Kučerová- Typizace C. perfringens pomocí metody PCR

Typizace C. perfringens
pomocí metody PCR
RNDr. Hana Kučerová, Ph.D.
Dyntec spol. s r.o.
Mechanismus PCR reakce
Denaturace - oddělení řetězců DNA
Annealing - nasednutí specifických primerů
Elongace - syntéza nového vlákna DNA
Cyklus se 30-40x opakuje
Varianty PCR
multiplex PCR
qPCR (real time)
nested PCR
rtPCR
asymetrická PCR
touch-down PCR
a další
Clostridium perfringens
-anaerobní, sporulující bakterie
-produkuje více než 17 různých toxinů
-rozdělena do toxinotypů A-E na základě produkce toxinů α, β, ε, ι
Toxiny
Onemocnění
Typ A
α
průjmy (různé živočišné druhy), nekrotické střevní katary
(drůbež)
Typ B
α, β, ε
dysenterie (novorozená jehňata), hemorhagické střevní
katary (novorozená telata, hříbata), enterotoxemie (ovce)
Typ C
α, β
nekrotické střevní katary(selata, ovce, hříbata, telata),
enterotoxemie (ovce)
Typ D
α, ε
α, ι
enterotoxemie (jehňata, ovce, telata, kozy)
Typ E
enterotoxemie (telata)
- β2 toxin
- enterotoxin (produkuje se pouze při sporulaci)
Metoda PCR
- molekulárně-biologická metoda pomocí které lze určit, zda se v
buňce vyskytuje nebo nevyskytuje určitý gen (v našem případě
gen pro toxin)
- kolonie nebo tekutá kultura C. perfringens
- destrukce buněk a uvolnění DNA
- PCR reakce
- vyhodnocení - porovnání paternu syntetizovaných fragmentů
DNA testovaného vzorku a standardů
- detekce α, β, β2 a ε toxinů
- pracujeme na detekci ι toxinu a enterotoxinu
Typizace C. perfringens pomocí metody PCR
Elektroforetogram standardních kmenů C. perfringens
A B C
D
β2
ε
α
β
Testováno 68 vzorků z terénu
- 28 vzorků C. perfringens typ A
- 27 vzorků C perfringens typ A s β2 toxinem
- 1 vzorek C. perfringens typ C s β2 toxinem
u 12 vzorků nebyla potvrzena přítomnost C. perfringens
Děkuji Vám za pozornost!