microbiol Lett 76:89-94.
Krolewski, J. J., E. Murphy, R. P. Novick, and M. G. Rush. 1981. Site-specificity of the
chromosomal insertion of Staphylococcus aureus transposon Tn554. J Mol Biol 152:19-33.
55
REFERENCE
85.
86.
87.
88.
89.
90.
91.
92.
93.
94.
95.
96.
97.
98.
99.
100.
101.
102.
103.
104.
105.
Kwak, J. H., E. C. Choi, and B. Weisblum. 1991. Transcriptional attenuation control of ermK,
a macrolide-lincosamide-streptogramin B resistance determinant from Bacillus licheniformis. J
Bacteriol 173:4725-35.
Lai, C. J., and B. Weisblum. 1971. Altered methylation of ribosomal RNA in an erythromycinresistant strain of Staphylococcus aureus. Proc Natl Acad Sci U S A 68:856-60.
Lampson, B. C., and J. T. Parisi. 1986. Nucleotide sequence of the constitutive macrolidelincosamide-streptogramin B resistance plasmid pNE131 from Staphylococcus epidermidis
and homologies with Staphylococcus aureus plasmids pE194 and pSN2. J Bacteriol 167:88892.
Leclercq, R., C. Carlier, J. Duval, and P. Courvalin. 1985. Plasmid-mediated resistance to
lincomycin by inactivation in Staphylococcus haemolyticus. Antimicrob Agents Chemother
28:421-4.
Leclercq, R., and P. Courvalin. 1991. Bacterial resistance to macrolide, lincosamide, and
streptogramin antibiotics by target modification. Antimicrob Agents Chemother 35:1267-72.
Leeb, M. 2004. Antibiotics: a shot in the arm. Nature 431:892-3.
Leelaporn, A., N. Firth, I. T. Paulsen, and R. A. Skurray. 1996. IS257-mediated
cointegration in the evolution of a family of staphylococcal trimethoprim resistance plasmids. J
Bacteriol 178:6070-3.
Lim, J. A., A. R. Kwon, S. K. Kim, Y. Chong, K. Lee, and E. C. Choi. 2002. Prevalence of
resistance to macrolide, lincosamide and streptogramin antibiotics in Gram-positive cocci
isolated in a Korean hospital. J Antimicrob Chemother 49:489-95.
Lina, G., A. Quaglia, M. E. Reverdy, R. Leclercq, F. Vandenesch, and J. Etienne. 1999.
Distribution of genes encoding resistance to macrolides, lincosamides, and streptogramins
among staphylococci. Antimicrob Agents Chemother 43:1062-6.
Livermore, D. 2004. Can better prescribing turn the tide of resistance? Nat Rev Microbiol
2:73-8.
Lodder, G., S. Schwarz, P. Gregory, and K. Dyke. 1996. Tandem duplication in ermC
translational attenuator of the macrolide-lincosamide-streptogramin B resistance plasmid
pSES6 from Staphylococcus equorum. Antimicrob Agents Chemother 40:215-7.
Lodder, G., C. Werckenthin, S. Schwarz, and K. Dyke. 1997. Molecular analysis of naturally
occuring ermC-encoding plasmids in staphylococci isolated from animals with and without
previous contact with macrolide/lincosamide antibiotics. FEMS Immunol Med Microbiol 18:715.
Long, K. S., J. Poehlsgaard, C. Kehrenberg, S. Schwarz, and B. Vester. 2006. The Cfr
rRNA methyltransferase confers resistance to Phenicols, Lincosamides, Oxazolidinones,
Pleuromutilins, and Streptogramin A antibiotics. Antimicrob Agents Chemother 50:2500-5.
Luthje, P., and S. Schwarz. 2006. Antimicrobial resistance of coagulase-negative
staphylococci from bovine subclinical mastitis with particular reference to macrolidelincosamide resistance phenotypes and genotypes. J Antimicrob Chemother 57:966-9.
Luthje, P., M. von Kockritz-Blickwede, and S. Schwarz. 2007. Identification and
characterization of nine novel types of small staphylococcal plasmids carrying the lincosamide
nucleotidyltransferase gene lnu(A). J Antimicrob Chemother 59:600-6.
Malbruny, B., A. Canu, B. Bozdogan, B. Fantin, V. Zarrouk, S. Dutka-Malen, C. Feger,
and R. Leclercq. 2002. Resistance to quinupristin-dalfopristin due to mutation of L22
ribosomal protein in Staphylococcus aureus. Antimicrob Agents Chemother 46:2200-7.
Mangili, A., I. Bica, D. R. Snydman, and D. H. Hamer. 2005. Daptomycin-resistant,
methicillin-resistant Staphylococcus aureus bacteremia. Clin Infect Dis 40:1058-60.
Marshall, V. P., W. F. Liggett, and J. I. Cialdella. 1989. Enzymic inactivation of
lincosaminide and macrolide antibiotics: divalent metal cation and coenzyme specificities. J
Antibiot (Tokyo) 42:826-30.
Martineau, F., F. J. Picard, N. Lansac, M. i. q. m. C, P. H. Roy, M. Ouellette, and M. G.
Bergeron. 2000. Correlation between the resistance genotype determined by multiplex PCR
assays and the antibiotic susceptibility patterns of Staphylococcus aureus and Staphylococcus
epidermidis. Antimicrob Agents Chemother 44:231-8.
Marton, M. J., C. R. Vazquez de Aldana, H. Qiu, K. Chakraburtty, and A. G. Hinnebusch.
1997. Evidence that GCN1 and GCN20, translational regulators of GCN4, function on
elongating ribosomes in activation of eIF2alpha kinase GCN2. Mol Cell Biol 17:4474-89.
Marty, F. M., W. W. Yeh, C. B. Wennersten, L. Venkataraman, E. Albano, E. P. Alyea, H.
S. Gold, L. R. Baden, and S. K. Pillai. 2006. Emergence of a clinical daptomycin-resistant
56
REFERENCE
106.
107.
108.
109.
110.
111.
112.
113.
114.
115.
116.
117.
118.
119.
120.
121.
122.
123.
124.
125.
Staphylococcus aureus isolate during treatment of methicillin-resistant Staphylococcus aureus
bacteremia and osteomyelitis. J Clin Microbiol 44:595-7.
Mason, D. J., and C. Lewis. 1964. Biological Activity of the Lincomycin-Related Antibiotics.
Antimicrobial Agents Chemother (Bethesda) 10:7-12.
Matsuoka, M., K. Endou, H. Kobayashi, M. Inoue, and Y. Nakajima. 1997. A dyadic
plasmid that shows MLS and PMS resistance in Staphylococcus aureus. FEMS Microbiol Lett
148:91-6.
Matsuoka, M., K. Endou, H. Kobayashi, M. Inoue, and Y. Nakajima. 1998. A plasmid that
encodes three genes for resistance to macrolide antibiotics in Staphylococcus aureus. FEMS
Microbiol Lett 167:221-7.
Matsuoka, M., M. Inoue, Y. Endo, and Y. Nakajima. 2003. Characteristic expression of three
genes, msr(A), mph(C) and erm(Y), that confer resistance to macrolide antibiotics on
Staphylococcus aureus. FEMS Microbiol Lett 220:287-93.
Matsuoka, M., L. Janosi, K. Endou, and Y. Nakajima. 1999. Cloning and sequences of
inducible and constitutive macrolide resistance genes in Staphylococcus aureus that
correspond to an ABC transporter. FEMS Microbiol Lett 181:91-100.
Matsuoka, M., L. Janosi, K. Endou, S. Saitoh, H. Hashimoto, and Y. Nakajima. 1993. An
increase of 63 kDa-protein present in the cell membranes of Staphylococcus aureus that
bears a plasmid mediating inducible resistance to partial macrolide and streptogramin B
antibiotics. Biol Pharm Bull 16:1288-90.
Mayford, M., and B. Weisblum. 1990. The ermC leader peptide: amino acid alterations
leading to differential efficiency of induction by macrolide-lincosamide-streptogramin B
antibiotics. J Bacteriol 172:3772-9.
Melter, O. 2003. Průkaz molekulární charakterizace kmenů meticilin rezistentních
Staphylococcus aureus a Bartonella henselae v České republice. Univerzita Karlova, 3.LF,
Praha.
Melter, O., M. Aires de Sousa, P. Urbaskova, V. Jakubu, H. Zemlickova, and H. de
Lencastre. 2003. Update on the major clonal types of methicillin-resistant Staphylococcus
aureus in the Czech Republic. J Clin Microbiol 41:4998-5005.
Melter, O., I. Santos Sanches, J. Schindler, M. Aires de Sousa, R. Mato, V. Kovarova, H.
Zemlickova, and H. de Lencastre. 1999. Methicillin-resistant Staphylococcus aureus clonal
types in the Czech Republic. J Clin Microbiol 37:2798-803.
Mendez, C., and J. A. Salas. 2001. The role of ABC transporters in antibiotic-producing
organisms: drug secretion and resistance mechanisms. Res Microbiol 152:341-50.
Minakhina, S., G. Kholodii, S. Mindlin, O. Yurieva, and V. Nikiforov. 1999. Tn5053 family
transposons are res site hunters sensing plasmidal res sites occupied by cognate resolvases.
Mol Microbiol 33:1059-68.
Mukhtar, T. A., K. P. Koteva, D. W. Hughes, and G. D. Wright. 2001. Vgb from
Staphylococcus aureus inactivates streptogramin B antibiotics by an elimination mechanism
not hydrolysis. Biochemistry 40:8877-86.
Mukhtar, T. A., and G. D. Wright. 2005. Streptogramins, oxazolidinones, and other inhibitors
of bacterial protein synthesis. Chem Rev 105:529-42.
Murphy, E. 1985. Nucleotide sequence of ermA, a macrolide-lincosamide-streptogramin B
determinant in Staphylococcus aureus. J Bacteriol 162:633-40.
NCCLS. 2004. Performance standards for antimicrobial susceptibility testing. 14th
informational supplement. M100-S14. NCCLS, Wayne, PA.
Noguchi, N., Y. Tamura, J. Katayama, and K. Narui. 1998. Expression of the mphB gene for
macrolide 2'-phosphotransferase II from Escherichia coli in Staphylococcus aureus. FEMS
Microbiol Lett 159:337-42.
Novotna, G., V. Adamkova, J. Janata, O. Melter, and J. Spizek. 2005. Prevalence of
resistance mechanisms against macrolides and lincosamides in methicillin-resistant
coagulase-negative staphylococci in the Czech Republic and occurrence of an undefined
mechanism of resistance to lincosamides. Antimicrob Agents Chemother 49:3586-9.
Novotna, G., and J. Janata. 2006. A new evolutionary variant of the streptogramin A
resistance protein, Vga(A)LC, from Staphylococcus haemolyticus with shifted substrate
specificity towards lincosamides. Antimicrob Agents Chemother 50:4070-6.
Novotna, G., J. Spizek, and J. Janata. 2007. In Vitro Activity of Telithromycin and
Quinupristin/dalfopristin against Methicillin-Resistant Coagulase-Negative Staphylococci with
Defined Resistance Genotypes. Folia Microbiol (Praha) Accepted.
57
REFERENCE
126.
127.
128.
129.
130.
131.
132.
133.
134.
135.
136.
137.
138.
139.
140.
141.
142.
143.
144.
145.
146.
147.
Ohki, R., K. Tateno, T. Takizawa, T. Aiso, and M. Murata. 2005. Transcriptional termination
control of a novel ABC transporter gene involved in antibiotic resistance in Bacillus subtilis. J
Bacteriol 187:5946-54.
Ojo, K. K., M. J. Striplin, C. C. Ulep, N. S. Close, J. Zittle, H. Luis, M. Bernardo, J. Leitao,
and M. C. Roberts. 2006. Staphylococcus efflux msr(A) gene characterized in Streptococcus,
Enterococcus, Corynebacterium, and Pseudomonas isolates. Antimicrob Agents Chemother
50:1089-91.
Olano, C., A. M. Rodriguez, C. Mendez, and J. A. Salas. 1995. A second ABC transporter is
involved in oleandomycin resistance and its secretion by Streptomyces antibioticus. Mol
Microbiol 16:333-43.
Oliveira, S. S., E. Murphy, M. R. Gamon, and M. C. Bastos. 1993. pRJ5: a naturally
occurring Staphylococcus aureus plasmid expressing constitutive macrolide-lincosamidestreptogramin B resistance contains a tandem duplication in the leader region of the ermC
gene. J Gen Microbiol 139:1461-7.
Ounissi, H., and P. Courvalin. 1985. Nucleotide sequence of the gene ereA encoding the
erythromycin esterase in Escherichia coli. Gene 35:271-8.
Paulsen, I. T., M. H. Brown, and R. A. Skurray. 1998. Characterization of the earliest known
Staphylococcus aureus plasmid encoding a multidrug efflux system. J Bacteriol 180:3477-9.
Paulsen, I. T., M. T. Gillespie, T. G. Littlejohn, O. Hanvivatvong, S. J. Rowland, K. G.
Dyke, and R. A. Skurray. 1994. Characterisation of sin, a potential recombinase-encoding
gene from Staphylococcus aureus. Gene 141:109-14.
Peeters, M. J., and J. C. Sarria. 2005. Clinical characteristics of linezolid-resistant
Staphylococcus aureus infections. Am J Med Sci 330:102-4.
Pechere, J. C. 1996. Streptogramins. A unique class of antibiotics. Drugs 51 Suppl 1:13-9.
Peschke, U., H. Schmidt, H. Z. Zhang, and W. Piepersberg. 1995. Molecular
characterization of the lincomycin-production gene cluster of Streptomyces lincolnensis 78-11.
Mol Microbiol 16:1137-56.
Petinaki, E., I. Spiliopoulou, M. Maniati, and A. N. Maniatis. 2005. Emergence of
Staphylococcus hominis strains expressing low-level resistance to quinupristin/dalfopristin in
Greece. J Antimicrob Chemother 55:811-2.
Pfaller, M. A., and L. A. Herwaldt. 1988. Laboratory, clinical, and epidemiological aspects of
coagulase-negative staphylococci. Clin Microbiol Rev 1:281-99.
Potoski, B. A., J. Adams, L. Clarke, K. Shutt, P. K. Linden, C. Baxter, A. W. Pasculle, B.
Capitano, A. Y. Peleg, D. Szabo, and D. L. Paterson. 2006. Epidemiological profile of
linezolid-resistant coagulase-negative staphylococci. Clin Infect Dis 43:165-71.
Projan, S. J. 2003. Why is big Pharma getting out of antibacterial drug discovery? Curr Opin
Microbiol 6:427-30.
Prunier, A. L., B. Malbruny, D. Tande, B. Picard, and R. Leclercq. 2002. Clinical isolates of
Staphylococcus aureus with ribosomal mutations conferring resistance to macrolides.
Antimicrob Agents Chemother 46:3054-6.
Putman, M., H. W. van Veen, J. E. Degener, and W. N. Konings. 2001. The lactococcal
secondary multidrug transporter LmrP confers resistance to lincosamides, macrolides,
streptogramins and tetracyclines. Microbiology 147:2873-80.
Putman, M., H. W. van Veen, and W. N. Konings. 2000. Molecular properties of bacterial
multidrug transporters. Microbiol Mol Biol Rev 64:672-93.
Rende-Fournier, R., R. Leclercq, M. Galimand, J. Duval, and P. Courvalin. 1993.
Identification of the satA gene encoding a streptogramin A acetyltransferase in Enterococcus
faecium BM4145. Antimicrob Agents Chemother 37:2119-25.
Reynolds, E., J. I. Ross, and J. H. Cove. 2003. Msr(A) and related macrolide/streptogramin
resistance determinants: incomplete transporters? Int J Antimicrob Agents 22:228-36.
Reynolds, E. D., and J. H. Cove. 2005. Resistance to telithromycin is conferred by msr(A),
msrC and msr(D) in Staphylococcus aureus. J Antimicrob Chemother 56:1179-80.
Rice, L. B., L. L. Carias, S. H. Marshall, and M. E. Bonafede. 1996. Sequences found on
staphylococcal beta-lactamase plasmids integrated into the chromosome of Enterococcus
faecalis CH116. Plasmid 35:81-90.
Roberts, M. C., J. Sutcliffe, P. Courvalin, L. B. Jensen, J. Rood, and H. Seppala. 1999.
Nomenclature for macrolide and macrolide-lincosamide-streptogramin B resistance
determinants. Antimicrob Agents Chemother 43:2823-30.
58
REFERENCE
148.
149.
150.
151.
152.
153.
154.
155.
156.
157.
158.
159.
160.
161.
162.
163.
164.
165.
166.
167.
Ross, J. I., E. A. Eady, J. H. Cove, and S. Baumberg. 1995. Identification of a
chromosomally encoded ABC-transport system with which the staphylococcal erythromycin
exporter MsrA may interact. Gene 153:93-8.
Ross, J. I., E. A. Eady, J. H. Cove, and S. Baumberg. 1996. Minimal functional system
required for expression of erythromycin resistance by msrA in Staphylococcus aureus
RN4220. Gene 183:143-8.
Ross, J. I., E. A. Eady, J. H. Cove, W. J. Cunliffe, S. Baumberg, and J. C. Wootton. 1990.
Inducible erythromycin resistance in staphylococci is encoded by a member of the ATPbinding transport super-gene family. Mol Microbiol 4:1207-14.
Ross, J. I., A. M. Farrell, E. A. Eady, J. H. Cove, and W. J. Cunliffe. 1989. Characterisation
and molecular cloning of the novel macrolide-streptogramin B resistance determinant from
Staphylococcus epidermidis. J Antimicrob Chemother 24:851-62.
Rosteck, P. R., Jr., P. A. Reynolds, and C. L. Hershberger. 1991. Homology between
proteins controlling Streptomyces fradiae tylosin resistance and ATP-binding transport. Gene
102:27-32.
Rowland, S. J., M. R. Boocock, and W. M. Stark. 2005. Regulation of Sin recombinase by
accessory proteins. Mol Microbiol 56:371-82.
Rowland, S. J., and K. G. Dyke. 1989. Characterization of the staphylococcal beta-lactamase
transposon Tn552. Embo J 8:2761-73.
Rowland, S. J., W. M. Stark, and M. R. Boocock. 2002. Sin recombinase from
Staphylococcus aureus: synaptic complex architecture and transposon targeting. Mol
Microbiol 44:607-19.
Sader, H. S., J. M. Streit, T. R. Fritsche, and R. N. Jones. 2006. Antimicrobial susceptibility
of gram-positive bacteria isolated from European medical centres: results of the Daptomycin
Surveillance Programme (2002-2004). Clin Microbiol Infect 12:844-52.
Sader, H. S., A. A. Watters, T. R. Fritsche, and R. N. Jones. 2007. Daptomycin
antimicrobial activity tested against methicillin-resistant staphylococci and vancomycinresistant enterococci isolated in European medical centers (2005). BMC Infect Dis 7:29.
Sandler, P., and B. Weisblum. 1989. Erythromycin-induced ribosome stall in the ermA
leader: a barricade to 5'-to-3' nucleolytic cleavage of the ermA transcript. J Bacteriol
171:6680-8.
Sarkis, G. J., L. L. Murley, A. E. Leschziner, M. R. Boocock, W. M. Stark, and N. D.
Grindley. 2001. A model for the gamma delta resolvase synaptic complex. Mol Cell 8:623-31.
Shaw, J. H., and D. B. Clewell. 1985. Complete nucleotide sequence of macrolidelincosamide-streptogramin B-resistance transposon Tn917 in Streptococcus faecalis. J
Bacteriol 164:782-96.
Shortridge, V. D., R. K. Flamm, N. Ramer, J. Beyer, and S. K. Tanaka. 1996. Novel
mechanism of macrolide resistance in Streptococcus pneumoniae. Diagn Microbiol Infect Dis
26:73-8.
Schlunzen, F., R. Zarivach, J. Harms, A. Bashan, A. Tocilj, R. Albrecht, A. Yonath, and F.
Franceschi. 2001. Structural basis for the interaction of antibiotics with the peptidyl
transferase centre in eubacteria. Nature 413:814-21.
Schmitz, F. J., J. Petridou, N. Astfalk, K. Kohrer, S. Scheuring, and S. Schwarz. 2002.
Molecular analysis of constitutively expressed erm(C) genes selected in vitro by incubation in
the presence of the noninducers quinupristin, telithromycin, or ABT-773. Microb Drug Resist
8:171-7.
Schmitz, F. J., J. Petridou, N. Astfalk, S. Scheuring, K. Kohrer, J. Verhoef, A. C. Fluit,
and S. Schwarz. 2001. Structural alterations in the translational attenuator of constitutively
expressed erm(A) genes in Staphylococcus aureus. Antimicrob Agents Chemother 45:1603-4.
Schnellmann, C., V. Gerber, A. Rossano, V. Jaquier, Y. Panchaud, M. G. Doherr, A.
Thomann, R. Straub, and V. Perreten. 2006. Presence of new mecA and mph(C) variants
conferring antibiotic resistance in Staphylococcus spp. isolated from the skin of horses before
and after clinic admission. J Clin Microbiol 44:4444-54.
Schoner, B., M. Geistlich, P. Rosteck, Jr., R. N. Rao, E. Seno, P. Reynolds, K. Cox, S.
Burgett, and C. Hershberger. 1992. Sequence similarity between macrolide-resistance
determinants and ATP-binding transport proteins. Gene 115:93-6.
Schreckenberger, P. C., E. Ilendo, and K. L. Ristow. 2004. Incidence of constitutive and
inducible clindamycin resistance in Staphylococcus aureus and coagulase-negative
staphylococci in a community and a tertiary care hospital. J Clin Microbiol 42:2777-9.
59
REFERENCE
168.
169.
170.
171.
172.
173.
174.
175.
176.
177.
178.
179.
180.
181.
182.
183.
184.
185.
186.
187.
Schulin, T., and A. Voss. 2001. Coagulase-negative staphylococci as a cause of infections
related to intravascular prosthetic devices: limitations of present therapy. Clin Microbiol Infect
7 Suppl 4:1-7.
Schwarz, S., C. Kehrenberg, and K. K. Ojo. 2002. Staphylococcus sciuri gene erm(33),
encoding inducible resistance to macrolides, lincosamides, and streptogramin B antibiotics, is
a product of recombination between erm(C) and erm(A). Antimicrob Agents Chemother
46:3621-3.
Schwarz, S., C. Werckenthin, and C. Kehrenberg. 2000. Identification of a plasmid-borne
chloramphenicol-florfenicol resistance gene in Staphylococcus sciuri. Antimicrob Agents
Chemother 44:2530-3.
Sidhu, M. S., E. Heir, T. Leegaard, K. Wiger, and A. Holck. 2002. Frequency of disinfectant
resistance genes and genetic linkage with beta-lactamase transposon Tn552 among clinical
staphylococci. Antimicrob Agents Chemother 46:2797-803.
Singh, K. V., K. Malathum, and B. E. Murray. 2001. Disruption of an Enterococcus faecium
species-specific gene, a homologue of acquired macrolide resistance genes of staphylococci,
is associated with an increase in macrolide susceptibility. Antimicrob Agents Chemother
45:263-6.
Singh, K. V., G. M. Weinstock, and B. E. Murray. 2002. An Enterococcus faecalis ABC
homologue (Lsa) is required for the resistance of this species to clindamycin and quinupristindalfopristin. Antimicrob Agents Chemother 46:1845-50.
Skinner, R., E. Cundliffe, and F. J. Schmidt. 1983. Site of action of a ribosomal RNA
methylase responsible for resistance to erythromycin and other antibiotics. J Biol Chem
258:12702-6.
Srinivasan, A., J. D. Dick, and T. M. Perl. 2002. Vancomycin resistance in staphylococci.
Clin Microbiol Rev 15:430-8.
Swaney, S. M., H. Aoki, M. C. Ganoza, and D. L. Shinabarger. 1998. The oxazolidinone
linezolid inhibits initiation of protein synthesis in bacteria. Antimicrob Agents Chemother
42:3251-5.
Štika, L. 2001. Spotřeba antimikrobiálních léčiv a její vliv na rezistenci mikroorganismů.
Klinická mikrobiologie a infekční lékařství 3:66-71.
Tait-Kamradt, A., T. Davies, M. Cronan, M. R. Jacobs, P. C. Appelbaum, and J. Sutcliffe.
2000. Mutations in 23S rRNA and ribosomal protein L4 account for resistance in
pneumococcal strains selected in vitro by macrolide passage. Antimicrob Agents Chemother
44:2118-25.
Takeuchi, F., S. Watanabe, T. Baba, H. Yuzawa, T. Ito, Y. Morimoto, M. Kuroda, L. Cui, M.
Takahashi, A. Ankai, S. Baba, S. Fukui, J. C. Lee, and K. Hiramatsu. 2005. Whole-genome
sequencing of staphylococcus haemolyticus uncovers the extreme plasticity of its genome and
the evolution of human-colonizing staphylococcal species. J Bacteriol 187:7292-308.
Tan, T. Y., S. Y. Ng, and W. X. Ng. 2006. Clinical significance of coagulase-negative
staphylococci recovered from nonsterile sites. J Clin Microbiol 44:3413-4.
Tenover, F. C., R. D. Arbeit, R. V. Goering, P. A. Mickelsen, B. E. Murray, D. H. Persing,
and B. Swaminathan. 1995. Interpreting chromosomal DNA restriction patterns produced by
pulsed-field gel electrophoresis: criteria for bacterial strain typing. J Clin Microbiol 33:2233-9.
Tenson, T., M. Lovmar, and M. Ehrenberg. 2003. The mechanism of action of macrolides,
lincosamides and streptogramin B reveals the nascent peptide exit path in the ribosome. J Mol
Biol 330:1005-14.
Tenson, T., and A. S. Mankin. 2001. Short peptides conferring resistance to macrolide
antibiotics. Peptides 22:1661-8.
Tenson, T., L. Xiong, P. Kloss, and A. S. Mankin. 1997. Erythromycin resistance peptides
selected from random peptide libraries. J Biol Chem 272:17425-30.
Thakker-Varia, S., W. D. Jenssen, L. Moon-McDermott, M. P. Weinstein, and D. T. Dubin.
1987. Molecular epidemiology of macrolides-lincosamides-streptogramin B resistance in
Staphylococcus aureus and coagulase-negative staphylococci. Antimicrob Agents Chemother
31:735-43.
Tillotson, L. E., W. D. Jenssen, L. Moon-McDermott, and D. T. Dubin. 1989.
Characterization of a novel insertion of the macrolides-lincosamides-streptogramin B
resistance transposon Tn554 in methicillin-resistant Staphylococcus aureus and
Staphylococcus epidermidis. Antimicrob Agents Chemother 33:541-50.
Townsend, D. E., S. Bolton, N. Ashdown, D. I. Annear, and W. B. Grubb. 1986.
Conjugative, staphylococcal plasmids carrying hitch-hiking transposons similar to Tn554: intra-
60
REFERENCE
188.
189.
190.
191.
192.
193.
194.
195.
196.
197.
198.
199.
200.
201.
202.
203.
204.
205.
and interspecies dissemination of erythromycin resistance. Aust J Exp Biol Med Sci 64 ( Pt
4):367-79.
Vannuffel, P., and C. Cocito. 1996. Mechanism of action of streptogramins and macrolides.
Drugs 51 Suppl 1:20-30.
von Eiff, C., G. Peters, and C. Heilmann. 2002. Pathogenesis of infections due to
coagulase-negative staphylococci. Lancet Infect Dis 2:677-85.
Walker, J. E., M. Saraste, M. J. Runswick, and N. J. Gay. 1982. Distantly related sequences
in the alpha- and beta-subunits of ATP synthase, myosin, kinases and other ATP-requiring
enzymes and a common nucleotide binding fold. Embo J 1:945-51.
Walsh, C. 2003. Where will new antibiotics come from? Nat Rev Microbiol 1:65-70.
Wang, J., N. B. Shoemaker, G. R. Wang, and A. A. Salyers. 2000. Characterization of a
Bacteroides mobilizable transposon, NBU2, which carries a functional lincomycin resistance
gene. J Bacteriol 182:3559-71.
Watanabe, S., T. Ito, Y. Morimoto, F. Takeuchi, and K. Hiramatsu. 2007. Precise excision
and self-integration of a composite transposon as a model for spontaneous large-scale
chromosome inversion/deletion of the Staphylococcus haemolyticus clinical strain JCSC1435.
J Bacteriol 189:2921-5.
Weigel, L. M., D. B. Clewell, S. R. Gill, N. C. Clark, L. K. McDougal, S. E. Flannagan, J. F.
Kolonay, J. Shetty, G. E. Killgore, and F. C. Tenover. 2003. Genetic analysis of a high-level
vancomycin-resistant isolate of Staphylococcus aureus. Science 302:1569-71.
Weinstein, M. P., M. L. Towns, S. M. Quartey, S. Mirrett, L. G. Reimer, G. Parmigiani, and
L. B. Reller. 1997. The clinical significance of positive blood cultures in the 1990s: a
prospective comprehensive evaluation of the microbiology, epidemiology, and outcome of
bacteremia and fungemia in adults. Clin Infect Dis 24:584-602.
Weisblum, B. 1995. Erythromycin resistance by ribosome modification. Antimicrob Agents
Chemother 39:577-85.
Weisblum, B. 1995. Insights into erythromycin action from studies of its activity as inducer of
resistance. Antimicrob Agents Chemother 39:797-805.
Weisblum, B. 1998. Macrolide resistance. Drug Resist Updat 1:29-41.
Werckenthin, C., M. Cardoso, J. L. Martel, and S. Schwarz. 2001. Antimicrobial resistance
in staphylococci from animals with particular reference to bovine Staphylococcus aureus,
porcine Staphylococcus hyicus, and canine Staphylococcus intermedius. Vet Res 32:341-62.
Werckenthin, C., S. Schwarz, and H. Westh. 1999. Structural alterations in the translational
attenuator of constitutively expressed ermC genes. Antimicrob Agents Chemother 43:1681-5.
Westh, H., D. M. Hougaard, J. Vuust, and V. T. Rosdahl. 1995. Prevalence of erm gene
classes in erythromycin-resistant Staphylococcus aureus strains isolated between 1959 and
1988. Antimicrob Agents Chemother 39:369-73.
Wondrack, L., M. Massa, B. V. Yang, and J. Sutcliffe. 1996. Clinical strain of
Staphylococcus aureus inactivates and causes efflux of macrolides. Antimicrob Agents
Chemother 40:992-8.
Wootton, J. C., and M. H. Drummond. 1989. The Q-linker: a class of interdomain sequences
found in bacterial multidomain regulatory proteins. Protein Eng 2:535-43.
Zarrouk, V., B. Bozdogan, R. Leclercq, L. Garry, C. Carbon, and B. Fantin. 2000.
Influence of resistance to streptogramin A type antibiotics on the activity of quinupristindalfopristin in vitro and in experimental endocarditis due to Staphylococcus aureus. Antimicrob
Agents Chemother 44:1168-73.
Zhang, H. Z., H. Schmidt, and W. Piepersberg. 1992. Molecular cloning and
characterization of two lincomycin-resistance genes, lmrA and lmrB, from Streptomyces
lincolnensis 78-11. Mol Microbiol 6:2147-57.
61