Pokračování

© K. Valentová, D. Stejskal, P. Bednář, J. Vostálová, Č. Číhalík, R. Večeřová, D. Koukalová,
M. Kolář, R. Reichenbach, L. Škňouřilová, J. Ulrichová, V. Šimánek
1
PILOTNÍ DVOJITĚ SLEPÁ PLACEBEM KONTROLOVANÁ STUDIE
S DOPLŇKEM STRAVY URINAL NA ZDRAVÝCH ŽENÁCH
Kateřina Valentová1, David Stejskal2, Petr Bednář3, Jitka Vostálová1, Čestmír Číhalík4,
Renata Večeřová5, Dagmar Koukalová5, Milan Kolář5, Richard Reichenbach6,
Lucyna Škňouřilová6, Jitka Ulrichová1, Vilím Šimánek1*
1
2
3
4
5
6
Ústav lékařské chemie a biochemie, Lékařská fakulta, Univerzita Palackého, Hněvotínská 3, 775 15 Olomouc,
[email protected],
Nemocnice Šternberk,
Katedra analytické chemie, Přírodovědecká fakulta, Univerzita Palackého,
Klinika tělovýchovného lékařství, Fakultní nemocnice, Olomouc,
Ústav mikrobiologie, Lékařská fakulta, Univerzita Palackého,
WALMARK, a.s., Třinec – Oldřichovice
V pilotní klinické studii na mladých zdravých ženách (n = 65) byly testovány dvě dávky sušené šťávy brusinky
(Vaccinium macrocarpon) v množství 400 mg, resp. 1200 mg/den po dobu 8 týdnů. Moč probandů užívajících vyšší dávku
inhibovala adherenci uropatogenního kmene Escherichia coli. Ve srovnání s placebem byly v moči stanoveny metodou
HPLC/ESI-MS významně zvýšené hladiny kyseliny hippurové, glukuronidu a methoxyderivátu kvercetinu (p < 0,05).
Anthokyaniny ani proanthokyanidiny nebyly v moči nalezeny. Došlo ke statisticky významnému snížení hladiny produktů
pokročilé oxidace bílkovin (AOPP) v krvi. Dosud u žádného z doplňků stravy, které obsahují přírodní antioxidanty,
nebyl tento specifický ochranný účinek proti oxidačnímu poškození bílkovin popsán.
ÚVOD
Plody brusinky (Vaccinium macrocarpon) a jejich šťáva jsou v tradiční medicíně používány v profylaxi a léčbě
mikrobiální infekce vedoucí ke chronickému zánětu močových cest (Howell, 2002, Harkins 2000, Lynch 2004,
Raz et al. 2004, Yarnell 2002). Šťáva plodů obsahuje vitaminy C, E a K, glukosu, fruktosu, polyfenolové glykosidy – anthokyaniny, proanthokyanidiny (kondenzované
taniny), flavonoidy, kyseliny gallovou, benzoovou, citronovou a šťavelovou (Foo et al. 2000a, 2000b, Jensen et al.
2002, Kandil et al. 2002, Murphy et al. 2003, Prior et al.
2001, Rimando et al. 2004, Seeram et al. 2004, Vinson
et al. 2001a, Vinson et al. 2001b, Vinson et al. 2001c,
Vvedenskaya et al. 2004, Zhang a Zuo 2004, Zuo et al.
2002). O biologické aktivitě brusinky bylo v nedávné době
publikováno několik přehledných článků (Anonymous
2005b, 2005c, 2005d, Berger 2005, Dreikorn 2005,
Howell 2002). Některé z látek plodů V. macrocarpon mají
farmakologicky ověřené účinky na složení plazmatických
lipidů a zvyšují antioxidační kapacitu krve. Polyfenolové
glykosidy mají protizánětlivý účinek chránící cévní epitel
a spolu s dalšími látkami mají chemoprotektivní a antioxidační účinky (Chu a Liu 2005, Reed 2002, Ruel et al.
2005, Vattem et al. 2005, Vinson et al. 2001a, Vinson
et al. 2001b, Vinson et al. 2001c, Wang a Stretch 2001,
Yan et al. 2002, Zuo et al. 2002). Medicínsky zajímavým
je účinek šťávy plodů na adherenci patogenních bakterií na
epitel močových cest. Z hlediska profylaxe je významné
zabránění adheze patogenů, především Escherichia coli, na
epitel močové trubice a močového měchýře. Tato bakterie
je dominantní příčinou komunitních infekcí močových
cest (Allison et al. 2000, Berger 2005, Di Martino et al.
2005, Foo et al. 2000a, 2000b, Howell et al. 2005, Turner
et al. 2005). Metaanalýza klinických studií nepotvrdila
terapeutický účinek šťávy u chronické infekce močových
cest (Jepson et al. 2004). Ve třech klinických studiích z roku 2005 byl však potvrzen preventivní účinek šťávy plodů
na močový trakt (Crews et al. 2005, McMurdo et al. 2005,
Super et al. 2005). Brusinková šťáva inhibovala adherenci
Helicobacter pylori na sliznici žaludku (Burger et al. 2002,
Zhang et al. 2005), tvorbu zubního plaku (Anonymous
2005a, Koo et al. 2006, Steinberg et al. 2005) a snižovala
virulenci virů chřipky (Weiss et al. 2005). Antiadherenční
účinky jsou vesměs připisovány proanthokyanidinovým
trimerům typu A (Foo et al. 2000a, 2000b, Howell et al.
2005), přičemž anthokyaninová frakce z brusinek neměla výraznou antibakteriální aktivitu (Leitao et al. 2005,
Monroy-Torres a Macias 2005). V literatuře jsme nenalezli jediný důkaz o možné přítomnosti antiadherenčně působících proanthokyanidinových trimerů typu A v lidské
moči (Ammon a Kaul 1994, Zhang a Zuo 2004, McGhie
et al. 2003). Antiadherenční aktivita moče byla prokázána
u myší po 30denním podávání (Howel et al. 2001) a v experimentech na dobrovolnících (n = 5, resp. n = 6) po
jednorázovém požití 42,5 g sušených brusinek (Greenberg
et al. 2005) nebo 240 ml brusinkového džusu (Howell
et al. 2005). Fruktosa je další látkou, které je připisována antiadherenční aktivita brusinky (Zafriri et al. 1989).
Fruktosa je obsažena ve všech druzích ovoce, avšak účinek na močový trakt byl prokázán výhradně u brusinek.
Antiadherenční účinek na některé kmeny E. coli v pod-
2
K. Valentová, D. Stejskal, P. Bednář, J. Vostálová, Č. Číhalík, R. Večeřová, D. Koukalová,
M. Kolář, R. Reichenbach, L. Škňouřilová, J. Ulrichová, V. Šimánek
mínkách in vitro měla také šťáva citrusových plodů, avšak
na kmeny vybavené P-fimbriemi nebyla aktivní (Zafriri
et al. 1989). U potravin se srovnatelným obsahem fruktosy
– hroznová a jablečná šťáva, sušené hrozinky a čokoláda,
nebyl antiadherenční účinek prokázán (Greenberg et al.
2005, Howell et al. 2005). Raz et al. (2004) předpokládají,
že účinek látek z brusinky je vzhledem k velmi nízké biodostupnosti primárně lokalizován do spodní části trávicího traktu, kde působí selektivně na potenciálně patogenní
bakterie.
Z nežádoucích účinků brusinkové šťávy je uváděno
riziko nefrolitiázy (Gettman et al. 2005, McHarg et al.
2003, Terris et al. 2001) a zvýšená hladina salicylátů
v plazmě (Duthie et al. 2005). Možná léková interakce
brusinky s antikoagulanciemi a/nebo antitrombotiky v důsledku inhibice CYP2C9 uváděná v pracích Sylvana a Justice (2005) a Walshe (2005) nebyla potvrzena (Greeblatt
et al. 2006).
Na světovém trhu je řada výrobků, které obsahují celé
plody brusinky, jejich šťávu nebo koncentrovaný extrakt
šťávy. Výrobci je doporučují jako funkční potraviny a/
nebo doplňky stravy k zabránění opakovaných infekcí
močového traktu zejména u žen. Dosavadní studie o antiadherenční aktivitě látek obsažených v plodech a údaje
o možných vedlejších účincích po dlouhodobém požívání
brusinky nejsou úplné. Žádná z klinických studií o účincích plodů, brusinkové šťávy a/nebo jejího koncentrátu
nebyla zaměřena na ověření bezpečnosti dlouhodobého
pravidelného užívání této funkční potraviny. Cílem naší
dvojitě slepé, placebem kontrolované studie, provedené na
mladých zdravých ženách, bylo vyhodnocení vlivu 8 týdenního užívání dávek 400 mg/den a 1200 mg/den sušené brusinkové šťávy ve formě doplňku stravy. U žen byly sledovány
základní parametry klinické biochemie a hematologie, hladina produktů lipoperoxidace, antioxidační kapacita krve,
přítomnost metabolitů látek brusinky v moči a antiadherenční aktivita močí ex vivo. U aktivní složky použitého
doplňku stravy bylo analyzováno jeho složení a testována
antimikrobiální a antiadherenční aktivita in vitro.
EXPERIMENTÁLNÍ ČÁST
Materiál
Pro in vitro studie byla použita standardizovaná sušená
šťáva z plodů brusinky Nutricran-90TM (Decas Botanical
Synergies, Wareham, MA, USA). V klinické studii byl
podáván doplněk stravy Urinal. Jedna želatinová tobolka
přípravku obsahovala 200 mg Nutricranu-90TM, 290 mg
sojového oleje, 15 mg lecithinu a 10 mg včelího vosku;
tobolka placeba 443 mg sojového oleje. Přípravek a placebo byly poskytnuty firmou Walmark a.s. (Třinec, Česká
republika).
Analýza anthokyaninů a fenolových sloučenin
Přístroj a metodika. Pro analýzy byl použit mikrokapalinový chromatograf (μLC/MS) CapLC (Waters
Corporation, Milford, USA) spojený s hmotnostním spektrometrem na bázi iontové pasti (LCQ, Finnigan, USA)
nebo hybridním hmotnostním spektrometrem Q-TOF
Premier (Waters Corporation). Pro chromatografickou
separaci byla použita mikrokolona Gemini C-18 (150 ×
0,3 mm, Phenomenex, USA). Dávkováno bylo 10 μl (přeplňování dávkovací smyčky) nebo 2 μl vzorku. Jako ionizační technika byl použit elektrosprej. Nastavení iontové
optiky a parametrů ionizace bylo optimalizováno přímým
zaváděním roztoků standardů malvidin-3-glukosidu, 3-hydroxybenzoové resp. hippurové kyseliny.
Stanovení anthokyaninů. Vzorky (10 mg Nutricranu90TM nebo lyofilizátů močí) byly rozpuštěny v 1 ml 0,01 %
HCl (v/v). Roztoky (0,5 ml) byly dávkovány na SPE kolonku na bázi polymerního sorbentu s vlastnostmi reverzní
fáze (Strata SDB-L, 500 mg/3 ml, Phenomenex, USA).
Kolonka byla následně promyta 3 ml 0,01 % HCl a anthokyaniny eluovány 3 ml okyseleného methanolu (0,01 %
HCl v MeOH). Eluát byl odpařen v proudu dusíku při
40 °C. Odparek byl rozpuštěn v příslušné mobilní fázi
A a analyzován μLC/MS za použití gradientové eluce:
Mobilní fáze A – 0,12 % (v/v) trifluoroctová kyselina, 5 %
acetonitril ve vodě (v/v); mobilní fáze B – 0,12 % trifluoroctová kyselina v acetonitrilu (v/v). Gradient: 0–30 min
10 %–90 % (v/v) B, 35–36 min 90 % (v/v) B.
Stanovení fenolových kyselin a jejich metabolitů s předseparací. Vzorky (Nutricran-90TM nebo lyofilizáty močí) byly
rozpuštěny ve fosfátovém pufru o pH 7,0 (44 mg vzorku
v 1,5 ml pufru) a filtrovány přes teflonový membránový mikrofiltr (porozita 0,45 μm). Filtrát byl nanesen na SPE kolonku (směsný sorbent reverzní fáze/anex Strata Screen A,
Phenomenex, 200 mg/3 ml). Kolonka byla promyta 3 ml
deionizované vody, 3 ml MeOH a eluována 3 ml 1 % HCl
v MeOH. Eluát byl následně odpařen v proudu dusíku.
Odparek byl rozpuštěn v odpovídající mobilní fázi A, pak
analyzován μLC/MS za použití gradientové eluce: Mobilní
fáze A – 0,1% octová kyselina, 5 % acetonitril ve vodě (v/v);
mobilní fáze B – methanol:acetonitril (1 : 1, v/v); gradient:
0–10 min, 5–10 % (v/v) B, 10–30 min 10–50 % (v/v) B, 30–
40 min 50 – 80 (v/v) % B, 40–60 min 80–90 % (v/v) B.
Stanovení fenolových kyselin a jejich metabolitů v moči
bez předseparace. Lyofilizáty močí byly nadto analyzovány
přímo po mikrofiltraci bez přečištění extrakcí tuhou fází.
Tyto analýzy byly navrženy pro případné zachycení netypických metabolitů, které by selektivita použitých SPE
kolonek nepokrývala. Postup není optimální z hlediska
očekávané kontaminace chromatografické kolony a hmotnostního spektrometru a není uvažován jako rutinní analytická technika. S ohledem na identifikované metabolity
se výsledky shodují s analýzami zahrnujícími v postupu
přípravy vzorku extrakce. Vzorky (10 mg lyofilizátů moče)
byly rozpuštěny v 1 ml roztoku odpovídající mobilní fáze
A (viz dále). Takto připravené roztoky byly přefiltrovány přes teflonový membránový mikrofiltr (porozita 0,45
μm) a analyzovány μLC/MS za použití gradientové eluce.
Mobilní fáze A – octová kyselina 5,7 mmol/l, 5% (v/v)
acetonitril ve vodě, mobilní fáze B – acetonitril; gradient:
0–5 min 10 % (v/v) B, 5–25 min 90 % (v/v) B, 25–40 min
90 % (v/v) B, 40–45 min 10 % (v/v) B, 45–50 min 10 %
(v/v) B.
Pilotní dvojitě slepá placebem kontrolovaná studie s doplňkem stravy Urinal na zdravých ženách
Antiadherenční aktivita
Antiadherenční aktivita Nutricranu-90TM a lyofilizátů
močí byla testována na 12 patogenních kmenech E. coli
izolovaných z moči pacientů s uroinfekcí. Výběr kmenů
spočíval v ověření jejich schopnosti aglutinovat červené
krvinky skupiny A1, Rh+, dokumentující tvorbu faktorů
adherence. Vybrané kmeny byly kultivovány v bujónu
s obsahem tryptosy (HiMedia, Indie) při 37 °C, v aerobní
atmosféře s 10 % CO2 po dobu 16 h. Poté byly v množství
300 μl inokulovány na celofánem pokrytou pevnou půdu
(Colonisation Medium, HiMedia, Indie) a kultivovány za
stejných podmínek do druhého dne. Získaná kultura byla
spláchnuta fosfátovým pufrem (PBS) pH 7,0 a centrifugována. Po trojnásobném proprání sedimentu v PBS a změření hustoty bakterií byla jejich koncentrace upravena na
5×108 buněk/ml. K testování biologické aktivity bylo vždy
použito 10 μl této suspenze. Čerstvé erytrocyty (A1, Rh+)
byly třikrát proprány v PBS, naředěny na 3% koncentraci,
k testování vždy použito po 10 μl. Vzorek Nutricranu-90™
byl rozpuštěn a po stanovení pH naředěn geometrickou
řadou v PBS. Z testovaných koncentrací (0–1,20 mg/ml)
bylo pipetováno 30 μl do jamek mikrotitrační destičky U
(Gama, Česká republika), přidány vybrané kmeny E. coli
a inkubovány na třepačce při pokojové teplotě po dobu
10 min. Poté byly přidány červené krvinky a následovala
inkubace 20 min. Mikroskopické hodnocení sledovalo zábranu hemaglutinace proti kontrolám jednotlivých kmenů
E. coli se samotnými krvinkami.
Adheze vybraného patogenního kmene E. coli byla
následně testována také stanovením vytvořeného mikrobiálního biofilmu na polystyrénových destičkách modifikovanou Christensenovou metodou (Christensen et al.
1985). Vzorky Nutricranu-90™, lyofilizovaných močí
a manosy byly rozpuštěny v kultivačním mediu BHI
(Brain Heart Infusion, Himedia, Indie) obohaceném
o 0,25 % (m/v) glukosy. Koncentrace Nutricranu-90™
byla 0, 0,037, 0,075, 0,15, 0,30, 0,6, 1,2 a 2,4 mg/ml, manosa byla použita v koncentraci 0,5 % a 1 % (m/v) a lyofilizované moče byly rozpuštěny na původní koncentraci
v kultivačním mediu. Do jamek sterilních mikrotitračních
destiček bylo pipetováno 200 μl těchto roztoků. Poté byl
pomocí aplikátoru inokulován do každé jamky 1 μl bakteriální suspenze o hustotě podle stupně 1 Mc Farlanda.
Množství bakterií v jamce odpovídalo koncentraci 105-6
CFU (Colony-Forming Unit)/ml. Po inkubaci při 37 °C
do druhého dne v aerobním prostředí byla destička šetrně promyta vodou a utvořený biofilm byl fixován 200
μl 99 % (v/v) methanolu po dobu 15 min. Po odsátí a vyschnutí byly jamky barveny 160 μl 1 % (m/v) krystalové violeti 10 min a důkladně promyty vodou. Fixované
barvivo bylo rozpuštěno přidáním 160 μl 33 % (v/v) kyseliny octové. Intenzita zbarvení odpovídala množství
adherovaných bakterií a byla hodnocena spektrofotometricky při vlnové délce 570 nm (fotometr MRX II,
Dynex) (Christensen et al. 1985, Pratt a Kolter 1998, Ren
et al. 2005, Wakimoto et al. 2004, Stepanovic et al. 2000,
Marthur et al. 2006).
3
Antibakteriální aktivita
Antimikrobiální účinnost Nutricranu-90™ byla testována pomocí standardní diluční mikrometody (National
Committee for Clinical Laboratory Standards 2002,
Urbášková 1998) určením minimální inhibiční koncentrace (MIC). Vzorky byly ředěny geometrickou řadou
v Mueller-Hintonově bujónu (Difco, USA). Do jamek mikrotitračních destiček bylo očkováno standardní množství
testovaného mikroba (hustota inokula odpovídala 105-6
CFU/ml). Po 24 h inkubaci při 37 °C byla odečtena MIC
jako nejnižší koncentrace testované látky, která inhibovala viditelný růst testované bakterie. K testování byly použity standardní referenční kmeny Staphylococcus aureus
CCM 3953, Enterococcus faecalis CCM 4224, E. coli CCM
3954 a Pseudomonas aeruginosa CCM 3955 (označení
dle Sbírky kultur, Masarykova Univerzita, Brno) a dále
kmeny izolované z klinického materiálu pacientů Fakultní
nemocnice Olomouc: Staphylococcus epidermidis, methicilin rezistentní Staphylococcus aureus (MRSA), vankomycin-rezistentní Enterococcus faecium (VRE) a Klebsiella
pneumoniae (ESBL, producent širokospektré β-laktamasy
AmpA). Typ účinku (bakteriostatický či baktericidní) byl
stanoven vyočkováním jamek bez viditelného nárůstu na
krevní agar. Testování bylo provedeno dvakrát.
Schéma studie
Studie se zúčastnilo 65 zdravých dobrovolnic ve věku
19–28 let (průměr 21,6 ± 1,6 let). Studie byly schválena
etickou komisí Lékařské fakulty Univerzity Palackého
a Fakultní nemocnice Olomouc. Evidence účastnic a prohlídky byly prováděny na Klinice tělovýchovného lékařství Fakultní nemocnice Olomouc. Všechny účastnice
podepsaly informovaný souhlas, byly seznámeny s cíli
studie a poučeny, že se mají v době 24 h před každým
odběrem vyhýbat potravinám s vysokým obsahem fenolových látek, zejména barevnému ovoci, ale také kávě a čaji. Dobrovolnice byly náhodně rozděleny do tří skupin:
Skupina I [n = 23, placebo (2 tobolky/den), 21,7 ± 2,0
let; BMI 21,2 ± 2,1; hmotnost 60,3 ± 7,1 kg], skupina II
[n = 20, 400 mg Nutricranu-90TM (2 tobolky Urinal/den);
21,4 ± 2,0 let; BMI 21,2 ± 1,5; hmotnost 59,7 ± 6,1 kg]
a skupina III [n = 22, 1200 mg Nutricranu-90TM (6 tobolek
Urinal/den); 21,7 ± 2,0 let; BMI 21,2 ± 1,5; hmotnost 57,8
± 6,1 kg]. Studie probíhala 8 týdnů se třemi kontrolními
odběry krve a moči – v den 0 (1. odběr), den 28 (2. odběr)
a den 56 (3. odběr). U 10 dobrovolnic ze skupiny III byl
proveden ještě 4. odběr po 8 měsících od ukončení experimentu. U všech účastnic studie byl při každé návštěvě
změřen tlak.
V odebraných vzorcích byly stanoveny základní parametry klinické biochemie a hematologie – cholesterol,
HDL-cholesterol, LDL-cholesterol, triacylglyceroly, ALT,
AST, GMT, močovina, kreatinin, kyselina močová a hladina produktů pokročilé oxidace proteinů (AOPP) v séru,
krevní obraz včetně diferenciálního rozpočtu leukocytů po
ranním odběru krve nalačno; v moči změřeno pH a vyšetřen sediment. U probandů skupiny III bylo vyšetření
rozšířeno o sběr moči po dobu 12 h před odběrem krve,
stanovení celkových fenolů v moči Folin-Ciocalteu fenolo-
4
K. Valentová, D. Stejskal, P. Bednář, J. Vostálová, Č. Číhalík, R. Večeřová, D. Koukalová,
M. Kolář, R. Reichenbach, L. Škňouřilová, J. Ulrichová, V. Šimánek
vým činidlem podle Zhenga a Wanga (2001), antioxidační kapacity krve a vybraných parametrů pro hodnocení
oxidačního stresu (celková antioxidační kapacita a celkové SH-skupiny v plazmě, produkty peroxidace lipidů
jako malondialdehyd (MDA) v plazmě a v erytrocytech,
glutathion (GSH), superoxiddismutasa (SOD) a glutathionperoxidasa (GPX) v erytrocytech (Psotová et al. 2006).
Sbíraná moč byla po celou dobu sběru udržována při 4 °C,
po odevzdání byla ihned odpařena na objem 50 ml a lyofilizována. Parametry klinické biochemie, hematologie
a hodnoty AOPP byly stanoveny na Oddělení klinické
biochemie Nemocnice Šternberk na analyzátoru ADVIA
1650 (Bayer, SRN).
Statistické vyhodnocení
Všechny výsledky byly hodnoceny metodou ANOVA
na hladině významnosti 95 %.
Tabulka 1. Anthokyaniny stanovené v Nutricranu-90™.
Anthokyanin
% (m/m)
Pn-3,5-diGal
Cy-3-Gal
Cy-3-Glu
Pn-3-Ara
Cy-3-Pent
Cy-3-Ara
Pn-3-Gal
Pn-3-Glu
Dp
Suma
0,106
0,031
0,054
0,025
0,013
0,024
0,045
0,135
0,008
0,44
Pn – peonidin, Cy – cyanidin, Dp – delphinidin, Gal – galaktosid, Glu – glykosid, Ara – arabinosid, Pent – blíže
neidentifikovaný pentosid
VÝSLEDKY
Analýza Nutricranu-90™ a biologická aktivita in vitro
Nutricran-90™ obsahoval 10–11 % (m/m) organických
kyselin. Mezi organickými kyselinami byly identifikovány
kyselina benzoová, salicylová, ellagová, ferulová, kávová,
Tabulka 2. Parametry klinické biochemie žen skupiny I (2 tobolky placeba/den).
Parametr
1. odběr
2. odběr
3. odběr
23
23
23
Tlak systolický
110 ± 10
110 ± 11
114 ± 10
Tlak diastolický
71 ± 10
73 ± 9
75 ± 8
Cholesterol (mmol/l)
4,8 ± 0,7
4,7 ± 0,7
Počet dobrovolnic
a
4,8 ± 0,8
HDL cholesterol (mmol/l)
2,01 ± 0,34
1,77 ± 0,26
1,71 ± 0,34a
LDL cholesterol (mmol/l)
2,64 ± 0,50
2,54 ± 0,53
2,45 ± 0,54
Triacylglyceroly (mmol/l)
1,11 ± 0,38
1,03 ± 0,65
1,06 ± 0,59
ALT (μkat/l)
0,33 ± 0,14
0,34 ± 0,19
0,30 ± 0,18
AST (μkat/l)
0,37 ± 0,07
0,33 ± 0,09
0,24 ± 0,11a,b
GMT (μkat/l)
0,25 ± 0,12
0,30 ± 0,20
0,24 ± 0,10
Urea (mmol/l)
2,97 ± 0,71
3,21 ± 0,73
3,24 ± 0,51
Kreatinin (μmol/l)
84,7 ± 5,5
81,0 ± 5,2
79,0 ± 4,6a,b
Kys. močová (μmol/l)
273,8 ± 57,1
247,8 ± 40,0
249,1 ± 50,6
AOPP (μmol/l)
55,6 ± 14,5
65,5 ± 39,9
51,2 ± 27,3
pH moči
6,18 ± 0,52
5,91 ± 0,69
5,98 ± 0,53
KO: Hemoglobin (g/l)
134,1 ± 9,2
137,7 ± 8,7
133,3 ± 8,0
Erytrocyty
4,63 ± 0,21
4,48 ± 0,23
4,54 ± 0,26
Leukocyty
7,6 ± 1,5
7,5 ± 1,6
7,7 ± 2,1
Trombocyty
276 ± 42
285 ± 55
277 ± 61
p < 0,05 vs. 1. kontrola, b p < 0,05 vs. 2. kontrola
a
5
Pilotní dvojitě slepá placebem kontrolovaná studie s doplňkem stravy Urinal na zdravých ženách
Tabulka 3. Parametry klinické biochemie žen skupiny II (2 tobolky Urinal/den).
Parametr
2. odběr
3. odběr
Počet dobrovolnic
20
19
18
Tlak systolický
114 ± 9
114 ± 13
116 ± 10
Tlak diastolický
76 ± 5
78 ± 9
77 ± 7
Cholesterol (mmol/l)
4,7 ± 0,7
4,7 ± 0,6
5,0 ± 0,8
HDL cholesterol (mmol/l) 1,91 ± 0,30
1,75 ± 0,22
1,69 ± 0,23a
LDL cholesterol (mmol/l)
2,50 ± 0,51
2,39 ± 0,51
2,30 ± 0,46
Triacylglyceroly (mmol/l)
1,36 ± 0,45
1,22 ± 0,29
1,34 ± 0,58
ALT (μkat/l)
0,28 ± 0,09
0,30 ± 0,08
0,30 ± 0,08
a,c
0,25 ± 0,07a
AST (μkat/l)
0,36 ± 0,08
0,25 ± 0,07
GMT (μkat/l)
0,22 ± 0,09
0,21 ± 0,08
0,23 ± 0,07
Urea (mmol/l)
3,11 ± 0,91
3,37 ± 0,95
3,19 ± 1,14
Kreatinin (μmol/l)
77,3 ± 15,3c
75,2 ± 6,9c
81,4 ± 6,0
Kys. močová (μmol/l)
257,9 ± 52,4
249,9 ± 62,7
a
AOPP (μmol/l)
42,9 ± 10,1
57,5 ± 19,8
pH moči
6,13 ± 0,88
5,71 ± 0,51
KO: Hemoglobin (g/l)
a
1. odběr
242,3 ± 60,9
61,8 ± 21,3a
5,97 ± 0,70
c
129,5 ± 10,4
127,6 ± 11,0
129,2 ± 12,0
Erytrocyty
4,62 ± 0,30
4,58 ± 0,26
4,59 ± 0,28
Leukocyty
7,86 ± 1,83
7,89 ± 1,52
7,97 ± 1,25
Trombocyty
303 ± 92
296 ± 91
296 ± 97
p < 0,05 vs. 1. kontrola, b p < 0,05 vs. 2. kontrola, c p < 0,05 vs. skupina I, d p < 0,05 vs. skupina II
p-kumarová, protokatechová, sinapová, vanilová a některé
izomery kyseliny dihydroxybenzoové. Obsah polyfenolů
byl 3 % (m/m). Byl nalezen kvercetin cca. 0,3 % (m/m)
a anthokyaninová barviva v množství 0,44 % (m/m, tab. 1).
Nutricran-90TM dále obsahoval 42 % (m/m) glukosy, 26 %
(m/m) fruktosy a 10 % (m/m) MgO jako nosiče.
Antiadherenční aktivita Nutricranu-90™ byla prokázána pro koncentrace 0,075–0,120 mg/ml; v testu hodnocení
tvorby biofilmu byl pokles adherence změřen již u koncentrace 0,037 mg/ml. Statisticky významný pokles adherence
nastal až u 2,40 mg/ml. Nutricran-90™ vykazoval slabou
antimikrobiální aktivitu na testovaných kmenech bakterií
(MIC 179 – 357 mg/ml). Nejvyšší účinnost byla zaznamenána u Pseudomonas aeruginosa s MIC 179 mg/ml.
Biobezpečnost přípravku
Z celkového počtu 65 dobrovolnic studii dokončilo 57.
Ze skupiny I odstoupily 2 ženy (respirační onemocnění
(1) a osobní důvody (1)), ze skupiny III 6 dobrovolnic
(respirační onemocnění (2), nadměrné močení (1), překyselení žaludku (1) a osobní důvody (2)).
Statisticky vyhodnocená data pro všechny skupiny jsou
uvedena v tabulkách 2–4. Data byla hodnocena jednak
mezi jednotlivými kontrolními odběry v každé skupině,
jednak mezi skupinami navzájem. U placeba (skupina I)
byl pozorován statisticky významný pokles HDL cholesterolu při druhé a třetí kontrole ve srovnání s kontrolou
v den 0. Při třetí kontrole došlo navíc k poklesu hladiny
AST a kreatininu v séru (tab. 2). Ve skupině II (400 mg
Nutricranu-90™/den) došlo k poklesu HDL cholesterolu při třetím odběru, k poklesu hladiny AST při druhém
a třetím odběru. Hladina AST při druhém odběru byla
nižší než ve skupině I, stejně jako hemoglobin (tab. 3).
Ve skupině III (1200 mg Nutricranu-90™/den) byl při
prvním odběru zaznamenán statisticky významně, avšak
klinicky nevýznamně vyšší diastolický tlak ve srovnání se
skupinou I. V dalších odběrech se však již tento jev nevyskytoval. Ve srovnání se skupinou I byly naměřeny také
nižší hodnoty hladiny ALT v plazmě při prvním a druhém
odběru, avšak vyšší hladinu AST při druhém a třetím odběru ve srovnání se skupinou II. Při třetím odběru byla
hodnota AST významně vyšší než při odběru prvním.
Významně poklesla také hladina kreatininu v séru při druhém odběru, a to ve srovnání s prvním a třetím odběrem
i se skupinou II (tab. 4). Všechny tyto pozorované změny
však byly v mezích fyziologických norem a nebyl pozorován
žádný vedlejší účinek přípravku na dobrovolnice.
6
K. Valentová, D. Stejskal, P. Bednář, J. Vostálová, Č. Číhalík, R. Večeřová, D. Koukalová,
M. Kolář, R. Reichenbach, L. Škňouřilová, J. Ulrichová, V. Šimánek
Tabulka 4. Parametry klinické biochemie žen skupiny III (6 tobolek Urinal/den).
Parametr
1. odběr
2. odběr
3. odběr
22
20
16
Tlak systolický
119 ± 11c
115 ± 11
116 ± 10
Tlak diastolický
80 ± 8
75 ± 9
78 ± 6
Počet dobrovolnic
Cholesterol (mmol/l)
4,7 ± 0,9
4,7 ± 1,0
HDL cholesterol (mmol/l)
c
1,79 ± 0,23
1,78 ± 0,27
1,72 ± 0,21
LDL cholesterol (mmol/l)
2,69 ± 0,67
2,67 ± 0,72
2,60 ± 0,74
Triacylglyceroly (mmol/l)
1,26 ± 0,43
1,16 ± 0,62
1,23 ± 0,57
ALT (μkat/l)
0,25 ± 0,07c
0,25 ± 0,06c
0,25 ± 0,07
AST (μkat/l)
0,40 ± 0,05
0,39 ± 0,06
d
GMT (μkat/l)
0,26 ± 0,11
0,27 ± 0,10
0,25 ± 0,10
Urea (mmol/l)
3,41 ± 0,52
3,11 ± 0,59
3,35 ± 0,54
Kreatinin (μmol/l)
79,4 ± 5,0
73,8 ± 4,3a,c
82,6 ± 6,1b
265,8 ± 46,5
289,7 ± 61,0c
270,5 ± 51,6
Kys. močová (μmol/l)
Antioxidační kapacitae
6,90 ± 1,11
7,32 ± 1,38
6,87 ± 1,25
f
SH-skupiny
5,99 ± 1,07
5,87 ± 0,79
4,93 ± 0,57a,b
SOD –ery (U/g proteinu)
2,59 ± 0,51
2,73 ± 0,42
2,68 ± 0,33
MDA-eryf
0,46 ± 0,10
0,57 ± 0,13a
0,59 ± 0,13a
GSH-eryf
116,3 ± 24,5
119,6 ± 23,4
124,3 ± 24,1
GPX-ery (μU/ g proteinu)
10,60 ± 2,28
11,06 ± 2,25
11,74 ± 3,01
MDA
0,16 ± 0,041
0,16 ± 0,031
0,15 ± 0,036
pH moči
5,79 ± 0,49
5,89 ± 0,54
5,75 ± 0,58
Celkové fenoly moč
(mg/mol kreatininu)
37,7 ± 14,9
54,2 ± 20,5a
37,8 ± 12,7b
132,3 ± 10,63
132,0 ± 6,94
131,1 ± 8,96
Erytrocyty
4,54 ± 0,35
4,53 ± 0,27
4,47 ± 0,37
Leukocyty
7,31 ± 1,75
7,36 ± 1,54
7,41 ± 1,84
276 ± 52
301 ± 54
277 ± 54
Trombocyty
9,53 ± 16,8
11,4 ± 12,1a,c,d
47,4 ± 25,0
KO: Hemoglobin (g/l)
f
a,c,d
0,43 ± 0,07c,d
AOPP (μmol/l)
f
a
4,6 ± 0,8
p < 0,05 vs. 1. kontrola, b p < 0,05 vs. 2. kontrola, c p < 0,05 vs. skupina I, d p < 0,05 vs. skupina II, e μA/ml plazmy;
μmol/g proteinu
Antioxidační status
U dobrovolnic všech tří skupin byla stanovena hladina produktů pokročilé oxidace proteinů (Advanced
Oxidation Protein Products, AOPP). Zatímco ve skupině II došlo při druhém a třetím odběru ke statisticky
významnému zvýšení tohoto parametru pozdního oxidačního stresu, ve skupině III došlo již po čtyřech týdnech užívání doplňku stravy ke statisticky významnému
poklesu AOPP, a to na hodnoty, které běžně v populaci
nenacházíme. U některých dobrovolnic byla naměřena
hodnota 5,0 μmol/l (tab. 4). Citlivost použité metody
neumožňovala stanovit nižší množství AOPP. Vzhledem
k tomuto neočekávanému pozitivnímu výsledku jsme se
rozhodli u skupiny III provést ještě stanovení dalších pa-
rametrů pro hodnocení oxidačního stresu. Byl naměřen
pokles celkové hladiny celkových SH-skupin v plazmě
u třetího odběru a nárůst hladiny produktů lipoperoxidace (MDA) v erytrocytech při druhém a třetím odběru
ve srovnání s odběrem prvním. Nebyla změněna antioxidační kapacita plazmy ani hladina produktů lipoperoxidace v plazmě. U erytrocytů nebyla ovlivněna hladina
SOD, GSH a GPX. Po 8 měsících od ukončení studie
bylo u 10 dobrovolnic ze skupiny III provedeno kontrolní měření hladiny AOPP. Hladina AOPP při tomto
čtvrtém odběru krve (průměrná hodnota byla 27,65 ±
6,54 μmol/l) byla statisticky významně vyšší ve srovnání
s druhou a třetí kontrolou, nedosáhla však hladiny změřené při prvním odběru (obr. 1).
7
Pilotní dvojitě slepá placebem kontrolovaná studie s doplňkem stravy Urinal na zdravých ženách
AOPP
µmol.l-1
1. odběr
2. odběr
3. odběr
80
4. odběr
70
60
47,36
50
40
27,65
30
20
11,41
9,53
10
0
Obr. 1. Hladina AOPP v séru dobrovolnic skupiny III při užívání 6 tobolek Urinalu/den) 1. Odběr
v den 0, 2. odběr v den 28, třetí odběr v den 56 užívání přípravku; 4. odběr 8 měsíců po
ukončení studie.
E. coli
3,5
3
A 570 nm
2,5
2
1,5
1
0,5
22
an
os
N
a 23
ut
ric Ma 0 ,5
N ra n- no s %
a
ut
ric 9 0™ 1 %
ra
n- 2,4
90
™ mg
3
K 7 µg
on
tr o
la
M
19
18
16
15
14
13
12
9
5
4
3
2
0
Obr. 2. Vliv močí, Nutricranu-90™ a manosy na adherenci uropatogenní E. coli. Vzorky 2-22
odpovídají dobrovolnicím skupiny III, vzorek 23 je moč ze skupiny I (placebo).
Identifikace a stanovení fenolových látek v moči
Během studie nedošlo u žádné účastnice ze skupin
I až III ke statisticky významné změně hodnoty pH
moče. Celková hladina fenolových látek v moči dobrovolnic skupiny III, vztažená na kreatinin, se statisticky
významně zvýšila při druhém odběru, při třetím odběru
však jejich koncentrace zase poklesla (p < 0,05, tab. 4).
U skupiny III byly v moči sbírané poslední den studie analyzovány organické kyseliny a fenolové sloučeniny. Vedle
kyseliny citrónové byly identifikovány kyseliny hippurová
a salicylurová, glukuronid a methoxyderivát kvercetinu
a apigenin. Anthokyaniny ani proanthokyanidiny nebyly
nalezeny (analýzy byly prováděny při pozitivní i negativní
ionizaci elektrosprejem).
Koncentrace těchto látek v moči mohou být ovlivněny stravováním. Proto byly porovnány vzorky vykazující
vysokou inhibici adherence (lyofilizovaná moč probandů
skupiny III) se vzorkem kontrolním (skupina I). U močí
s antiadherenční aktivitou byly stanoveny zvýšené hladiny
kyseliny hippurové, glukuronidu a methoxyderivátu kvercetinu (p < 0,05).
8
K. Valentová, D. Stejskal, P. Bednář, J. Vostálová, Č. Číhalík, R. Večeřová, D. Koukalová,
M. Kolář, R. Reichenbach, L. Škňouřilová, J. Ulrichová, V. Šimánek
Antiadherenční aktivita moče
Účinek močí na adhezi E. coli byl testován u skupiny III metodou tvorby biofilmu. Bakterie uropatogenního kmene E. coli vytvořily biofilm s početnou populací
pouze v prostředí moče bez metabolických produktů
brusinky (vzorek 23, skupina I) (obr. 2). Vzorky ze skupiny III snižovaly adhezi E. coli ve srovnání se vzorkem
skupiny I (p < 0,01). Manosa v koncentraci 0,5 % a 1 %
snížila množství adherovaných bakterií E. coli výrazněji
než vzorky ze skupiny III (p < 0,05).
DISKUSE
Srovnání hodnot parametrů klinické biochemie
mezi skupinou I (placebo) a skupinou II (400 mg/den
Nutricranu-90TM) neprokázalo statisticky významný účinek přípravku Urinal na žádný z nich (tab. 2 a 3). Rozdíly
mezi některými parametry uvnitř obou skupin, resp. mezi
oběma skupinami byly vždy v rozmezí normálních hodnot
a lze je připsat změnám ve složení diety během studie.
Ve skupině III (1200 mg/den Nutricranu-90TM) vedlo 8 týdenní podávání přípravku Urinal ke statisticky významnému snížení hladiny produktů pokročilé oxidace proteinů
(Advaced Oxidation Protein Products, AOPP) na hodnoty, které běžně v populaci nenacházíme (tab. 4, obr. 1).
V provedeném kontrolním odběru 8 měsíců po ukončení
experimentu došlo k opětovnému zvýšení hladiny AOPP
v séru (obr. 1). Tento účinek na hladinu produktů AOPP
nebyl u rostlinných antioxidantů, s výjimkou kyseliny askorbové, dosud popsán (Griffiths et al. 2002). Nenalezli
jsme vztah mezi AOPP a ostatními parametry oxidačního
poškození (tab. 4). AOPP vznikají reakcí volných radikálů s bílkovinami. Aktivují prozánětlivé cytokiny, které
spouštějí oxidační „vzplanutí“ u neutrofilů, monocytů
a T-lymfocytů (Kalousová et al. 2005). Bylo zjištěno, že
nemocní s ischemickou chorobou srdeční a uremickým
syndromem měli zvýšené hodnoty AOPP. U obou skupin
nemocných byly hladiny AOPP statisticky významně vyšší
než u zdravých dobrovolníků (Kaneda et al. 2002; WitkoSarsat et al. 1996). Naše studie prokázala, že extrakt šťávy
plodů V. macrocarpon může mít mimo antiadherenčního,
také antiaterogenní účinek. Ruel et al. (2005) popsali, že
po pití brusinkové šťávy (muži, n = 21, věk 38 ± 8 roků,
7 ml/kg hmotnosti, 2 týdny) došlo ke snížení hladiny
produktů lipoperoxidačního poškození. Obsahové látky
šťávy nebyly charakterizovány. Námi nalezené rozdíly
v hodnotách parametrů oxidačního poškození (celkové
SH-skupiny, MDA, GSH a TBARS) uvnitř skupiny III se
pohybovaly v rozmezí normálních hodnot (tab. 4).
Ex vivo antiadherenční aktivita moče byla dosud u lidí studována jen po jednorázové konzumaci brusinky.
Aktivitu na uropatogenní E. coli měly moče šesti dobrovolníků po vypití 240 ml brusinkové šťávy (Howel et al.
2005), stejně jako moče tří z pěti dobrovolnic po požití
42,5 g sušených plodů brusinky (Greenberg et al. 2005).
Zhang a Zuo (2004) nalezli v plazmě dobrovolníka, po
jednorázovém vypití 1800 ml brusinkového nápoje obsahujícího 25 % ovocného podílu, kyseliny benzoovou,
o-hydroxybenzoovou, p-hydroxybenzoovou, 2,3- a 2,4-di-
hydroxybenzoovou, ferulovou a sinapovou. McGhie et al.
(2003) popsali, že proanthokyanidiny z různých druhů
ovoce, ne však z brusinky, jsou absorbovány a vylučovány
močí u lidí a potkanů. Nicméně v moči bylo detekováno
jen 0,1 % podaného množství proanthokyanidinů. Jediná
zmínka o možné přítomnosti proanthokyanidinových trimerů a oligomerů v moči byla nalezena v práci Ammona
a Kaula (1994). Tito autoři citují disertační práci HeckerNiedieka (1983), kdy myším byly podávány 14C-značené
anthokyaniny izolované z hlohu. Podle autora byly nalezeny v moči trimery a oligomery proanthokyanidinů.
Vzhledem k tomu, že byla měřena pouze radioaktivita
moče, je pravděpodobné, že byly takto detekovány pouze
metabolity značených látek. Naše studie prokázala, že moč
člověka, který dlouhodobě užívá extrakt z plodů brusinky,
má inhibiční účinek na adherenci bakterií vyvolávajících
akutní a/nebo chronickou infekci močových cest (obr. 2).
V močích probandů skupiny III byly ze skupiny fenolových kyselin nalezeny vysoké hladiny kyseliny hippurové,
konjugáty některých dalších fenolových kyselin, z flavonoidů glukuronid a methoxyderivát kvercetinu a apigenin. Kyselina hippurová je pravděpodobně aktivní látkou
v moči, která brání adhezi bakterií na epitel močových
cest. V moči nebyly nalezeny anthokyaniny, resp. proanthokyanidiny, které jsou uváděny jako klíčové faktory v inhibici adherence E. coli. Nepřítomnost těchto polyfenolů
v moči potvrdila výsledky Olthofa et al. (2003), že zdraví
lidé metabolizují polyfenolové látky na fenolové kyseliny
již v trávícím traktu.
ZÁVĚR
Denní dávka doplňku stravy Urinal obsahující 400 mg
Nutricranu-90TM podávaná osm týdnů zdravým ženám neovlivnila žádný ze sledovaných parametrů klinické biochemie
a krevní obraz. U skupiny, která užívala dávku 1200 mg
Nutricranu-90TM/den došlo ke statisticky významnému
snížení hladiny produktů pokročilé oxidace bílkovin v krvi
(AOPP). Dosud u žádného z doplňků stravy, které obsahují
přírodní antioxidanty, nebyl tento specifický ochranný účinek proti oxidačnímu poškození bílkovin popsán. Moč žen
této skupiny měla inhibiční účinek na adherenci uropatogenních kmenů E. coli, nebyl však prokázán vliv vyšší dávky
přípravku na zvýšení její acidity. Plody brusinky, buď jako
funkční potravina a/nebo jako komponenta doplňků stravy,
jsou nejen účinné v ochraně močových cest před infekcí, ale
také mohou být prospěšné rizikovým skupinám populace
ohrožené metabolickým syndromem a dialyzovaným pacientům v ochraně jejich organismu před oxidačním stresem.
PODĚKOVÁNÍ
Autoři prohlašují, že získané výsledky byly interpretovány nezávisle a nevyjadřují žádný obchodní zájem firmy
Walmark, a.s., která poskytla doplněk stravy Urinal a placebo. Za finanční podporu děkujeme projektům MŠMT
ČR (grant MSM 6198959216) a MPO ČR (grant FT-TA3/
024).
Pilotní dvojitě slepá placebem kontrolovaná studie s doplňkem stravy Urinal na zdravých ženách
LITERATURA
Allison DG, Cronin MA, Hawker J, Freeman S (2000) Influence of
cranberry juice on attachment of Escherichia coli to glass. J Basic
Microbiol 40:3–6
Ammon HPT, Kaul R (1994) Crataegus. Herz-kreislauf-wirkunen von
Crataegusextrakten, flavonoiden und procyanidinen. Deutsch
Apothek Zeit 134:2631–2636, německy
Anonymous (2005a) Cranberries fight bacteria. Br Dent J 199:698
Anonymous (2005b) Cranberries. Full of potential health benefits.
Mayo Clin Womens Healthsource 9:9
Anonymous (2005c) Cranberry and urinary tract infection. Drug Ther
Bull 43:17–19
Anonymous (2005d) Cranberry juice and urinary tract infections. Harv
Health Lett 30:7
Berger RE (2005) Cranberries for preventing urinary tract infections.
J Urol 173:1988
Burger O, Weiss E, Sharon N, Tabak M, Neeman I, Ofek I (2002)
Inhibition of Helicobacter pylori adhesion to human gastric mucus
by a high-molecular-weight constituent of cranberry juice. Crit Rev
Food Sci Nutr 42:279–284
Crews WD, Jr., Harrison DW, Griffin ML, Addison K, Yount AM,
Giovenco MA, Hazell J (2005) A double-blinded, placebo-controlled, randomized trial of the neuropsychologic efficacy of cranberry
juice in a sample of cognitively intact older adults: pilot study findings. J Altern Complement Med 11:305–309
Di Martino P, Agniel R, Gaillard JL, Denys P (2005) Effects of cranberry juice on uropathogenic Escherichia coli in vitro biofilm formation. J Chemother 17:563–565
Dreikorn K (2005) Complementary and alternative medicine in urology. BJU Int 96:1177–1184
Duthie GG, Kyle JA, Jenkinson AM, Duthie SJ, Baxter GJ, Paterson
JR (2005) Increased salicylate concentrations in urine of human
volunteers after consumption of cranberry juice. J Agric Food
Chem 53:2897–2900
Foo LY, Lu YR, Howell AB, Vorsa N (2000a) The structure of
cranberry proanthocyanidins which inhibit adherence of uropathogenic P-fimbriated Escherichia coli in vitro. Phytochemistry
54:173–181
Foo LY, Lu YR, Howell AB, Vorsa N (2000b) A-type proanthocyanidin
trimers from cranberry that inhibit adherence of uropathogenic
P-fimbriated Escherichia coli. J Nat Prod 63:1225–1228
Gettman MT, Ogan K, Brinkley LJ, Adams-Huet B, Pak CY, Pearle MS
(2005) Effect of cranberry juice consumption on urinary stone risk
factors. J Urol 174:590–594; quiz 801
Greenberg JA, Newmann SJ, Howell AB (2002) Consumption of
sweetened dried cranberries versus unsweetened raisins for inhibition of uropathogenic Escherichia coli adhesion in human urine:
a pilot study. J Altern Compl Med 11: 875–878
Greenblatt DJ, von Moltke LL, Perloff ES, Luo Y, Harmatz JS, Zinny
MA (2006) Interaction of flurbiprofen with cranberry juice, grape juice, tea, and fluconazole: in vitro and clinical studies. Clin
Pharmacol Ther 79: 125–133
Griffiths HR, Moller L, Bartosz G, Bast A, Bertoni-Freddari C, Collins
A, Cooke M, Coolen S, Haenen G, Hoberg AM, Loft S, Lunec J,
Olinski R, Parry J, Pompella A, Poulsen H, Verhagen H, Astley SB
(2002) Biomarkers. Mol Aspects Med 23: 101–208
Harkins KJ (2000) What‘s the use of cranberry juice? Age Ageing
29(1):9–12.
Hecker-Niediek AE (1983) Untersuchung zur Biogenese, markierung
und pharmakokinetik der procyanidine aus Crataegus-species.
Disertační práce Marburg, str. 33–38.
Hollman OMR, Buijsman MN, van Amelsvoort JM, Katan MB (2003)
Chlorogenic acid, quercetin-3-rutinoside and black tea phenols are
extensively metabolized in humans. J Nutr 133: 1806–1814.
Howell AB (2002) Cranberry proanthocyanidins and the maintenance
of urinary tract health. Crit Rev Food Sci Nutr 42:273–8.
Howell AB, Leahy M, Kurowska E., Guthrie N (2001) In vivo evidence
that cranberry proanthocyanidins inhibit adherence of P-fimbriated
E. coli bacteria to uroepithelial cells. Fed Amer Soc Exp Biol J
15:A284.
9
Howell AB, Reed JD, Krueger CG, Winterbottom R, Cunningham
DG, Leahy M (2005) A-type cranberry proanthocyanidins and
uropathogenic bacterial anti-adhesion activity. Phytochemistry
66:2281–2291
Christensen GD, Simpson WA, Younger JJ, Baddour LM, Barrett
FF, Melton DM (1985) Adherence of Coagulase-Negative
Staphylococci to Plastic Tissue-Culture Plates – a Quantitative
Model for the Adherence of Staphylococci to Medical Devices. J
Clin Microbiol, 22: 996–1006.
Chu YF, Liu RH (2005) Cranberries inhibit LDL oxidation and induce
LDL receptor expression in hepatocytes. Life Sci 77:1892–1901
Jensen HD, Krogfelt KA, Cornett C, Hansen SH, Christensen SB
(2002) Hydrophilic carboxylic acids and iridoid glycosides in the
juice of American and European cranberries (Vaccinium macrocarpon and V-oxycoccos), lingonberries (V-vitis-idaea), and blueberries
(V-myrtillus). J Agric Food Chem 50:6871–6874
Jepson RG, Mihaljevic L, Craig J (2004) Cranberries for treating urinary tract infections. Cochrane Database Syst Rev CD001322
Kalousová M, Zima T, Tesař V, Dusilová-Sulková S, Škrha J (2005)
Advanced glycoxidation end products in chronic diseases – clinical
chemistry and genetic background. Mutat Res 579: 37–46
Kandil FE, Smith MAL, Rogers RB, Pepin MF, Song LL, Pezzuto
JM, Seigler DS (2002) Composition of a chemopreventive proanthocyanidin-rich fraction from cranberry fruits responsible for
the inhibition of 12-O-tetradecanoyl phorbol-13-acetate (TPA)induced ornithine, decarboxylase (ODC) activity. J Agric Food
Chem 50:1063–1069
Kaneda H, Taguchi J, Ogasawara K, Aizawa T, Ohno M (2002)
Increased level of advanced oxidation protein products in patients
with coronary artery disease. Atherosclerosis 162: 221–225
Koo H, Nino de Guzman P, Schobel BD, Vacca Smith AV, Bowen WH
(2006) Influence of cranberry juice on glucan-mediated processes
involved in Streptococcus mutans biofilm development. Caries Res
40:20–27
Leitao DP, Polizello AC, Ito IY, Spadaro AC (2005) Antibacterial screening of anthocyanic and proanthocyanic fractions from cranberry
juice. J Med Food 8:36–40
Lynch DM (2004) Cranberry for prevention of urinary tract infections.
Am Fam Physician 70:2175–2177
Mathur T, Singhal S, Khan S, Upadhyay DJ, Fatma T, Rattan A (2006)
Detection of biofilm formation among the clinical isolates of
Staphylococci: an evaluation of three different screening methods.
Indian J Med Microbiol, 24:25–29
McGhie TK, Ainge GD, Barnett LE, Cooney JM, Jensen DJ (2003)
Anthocyanin glycosides from berry fruit are absorbed and excreted unmetabolized by both humans and rats. J Agric Food Chem
51:4539–4548
McMurdo ME, Bissett LY, Price RJ, Phillips G, Crombie IK (2005)
Does ingestion of cranberry juice reduce symptomatic urinary tract
infections in older people in hospital? A double-blind, placebo-controlled trial. Age Ageing 34:256–261
McHarg T, Rodgers A, Charlton K (2003) Influence of cranberry juice
on the urinary risk factors for calcium oxalate kidney stone formation. BJU International 92:765–768
Monroy-Torres R, Macias AE (2005) Does cranberry juice have bacteriostatic activity? Rev Invest Clin 57:442–446
Murphy BT, MacKinnon SL, Yan XJ, Hammond GB, Vaisberg AJ, Neto
CC (2003) Identification of triterpene hydroxycinnamates with in
vitro antitumor activity from whole cranberry fruit (Vaccinium
macrocarpon). J Agric Food Chem 51:3541–3545
National Committee for Clinical Laboratory Standards (2002)
Performance standards for antimicrobial susceptibility testing.
Twelfth informational supplement. NCCLS document M100-S12.
NCCLS, Wayne, Pennsylvania
Olthof MR, Hollmam PC, Buijsman MN, van Amelsvoort JM, Katan
MB (2003) Chlorogenic acid, quercetin-3-rutinoside and black
tea phenols are extensively metabolized in humans. J Nutr 133:
1806–1814
Pratt LA, Kolter R (1998) Genetic analysis of Escherichia coli biofilm
formation: roles of flagella, motility, chemotaxis and type I pili.
Molecular Microbiology, 30: 285–293
10
K. Valentová, D. Stejskal, P. Bednář, J. Vostálová, Č. Číhalík, R. Večeřová, D. Koukalová,
M. Kolář, R. Reichenbach, L. Škňouřilová, J. Ulrichová, V. Šimánek
Prior RL, Lazarus SA, Cao GH, Muccitelli H, Hammerstone JF
(2001) Identification of procyanidins and anthocyanins in blueberries and cranberries (Vaccinium spp.) using high-performance
liquid chromatography/mass spectrometry. J Agric Food Chem
49:1270–1276
Psotová J, Večeřa R, Zdařilová A, Anzenbacherová E, Kosina P,
Svobodová A., Hrbáč J, Jirovský D, Stiborová M, Lichnovský V,
Vičar J, Šimánek V, Ulrichová J (2006) Safety assesment of sanguiritrin, alkaloid fraction of Macleaya cordata, in rats. Vet MedCzech 51:145–155
Raz R, Chazan B, Dan M (2004) Cranberry juice and urinary tract
infection. Clin Infect Dis. 38:1413–9
Reed J (2002) Cranberry flavonoids, atherosclerosis and cardiovascular
health. Crit Rev Food Sci Nutr 42:301–316
Ren DC, Zuo RJ, Barrios AFG, Bedzyk LA, Eldridge GR, Pasmore ME
(2005) Differential gene expression for investigation of Escherichia
coli biofilm inhibition by plant extract ursolic acid. Applied and
Environmental Microbiology, 71: 4022–4034
Rimando AM, Kalt W, Magee JB, Dewey J, Ballington JR (2004)
Resveratrol, pterostilbene, and piceatannol in Vaccinium berries.
J Agric Food Chem 52:4713–4719
Ruel G, Pomerleau S, Couture P, Lamarche B, Couillard C (2005)
Changes in plasma antioxidant capacity and oxidized low-density
lipoprotein levels in men after short-term cranberry juice consumption. Metab Clin Exper 54:856–861
Seeram NP, Adams LS, Hardy ML, Heber D (2004) Total cranberry
extract versus its phytochemical constituents: Antiproliferative and
synergistic effects against human tumor cell lines. J Agric Food
Chem 52:2512–2517
Steinberg D, Feldman M, Ofek I, Weiss EI (2005) Cranberry high
molecular weight constituents promote Streptococcus sobrinus desorption from artificial biofilm. Int J Antimicrob Agents
25:247–251
Stepanovic S, Vukovic D, Dakic I, Savic B, Svabic-Vlahovic M (2000)
A modified microtiter-plate test for quantification of staphylococcal biofilm formation. Journal of Microbiological Methods, 40:
175–179
Super EA, Kemper KJ, Woods C, Nagaraj S (2005) Cranberry use
among pediatric nephrology patients. Ambul Pediatr 5:249–252
Sylvan L, Justice NP (2005) Possible interaction between warfarin and
cranberry juice. Am Fam Physician 72:1000.
Terris MK, Issa MM, Tacker JR (2001) Dietary supplementation with
cranberry concentrate tablets may increase the risk of nephrolithiasis. Urology 57:26–29
Turner A, Chen SN, Joike MK, Pendland SL, Pauli GF, Farnsworth NR
(2005) Inhibition of uropathogenic Escherichia coli by cranberry
juice: a new antiadherence assay. J Agric Food Chem 53:8940–
8947
Urbášková P (1998) Rezistence bakterií k antibiotikům – vybrané metody. Trios, Praha
Vattem DA, Ghaedian R, Shetty K (2005) Enhancing health benefits
of berries through phenolic antioxidant enrichment: focus on cranberry. Asia Pac J Clin Nutr 14:120–130
Vinson JA, Bose P, Su M (2001a) Cranberry: A fruit unusually rich in
antioxidants. Faseb Journal 15:A287–a287
Vinson JA, Proch J, Bose P, Taffera P, Dick L, Su M (2001b) Cranberries:
Powerful in vitro and in vivo source of antioxidants. Abstracts of
Papers of the American Chemical Society 221:U34–U34
Vinson JA, Su XH, Zubik L, Bose P (2001c) Phenol antioxidant quantity and quality in foods: Fruits. Journal of Agricultural and Food
Chemistry 49:5315–5321
Vvedenskaya IO, Rosen RT, Guido JE, Russell DJ, Mills KA, Vorsa
N (2004) Characterization of flavonols in cranberry (Vaccinium
macrocarpon) powder. J Agric Food Chem 52:188–195
Wakimoto N, Nishi J, Sheikh J, Nataro JP, Sarantuya J, Iwashita M
(2004) Quantitative biofilm assay using a microtiter plate to screen for enteroaggregative Escherichia coli. American Journal of
Tropical Medicine and Hygiene, 71: 687–690
Walsh KM (2005) Getting to yes. J Am Geriatr Soc 53:1072
Wang SY, Stretch AW (2001) Antioxidant capacity in cranberry is influenced by cultivar and storage temperature. J Agric Food Chem
49:969–974
Weiss EI, Houri-Haddad Y, Greenbaum E, Hochman N, Ofek I, ZakayRones Z (2005) Cranberry juice constituents affect influenza virus
adhesion and infectivity. Antiviral Res 66:9–12
Witko-Sarsat V, Friedlander M, Capeiller-Blandin C, Nguyen-Khoa T,
Nguyen AT, Zingraff J, Jungers P, Descamps-Latscha B (1996)
Advanced oxidation products as a novel marker of oxidative stress
in uremia. Kidney Int 49:1304–1313
Yan XJ, Murphy BT, Hammond GB, Vinson JA, Neto CC (2002)
Antioxidant activities and antitumor screening of extracts from
cranberry fruit (Vaccinium macrocarpon). J Agric Food Chem
50:5844–5849
Yarnell E (2002) Botanical medicines for the urinary tract. World J
Urol. 20285-93.
Zafriri, D., Ofek, I., Adar, R., Pocino, M., Sharon, N. (1989). Inhibitory
activity of cranberry juice on adherence of type 1 and type P fimbriated Escherichia coli to eucaryotic cells. Antimicrob Agents
Chemother, 33(1), 92–98
Zhang K, Zuo YG (2004) GC-MS determination of flavonoids and
phenolic and benzoic acids in human plasma after consumption
of cranberry juice. J Agric Food Chem 52:222–227
Zhang L, Ma J, Pan K, Go VL, Chen J, You WC (2005) Efficacy of
cranberry juice on Helicobacter pylori infection: a double-blind,
randomized placebo-controlled trial. Helicobacter 10:139–145
Zheng W, Wang SY (2001) Antioxidant activity and phenolic compounds in selected herbs. J Agric Food Chem 49:5165–5170.
Zuo YG, Wang CX, Zhan J (2002) Separation, characterization, and
quantitation of benzoic and phenolic antioxidants in American
cranberry fruit by GC-MS. J Agric Food Chem 50:3789–3794