METODY STANOVENÍ PROSTOROVÉ STRUKTURY PROTEINŮ

METODY STANOVENÍ PROSTOROVÉ
STRUKTURY PROTEINŮ
David Kopečný
garant Ivo Frébort
KBC/BAM - Pokročilé biochemické a biotechnologické metody
ZS 2014, čtvrtek 22.9.2014
1
Kapitoly
•
•
•
•
•
•
•
•
•
•
•
Metody stanovení struktury makromolekul (X ray crystallography, NMR,
cryo-EM)
Krystalizace
Elementární buňka, Krystalové soustavy
Bravaisovy mřížky
Braggův zákon, Millerovy indexy
Synchrotron
Strukturní faktor, Elektronová hustota
Fázový problém, MAD, SAD, IR, MR
R-faktor, rozlišení, teplotní faktor
PDB proteinová databanka, PDB formát
Sofware pro refinement a vizualizaci struktur
2
The science of X-ray crystallography is based on the diffraction of X-rays
by a crystalline material. It is the only analytical technique that can
provide the molecular structure of a given compound in the solid
crystalline state.
3
a) Refraction of light from a microscope; (b) diffraction of X-rays in a crystallography experiment
X-ray crystallography
small-molecule crystallography
macromolecular crystallography
(protein crystallography)
Inorganic molecules
Organic molecules
Organometallic molecules
• to identify accurately all of the atom types
within the molecule
• identification and structural confirmation
of newly synthesized molecules from
catalysts and new materials to new drugs
Nucleic acids – DNA, RNA
Proteins
• to identify the secondary structures – the
shapes and motifs of the overall structure
• identification of deoxyribonucleic acid (DNA) Watson, Crick, and Wilkins, Nobel Prize in 1962
4
4 úrovně struktury proteinů
primární
terciární
sekundární
kvartérní
5
Jak stanovit 3D strukturu proteinu/DNA/RNA?
primární
sekundární
Modelling
NMR
difficult > 30 kDa
X-ray crystallography
Modelling
terciární + kvartérní
electron microscopy
weak resolution
6
Sekundární struktury
Všechny tyto lokální struktury jsou stabilizovány vodíkovými vazbami
•
•
•
•
•
Alfa šroubovice (helix)
Jiné helixy (310-helix, π-helix)
Beta skládaný list (složený z β-vláken)
Beta kličky či otočky
Beta výduť (“bulge”)
Helix: Methionin (M), alanin (A),
leucin (L), glutamate (E) a lysine (K)
= MALEK
Beta skládaný list: aromatická
residua (W, Y a F) a Cβ-rozvětvenené
alifatické AMK (I,V a T)
7
Metoda stanovení sekundární struktury - CD
• Circularní dichroismus (CD) je typem absorpční spektroskopie, která může
poskytnout informace o struktuře mnoha typů biomakromolekul
•
Cirkulárně
polarizované
světlo;
vektory
intenzity
elektrického
pole
(E)
dvou
elektromagnetických vln jsou posunuty o ¼
vlnové délky mimo fázi a vůči sobě kolmé.
Vektor, který je součtem těchto E vektorů se
otáčí v prostoru tak, že jeho vrchol se otáčí po
šroubovité trajektorii (tečkovaná čára).
• Cirkulárně polarizované světlo:
Směr vektoru intenzity elektrického pole (E) se mění - magnituda konstantní
• Lineárně polarizované světlo:
Vektor intenzity elektrického pole (E) je konstantní - magnituda se mění
Cirkulární dichroismus
• CD měří rozdíl mezi absorpcí levostranně a pravostranně orientovaného
cirkulárně polarizovaného světla.
• typický extinkční koeficient ε u abs. spektrometrie okolo 10000- 20000 M-1cm-1
• Δε (molar circular dichroism) u CD je rozdíl typicky < 10 M-1cm-1
• CD signál = velmi malý rozdíl mezi dvěma velkými měřenými hodnotami
• Molar ellipticity [θ]:
[θ]=3298.2 Δε, (deg·cm2/dmol nebo deg.M-1m-1)
• Sekundární struktura proteinů může být stanovena CD spektroskopií v vzdálené
UV oblasti (190-250 nm). Při těchto vlnových délkách je chromoforem peptidová
vazba, a signál je silnější, když se nachází v pravidelně uspořádané struktuře.
• Peptidová vazba je asymetrická a vždy opticky aktivní
• Struktury alfa-helixu, beta-skládaného listu a náhodné smyčky poskytují
charakteristický tvar a výšku CD spektra
α-helix: 208 a 222 nm (tvar W)
β-sheet: 216 nm (tvar V)
Progresivní změna v θ222 jak se množství alfa helixů zvyšuje od chymotrypsinu
k myoglobinu.
• Pomocí CD lze určit, že protein obsahuje okolo 30% alfa-helixů, ale nelze
určit která rezidua se nachází v frakci alfa-helixů.
Využití CD spektroskopie
• Determine whether a protein is folded, and if so characterizing its
secondary structure, tertiary structure, and the structural family to which it
belongs
• Study the conformational stability of a protein under stress -- thermal
stability, pH stability, and stability to denaturants -- and how this
stability is altered by buffer composition or addition of stabilizers
• Determine whether protein-protein interactions alter the conformation of
protein. Small conformational changes have been seen, for example, upon
formation of several different receptor/ligand complexes.
CD spektroskopie – membránové proteiny
•
•
•
•
Membránové proteiny jsou obtížně studovatelné
Krystalografie je složitá – je třeba detergentů
I když je zjištěna struktura: Q- je stejná jako v lidpid. membráně?
CD proteinů je možno měřit v lipidických tělíscích
Metody stanovení struktury makromolekul
1. Rentgenová (strukturní) krystalografie (X ray crystallography)
2. Nukleární magnetická rezonance (NMR)
3. Kryoelektronová mikroskopie (cryo-EM)
• U RTG krystalografie získáváme difrakční obrazec a mapu elektronové hustoty.
• U NMR získáváme informaci o místní konformaci a vzdálenosti mezi blízkými
atomy.
• U cryo-EM získáváme obraz celkového vzhledu molekuly.
14
1. Rentgenová krystalografie
• je metoda stanovení struktur rigidních proteinů, které tvoří pěkné a uspořádané
krystaly. Problémem jsou flexibilní proteiny, které „neochotně“ krystalizují. El.
hustota flexibilních částí proteinů ve strukturách často chybí.
• přesnost výsledné struktury závisí na kvalitě krystalů
• přesnost výsledné struktury závisí na rozlišení (Å) a popisuje se hodnotou R-faktoru
2. Nukleární magnetická rezonance (NMR)
• purifikovaný protein je vložen do silného magnetického pole, ve kterém protein
absorbuje radiofrekvenční záření
• principem vzniku signálů v NMR je tedy absorpce radiofrekvenčního záření.
• mnoho jader biologicky důležitých prvků má magnetický moment. Postrádají ho
pouze jádra, která mají sudá atomová i hmotnostní čísla např. 12C nebo 16O. Pro
měření NMR spekter v biochemii nachází použití 1H, 13C, 15N a 31P. Nevýhodou je
nízké izotopové zastoupení 13C a 15N.
• analýza pozorovaných rezonancí poskytne výsledný soubor atomových jader, které
jsou vzájemně blízko, plus poskytne místní konformaci atomů, které jsou k sobě
15
vázány.
• NMR spektra biomolekul (peptidy, proteiny, nukleové kyseliny) jsou velmi
složitá z důvodu přítomnosti značného množství jader. Proto je metoda omezená
na menší molekuly, protože u velkých dochází k překryvu píků.
• NMR spektroskopie poskytuje informace o struktuře v roztoku, není
třeba krystalů, je proto vhodná pro analýzu flexibilních proteinů.
• Analyzují se spektra ve více dimenzích - 2D/3D spektra. Vícerozměrný
experiment se skládá ze série 1-D experimentů, sekvence pulsů s časovými prodlevami.
• Pro řešení problému se měří 2D COSY spektra („correlated spectroscopy“).
Dále se určují HSQC spektra (Heteronuclear Single Quantum Correlation),
NOESY spektra (Nukleární Overhauserův Efekt) a TOCSY spektra (Total
correlation spectroscopy)..……………………………………..Přednáší prof. Šebela
Například:
Pro proteiny 10-15 kDa je třeba 3D experimentů s 15N značeným proteinem (3D
HSQC-TOCSY, 3D HSQC-NOESY). Pro proteiny 15-30 kDa je třeba 3D
experimentů a dvojího značení 15N a 13C (3D HSQC-NOESY, triple resonance).
16
3. Cryo-EM (kryoelektronová mikroskopie)
• Forma transmisní electronové mikroskopie (EM), kde je vzorek studován při
kryogenních teplotách (nejčastěji při teplotě kapalného dusíku).
• Kapalný dusík: B.v. −196 °C
• Studium virů, malých organel, biologických a makromolekulárních komplexů 200
kDa nebo větších (komplexy ribosomů, tRNA a proteinových faktorů, svalových
aktino-myosinových struktur apod.) uchovaných v amorfním ledu při 4-20 Ǻ
Rice Dwarf Virus
Actin-tropomyosin-Myosin complex
70S-tRNA-EFG-GDP-FA complex
gastric H+,K+-ATPase
3. Cryo-EM (kryoelektronová mikroskopie)
Dvě nejčastější metody přípravy a měření:
1.Tenký film na mřížce - Biologický materiál se vloží na mřížku pro EM měření a
je uchován ve zmrazeném a hydratovaném stavu pomocí rychlého zmrazení,
běžně v tekutém etanu
2. U větších vzorků zmrazení za vysokého tlaku (high pressure freezing
vitrification) a rozřezání na menší vrtvy (40 to 200 nm), a vložení na mřížku
•
Výhoda: Dovoluje studium strukturních vlastností biologických vzorků v nativním a
hydratovaném stavu
•
Nevýhoda: Snímky získané z kryo-elektronové mikroskopie obvykle mají značný šum a jsou
velmi málo kontrastní. Během refinementu je nutné snížit šum i zvýšit kontrast. I když nelze
získat atomární detaily, je možné rekonstruovat sek. strukturu:
18
Databáze
PROTEIN DATA BANK
EMD DATA BANK
www.pdb.org
www.emdatabank.org
19
PDB content growth
Září 2014
103354 structures total
91655 solved by X-ray (88.7%)
10611 solved by NMR (10.3%)
837 solved by electron microscopy (0.8%)
www.pdb.org
93 % proteins
2 % DNA/RNA
5 % Protein DNA/RNA complexes
20
RTG záření (X ray)
•RTG záření (0.01-100 Å) je užitečné
pro zobrazování složení molekul,
jelikož jeho vlnová délka pokrývá
velikosti atomů a jejich vzdálenosti
v molekulách.
• RTG paprsky jsou rozptylovány na
elektronech atomů a tvoří difrakční
obrazec
• Rozptyl je přímo úměrný počtu elektronů
• Difrakce na jednom atomu, molekule je příliš malá, aby šla měřit přímo.
• Krystaly obsahují miliony kopií daného atomu, molekuly (a tím i
elektronů) – v tomto případě difraktovaný signál měřit lze.
• Hodnota jednoho angstromu 1 Å je rovna 0,1 nm
21
4 steps in structure determination
Highly concenrated and pure protein
Crystallization
Collection of
diffraction data
1. Protein crystal
Phasing
2. Diffraction spots
Model
construction and
refinement
4. Determined structure
3. Electron density
22
Purifikace
•
CHELATAČNÍ CHROMATOGRAFIE
Purifikace rekombinantních proteinů His-tag - jde o peptid
(6 histidinových zbytků) navázaný na C- nebo N-konec
proteinu s využitím klonovacích technik.
STŘEDNĚTLAKÁ KAPALINOVÁ CHROMATOGRAFIE
1.2
100
6xHis-AMADH1
1
80
60
0.6
40
0.4
20
0.2
0
0
10
20
Time (min)
30
23 40 0
Gradient (%)
0.8
Absorbance
•
Purifikace
• Vysoká čistota a homogenita vzorku je klíčová pro úspěšnost krystalizace:
•
Dynamic light scattering (DLS, dynamický rozptyl světla) - lze použít k charakterizaci
polydisperzity vzorku (přítomnost různých oligomerních forem nebo agregátů proteinu v
roztoku)
•
Analytická ultracentrifugace
•
Differential scanning fluorometry (DSF, diferenciální skenovací fluorimetrie) – lze požít k
měření teplotní stability proteinu v různých pufrech a v přítomnosti fluorescenčního ligandu.
•
CD spektroskopie - lze požít pro ověření stability a sekundární struktury proteinu
•
Kinetické měření - pro ověření aktivity proteinu
Krystalizace je druh fázové přeměny, při které dochází k
pravidelnému uspořádání částic do krystalové mříže.
Roztok proteinu musí být v „přesyceném stavu“
• Metastabilní oblast – nukleační rychlost je malá
• Labilní (nukleační, krystalizační) oblast – dochází k nukleaci
• Precipitační oblast – vznikají neorganizované formy shluky a precipitáty
•
•
•
běžně se zvyšování úrovně nasycení roztoku
proteinu dosahuje použitím vhodného
precipitačního činidla ((NH4)2SO4, PEG,…)
precipitační činidlo váže vodu
dále lze ovlivnit krystalizaci modifikací pH, teploty, koncentrace proteinu nebo
typu rozpouštědla.
25
Difúze plynnou fází (vapor-diffusion method)
• Pro krystalizace nízkomolekulárních látek stačí odpařování rozpouštědla (CuSO4).
• V případě biomakromolekul takto získáme pouhý precipitát.
Raoultův zákon- závislost tlaku syté páry nad kapalným roztokem
Parciální tlak vody nad precipitantem (reservoir solution) je menší než
nad vzorkem - vodní páry difundují ze vzorku, kde roste koncentrace
proteinu  KRYSTALIZACE
Hanging drop
Sitting drop
Microdialysis
water
water
Sandwich drop
26
Difúze plynnou fází (vapor-diffusion method) II
Hanging drop
24-wells plate
27
Difúze plynnou fází (vapor-diffusion method) III
Komerční krystalizační kity:
• Hampton Research
(www.hamptonresearch.com)
• Molecular Dimensions
(www.moleculardimensions.com)
• Nextal/Qiagen
(www.qiagen.com)
Obsahují sadu roztoků s množstvím pufrů, které pokrývají širokou oblast pH, s
množstvím organických a anorganických precipitantů, solí a aditiv.
(NH4)2SO4
PEG
pH
28
NEJČASTĚJŠÍ PRECIPITANTY
Anorganické precipitanty (soli): •(NH4)2SO4
•NaCl
•Citrát sodný
•Fosforečnan sodný/draselný
•CH3COONa
Organické precipitanty:
• PEG (Polyethylenglykol)
PEG 400, 1000, 1500, 4000, 6000, 8000, 10000, 20000
• rozpouštědla (isopropanol, etanol a terc-butanol)
• 2-methyl-2,4-pentandiol (MPD)
29
KRYSTALOVÁ STRUKTURA
= rozmístění základních stavebních částic (iontů, atomů, molekul) v prostoru krystalu
• k popisu se používá pojmu MŘÍŽOVÝCH BODŮ –imaginární body, jejichž okolí je
identické !! Nemusí jít o atom nebo molekulu!!
• KRYSTALOVÁ MŘÍŽKA (lattice) je spojením mřížových bodů
Volba počátku mříže je libovolná
mřížový bod
•
mříž
motiv
nejmenší jednotkou je ELEMENTÁRNÍ BUŇKA (unit cell)
30
ELEMENTÁRNÍ BUŇKA (UNIT CELL)
•
nejmenší jednotkou je ELEMENTÁRNÍ BUŇKA
• ‘nejlepší’ elementární buňkou je ta nejmenší buňka, která má nejvyšší symetrii
(čtverec má vyšší vnitřní symetrii než kosočtverec)
31
„ASYMMETRIC UNIT“ vs. „UNIT CELL“
• Krystal je tvořen identickými elementárními buňkami, které se symetricky v
prostoru opakují (operací translace).
• Obsah elementární buňky lze většinou operacemi symetrie (rotací, inverzí…)
zredukovat na 2 a více asymetrické jednotky. Asymetrická jednotka = nejmenší
repetice, ze které lze krystal zkonstruovat.
Příklad:
Elementární buňka - tvořena 4 asymetrickými jednotkami
32
BRAVAISOVY TRANSLAČNÍ MŘÍŽKY
Auguste BRAVAIS (1845) ukázal, že existuje 14 způsobů, jak
vytvořit prostorovou periodickou mřížku
• 14 typů prostorových Bravaisových translačních mřížek, liší
se operacemi symetrie (7 primitivních a 7 centrovaných)
c



b
a
P
• pro primitivní buňky (P) platí, že na jednu buňku připadá
jeden mřížový bod.
• bazálně centrovaná buňka (C) – 2 mřížové body
• plošně centrovaná buňka (F) – 4 mřížové body
• objemově (prostorově) centrovaná buňka (I) – 2 mřížové body
C
F
I
33
7 KRYSTALOGRAFICKÝCH SOUSTAV
(CRYSTAL SYSTEMS)
Známe 7 krystalografických soustav, podle toho, jakých os se použije k popisu
ploch krystalu. Postupujeme tak od trojklonné soustavy s rozdílnými
parametry os a úhlů k vysoce symetrické soustavě kubické.
•trojklonná (triclinic)
•jednoklonná (monoclinic)
•kosočtverečná (orthorhombic)
•romboedrická - trigonální (rhombohedral, trigonal)
•čtverečná (tetragonal)
•šesterečná (hexagonal)
•krychlová (cubic)
34
Krystalografické soustavy a Bravaisovy mřížky
Bravaisovy mřížky
krychlová (cubic)
čtverečná (tetragonal)
kosočtverečná (orthorhombic)
šesterečná (hexagonal)
trigonální (rhombohedral)
jednoklonná (monoclinic)
trojklonná (triclinic)
35
7 krystalografických soustav (crystal systems) II
Teoreticky:
4 typy elementárních buněk (primitvní a 3 centrované) x 7 krystalografických
soustav = 28 typů prostorových Bravaisových translačních mřížek
Ve skutečnosti:
14 typů prostorových Bravaisových translačních mřížek
Důvod:
14 zbylých teoreticky možných mřížek je možno rozložit na jednodušší typ
mřížky.
Příklad:
Bazálně centrovaná kubická mřížka lze zjednodušit a rozložit na
primitivní tetragonální (čtverečnou) mřížku
36
Shrnutí
•4 typy elementárních buněk (primitvní a 3 centrované) P, I, F, C
• 7 krystalografických soustav
+
=
•14 typů prostorových Bravaisových translačních mřížek (teoreticky 28)
37
Řešeno na katedře biochemie
Cytokininoxidasa/dehydrogenasa
Nukleosid-N-ribohydrolasa
38
Řešeno na katedře biochemie
Aminoaldehyddehydrogenasa
(ALDH10)
ALDH2, ALDH7
ZmALDH7 (green)
ZmALDH2 (yellow)
ZmAMADH1a (red)
Ukázka orthorhombické elementární buňky
ZmNRH3 apoenzyme
Space group
P212121
Asymmetric unit
1 dimer
Unit cell (Å)
a
76.4
b
85.8
c
87.4
90.0
== (°)
PpNRH1 apoenzyme
P212121
4 dimers
125.9
126.1
253.6
90.0
Nukleosid-N-ribohydrolasa 3 z kukuřice
40
Nukleosid-N-ribohydrolasa 1 z mechu
Ukázka monoklinické elementární buňky
CKO1
41
Interakce rentgenových paprsků s krystalem
• Difrakci RTG paprsků lze prezentovat jako „odraz“ na soustavě rovnoběžných
atomových rovin v krystalu.
• Všechny vlny „odražené“ jednou rovinou jsou ve fázi.
• Naproti tomu vlny „odražené“ různými vrstvami budou spolu ve fázi jen za
určitých podmínek. Úhel pod nímž dopadají paprsky musí být takový, aby
dráhový rozdíl mezi vlnami odraženými od kterýchkoli sousedních rovin byl
roven celistvému násobku vlnové délky.
AY + YB = n λ
42
Zákon, rovnice Braggů Lawrence Bragg, 1914 Nobelova cena za chemii
AY + YB = n λ
sinΘ = AY/d
AY = YB
n.λ = 2.d.sinΘ
n je celé číslo (řád difrakce), λ je vlnová délka dopadajícího RTG paprsku, d je
mezirovinná vzdálenost v krystalu, Θ (theta) je úhel dopadu.
Zákon říká, že k difrakci dojde, když platí n.λ = 2.d.sinΘ, tzn. když vlnová
délka dopadajícího záření je rovna součinu dvojnásobku mezirovinné
vzdálenosti a sinu úhlu dopadu.
43
Zákon, rovnice Braggů
n.λ = 2.d.sinΘ
William Henry Bragg a jeho syn William Lawrence Bragg
V trojrozměrném krystalu musí být Braggova rovnice splněna ve
všech třech rozměrech.
Laueho podmínky difrakce
2.a.sin  = h.λ
2.b.sin  = k. λ
2.c.sin  = l.λ
kde a, b a c jsou vzdálenosti rozptylových center (mřížových bodů v
elementární buňce), h, k a l jsou Milerovy indexy - celá čísla
reprezentující orientaci atomové roviny v krystalové mřížce.
Definovány jako převrácené hodnoty průsečíků, které rovina vytíná
na osách.
44
Millerovy roviny a indexy
• Mimo znalosti krystalografických soustav a Bravaisových translačních
mřížek, lze mřížku rozdělit na imaginární roviny tzv. Millerovy roviny, na
nichž dochází k difrakci.
• Roviny jsou definovány třemi celými čísly h,k,l – Millerovy indexy
Kartézské souřadnice
x
y
z
Elementární buňka
a
b
c
Millerovy indexy
h
k
l
• Je-li rovina paralelní k dané ose, pak má hodnotu nula
z
Kartézské souřadnice
x
y
z
1. Průsečíky
∞
1
∞
2. Převrátit hodnoty
1/∞
1/1
1/∞
3.Upravit/zredukovat
0
1
0
x
Miller indices (0,1,0)
y
William Hallowes Miller
45
Millerovy roviny a indexy
46
Zdroj RTG záření - synchrotron
• Synchrotron je urychlovač částic kruhového tvaru (uvnitř je vakuum),
který se používá buď k získání energetických částic nebo záření, které
tyto částice produkují. Má-li být synchrotron zdrojem záření, jsou
částicemi elektrony nebo pozitrony.
• Je zde synchronizováno magnetické pole (k ohybu dráhy částic) a
elektrické pole (k urychlování částic) k udržení svazku částic v
uzavřeném kruhu a k fokusaci.
• Vysokoenergetické záření (nejčastěji RTG) je v synchrotronu
emitováno v okamžiku, kdy se paprsek elektronů o rychlosti blížící se
rychlosti světla ohýbá působením silného magnetického pole.
•čím menší zakřivení, tím větší
zrychlení elektronů lze dosáhnout
47
Ohýbání dráhy elektronů
Elektrony procházejí skrze magnety jsou nuceny oscilovat a uvolňovat energii zářením
WIGGLERS (dříve)
Skupina „bending magnetů“ za sebou
+ Intenzivní záření v širokém spektrálním rozsahu
- Většina experimentů si vystačí s úzkým spektrem,
většina zůstává nevyužita a to vede k nežádoucí
tvorbě tepla a ovlivnění měřící optiky.
Dipólové magnety
UNDULATOR (dnes)
Upgraded wiggler
Užívají slabší magnetické pole a kratší magnety
+ Užší paprsek – λ ~ 0.1 nm
48
Charakteristika synchrotronu
magnety DIPOLE, QUADRUPOLE,
SEXTUPOLE a CORECTOR
4
3
2
1
6
5
SPring-8, Japonsko, obvod 1.4 km, 8GeV
APS, USA, obvod 1.1 km, 7GeV
ESRF, Francie, obvod 850 m, 6GeV
1. ELEKTRONOVÉ DĚLO
2. LINAC (Lineární urychlovač) - zhuštění a urychlení na energii v řádech stovek MeV
3. BOOSTER (urychlovač) - urychlení na rychlost blízkou rychlosti světla a energie v řádech jednotek GeV
4. STORAGE RING (skladovací prstenec)
5. BEAMLINE (paprskovod)
49
6. WORKING STATION
EU synchrotrons
SOLEIL, Source optimisée de lumière d’énergie
intermédiaire du LURE, Paris, 2.8 GeV
DESY, Deutsches Elektronen Synchrotron,
DORIS III, Hamburg, 4.5 eV
společné zařízení původně 12 evropských zemí
(plus 7 včetně ČR)
ESRF, European Synchrotron Radiation
Facility, Grenoble, Francie, obvod 850 m, 6GeV
50
Pracovní stanice (ID14)
51
2 způsoby sběru dat:
Kryoprotektanty
1.
Bez kryoprotekce – dochází k poškození krystalu RTG zářením, rozpadá se
pravidelná mřížová struktura krystalů, klesá intensita difraktovaných bodů.
(minusy: Často nutné sbírat data při nižším a vyšším rozlišení z více krystalů)
2. Rychlé zmrazení v dusíku (flash freezing). Jelikož krystaly obsahují množství
vody, je nutno použít kryoprotektantů, které molekuly vody částečně vytěsní.
(minusy: MOZAICITA- nepravidelnost uspořádání mříže krystalu).
Nejčastější kryoprotektanty: Glycerol (13-25%), Ethylenglykol (11-30%), PEG 400
(25-35%), MPD (2-methyl-2,4-pentanediol) (do 28%), Glukosa (do 25%)
Je nutná optimalizace:
Vysoká mozaicita - NE
Glycerol
Nízká mozaicita - OK
Paratone-N
52
SBĚR DAT, INDEXACE
• Difrakční obrázky jsou nejčastěji sbírány po 1°rotace, lze volit i jinak, např. 0.5°
• Nejdříve se sbírá prvních 5-10 obrázků (5-10°), pak se data indexují, stanovují
se mřížkové parametry, rozlišení….ověřuje se, zda data půjdou zpracovat
• Určují se prostorová grupa (space group) a Matthewsův koeficient
Matthewsův koeficient (Vm) a obsah solventu Vs
Vm = V/M.Z
Vs = 1,23/Vm
Vm – Matthewsův koeficient, V - objem elementární buňky, M – molekulová hmotnost proteinu, Z –
počet molekul proteinu v elementární buňce), Vs – obsah solventu,
53
Matthewsův koeficient
Rozmezí 1.68 - 3.53 Å3/Dalton
průměr 2.69 Å3/Dalton, medián 2.52 Å3/Dalton
Vm = V/M.Z
Obsah solventu ∼47%
Krystaly, které dávají nepřirozené hodnoty Vm nebo obsahu solventu,
indikují možné problémy a jsou vyřazeny
54
Difrakční obraz („pattern“) proteinového krystalu
(n.λ /2). (1/d)= sinΘ
Čím blíže jsou Millerovy roviny (menší
hodnota vzdálenosti d), tím větší úhel
difrakce, a body jsou lépe diferencované
jeden od druhého.
Závislost difrakčního obrazu na 1/d
1/d je znám pod pojmem RECIPROCAL SPACE (reciproký prostor)
tzn . každému bodu v Millerově rovině odpovídá bod reciprokém prostoru,
Výsledně mluvíme o reciproké mřížce.
Během RTG analýzy měříme intenzitu bodů v reciprokém prostoru,
abychom vytvořily mapu elektronové hustoty pro elementární buňku ve
skutečném prostoru.
55
Difrakční obraz („pattern“) proteinového krystalu
(n.λ /2). (1/d)= sinΘ
Čím blíže jsou Millerovy roviny (menší
hodnota vzdálenosti d), tím větší úhel
difrakce, a body jsou lépe diferencované
jeden od druhého.
Závislost difrakčního obrazu na 1/d
Real space
Reciprocal space
Crystal structure
Diffraction pattern
Electron density
Amplitudes and phases
Crystal lattice, unit cell
Reciprocal lattice, cell
Coordinates (x,y,z)
Coordinates (h,k,l)
•Rsym (also called Rmerge) is almost universally used for describing X-ray
diffraction data quality
56
STRUKTURNÍ FAKTOR Fhkl
Vlna difraktovaná v prostoru hkl je popsaná strukturním
faktorem Fhkl.
Je to komplexní číslo: Fhkl = |Fhkl| e i(h,k,l)
|Fhkl| je amplituda
(h,k,l) fí je fáze, celá čísla hkl jsou Millerovy indexy
určující vektor v reciprokém prostoru.
• Pro výpočet elektronové hustoty je nutno znát obojí tz. amplitudu
|Fhkl| a fázi (h, k, l). První parametr lze změřit, ale fáze nelze.
• Amplituda |Fhkl| je úměrná odmocnině intensity naměřeného
reflexního bodu v prostoru hkl: |Fhkl| = K √ I(hkl).
57
ELEKTRONOVÁ HUSTOTA (x, y, z)
Elektronovou hustotu lze spočítat ze strukturních faktorů pomocí
inversní Fourierovy transformace.
Elektronová hustota v každém bodě (v reálném prostoru, koordináty x, y,
z) je definována jako suma všech difraktovaných amplitud a fází.
(x, y, z) = 1/V hkl |Fhkl | e i(hkl) e-2i(hx+ky+lz)
- vzorec je vztažen na objem elementární buňky 1/V.
58
ELEKTRONOVÁ HUSTOTA (x, y, z)
Jelikož informace o fázi (hkl) je ztracena, vylučuje to přímý výpočet elektronové
hustoty. Vzniká tzv. „fázový problém“ a v praxi se řeší metodami:
molekulovým nahrazením (molecular replacement),
isomorfním nahrazením (isomorphous replacement),
anomální mrozptylem (anomalous scattering, použitím těžkých kovů)
MOLEKULOVÉ NAHRAZENÍ (MR)
• Nejpoužívanější technika
• Využijí se koordináty jiné již známé struktury, která je hledané molekule
podobná. Pro úspěšný výsledek se uvádí podobnost sekvencí alespoň 30%.
• programy MOLREP, PHASER, AmoRe, XPLOR-CNS
• Řeší se šestiprostorový problém ve 2 krocích - rotace a translace = hledá se
Pattersonova rotační a translační funkce
• Při úspěšném hledání by měl být R-faktor méně jak 50%
M2=M1.[R] +T
M2- řešený model,M1 - templát z PDB databáze, [R] – rotační funkce, T – translační vektor
59
ISOMORFNÍ NAHRAZENÍ (IR)
• Není-li k dispozici podobná struktura. Jedná se o zavedení iontů těžkých kovů
do struktury proteinů (těžké v tom smyslu, že mají vysoké atomové číslo, tj.
množství elektronů), které zásadně mění intenzitu rozptýleného záření.
• Krystaly proteinu jsou kokrystalizovány nebo infiltrovány v roztocích solí
těžkých kovů (Hg, Pt, lanthanidy) jako např. HgCl2, K2[HgI4] nebo PCMB (pchloromercuribenzoate). Úspěšnost metody závisí vazbě těžkých atomů na
protein. Připojení může být zprostředkováno kovalentní vazbou, iontovou vazbou
nebo slabší (vW) interakcí.
•Refinement se provádí na základě diferencí difrakčních obrazů.
• Strukturní faktor modif proteinu (FPH) je roven sumě strukturního faktoru
proteinu (FP) a těžkého kovu (FH):
FPH = FP + FH
• Amplitudy strukturních faktorů |FPH| a |FP| jsou změřeny experimentálně,
|FH| a fázový úhel jsou získány užitím Pattersonovy funkce a Harkerova
zobrazení.
60
•Pattersonova funkce hraje nezastupitelnou roli v metodách řešení problému
fází v proteinové krystalografii.
•Je to vlastně mapa všech meziatomových vektorů v základní buňce. Může
být vypočtena přímo z difrakčních dat. Fáze nejsou zapotřebí.
• Jde o modifikaci funkce elektronové hustoty:
(x, y, z) = 1/V hkl |Fhkl | cos2Π (hx + ky + lz - Φ(hkl)) - Electron density function
•Místo x,y,z koordinát se objevují u,v,w pro |Fhkl |2 prostor
• Fáze Φ(hkl) je rovna nule
P(u, v, w) = 1/V hkl |Fhkl |2 cos2Π (hu + kv + lw) - Patterson Function
|Fhkl| = K √ I(hkl)
| Fhkl | 2 = I(hkl) / K.A.L.p
The relationship between structure factor amplitude and intensity. K is a scale factor, A is the
absorption factor, L is the Lorentz factor, and p represents the polarization factor
Pattersonova funkce pro základní buňku s 5,000 atomy má 24 995 000
meziatomových vektorů.
61
ANOMÁLNÍ ROZPTYL (AS nebo AD)
•je rozptyl na atomu za podmínek, kdy dopadající záření má dostatečnou
energii ΔΕ (h), aby způsobilo přechod elektronu mezi orbitaly (absorpční
hrana). Atom pak rozptyluje záření anomálně, s fázovým posunem až -90 °
a se sníženou amplitudou.
•pokud dopadající foton má energii rozdílnou od ΔE mezi orbitaly, pak je k
anomální rozptylu nedochází.
• na synchrotronu může být energie dopadajícího záření přesně naladěna na
hodnotu ΔE. ΔE pro C, N, O jsou mimo rozsah měření s RTG zářením.
•Běžně používaná technika je příprava selenomethioninových derivátů
proteinu (Se místo S, 1SeMet/100 residuí). Nebo jodouracil nebo
jodocytosin u nukleových kyselin
•Metoda single anomalous diffraction (SAD)
je populární
metaloproteinů, které obsahují prvek s vlastnostmi anomálního rozptylu.
u
• Metoda Multiple anomalous scattering or diffraction (MAD) využívá
sběru dat z jednoho krystalu při různých vlnových délkách (různých ΔΕ).
•AS also includes a combination of methods combining a single wavelength
analysis with SIR or MIR method (SIRAS, MIRAS).
62
MĚŘÍTKA KVALITY ZÍSKANÉ STRUKTURY
1. R-faktor - je měřítkem kvality modelu získaného z krystalografických dat.
R-hodnota porovnává, jak dobře se simulovaný difrakční vzor vytvořeného
modelu shoduje s experimentálně pozorovaným difrakčním obrazcem. Jde o
podíl sumy rozdílu strukturních faktorů pozorovaných (observed, Fo) a
vypočítaných (calculated, Fc) k sumě strukturních faktorů pozorovaných (Fo).
R =  ||Fo | - |Fc ||
 |Fo |
Čím nižší hodnoty, tím větší shoda.
Pomůcka: Struktury při 2 Ǻ mají hodnotu R-faktoru kolem 0.20 (20%) a r free
je 0.25 (25%).
2. Free R faktor - je odvozen od R-faktoru, ale porovnává strukturní faktory
náhodně vybrazných odrazů (reflections) – běžně 5 nebo 10% všech odrazů –
které nejsou použity běhěm refinementu a modelování struktury
63
MĚŘÍTKA KVALITY ZÍSKANÉ STRUKTURY
3. Rozlišení (resolution) - je měřítkem kvality dat, běžně pod 2 Å = při tomto
rozlišení je možno rozlišit 2 atomy při vzdálenosti 2.0 Å.
• Struktury s vysokým rozlišením
(1.0 Å) jsou velmi spořádané a je
snadno vidět každý atom.
• Struktury s nízkým rozlišením
(3.0 Å) - jsou zobrazeny pouze
základní kontury proteinu.
64
MĚŘÍTKA KVALITY ZÍSKANÉ STRUKTURY
4. Teplotní faktory (B-factors) - pozorovaná elektronová hustota představuje
průměr malých pohybů, vibrace atomů, což vede k mírně rozmazanému obrazu
molekuly
• Sloupec 61-66 v pdb souboru, standardní hodnoty 1-50
• Hodnoty pod 10 ukazují na model atomu, který je velmi ostrý.
• Hodnoty nad 50 ukazují, že atom se pohybuje tak moc, že může být
stěží pozorován. To je často případ pro atomy na povrchu proteinů.
Okupance a alternativní konformace
• postranní řetězce a ligandy se objevují ve vícero konformacích (Tyr, Arg, Lys)
• ionty kovů a jiné ligandy nemusí být přítomny ve všech molekulách
Low B-values are shown in blue
Two conformations of tyrosine
65
MĚŘÍTKA KVALITY ZÍSKANÉ STRUKTURY
5. Geometrie modelu (vzdálenost vazeb, vazebné úhly, Ramachandranův diagram)
Ramachandranův diagram zobrazuje všechny kombinace torzních úhlů (úhel
mezi dvěma rovinami) φ (phí) a ψ (psí), které jsou v peptidovém řetězci možné.
Pouze zlomek úhlů φ a ψ jich v proteinech pozorujeme:
Úhel ψ (psí)
= rotace kolem vazby Cα a C1
Úhel φ (phí)
= rotace kolem vazby atomů N1 a Cα
66
MĚŘÍTKA KVALITY ZÍSKANÉ STRUKTURY
Ramachandranův diagram je široce používán k určování kvality experimentálně
určených struktur nebo struktur vytvořených pomocí homologního modelování
•
Obecně platí, že struktury s
nízkým rozlišením mají větší
podíl AMK (jejich kombinace
úhlů) v zakázaných oblastech.
•
Obsahuje-li model získaný
pomocí
homologního
modelování
zakázané
kombinace úhlů (v bílém
pozadí), model není v daném
úseku zcela věrohodný
67
PROTEIN DATA BANK
www.pdb.org
68
69
70
71
72
73
PDB file download
PDB file: 1KSI.pdb
74
PDB formát
"header section" summarizes the protein, citation, the details of the structure solution,
"core" - long list of the atoms and their coordinates.
Header details
Oligomerization status
75
PDB formát
1
2
3
4
5
6
7
8
12345678901234567890123456789012345678901234567890123456789012345678901234567890
ATOM
8239 ND2 ASN B 386
12.379 49.612 24.586 1.00 19.98
N
HETATM 8240 N
TPQ B 387
15.526 46.735 23.732 1.00 19.99
N Columns:
1-6 Record name "ATOM " or "HETATM"
7-11 Atom serial number
13-16 Atom name
17 Alternate location indicator
18-20 Residue name
22 Chain identifier
23-26 Residue sequence number
27 Code for insertion of residue
31-38 X Angstrom coordinates
39-46 Y Angstrom coordinates
47-54 Z Angstrom coordinates
55-60 Occupancy
61-66 Temperature factor (B-value)
73-76 Segment identifier, left justified (used by XPLOR)
77-78 Element symbol
79-80 Charge on atom
76
Refinement struktur – nejčastější programy
CCP4, obsahuje MOLREP, PHASER, Refmac
Coot, Wincoot – snadná vizualizace struktur a elektronových map
77
Phenix
Refinement struktur – nejčastější programy
CNS
78
Molecular Graphics Software
VMD – Visual molecular dynamics – vizualizace struktur
UCSF Chimera – vizualizace struktur, tvorba obrázků
79
PyMOL – vizualizace struktur, tvorba obrázků
http://pymol.org/
PyMOL is a molecular viewer, render tool, and 3D molecular editor for
visualization of 3D structures of: proteins, nucleic acids (DNA, RNA, & tRNA),
and carbohydrates, as well as small molecule structures of drug leads, inhibitors,
metabolites and other ligands including inorganic salts and solvent molecules.
80
MGL tools
ADT – AutoDock Tools – dokování ligandů do vazebných míst
PMV – Python molecular viewer – vizualizace struktur
81
Jak prezentovat struktury?
PDB databanka
PyMOL
Pisum satium amine oxidase (PBD 1KSI)
Pseudomonas aeruginosa betaine aldehyde dehydrogenase (PDB 2VE5)
82