CE stanovení energeticky významných metabolitů v

Mgr. Jindra Musilová
Vedoucí: Prof. RNDr. Zdeněk Glatz, CSc.
Centrum bioanalytických technologií, Ústav biochemie, Přírodovědecká fakulta,
Masarykova univerzita, Kamenice 5, 625 00 Brno
 Teorie
• Metabolomika – důležité pojmy
• Příprava vzorku
• Analytické metody
o Kapilární elektroforéza v metabolomice
 Výsledky
• Optimalizace CE metody
• Analýza extraktu bakterie Paracoccus Denitrificans
• Analýza extraktu kmenových buněk
• Analýza extraktu rostlinných buněk Vitis Vinifera
METABOLOMIKA: vědní disciplína zaměřená na studium metabolomu
METABOLOM: kompletní sada intracelulárních (endometabolom) a
extracelulárních (exometabolom) metabolitů v buňkách nebo
v organismech za daného metabolického stavu.
(Escherichia coli K12)
Genom
(4392 genů)
Vnější vlivy
Proteom
(4464 proteinů)
Počet
metabolitů v buňce může být až
řádově nižší než počet genů a proteinů.
– nejnižší linie genové
exprese - přímo odráží funkční úroveň
buňky.
Metabolom
Změny
Metabolom
(796 metabolitů)
metabolitů v buňce nejsou
regulovány pouze genovou expresí, ale
i vlivy životního prostředí.
Metabolomické
experimenty vyžadují
2x – 3x méně času ve srovnání s
proteomickými a transkriptomickými
experimenty.
Obtížné technologie – obtížné měření, dostupnost dat!!
Roste chemická komplexnost
analyzovaných sloučenin

Genom
Proteom
Metabolom
RT-PCR,
DNA Microarrays,
Gene Chips
2D-PAGE MALDI-TOF,
2D-LC,
LC-MS
NMR,
GC-MS, LC-MS, CE-MS
Buněčná lyze
EXTRAKCE
Inaktivace
veškerých
biochemických
procesů
Zpřístupnění
intracelulárních
metabolitů
analytickým
metodám za
účelem jejich
stanovení
ZAKONCENTROVÁNÍ
VZORKU
Obohacení vzorku o
vybrané metabolity
ANALÝZA
UHASÍNÁNÍ
Biologické tekutiny
Extrakce metabolitů
Extrakce metabolitů
RI
UV
Metabolite target analysis
MS
NMR
CE
MS
LC
MS
GC
GC
CE
HPLC
Derivatizace
Derivatizace
NMR, FT-IR,
Raman
ESI-MS
Metabolite profiling
Fingerprinting,
Footprinting
VÝHODY CE:
•
•
•
•
•
široký výběr aplikací
vysoká separační účinnost
krátký čas analýz
minimální spotřeba vzorku
minimální odpady organických činidel → nízká cena
NEVÝHODY CE:
• Nízká koncentrační citlivost (CE s UV detekcí)
Řešení problému:
 využití detektoru s vyšší citlivostí
 bublinková kapilára, Z-kapilára
Obr.: Bublinková kapilára.
 on-line prekoncentrační techniky
• field enhanced sample stacking
• sweeping
• dynamic pH junction
• transient isotachophoresis
Obr.: Field enhanced sample stacking.
CZE: field enhanced sample stacking
Optimální separační podmínky:
• Křemenná kapilára: 75 m I.D., Ltot 95 cm,
Leff 86,5 cm, teplota: 25 °C.
• Základní elektrolyt: 150 mM glycin, pH 9,55
• Dávkování vzorku: hydrodynamické tlakové,
dávkováno po dobu 25 s při 35 mbar.
• Separační napětí: 30 kV (pozitivní polarita).
• Detekce: přímá, při 260 nm.
• Vzorek: směs standardů rozpuštěná
v deionizované vodě.
Validace metody:
Metabolite:
NAD+
NADH
AMP
NADP+
CMP
GMP
AcCoa
UMP
ADP
NADPH
GDP
CDP
ATP
GTP
CTP
UDP
UTP
RSD, migrační čas (%), N=10
0.40
*
0.48
0.51
0.50
0.52
0.57
0.52
0.57
0.55
0.57
0.62
0.59
0.59
0.15
0.65
0.59
0.71
RSD, plocha píku (%), N=10
3.87
*
4.16
4.27
4.38
4.12
4.10
4.40
4.31
4.40
6.24
4.33
4.09
4.23
4.34
4.08
3.87
4.10
Korelační koeficient
0.9931
0.9937
0.9943
0.9927
0.9910
0.9927
0.9933
0.9928
0.9909
0.9986
0.9923
0.9924
0.9931
0.9928
0.9932
0.9938
0.9943
LOQ, limit kvantifikace (µM)
0.9
1.0
0.9
0.5
1.5
1.0
0.5
1.2
0.5
1.0
0.9
1.5
0.9
1.2
2.0
1.0
1.5
*
*
*
Literatura:
▪ Lu, W., Kimball, E., Rabinowitz, J.D., J. Am. Soc. Mass Spectrom. 2006, 17, 37-50.
▪ Grob, M.K., O´Brien, K., Chu, J.J., Chen, D.D.Y., J. Chromatogr. B 2003, 788, 103-111.
Testované složení extrakčního média:
• EtOH (20, 50, 80, 100%)
• MetOH (20, 50, 80, 100%)
• ACN (20, 50, 80, 100%)
Postup extrakce:
Centrifugace
(6 min, 3 000×g, 4°C)
Supernatant
Pelet + 300 l of 50% ACN (4 °C)
Buněčná suspenze
bakterie P. Denitrificans
Inkubace (15 min., 4 °C)
Centrifugace
(5 min, 16 100g, 4 °C)
Supernatant: umístěn na led
Pelet: 2x extrakce pomocí
200 l 50 % ACN
Odpaření ACN na vakuovém
koncentrátoru, 45 °C
Rozpuštění suchého vzorku
v deionizované vodě
Centrifugace přes
Millipore 5 kDa filtr
Analýza extraktu bakterie P. Denitrificans – kvantifikováno 11 metabolitů
Extrakt bakterie P. denitrificans
Směs standardů
Optimální separační podmínky:
• Křemenná kapilára: 75 m I.D., Ltot 95 cm,
Leff 86.5 cm, teplota: 25 °C.
• Základní elektrolyt: 150 mM glycin, pH 9.55
• Dávkování vzorku: hydrodynamické tlakové,
dávkováno po dobu 25 s při 35 mbar.
• Separační napětí: 30 kV (pozitivní polarita).
• Detekce: přímá, při 260 nm.
• Vzorek: směs standardů rozpuštěná
v deionizované vodě.
Proces extrakce: stejný jako u bakterie P. Denitrificans
Analýza extraktu kmenových buněk- kvantifikováno 10 metabolitů
Extrakt kmenových buněk
Směs standardů
Optimální separační podmínky:
• Křemenná kapilára: 75 m I.D., Ltot 95 cm,
Leff 86,5 cm, teplota: 25 °C.
• Základní elektrolyt: 150 mM glycin, pH 9,55
• Dávkování vzorku: hydrodynamické tlakové,
dávkováno po dobu 25 s při 35 mbar.
• Separační napětí: 30 kV (pozitivní polarita).
• Detekce: přímá, při 260 nm.
• Vzorek: směs standardů rozpuštěná
v deionizované vodě.
Proces extrakce: stejný jako u bakterie P. Denitrificans
Analýza extraktu kmenových buněk- identifikovány 4 metabolity
Extrakt Vitis Vinifera
NADP
AMP
GMP
CMP
Optimální separační podmínky:
• Křemenná kapilára: 75 m I.D., Ltot 95 cm,
Leff 86,5 cm, teplota: 25 °C.
• Základní elektrolyt: 150 mM glycin, pH 9,55
• Dávkování vzorku: hydrodynamické tlakové,
dávkováno po dobu 25 s při 35 mbar.
• Separační napětí: 30 kV (pozitivní polarita).
• Detekce: přímá, při 260 nm.
• Vzorek: směs standardů rozpuštěná
v deionizované vodě.
Školitel:
Prof. RNDr. Zdeněk Glatz, CSc.
Kolegové:
Mgr. Marta Zeisbergerová, Ph.D.
Mgr. Bc. Roman Řemínek
Mgr. Aleš Mádr
Mgr. Monika Langmajerová
Mgr. Lenka Michalcová