K-RAS - Fingerlandův ústav patologie

Karcinomy štítné žlázy
parafolikulární buňka
medulární
MTC
< 10%
folikulární buňka
papilární
PTC
> 80%
folikulární
FTC
10-20%
anaplastický
ATC
2-5%
Incidence
Rok 1986
Černobyl
26. 4. 1986
Příčiny zvyšující se incidence nádorů ŠŢ, zejména PTC:

přesnější diagnostika, mikrokarcinomy

změna diagnostických kritérií

vyšší příjem jodu

černobylská havárie (26. duben 1986)
Genetika karcinomů štítné žlázy

Zejména mutace proto-onkogenů a tumor-supresorových genů

Chromozomální přeskupení:
 RET/PTC, NTRK1, PAX8/PPARγ,
BRAF/AKAP9

Bodové mutace:
 Zárodečné v RET genu u FMTC a
syndromů MEN2
 Somatické v genech BRAF a RAS,
u PDTC a ATC také TP53, CTNNB1,
PIK3CA, PTEN a AKT1
Faktory podílející se na vzniku DTC
Landa I , Robledo M J Mol Endocrinol 2011;47:R43-R58
Genetické markery

Diagnostika onemocnění

Přesnější určení prognózy

Predikce reakce na léčbu

Cílená genová terapie
Cílená léčba – inhibitory tyrozinkináz (TKI)
VANDETANIB
Keefe S M et al. Clin Cancer Res 2010;16:778-783
Genetika PTC
Extracelulární
prostor
Cytoplazma
RET/PTC
Tyrozinkinázový
receptor
přeskupení
NTRK1 přeskupení
RAS mutace
Ras
met amplifikace
BRAF mutace
Raf
AKAP9/BRAF přeskupení
MAPK
Jádro
PTEN mutace
Růstový
faktor
TP53 mutace
Transkripční
faktor
TP
Studovaný materiál
 čerstvé zamražené tkáně
Klinika ORL a chirurgie hlavy a krku UK 1.LF a FN Motol
Chirurgická klinika UK 2.LF a FN Motol
Oddělení ORL Nemocnice Na Homolce
 parafinové bločky
Fingerlandův ústav patologie, Hradec Králové
Ústav patologie 1.LF UK, Praha
Ústav patologie LF UP, Olomouc
 vzorky biopsií z Endokrinologického ústavu
 vzorky periferní krve kontrolních osob
Molekulárně genetická analýza:
 234 PTC, 6 FTC, 1 FTA, 8 špatně dif. karcinomů, 3 ATC, 23 MTC
 172 zdravých kontrol
Klinicko-patologické parametry
 pohlaví
 věk
 velikost nádoru
 histologická varianta PTC
 invaze nádoru
 metastázy v lymfatických uzlinách
 vzdálené metastázy
 multifokalita
 opouzdření nádoru
 angioinvaze
 TNM stadium
 recidiva onemocnění
Papilární struktura
Metodika
Izolace NK
RNA
Trizol
DNA
Trizol, kit
RNA → cDNA
Real Time PCR
PCR
PCR
Genotypizace
Sekvenace
Elektroforéza
RET polymorfismy
A432A – 7. exon
RET
BRAF – 15. exon
H-RAS – 1. a 2. exon
K-RAS – 1. a 2. exon
N-RAS – 1. a 2. exon
GAPDH
PAX8
EC RET
TK RET
RET/PTC1
RET/PTC3
G691S – 11. exon
L769L – 13. exon
S836S – 14. exon
S904S – 15. exon
Výsledky – RET/PTC
RET/PTC přeskupení
•
26 RET/PTC ze 101 PTC (25,5 %):
2 RET/PTC1, 2 RET/PTC3 a 22 RET/PTCX
RET/PTC1
•
muţ, 19 let, T1N0M0, multifokální neopouzdřený neinvazivní PTC, difúzní
sklerotizující varianta, 17 měsíců bez recidivy
•
ţena, 33 let, T1N1M0, unifokální opouzdřený neinvazivní PTC, klasická
varianta, 18 měsíců bez recidivy
RET/PTC3
•
ţena, 12 let, T3N1M1, unifokální neopouzdřený PTC s invazí do okolních
tkání a cév, smíšená klasicko-folikulární varianta, 39 měsíců bez recidivy
•
ţena 43 let, T3N0M0, multifokální PTC, folikulární varianta, 20 měsíců
bez recidivy
Výsledky PTC – polymorfismy RET
Polymorfismy RET genu
 234 PTC vs. 172 kontrol
p = 0,02
 101 PTC – rozdíly v 7. a 13.
exonu v závislosti na RET/PTC
a pohlaví pacientů
 rizikové alely – majoritní alela
G (7. exon) a minoritní alela G
(13. exon)
 nositelé rizikových haplotypů
(GGGCC a GGGTC) – 2x větší
riziko RET/PTC přeskupení
p = 0,04
Výsledky –mutace BRAF
 Detekována u 81 z 242 pacientů s PTC (33,5 %), u 1 ze 6 špatně
diferencovaných karcinomů (16,7 %), 1 ATC a u ţádného z 23 MTC
 Vliv černobylské havárie – retrospektivní studie za 47 let
100
17
80
70
53
58
10
5
4
1991-1995
60
50
7
40
31
11
23
20
1
BRAF (%)
60
1986-1990
2001-2005
40
2006-2007
30
1996-2000
20
-2
00
7
20
06
-2
00
5
20
01
-2
00
0
19
96
-1
99
5
19
91
-1
99
0
19
86
19
86
0
Př
ed
Výskyt (%)
22
10
Před 1986
0
30
35
40
45
50
Věk (median)
55
60
65
Výsledky – mutace BRAF
BRAF mutace koreluje s
 vyšším věkem pacientů (p = 0,049)
 histologickou variantou nádoru (p = 0,001)
(46,4 % klasická vs. 13,2 % folikulární varianta)
 větší velikostí nádoru (p = 0,041)
 vyšší agresivitou nádoru
 přítomnost metastáz v lymfatických uzlinách (p = 0,029)
 vyšší TNM stadium (p = 0,014)
 recidiva onemocnění (p = 0,008)
Výsledky – mutace RAS genů
Gen
Exon
Alterace
Kodon
Pacient
H-RAS
2
V44M
GTG-ATG
A
C51Y
TGC-TAC
B
L79L
CTG-TTG
B
1
E3K
GAA-AAA
A
2
Y40Y
TAC-TAT
C
T50I
ACC-ATC
D
L56L
CTC-CTT
D
G60G
GGT-GGA
E
G60G
GGT-GGC
F
Q61K
CAA-AAA
E, F
Q22Q
CAG-CAA
G
Q22X
CAG-TAG
H
Q61R
CAA-CGA
I, J, K, L
A66T
GCC-ACC
C
D69D
GAC-GAT
G
E76K
GAA-AAA
C
K-RAS
N-RAS
1
2

98 tkání – 83 PTC (56 FV PTC, 11
KV PTC, 14 smíšených, 2 vzácné
varianty), 7 FTC, 1 FTA, 3 ATC, 4
špatně dif. karcinomy

U šesti pacientů nalezena
mutace v 61. kodonu genu NRAS a genu K-RAS (aktivační
doména)

Nalezeny další silent, nonsense i
missense genetické změny

Všechny genetické změny
nalezeny u folikulární varianty
PTC

In silico analýza ukazuje na
patogenitu některých missense
mutací (p.Cys51Tyr, p.Glu3Lys),
kterou je třeba ověřit
MTC a RET proto-onkogen
lokalizace 10q11.2
1 2
3
4
5
6
7
8 9
10 11
12
Kadherinu Oblast bohatá
podobná doména na cystein
13
14
15
16
17 18
19
Tyrozinkinázové
domény
Extracelulární doména
Intracelulární doména
Transmembránová doména
Aktivující zárodečné mutace
FMTC, MEN 2A, MEN 2B
Aktivující somatické mutace
sporadický MTC
Inaktivující mutace
Hirschsprungova choroba
20 21
Genetický screening
Pacient s MTC
DNA test (krev i tumor)
mutace jen
v tumoru
mutace v tumoru
i v krvi
MTC
sporadický
MTC
familiární
DNA test u všech
pokrevních členů rodiny
totální
tyreoidektomie
přítomnost
mutace
nepřítomnost
mutace
biochemický
screening
vyřazení
ze screeningu
Záchyt zárodečných mutací - MTC
1 2
3
4
Arg321Gly 1x
5
6
7
8
Cys609Tyr 1x
Cys611Arg 1x
Cys611Tyr 1x
9
10
11 12
14
15
16
17
Cys634Ser 1x
Cys634Phe 1x
Leu790Phe 1x
Tyr791Phe 3x
Val804Leu 1x
Val804Met 4x
Cys634Trp 1x
Glu768Asp 1x
Tyr791Phe 2x
Val804Met 1x
Cys618Arg 1x
Cys620Phe 1x
Cys620Arg 1x
13
Cys634Arg 8x
Cys634Tyr 1x
Cys634Ser 2x
18 19 20
21
Met918Thr 9x
Tyr791Phe 1x
Tyr791Phe 1x
spor. MTC
FMTC
MEN2A
MEN2B
celkem
počet rodin
340
12
14
9
375
záchyt mutace
14 (4%)
7 (58%)
13 (93%)
9 (100%)
počet příbuzných
202
61
69
20
352
záchyt mutace
13
19
25
3
60
vyloučení ze screeningu
20
20
43
17
100


Záchyt zárodečných mutací - HSCR
1 2
3
4
5
6
7
8
9
10
11 12
Pro566Leu 1x
Ala373Val 1x
13
del603(A)
14
15
16
Ser649Leu 2x
Cys609Tyr 1x
Cys620Arg 2x
17
18 19 20
Tyr791Phe 8x
Gly798Ser 1x
Exon
Mutace
Záchyt
Fenotyp HSCR
Typické duální
RET mutace
Exon 10
Cys609Tyr
1x
TCA
Exon 10
Cys620Arg
2x
TCA
RET mutace
Exon 11
Ser649Leu
2x
1x TCA, 1x RS
typické pro MTC
Exon 13
Tyr791Phe
8x
2x TCA, 6x RS
Exon 6
Ala373Val
1x
RS
Exon 9
Pro566Leu
1x
TCA
Exon 10
del603(A)
1x
TCA
Exon 13
Gly798Ser
1x
TCA
17x
9x TCA, 8x RS
Nové RET mutace
s neznámou funkcí
Celkem ze 156 pacientů
21
Záchyt somatických mutací - MTC
1 2
3
4
5
6
7
8
9
10
11 12
13
Val591Ile+Met918Thr 1x
Cys630Arg 1x
del Glu632-Leu633 3x
14
15
16
17
18 19 20
Ala883Phe 1x
Met918Thr 13x
Ala883Ser 1x
Ser922Pro 1x
Thr930Met 1x
Gly911Asp+Met918Thr+Glu921Lys 1x
Počet tkání
Záchyt mutací
48
23 (48%)
21
Vyšší stádium TNM
Horší prognóza
Haplotypy - MTC
1 – A45A (G/A)
2 – A432A (G/A)
3 – G691S (G/A)
4 – L769L (T/G)
5 – S836S (C/T)
6 – IVS14-24G>A
7 – S904S (C/G)
Kontroly p = 0,003
Pacienti
Publikace

Dvorakova S, Vaclavikova E, Sykorova V, Duskova J, Vlcek P, Ryska A, Novak Z, Bendlova B 2006 New
multiple somatic mutations in the RET proto-oncogene associated with a sporadic medullary thyroid
carcinoma. Thyroid 16:311–316. IF = 3,000

Bendlová B, Dvořáková S, Václavíková E, Sýkorová V, Vlček P, Škába R 2006 Nádory štítné ţlázy a
Hirschsprungova choroba – 10leté zkušenosti s molekulárně-genetickým testováním RET protookogenu. Vnitř Lek 52:926–934.

Sýkorová V, Dvořáková Š, Kodetová D, Astl J, Ryška A, Dušková J, Vlček P, Novák Z, Bendlová B 2007
Genetické příčiny vzniku papilárního karcinomu štítné ţlázy Diab Metab Endokrinol Výţiva
1:30–35.

Dvorakova S, Vaclavikova E, Sykorova V, Vcelak J, Novak Z, Duskova J, Ryska A, Laco J, Cap J,
Kodetova D, Kodet R, Krskova L, Vlcek P, Astl J, Vesely D, Bendlova B 2008 Somatic mutations in the
RET proto-oncogene in sporadic medullary thyroid carcinomas. Mol Cell Endocrinol, 284(1–2):21–27.
IF = 3,611

Vaclavikova E, Dvorakova S, Sykorova V, Bilek R, Dvorakova K, Vlcek P, Skaba R, Zelinka T, Bendlova
B 2009 RET mutation – Tyr791Phe – the genetic cause of different diseases derived from neural crest.
Endocrine, 36(3):419–424. IF = 1,842

Sykorova V, Dvorakova S, Ryska A, Vcelak J, Vaclavikova E, Laco J, Kodetova D, Kodet R, Cibula A,
Duskova J, Hlobilkova A, Astl J, Vesely D, Betka J, Hoch J, Smutny S, Cap J, Vlcek P, Novak Z,
Bendlova B 2010 BRAFV600E Mutation in the Pathogenesis of a Large Series of Papillary Thyroid
Carcinoma in Czech Republic. J Endocrinol Invest, 33:318-324. IF = 1,888
Poděkování
Endokrinologický ústav
RNDr. Š. Dvořáková, Ph.D.
Mgr. E. Václavíková
Mgr. V. Sýkorová, Ph.D.
Mgr. Tereza Hálková
Mgr. Josef Včelák
MUDr. Z. Novák, CSc.
MUDr. J. Vrbíková, CSc.
Klinika nukleární medicíny a endokrinologie, 2.LF UK a FN Motol
Doc. MUDr. P. Vlček, CSc.
Klinika ORL a chirurgie hlavy a krku, 1. LF UK a FN Motol
Doc. MUDr. J. Astl, CSc., MUDr. J. Veselý, Prof. MUDr. J. Betka, DrSc.
Chirurgická klinika, 2. LF UK a FN Motol
Prof. MUDr. J. Hoch, CSc., MUDr. S. Smutný
Ústav patologie a molekulární medicíny, 1. LF UK a FN Motol
Prim. MUDr. D. Kodetová, Prof. MUDr. R. Kodet, CSc., Mgr. A. Cibula
Fingerlandův ústav patologie, FN Hradec Králové
Prof. MUDr. A. Ryška, CSc., MUDr. J. Laco
Ústav patologie a IPVZ, 1.LF UK
Doc. MUDr. J. Dušková, CSc.
Laboratoř molekulární patologie, LF UP, Olomouc
MUDr. A. Hlobilková, Ph.D.
Oddělení ambulantních provozů, FN Hradec Králové
Prof. MUDr. J. Čáp, CSc.
Oddělení ORL, Nemocnice Na Homolce
MUDr. J. Lukáš
Podpořeno grantem IGA MZ ČR NS/9165-3, NT/13901-4
Děkuji za pozornost