docChanges in PSII activity under natural light regime: use of
download 
Stížnost Transkript
Changes in PSII activity under natural light regime: use of
Biologická fakulta Jihočeská Univerzita v Českých Budějovicích Laboratoř fotosyntézy, Třeboň Mikrobiologický Ústav Akademie Věd ČR Denní změny fotosyntetické aktivity rozsivky Thalassiosira weissflogii : vliv dynamického světelného režimu a limitace dusíkem Diplomová práce Vypracoval: Bc. Vojtěch Kasalický Vedoucí práce: Doc. Ondřej Prášil, PhD. V Českých Budějovicích, duben 2006 Magisterská diplomová práce Kasalický V (2006): Denní změny fotosyntetické aktivity rozsivky Thalassiosira weissflogii : vliv dynamického světelného režimu a limitace dusíkem. [Daily rhythms of photosynthetic activity of diatom Thalassiosira weissflogii: impact of natural light-regime and nitrogen limitation – Mgr. Thesis, in Czech]. 99 p., Faculty of Biological Sciences, The University of South Bohemia, České Budějovice, Czech Republic. Anotace: Daily rhythms of photosynthetic activity of marine diatom Thalassiosira weissflogii were followed during the natural and subsequent constant light regime. Light intensity changes and the long term nitrogen limitation were examined for their impact on pigment composition and photosynthetic rates. Finanční zabezpečení projektu: Tato práce byla podpořena mezinárodním grantem CZ/CNRS – Modelování fotosyntézy fytoplanktonu v přirozených podmínkách, dále ze záměru MBÚ AV0Z50200510 a ÚFB MSM6007665808. Poděkování: Na tomto místě bych chtěl poděkovat nejprve svému školiteli Doc. Ondřeji Prášilovi, PhD. za možnost účastnit se různých projektů. Díky tomu byla má diplomová praxe pestrá a podnětná. Rovněž mu patří ocenění za preciznost a trpělivost, kterou věnoval dokončení této práce. Za nedocenitelnou psychickou podporu, jazykovou korekci této práce a vynikající večeře děkuji své přítelkyni Janě Kvičerové. Děkuji za srdečné přijetí ve Francii Antoinu Sciandrovi. Dále pak Wimovi Vredebergovi, Evě Šetlíkové, Jiřímu Kopeckému, Janě Hofhanzolvé a všem lidem z Mikrobiologického Ústavu AVČR v Třeboni. Prohlašuji, že jsem tuto práci vypracoval samostatně s použitím uvedené literatury. V Českých Budějovicích, duben 2006 Vojtěch Kasalický Obsah 1 SHRNUTÍ ............................................................................................................ 1 2 ÚVOD .................................................................................................................. 2 2.1 Fotosyntetické mikroorganismy.................................................................................. 2 2.1.1 Rozsivky...................................................................................................................... 2 2.2 Denní rytmy řas............................................................................................................ 4 2.2.1 Endogenní rytmy genové exprese ............................................................................... 4 2.2.2 Buněčný cyklus ........................................................................................................... 5 2.2.3 Denní rytmy ve fotosyntéze ........................................................................................ 6 2.2.4 Denní rytmy u rozsivek ............................................................................................... 6 2.2.4.1 Rytmy v koncentraci pigmentů .......................................................................... 6 2.2.4.2 Exprese fotosyntetických genů........................................................................... 7 2.3 Metabolismus dusíku a fotosyntéza ............................................................................ 8 2.3.1 Metabolismus dusíku................................................................................................... 8 2.3.2 Nedostatek dusíku ....................................................................................................... 9 2.4 Fotosyntetický přenos elektronů............................................................................... 10 2.4.1 Primární reakce ve fotosystému II ............................................................................ 10 2.4.2 Lineární přenos elektronů.......................................................................................... 10 2.4.3 Cyklický elektronový transport................................................................................. 11 2.4.4 Chlororespirace ......................................................................................................... 12 2.4.5 Fotoaklimace ............................................................................................................. 13 2.4.5.1 „State-transitions“ ............................................................................................ 14 2.4.5.2 Nefotochemické zhášení fluorescence ............................................................. 14 2.4.5.3 Fotosyntetická křivka ....................................................................................... 16 2.5 Variabilní fluorescence chlorofylu............................................................................ 18 2.5.1 Základy metody variabilní fluorescence ................................................................... 18 2.5.2 Principy měření ......................................................................................................... 19 2.5.3 Fluorescence a stres................................................................................................... 20 2.5.4 Metody měření variabilní fluorescence..................................................................... 20 2.5.5 Reoxidace QA- ........................................................................................................... 20 2.6 Thermoluminescence fotosystému II ........................................................................ 22 2.6.1 Historický úvod ......................................................................................................... 22 2.6.2 Základní principy ...................................................................................................... 22 2.6.3 Původ TL pásů .......................................................................................................... 23 2.6.4 Interpretace TL křivky .............................................................................................. 23 2.6.5 Mikroorganismy v TL ............................................................................................... 24 3 CÍLE PRÁCE..................................................................................................... 25 4 METODY ........................................................................................................... 26 4.1 Popis experimentů ...................................................................................................... 26 4.2 Určení velikosti buněk, dusíku a absorpčních spekter ........................................... 27 4.3 Stanovení pigmentů.................................................................................................... 27 4.4 Měření asimilace uhlíku............................................................................................. 27 4.5 Měření variabilní fluorescence chlorofylu ............................................................... 28 4.6 Thermoluminescence ................................................................................................. 29 4.6.1 4.6.2 4.6.3 4.6.4 TL aparatura .............................................................................................................. 29 Řídící software .......................................................................................................... 30 Příprava ..................................................................................................................... 30 Měřící protokol.......................................................................................................... 30 5 VÝSLEDKY A DISKUSE................................................................................... 32 5.1 Počet buněk................................................................................................................. 32 5.2 Velikost buněk ............................................................................................................ 32 5.3 Množství dusíku a uhlíku v buňce ............................................................................ 34 5.4 Množství pigmentů v buňce....................................................................................... 37 5.5 Variabilní fluorescence v temnotně adaptovaném stavu ........................................ 39 5.5.1 Fluorescenční výtěžky............................................................................................... 40 5.5.2 FM MT/FM ST ............................................................................................................ 41 5.5.3 Maximální fotochemická účinnost v LD režimu....................................................... 42 5.5.4 Maximální fotochemická účinnost v LL režimu ....................................................... 44 5.5.5 Reoxidace QA ............................................................................................................ 44 5.6 Variabilní fluorescence na světle .............................................................................. 46 5.7 Rychlá kinetika indukce variabilní fluorescence..................................................... 47 5.8 Asimilace uhlíku ......................................................................................................... 48 5.8.1 Rychlost fotosyntézy vztažená na chlorofyl a........................................................... 49 5.8.2 Rychlost fotosyntézy v jedné buňce.......................................................................... 50 5.8.3 Vztah mezi fotosyntézou limitovanou a saturovanou zářením (α a Pmax) ................ 51 5.9 Thermoluminescence ................................................................................................. 52 5.9.1 Thermoluminescenční křivky.................................................................................... 52 5.9.2 Intenzita thermoluminescence................................................................................... 53 5.10 Synchronizace buněčné kultury................................................................................ 54 5.11 Limitace dusíkem ....................................................................................................... 55 5.12 Denní rytmy - shrnutí ................................................................................................ 57 5.13 Endogenní rytmy ........................................................................................................ 57 5.14 Regulace fotosyntézy v přirozeném světelném režimu ........................................... 57 5.14.1 Příjem světelného záření ........................................................................................... 58 5.14.2 Tok elektronů přes PSII............................................................................................. 59 5.14.3 Asimilace CO2 ........................................................................................................... 60 6 ZÁVĚR .............................................................................................................. 61 7 LITERATURA ................................................................................................... 62 8 ZKRATKY ......................................................................................................... 70 9 PŘÍLOHY .......................................................................................................... 72 1 Shrnutí V této magisterské práci jsem sledoval denní změny fotosyntetické aktivity v proměnném světelném režimu u mořské rozsivky Thalassiosira weissflogii pěstované v ustáleně rostoucí kontinuální kultuře. Podařilo se mi zjistit pravidelné denní rytmy v koncentraci pigmentů v buňce, aktivitě fotosystému II, maximální fotochemické účinnosti, kinetice reoxidace primárního akceptoru QA ve fotosystému II, maximální rychlosti fixace CO2, fotoaklimaci buněk a dalších měřených parametrech u buněk rostoucích v kompletním médiu i u buněk limitovaných dusíkem. Mnohé z těchto parametrů byly patrny i po změně světelného režimu na konstantní. Jako jeden z prvních jsem pozoroval výrazné denní rytmy v intenzitě thermoluminescence z fotosystému II, i ve tvaru thermoluminescenční křivky. Pro nový přístroj od firmy P.S.I. (Brno) jsem zavedl metodiku měření thermoluminescence z fotosyntetických mikroorganismů. Tato jednoduchá metoda je využitelná při sledování denních změn v aktivitě fotosystému II, charakterizování fotosyntetických mutantů i aktivitu chlororespiračních procesů. Poslední z těchto možností lze sledovat pomocí specifických inhibitorů oxidoreduktáz či infračerveným zářením. Dále jsem se zabýval metodickou otázkou rozdílu maximálního fluorescenčního výtěžku získaného excitací jedním krátkým zábleskem (< 50 μs, „single turnover“) a celou sérií těchto záblesků („multiple turnover“) u izolovaných thylakoidních membrán hrachu (Pea sativa). Fitováním kinetiky reoxidace primárního akceptoru lze určit druh procesů a jejich příspěvek k naměřenému fluorescenčnímu výtěžku. 1 2 Úvod 2.1 Fotosyntetické mikroorganismy Fotosyntéza je biologickou přeměnou sluneční energie na energii chemických vazeb uhlíkatých organických látek. Ve vodním prostředí probíhá převážně ve fotosyntetických jednobuněčných mikroorganismech. Přestože tyto organismy tvoří zhruba 1% biomasy na Zemi, odhaduje se, že v současné době probíhá asi 40 % globální primární produkce ve vodním prostředí (Falkowski a Raven 1997). Fotosyntetické mikroorganismy jsou proto důležitým zdrojem informací o fotosyntetických reakcích a jejich studium je významným přínosem ke studiu globálních cyklů uhlíku a kyslíku, ale i dalších látek. Díky buněčné organizaci stélky mikroorganismů je možné studovat stupeň propojení s dalšími metabolickými procesy. Pro svůj krátký reprodukční cyklus a nenáročné pěstování se řasy a sinice staly častými modelovými organismy pro studium fotosyntézy, respirace a dalších metabolických interakcí. Tyto organismy netvoří monofyletickou skupinu. Současné představy o vývoji taxonů protist (a ostatních eukaryot) popisuje Keeling a spol. (2005). V Tabulce 1 je uvedeno rozdělení základních skupin kyslík vyvíjejících (oxygenních) fotosyntetických mikroorganismů podle fyziologických vlastností jejich fotosyntetického aparátu - organizace thylakoidních membrán a složením protein-pigmentových komplexů (Falkowski a Raven 1997, Durnford a spol. 1999). skupina Prokaryota Cyanophyceae Prochlorophyceae Eukaryota červená linie Světlosběrné komplexy Thylakoidní membrány Chl a PBS, SCP, HLIP, Isia jednoduché thyl. Chl a + b Pcb párové Rhodophyta Chl a PBS, HLIP jednoduché thyl Cryptophyta Chl a + c1 CAC, PBP, HLIP párové thyl. Chl a + c, peridinin iPCP, sPCP po 3 a více Haptophyta Chl a + c FCP po 3 Heterokonta Chl a + c, fukoxanthin FCP po 3 Chlorophyta Chl a + b LHC, CP22, ELIP po 3 a více (grana) Euglenophyta Chl a + b LHC po 1 a více Chlorachniophyta Chl a + b LHC po 3 Dinophyta zelená linie Pigmenty Tabulka 1. Funkční rozdělení oxygeniích fotosyntetických mikroorganismů dle buněčné struktury, typu chlorofylu a světlosběrných komplexů. Podle Falkowski a Raven (1997) a Durnford a spol. (1999). 2.1.1 Rozsivky Rozsivky (Bacillariophyceae - Heterokonta) tvoří dominantní skupinu fytoplanktonních řas, která hraje významnou roli v biogeochemických cyklech uhlíku, křemíku a dusíku (Tréguer a spol. 1995, Field a spol. 1998, Smetacek 1999). V oceánech jsou 2 dominantní součástí fytoplanktonu a jejich produktivita se odhaduje na 40 % z celkové oceánské produkce. Jako součást fytoplanktonu se vyskytují také ve sladkých vodách, kde mohou tvořit nepřehlédnutelné nárosty na ponořených rostlinách. Jejich tělo je uzavřeno v křemičité schránce, která určuje jejich velikost. Rozmnožují se pohlavně i nepohlavně. Charakteristická je pro ně centrální vakuola s významnou zásobní funkci (Graham a Wilcox 2000). Nástěnné chloroplasty jsou uzavřeny ve čtyřech membránách, které odkazují na sekundární endosymbiosu se společným předkem v červené linii (Raymond a spol. 2003). Thylakoidní membrány jsou složené po třech. Není u nich patrná granální struktura, nebyla zjištěna ani segregace fotosystémů (Pyszniak a Gibbs 1992). Rozsivky se liší od zelených řas a vyšších rostlin svým světlosběrným systémem. Jejich světlosběrné antény jsou tvořeny fukoxanthin-chlorofylovými proteiny (FCP). Ty mají podobné znaky jako „chlorophyll a-binding“ (CAB) proteiny vyšších rostlin (Durnford a spol. 1996). U mořských centrických rozsivek Phaeodactylum tricornutum, Cyclotella cryptica a Thalassiosira pseudonana byly popsány celé rodiny genů kódující FCP (Bhaya a Grossman 1993, Eppard a Rhiel 1998, Armbrust a spol. 2004) zatímco u rozsivky T. weissflogii pouze jeden (GenBank). Funkce těchto antén připomíná světlosběrné antény vyšších rostlin (LHC). Nedávno byly separovány dvě proteinové frakce obsahující funkční oligomery FCP (Guglielmi a spol. 2005). Větší a stabilnější frakce obsahovala převážně Chl a a fukoxanthin. Menší komplex byl ochuzený o Chl c, naopak pro něj bylo charakteristické vysoké množství diadinoxanthinu (DD), pigmentu xanthofylového cyklu (viz kapitola 2.3.5.2). Zatím lze pouze předpokládat, že tyto frakce mají podobnou funkci jako LHC 2 a LHC 3. Kompletní sekvenací genomu rozsivky T. pseudonana (Armbrust a spol. 2004) bylo zjištěno, že oproti zeleným řasám a vyšším rostlinám došlo u rozsivek k výrazně menšímu transportu genů z plastidů do jádra. Lze se domnívat, že regulace exprese (nejen) fotosyntetických genů tak může probíhat rychleji a účinněji než u jiných organismů. 3 2.2 Denní rytmy řas Sluneční světlo je pro fotosyntetické mikroorganismy hlavním zdrojem energie. Intenzita slunečního záření se během dne mění. Kromě pravidelných denních změn způsobených otáčením Země dochází k nepravidelným fluktuacím v intenzitě záření dopadajícího na povrch Země v rozsahu až dvou řádů, které jsou způsobeny atmosférickými podmínkami. Ve vodním prostředí se intenzita i spektrální složení dopadajícího světla mění s polohou ve vodním sloupci. Vzhledem k tomu, že existuje mnoho procesů, které mohou způsobit promíchání vodního sloupce, jsou fotosyntetické mikroorganismy denně vystaveny značné světelné variabilitě prostředí. Jejich hlavním úkolem zůstává efektivně přijímat sluneční energii a nezpůsobit nadměrné poškození fotosyntetického aparátu. Pravidelné střídání světla a tmy (nebo světla o vysoké a nízké intenzitě) řídí metabolickou aktivitu fotosyntetických organismů. V přírodě má střídání světla a tmy navíc také vliv na denní změny teploty. Teplota pak ovlivňuje mnoho metabolických procesů, např. rychlost enzymatických reakcí Calvin-Bensonova cyklu, fotosyntetický vývoj kyslíku nebo intenzitu dýchání (Falkowski a Raven 1997). Má také vliv na rozpustnost plynů ve vodě. Je zřejmé, že světelné i teplotní změny přispívají k pravidelným denním rytmům celého metabolismu buňky. Pravidelné střídání světla a tmy („light-dark“, LD režim) doprovázené změnami teploty patří k nejstarším a nejpravidelnějším jevům na Zemi. 2.2.1 Endogenní rytmy genové exprese Endogenní rytmy jsou procesy pozorovatelné ve stálých intervalech nezávisle na okolním prostředí. Výraz endogenní hodiny se používá pro mechanismus, který je spouští (Sweeney 1987). Geny fotosyntetických mikroorganismů (všechny u sinic a většina u řas) obsahují sekvence, díky kterým je jejich exprese kontrolována endogenními biologickými hodinami (shrnutí v Suzuki a Johnson 2001). Endogenní rytmy pak způsobují např. cirkadiální rytmy transkripce fotosyntetických genů i po přenesení organismů na konstantní světelný režim („light-light“, LL). Nejkonzervativnějším a modelovým endogenním rytmem je jeden z prvních objevených cirkadiálních rytmů - schopnost luminiscence u mořských obrněnek Gonyaulax polyedra. Ta bývá zachována i po 35 cyklech v konstantním světelném prostředí (Hastings a Sweeney 1958). Většina endogenních hodin však potřebuje pravidelně „seřizovat“. Proto v konstantních podmínkách dochází k postupnému vymizení rytmů, a tím k regulaci genové exprese a adaptaci (Sweeney 1987). Zachování cirkadiálních rytmů je pro fotosyntetické organismy výhodné. U dvou mutant sinice Synechococcus elongatus, které mají pozměněný gen ovládající endogenní 4 hodiny, byly pozorovány odlišné periody endogenních rytmů - 24 a 21 hodin (Ouyang a spol. 1998). Po jejich smíchání docházelo k převládnutí populace s endogenními hodinami, které lépe odpovídaly nastavenému LD režimu. Obdobné výsledky byly nedávno publikovány i pro dva mutanty Arabidopsis thaliana (Dodd a spol. 2005). V této práci rostliny (mutanty nebo divoký typ), jejichž endogenní hodiny lépe odpovídaly okolnímu prostředí obsahovaly více chlorofylu, dokázaly asimilovat více uhlíku a rostly rychleji než rostliny, u kterých se jejich endogenní hodiny lišily od LD režimu, kterému byly vystaveny. Správná synchronizace endogenních hodin s denním režimem je proto významným předpokladem k optimálnímu využití sluneční energie fotosyntetickými organismy. V některých případech nejsou rytmy v množství mRNA doprovázené stejně robustními rytmy v koncentraci proteinů. Proteiny genů rbcL (velká podjednotka enzymu RUBISCO), psbA a psbB (D1 a D2 proteiny reakčního centra PSII) jsou syntetizovány pouze během fotoperiody. Naopak transkripce těchto genů a genů pro PSI a ATP-syntázu je indukována mechanismem, který nepodléhá regulaci světlem (Leu a spol. 1990). Obecně platí, že fotosyntetické geny jsou nejvíce transkribovány těsně před začátkem a v první polovině fotoperiody (Oeltjen a spol. 2004, Bruyant a spol. 2005). Na výsledném fenotypu se tak vedle genové exprese podílejí i další mechanismy, zodpovědné za funkční formu výsledného proteinového komplexu. 2.2.2 Buněčný cyklus Buněčný cyklus řas a sinic má specifické vlastnosti, které dennímu rytmu podléhají jen částečně. Rychlost dělení (zdvojení počtu buněk za periodu, μ) závisí na trofických podmínkách (Falkowski a Raven 1997). Pokud buňka asimiluje dostatečné množství živin, projde tzv. kontrolním bodem („commitement point“), a nastoupí dráhu buněčného dělení (syntetická fáze buněčného cyklu). Periodicita buněčného dělení je tak spojena se střídáním světla a tmy. Přesné načasování je ale různé u jednotlivých mikroorganismů a může být také kontrolováno jinými faktory (Nelson a Brandt 1979). Zvláštní synchronizace buněčného cyklu s LD režimem byla popsána u bičíkatých zelených řas Scenedesmus quadricauda a Chamydomonas reinhardtii (Šetlík a spol. 1972, Zachleder a Šetlík 1990). Mateřské buňky těchto řas mohou projít za optimálních podmínek i více kontrolními body během jedné fotoperiody. Dělení buněk (mitóza) ale probíhá pouze jednou, a sice v druhé polovině temné periody. Počet dceřiných buněk je následně úměrný počtu úspěšně absolvovaných kontrolních bodů. Díky jedinému dělení buněk může být růst těchto organismů plně synchronizován s LD režimem. 5 Na druhou stranu má buněčný cyklus významný vliv na fotosyntetické schopnosti řas a sinic. U mořského prokaryotního organismu Prochlorococcus (Bruyant a spol. 2005) dělení buněk snižuje maximální schopnost fixace uhlíku a přechod z G1 fáze buněčného cyklu výrazně ovlivňuje fotosyntetické vlastnosti elektronového transportu na thylakoidních membránách. Podobný vliv buněčného cyklu na aktivitu fotosytému II popsali Kaftan spol. (1999) a Šetlíková a spol. (2005) také u zelené řasy Scenedemus quadricauda, kde nárůst nefotochemického zhášení charakterizuje počátek dělení buněk. Vzhledem k tomu, že toto dělení probíhá v noci, jde zřejmě o ochranný mechanismus bránící přeredukování PQ poolu a poškození fotosyntetického aparátu, neboť útlum genové transkripce znemožňuje jeho obnovu a nahuštění membrán dělících se buněk zmenšuje relativní velikost PQ poolu. 2.2.3 Denní rytmy ve fotosyntéze Fotosyntetické reakce závisí na intenzitě a kvalitě dopadajícího slunečního záření (Falkowski a Raven 1997). Během přirozeného denního světelného režimu se intenzita záření mění po celou délku fotoperiody, a proto je za přirozených podmínek velmi obtížné odlišit fotosyntetické rytmy vyvolané změnou intenzity záření od rytmů endogenních či způsobených některou fází buněčného cyklu. Denní změny fotosyntetické aktivity u řas a sinic byly popsány v mnoha terénních i laboratorních pracích za dobu, která převyšuje můj věk (srovnej Prézelin a Ley 1980 a Owens a spol. 1980). Periodické denní změny byly zjištěny pro rychlost a maximální schopnost asimilace uhlíku, pro vývoj kyslíku, in vivo fluorescenci chlorofylu a, fotochemickou účinnost PSII, rychlost elektronového přenosu na thylakoidních membránách, velikost světlosběrné antény obou fotosystémů, expresi genů fotosyntetických enzymů, buněčnou koncentraci pigmentů, tvar a orientaci chloroplastů, asimilaci živin, aktivitu a exkreci alkalických fosfatáz (shrnutí v Owens a spol. 1980 a Falkowski a Raven 1997). Otázky týkající se mechanismu regulace fotosyntézy během přirozeného světelného režimu však dodnes nejsou spolehlivě vysvětleny (Behrenfeld a spol. 2004). Proto má smysl i v současné době provádět experimenty, které podrobně zkoumají kovariaci fotosyntézy, genové exprese a buněčného cyklu a které se snaží na tyto otázky odpovědět (Bruyant a spol. 2005). 2.2.4 Denní rytmy u rozsivek 2.2.4.1 Rytmy v koncentraci pigmentů Velká variabilita v buněčné koncentraci světlosběrných pigmentů chlorofylu a a c, v rozsahu 20 až 100 % během jednoho dne, byla prokázána v závislosti na růstových podmínkách (Owens a spol. 1980, Post a spol. 1984). Tyto velké denní změny byly 6 vysvětleny různým způsobem. Post a spol. (1984) navrhli existenci endogenních hodin, zatímco Owens a spol. (1980) obhajovali prostý vliv změn světla a tmy. Obě tyto studie se zabývaly pouze oscilacemi v koncentraci chlorofylu, nikoli dalších pigmentů (fukoxanthinu, diadinoxanthinu, diatoxanthinu a β-karotenu). Tyto pravidelné denní rytmy v buněčné koncentraci chlorofylu a doprovázely podobné změny ve fluorescenci in vivo (Owens a spol. 1980). 2.2.4.2 Exprese fotosyntetických genů O expresi fotosyntetických genů u rozsivek není zatím mnoho známo. U většiny z nich se předpokládá, že se řídí podobnými zásadami jako u zelených řas či vyšších rostlin (Leu a spol. 1990). U Cyclotella cryptica byly popsány dvě skupiny genů pro světlosběrné antény FCP exprimovaných za různých světelných podmínek (Oeltjen a spol. 2002). Transkripty genů fcp6, fcp7 a fcp12 vzrostly přednostně za vysoké světelné intenzity. Naopak nízká intenzita záření zvyšovala transkripční úroveň genů fcp1, fcp2, fcp3 a fcp4. Z každé této skupiny byly vybrány dva geny, fcp2 a fcp6, u kterých byla sledována exprese během LD i LL režimu (Oeltjen a spol. 2004). Zatímco gen fcp2 vykazoval circadiální expresi pravidelně uprostřed fotoperiody, největší množství transkriptu fcp6 bylo zjištěno již na počátku a jednu hodinu před začátkem fotoperiody. Leblanc a spol. (1999) uvádí, že u T. weissflogii se transkripce genu fcp zvyšovala po osvětlení a nejvyšších hodnot dosahovala 6-8 hod od začátku ozáření. 7 2.3 Metabolismus dusíku a fotosyntéza 2.3.1 Metabolismus dusíku Dusík se ve vodním prostředí vyskytuje v několika formách, které jsou dostupné fotosyntetickým mikroorganismům – amonium (NH4+), nitrát (NO3-), nitrit (NO2-), močovina, aminokyseliny, nukleosidy, dusíkaté báze a (pouze pro diazotrofní sinice) N2. Nejoxidovanější a nejstabilnější forma dostupného dusíku ve vodním prostředí, nitrát, je také nejčastěji asimilovanou látkou ve většině vodních ekosystémů (Falkowski a Raven 1997). Naopak nejpreferovanější látkou pro všechny sinice i řasy je amonium (Shehawy a Kleiner 2000). Fotosyntetická asimilace uhlíku je výrazně ovlivněna metabolismem dusíku (Padmasree a Raghavendra 2000). Zatímco redukce nitrátu na nitrit probíhá v cytosolu, v chloroplastech dochází hned ke třem významným procesům: (i) k redukci NO2- na NH4+, (ii) k rychlé fixaci NH4+ enzymy glutamin syntázou (GS) a 2-oxoglutarát aminotransferázou (GOGAT), (iii) k přeměně 2-oxoglutarátu na glutamát, následně pyruvátu na alanin a oxaloacetátu na aspartát. Fotosystémem I redukovaný ferredoxin se účastní redukce NO2-, transaminace glutaminu a syntézy aminokyselin. Jen pro redukci NO3-/NO2- na NH4+ je využíváno asi 20 % kapacity fotosyntetického elektronového řetězce (Padmasree a Raghavendra 2000). K přímému prolnutí dusíkového metabolismu a fixace uhlíku tedy dochází na úrovni produktů světelných reakcí thylakoidních membrán. V případě, že je zdrojem dusíku nitrát (místo amonia), zvýší se fotosyntetická produkce kyslíku k asimilovanému CO2 (Lara 1992). K tomuto jevu dochází při všech intenzitách ozářenosti. Má se za to, že si fotosyntéza s asimilací dusíku nekompetuje, neboť kapacita elektronového transportu je obvykle v nadbytku nad potřebou pro fixaci uhlíku (Padmasree a Raghavendra 2000). Fotorespirace je také významným zdrojem NH4+ pro GS-GOGAT systém syntézy aminokyselin de novo (Oliver 2000). V mezofylových buňkách listů vyšších rostlin je tok amonia z fotorespirace několikanásobně vyšší než příjem dusíku z floému. U sinic a řas se vyskytují různé varianty CO2 koncentračních mechanismů, a proto je tento příspěvek velmi nízký (Giordano a spol. 2005). Nicméně tyto mechanismy hrají významnou roli v regulaci toku energie při nedostatku živin, dostupnosti CO2 či nadměrném příjmu světelného záření (Beardall a Giordano 2002). 8 2.3.2 Nedostatek dusíku Koncentrace dusíku v živném médiu přímo určuje rychlost růstu fotosyntetických mikroorganismů. Obecně platí, že nedostatek dusíku má vliv na fyziologii buňky na úrovni translace, kde nedostatek aminokyselin limituje translaci mRNA, a tak dochází k redukci proteosyntézy (Falkowski a spol. 1989). Při limitaci dusíkem se naopak syntetizují vysokoafinitní přenašeče využívající ATP (ABC-transportery), schopné zajistit růst při velmi nízkých koncentracích nitrátu (méně než 1μM u sinic) (Shehawy a Kleiner 2000). Buněčným receptorem koncentrace dusíku je u sinic gen ntcA (Vega-Palas a spol. 1992). Proteinový produkt tohoto genu stimuluje transkripci dalších genů, např. nitrogenázy a membránových přenašečů, či iniciuje diferenciaci heterocytu (Shehawy a Kleiner 2000). Cytokininy hrají pravděpodobně hlavní roli při signalizaci nedostatku dusíku u vyšších rostlin. Tyto látky byly také objeveny u zelených řas a jejich vliv se nyní intenzivně studuje. U ostatních eukaryotních fototrofů nebyly zatím žádné konkrétní látky objeveny (Shehawy a Kleiner 2000). Většina reakcí fotosyntézy na nedostatek dusíku byla sledována na úrovni krátkodobé limitace dusíku (hladovění). V tomto případě dochází k poklesu množství pigmentů na buňku, snižuje se množství fotosyntetických jednotek a klesá celková fotosyntetická produkce. U mikroorganismů, které mají fykobilisomy jako světlosběrné antény (sinice a ruduchy), dochází k výrazné redukci koncentrace fykoerythrinu vzhledem k Chl a. Nedostatek dusíku u zelené řasy Selenastrum minutum dramaticky snížil koncentraci ribuloso-bisfosfátu a způsobil přesměrování toku uhlíku do biosyntézy aminokyselin (Elrifi a Turpin 1986). Naopak krátká expozice zvýšenému množství dusíku u limitovaných kultur zřejmě inaktivuje některé klíčové enzymy, např. sedoheptulózo-bisfosfatázu a fosforibulokinázu, a krátkodobě i fixaci CO2 (Smith a spol. 1989), zatímco aktivita PEP-karboxylázy je stimulovaná (Guy a spol. 1989). Fyziologické údaje o vlivu dlouhodobého nedostatku dusíku na fotosyntetické mikroorganismy zatím bohužel chybí. Variabilní fluorescence a fotochemická účinnost PSII byla považována za účinný nástroj ke stanovení primární produkce fytoplanktonu a zjištění nutričních podmínek pro organismus (Kolber a Falkowski 1993, Babin a spol. 1996). Teprve nedávno publikovali Parkhill a spol. (2001) výsledky měření fotosyntetické aktivity rozsivky Thalassiosira weissflogii pěstované při různých koncentracích dusíku. Jejich zjištění je poměrně převratné, neboť dokládají, že u ustáleně rostoucích kultur je maximální účinnost fotosytému II stejná pro dusíkem limitované i nelimitované kultury. 9 2.4 Fotosyntetický přenos elektronů 2.4.1 Primární reakce ve fotosystému II Světelná energie je zachycena ve vnějších světlosběrných anténách fotosystému II (PSII) a přenesena přes vnitřní antény (CP43 a CP47) do reakčního centra P680 (RC). Zde dochází k rozdělení náboje a oddělení elektronu, který je dále předáván na akceptory pheophytin (Pheo), plastochinon QA a ve vazebném místě QB na pohyblivé plastochinony (PQ) (viz Obrázek 1). Plastochinon QB je dvakrát redukován na PQH2. Na redukci 1 molekuly PQ je zapotřebí 2 elektronů a 2 protonů H+ z vnější strany thylakoidní membrány. RC dostává elektrony z tyrosinu (Tyr). Tyto elektrony pocházejí ze štěpení vody na manganovém komplexu (Mn). Podrobný popis struktury PSII uvádí např. Falkowski a Raven (1997) či Whitmarsh a Govindjee (2002). Obrázek 1. Schematické znázornění zachycení fotonů ve světlosběrných anténách a přenosu elektronů ve fotosystému II. LHC-II – vnější antény, CP47 a CP43 – vnitřní antény, P680 – reakční centrum, Phe – pheophytin, Tyr – tyrosin, , QA a QB – akceptory, PQ – volné plastochinony, D1 a D2 hlavní podjednotky PSII, Mn – manganový komplex (převzato z Whitmarsh a Govindjee 2002). B 2.4.2 Lineární přenos elektronů Lineární přenos elektronů v kyslík vyvíjejících fotosyntetických membránách zachycuje tzv. Z-schéma (viz obrázek 2). Plastochinony PQ redukované v PSII jsou reoxidovány na cytochromu (Cyt) b6f. Extramembránový přenašeč plastocyanin (PCy) přenášejí elektrony na fotosystém I, kde rozdělením náboje v další světelné reakci získají 10 redoxní potenciálovou energii. Elektrony s velkým negativním redoxním potenciálem jsou využité enzymem ferredoxin-NADP+-reduktázou (FNR) k redukci NADP+. Výsledným produktem lineárního elektronového transportu jsou tedy redukované koenzymy NADPH . Během lineárního elektronového transportu podle Z-schématu se produkce 1 molekuly O2 účastní 8 kvant záření, vytvoří se 8 NADPH a 12 protonů (H+) se přenese do lumen thylakoidů. Experimentální měření však ukazují, že produkce 1 molekuly O2 se účastní obvykle 10 kvant. To znamená, že zhruba 20 % absorbovaných fotonů se účastní cyklického transportu okolo PSI. Obrázek 2. Z-schéma lineárního přenosu elektronů ve fotosyntetickém řetězci (www.molecadr.com). 2.4.3 Cyklický elektronový transport Cyklický elektronový transport (CET) okolo PSI vrací elektrony z akceptorové strany PSI zpět na plastochinony (PQ) nebo přímo na Cyt b6f (viz Obrázek 3). Místo reduktantů se vytváří transmembránový potenciál protonů a ve svém důsledku se zvyšuje poměr ATP k produkci redukovaných koenzymů (NADPH+) oproti lineárnímu transportu. V chloroplastech byly popsány minimálně čtyři možné procesy, které se mohou podílet na CET: i) enzym ferredoxin-PQ-reduktáza (FQR), ii) enzym NAD(P)H-PQ oxidoreduktáza (NDH), iii) super komplex Cyt b6f s enzymem FNR (Joliot a Joliot 2002, 2005), případně s PSI a iv) extra Hem v Cyt b6f (Johnson 2004). Tyto procesy mají pravděpodobně fotoprotektivní význam a mohou se rovněž uplatnit ve stresových situacích (Cruz a spol. 2004). Analýza mutantních organismů s poškozenými či chybějícími komponenty CET ukazuje, že cyklická fosforylace je nezbytná pro optimální funkci fotosyntézy (Munekage a spol. 2004). 11 Obrázek 3. Model cyklického elektronového transportu vytvořením komplexu FNR/Cyt b6f na thylakoidní membráně. FNR – ferredoxin-NADP+-reduktáza, Fd – ferredoxin, SI a SII – fotosystém I a II, PC – plastocyanin, cyt bf – cytochrom b6f (převzato z Joliot a Joliot 2005). Problém kvantifikace CET souvisí s jeho samotným principem, s regulací toku elektronů. Cyklický elektronový transport je možné prokázat např. pomocí variabilní fluorescence (Prášil a spol. 1996). Přisuzuje se mu role ve zvýšení minimální fluorescence (F0) ihned po zhasnutí aktinického světla. Redoxní stav plastochinonů se nachází v dynamické rovnováze s QB kapsou na PSII. Po přenesení vzorku do tmy dochází k nárůstu fluorescence vlivem zpomalení odtoku PQH2 z QB kapsy. Lze si představit, že zpomalením činnosti PSI a stálou aktivitou CET dojde po vypnutí aktinického světla k redukci PQ. 2.4.4 Chlororespirace Chlororespirace (shrnutí v Peltier a Cournac 2002) zahrnuje procesy, které aktivně redukují PQ pool ve tmě. Temnotní redukce PQ může být zablokována inhibitory enzymů dýchacího řetězce, a proto chlororespiraci způsobují enzymy dýchacího řetězce, které jsou přítomny v chloroplastech. Mezi tyto přenašeč patří následující komplexy. Prvním je Ndh komplex (NAD(P)H dehydrogenáza), který je homologní s mitochondriálním komplexem I (NADH dehydrogenáza) (Matsubayashi a spol. 1987). Přestože byl prokázán u vyšších rostlin, u zelené řasy Chlamydomonas reinhardtii tento gen ale objevený nebyl. Naopak genom sinice Synechocystis PCC 6803 kóduje dokonce 2 typy těchto dehydrogenáz (Howitt a spol. 1999). Dalším komplexem účastnícím se nefotochemické redukce PQ je sukcinát dehydrogenáza, chloroplastový homolog mitochondriálního komplexu II. Její aktivita byla potvrzena v Chlamydomonas reihardtii a v sinici Synechocystis PCC 6803 byly objeveny otevřené čtecí rámce jejich podjednotek. Má se za to, že u sinic představuje hlavní cestu nefotochemické redukce PQ (Cooley a Vermaas 2001). Jiným druhem enzymu, který se na chlororespiraci podílí, je terminální oxidáza (PTOX, „plant terminal oxidase“), která je homologní AOX 12 (mitochondriální alternativní oxidáze) a využívá elektronů z PQ k redukci O2 na vodu. Podle současných představ je spojena s chlororespiračním i fotosyntetickým řetězcem (Peltier a Cournac 2002).Pravděpodobné je také zapojení mechanismů CET do chlororespiračních procesů: enzymů TH (transhydrogenázy) a FQR (ferredoxin-PQ-reduktázy), které využívají koenzymy redukované při světelných reakcí v PSI (Peltier a Cournac 2002). U vyšších rostlin, které mají plastidové geny ndh, zahrnuje chlororespirace aktivitu plastidového Ndh komplexu. U zelených řas a organismů, kterým chybí geny ndh v plastidech, je nefotochemické redukce PQ dosaženo jinou aktivitou (např. enzymem podobným Ndh2). Chlororespirační pochody (Obrázek 4) jsou pravděpodobně omezeny na agranální části thylakoidních membrán, a prochází jimi pouze 2 % maximálního lineárního toku elektronů (Cournac a spol. 2002). Obrázek 4. Model chlororespirace a cyklického toku elektronů na thylakoidní membráně u zelených řas (Chlorophyceae). Zkratky jsou vysvětleny v textu (převzato z Peltier a Cournac 2002). 2.4.5 Fotoaklimace Fotoaklimace zahrnuje mechanismy, které se podílejí na regulaci fotosyntézy vyvolané změnou intenzity záření. Tyto děje probíhají v různých časových úrovních (Obrázek 5). V následující kapitole uvádím hlavní mechanismy těchto procesů na fotosyntetických membránách, které přímo nesouvisí s lineárním přenosem elektronů ve fotosyntetickém řetězci. Jejich přítomnost či absence však lineární přenos elektronů ovlivňují, a proto je nutné s nimi počítat při interpretaci výsledků měřených pomocí biofyzikálních metod. 13 Minuty Syntéza a degradace pigmentů přizpůsobení fotosyntetické kapacity poškození a oprava PSII Obrázek 5. Diagram časového rozložení fotoaklimačních dějů fytoplanktonu indukovaných změnou intenzity záření (převzato z MacIntyre a spol. 2001). 2.4.5.1 „State-transitions“ Rozdělení excitační energie mezi fotosystémy PSII a PSI může mít značný vliv na lineární tok elektronů. Pokud PSII absorbuje více excitační energie než PSI (např. v důsledku změny spektrálního složení záření nebo změnou stochiometrie fotosystémů), dojde k rychlému zredukování PQ a k poklesu rychlosti fotosyntézy. Během 5 – 10 minut dochází k ustálení rychlosti fotosyntetického vývoje kyslíku na nižší hladinu (Bonaventura a Myers 1969). Ustálená rychlost vývoje kyslíku po specifické excitaci PSII zářením o vlnové délce 645 nm byla nazvána Stav II a po excitaci PSI (680 nm) Stav I. Benett (1991) dokázal, že přechod mezi těmito stavy, tzv. „state-transitions“ souvisí s fosforylací enzymu LHC2 v thylakoidních membránách. Při excitaci PSII jsou světlosběrné komplexy LHC2 fosforylovány vlivem zredukování PQ. Fosforylace přidává proteinům negativní náboj, což vede k odpoutání komplexů od PSII. Jejich napojení na PSI bylo zjištěno simultánním měřením absorpčního průřezu PSII a PSI (σPSII a σPSI). Tyto změny probíhají v řádu 10 % celkové velikosti antény. „State-transitions“ jsou považovány za jeden z prvních regulačních mechanismů na malé změny ozářenosti. Mnohem více zřejmě závisí na redoxním stavu PQ než na kvalitě záření (Falkowski a Raven 1997). 2.4.5.2 Nefotochemické zhášení fluorescence Aktivace nefotochemického zhášení fluorescence (NPQ) je dalším krokem regulace fotosyntézy (Masojídek a spol. 2004). Projevuje se výrazným zhášením fluorescence a změnou σPSII (až o 50 %) (Kolber a spol. 1993). NPQ vzniká za vysoké ozářenosti ve světlosběrných anténách PSII ve dvou fázích (obrázek 6). Na obou fázích se podílí membránový protonový gradient. První fází je protonace komplexu PsbS/LHC (Müller a spol. 2001). Tím dojde k menšímu zrychlení vyzařování fluorescence chlorofylu. V druhé fázi je 14 vytvořen zhášecí komplex, který velmi účinně převádí zachycené záření na tepelnou energii a urychluje vyzařování fluorescence. Pro jeho vytvoření je nutná přeměna epoxidované formy specifických karotenoidů na deepoxidovanou formu. Jedná se o reverzibilní proces (odtud pochází název xantofylový cyklus), přičemž opačná reakce (epoxidace) probíhá po přenesení vzorku do tmy nebo na nižší intenzitu ozářenosti. Vztah mezi pigmenty xanthofylového cyklu a NPQ bylo poprvé zmíněno v práci Demmig-Adams (1990). U zelených řas a vyšších rostlin je epoxidovanou formou pigmentu v xantofylovém cyklu violaxanthin (Viol). Deepoxidace zde probíhá ve třech stupních, za postupného vzniku antheroxanthinu (Ant) a zeaxantinu (Zea). Intenzita NPQ často přímo souvisí s deepoxidačním stavem karotenoidů (DEPS), vyjádřeným jako poměr (Zea+Ant)/(Zea+Ant+Viol) (Masojídek a spol. 2004). U rozsivek a hnědých řas jsou fotoprotektivními pigmenty diadinoxanthin (DD) a jeho deepoxidovaná forma diatoxanthin (DT) (Olaizola a spol. 1994). Koncentrace DT vzhledem k Chl a přímo souvisí s intenzitou NPQ a určuje jeho kinetiku relaxace (Lavaud a spol. 2002). V případě zvýšené koncentrace DT může NPQ přetrvávat i 60 minut ve tmě. Naopak kinetika aktivace NPQ je v řádu několika minut. Obrázek 6. Model vzniku nefotochemického zhášení. (A) Ve tmě či při velmi nízké ozářenosti (černý rám) žádné zhášení nenastává. (B) Při vysoké intenzitě záření (bílý rám) jsou PsbS a LHC protonované, čímž způsobují zkrácení dobu vyzařování fluorescence Chl na 1.6 ns. (C) Je vytvořen zhášecí komplex se změněnými absorbčními vlastnostmi ( A535) (deepoxidační přeměna violaxanthinu na zeaxanthin). Vyzařování fluorescence Chl se zkrátí na 0.4 ns. (D) Po skončení světelného stresu dochází k rychlé deprotonaci, zatímco epoxidace pigmentů probíhá pomaleji (převzato z Müller a spol. 2001). 15 2.4.5.3 Fotosyntetická křivka Vztah mezi rychlostí fotosyntézy (vyjádřenou jako asimilace uhlíku, vývoje kyslíku, nebo fotosyntetický tok elektronů), ozářeností (světelnou energií, kvanty) a biomasou (počtem buněk, množstvím Chl a) znázorňuje fotosyntetická křivka (tzv. P vs. E křivka, Obrázek 7). Fotosyntetická křivka má vzhledem k ozářenosti dvě charakteristické oblasti – světlem limitovanou a světlem saturovanou část (Falkowski a Raven 1997). První oblast je charakterizována téměř lineárním nárůstem rychlosti fotosyntézy (α) se vzrůstající ozářeností. V této oblasti rychlost fotosyntézy limitují fotochemické reakce na thylakoidní membránách (α = n.σPSII, n je množství funkčních fotosyntetických jednotek, σPSII je funkční velikost světlosběrné antény PSII). V druhé oblasti linearita P vs. E křivky mizí a nastává nasycení fotosyntézy. Její rychlost je omezena enzymatickými reakcemi fixace uhlíku. Saturaci vyjadřuje maximální rychlost fotosyntézy (Pmax, Pmax = n.(1/τ), kde 1/τ je maximální rychlost obrátky fotosyntetické jednotky). Jako matematický model fotosyntetické křivky bylo navrženo několik druhů rovnic (pravoúhlé hyperboly, kvadratické rovnice, exponenciální a hyperbolické tangenty), z nichž se nejčastěji využívá rovnice z Platt a spol. (1976): (1) P = Pmax(1-e-α.E/Pmax) Při vysokých intenzitách světelného záření dochází k fotoinhibici, která se projeví poklesem Pmax. Tento pokles vyjadřuje fotoinhibiční parametr β. Výsledná rovnice po započtení fotoinhibice je potom komplikovanější a vypadá např. takto (Platt a spol. 1980): (2) P = PS(1-e-α.E/PS)( e-β.E/PS) V případě, že je fotoinhibiční parametr β = 0, platí vztah Pmax = PS, V ostatních případech je Ps parametr vyjadřující potenciální fotosyntetickou rychlost za saturačního záření a pro zjištění maximální fotosyntetické schopnosti se využívá vztah: (3) Pmax = PS(α/(α+β)*β/(α+β))β/α Klasická představa o regulaci fotosyntetického aparátu, podložená výsledku laboratorních měření, předpokládá nezávislost světlosběrné kapacity (která určuje α) a enzymatických procesů fixace uhlíku (které určují Pmax). Výsledky z terénních měření nebo laboratorních měření simulující přirozené podmínky (např. Harding a spol. 1981, Putt a Rivkin 1988, Babin a spol. 1996, Behrenfeld a spol. 2004) ukázaly, že vzájemný vztah parametrů α a Pmax během dne je výsledkem dvou variací. První se nazývá variabilita závislá na změně EK a lze ji popsat jako klasickou fotoaklimaci. Vyjadřuje se změnou tzv. saturačního parametru parametr EK. Tento parametr popisuje intenzitu ozářenosti, při které rychlost fotosyntézy přestává být limitovaná světlosběrnou kapacitou a začíná být omezená 16 kapacitou fotosyntetických reakcí. EK se dynamicky mění během dne s výrazným denním maximem. EK lze vyjádřit rovnicí 4. (4) EK = Pmax/α Při druhém typu variace vztahu parametrů α a Pmax se EK nemění, dochází k současné změně obou parametrů (kovarianci). Proto se tento typ nazývá EK-nezávislou variabilitou. Z toho také vyplývá, že k těmto změnám dochází simultánně u světlem limitované fotosyntézy i světlem saturované fotosyntézy. Fyziologický původ EK-nezávislé variability se zatím nepodařilo spolehlivě objasnit. Nelze jej vysvětlit změnami v absorbčním koeficientu, teplotě, salinitě ani koncentrací nitrátu v médiu (Behrenfeld a spol. 2004). Obrázek 7. Dvě možné podoby závislosti fotosyntézy na ozářenosti, tzv. „P vs. E křivka“. Pokud dojde k fotoinhibici, β > 0, dosahuje fotosyntéza nižších hodnot za vyšších ozářeností, než je maximální hodnota Pmax. Význam symbolů je uveden v textu. 17 2.5 Variabilní fluorescence chlorofylu Měření variabilní fluorescence chlorofylu má dnes široké uplatnění v rostlinné fyziologii a v ekofyziologii fotosyntézy. Tato metoda je významným nástrojem při sledování všech procesů, které přímo či nepřímo souvisí s fotosyntézou. Variabilní fluorescence, jak se tato metoda také ve zkratce nazývá, se používá jak při základním výzkumu fotosyntézy v laboratořích, tak v celé řadě aplikací. Díky ní můžeme sledovat změny fotosyntézy na mikroskopické úrovni chloroplastů v jednobuněčných řasách až po celá rostlinná společenství v korunách tropických pralesů. Fluorescenci chlorofylu dokážeme detekovat i z družic z výšky několika set kilometrů nad zemí. Rutinní aplikace již zahrnují diagnostiku a selekci odolných kultivarů zemědělských plodin i měření primární produktivity v hlubinách oceánů. Moderní přístroje jsou dnes schopné při vysoké citlivosti využívat časového (v mikrosekundách až po minuty) i prostorového rozlišení sledovaného objektu. Obrázek 8. Energetický model přeměny energie zachycené ve fotosystému II – fotochemické procesy, nefotochemické zhášení, tepelná disipace, fluorescence, vytvoření tripletního stavu. 2.5.1 Základy metody variabilní fluorescence Fotosyntéza využívá pouze část energie světelného záření, kterou zachytí molekuly chlorofylu ve světlosběrných anténách. Zbylou část pohlcené energie fotosyntetické organismy přemění na teplo, nebo ji znovu vyzáří ve formě světla jako fluorescenci chlorofylu. Dále také mohou vznikat tzv. tripletní stavy, které mohou reagovat s O2 za vzniku kyslíkových radikálů. Tyto možné způsoby využití zachycené energie spolu navzájem „soutěží“ (viz Obrázek 8). Mezi účinností fotosyntézy a množstvím fluorescence proto existuje nepřímá závislost. Sníží-li se účinnost fotosyntézy (například kvůli nedostatku živin), 18 úměrně se zvýší množství energie vyzářené jako fluorescence nebo přeměněné na teplo. Fotochemické děje tedy způsobují, že výtěžek fluorescence je variabilní (proměnný). Odtud název metody. 2.5.2 Principy měření Světelné záření vyvolá v reakčním centru PSII fotochemické rozdělení náboje a elektron se přenese na plastochinon označovaný jako QA. Dokud elektron tuto molekulu neopustí, nemůže v reakčním centru dojít k dalšímu fotochemickému procesu. Během této doby (řádově stovky mikrosekund až milisekundy) zůstává reakční centrum neaktivní, neboli „zavřené“. Toto dočasné snížení účinnosti fotosyntézy se projeví zvýšením výtěžku fluorescence chlorofylu. V případě, že jsou všechna reakční centra ve vzorku neaktivní s redukovaným plastochinonem (QA-), naměřená intenzita fluorescence je označována FM (maximální fluorescenční výtěžek). Pro její dosažení lze použít dvou přístupů: fyzikálního a chemického. Prvním způsobem je již zmíněné použití velmi silného záblesku. Fotochemické procesy mohou být také zablokovány použitím herbicidu, např. 3-(3‘,4‘-dichlorophenyl)-1,1dimethyl-urea (DCMU), který blokuje plastochinon QB (sekundární akceptor v PSII) a znemožňuje redukci plastochinonů (PQ) v thylakoidní membráně (Obrázek 9). Podrobný návod s možnostmi využití variabilní fluorescence je možné nalézt v mnoha publikacích (např. Kaftan a spol. 1999, Roháček a Barták 1999, Maxwell a Johnson 2000, Lazár a spol. 2001, Roháček 2002). Obrázek 9. Fluorescenční křivky získané „zavřením“ reakčních center fotosystému II po jednom záblesku (FM ST, „single turnover“), více záblescích nebo delším pulsu (FM MT, „multiple turnover“, Kautského křivka), a po zablokování plastochinonu QB herbicidem DCMU. Mechanismy nejsou stejné. Minimální fluorescence F0 byla měřena 1 ms před zábleskem. Všimněte si nárůstu F0 po přidání DCMU. Měřítka na časové ose nejsou vždy stejná. B 19 2.5.3 Fluorescence a stres Maximální fotochemickou účinnost v temnotně adaptovaném stavu lze vyjádřit jako, FV/FM = (FM – F0)/FM (F0 je fluorescenční výtěžek při záření způsobujícím redukci maximálně 1 % QA). Pro stabilně rostoucí fotosyntetické mikroorganismy v kultuře dosahuje FV/FM ~ 0.65 (Parkhill a spol. 2001, Steglich a spol. 2001, Bruyant a spol. 2005), nicméně při měřeních v terénních měřeních bývá dosaženo nižších hodnot a větší variability (Behrenfeld a Kolber 1999). Pokles parametru FV/FM je všeobecně uznáván jako spolehlivý doklad o tom, že se fotosyntetické organismy nacházejí ve stresové situaci (Falkowski a Raven 1997). Snížení FV/FM může být způsobeno nedostatkem biogenních prvků, např. dusíku a železa. 2.5.4 Metody měření variabilní fluorescence Současné přístroje umožňují vysílat velmi krátké a intenzivní záblesky (< 50 μs), které vyvolají právě jedno rozdělení náboje v reakčním centru a „zavření“ PSII díky redukci akceptoru QA. Získaná hodnota maximálního fluorescenčního výtěžku se pak označuje FM ST (z angl. „single turnover“, viz Obrázek 9). Pokud je k „zavření“ PSII použito delších záblesků (pulsů o délce až 1s), označuje se naměřený fluorescenční výtěžek FM MT („multiple turnover“). Digitální zobrazovací metody podpořily možnosti měření variabilní fluorescence celých objektů. Variabilní fluorescence tak poskytuje nový a účinný nástroj pro sledování prostorové heterogenity fotosyntetických organismů (Šetlíková a spol. 2005). Je tedy možné sledovat fotosyntetickou aktivitu na úrovni celých listů, jednotlivých buněk (Küpper a spol. 2000), chloroplastů i jednotlivých molekul PSII. Ačkoliv se dnes variabilní fluorescence používá velmi často, je třeba mít na paměti také její omezení. Měření se sice zdají být velmi snadná, ale pokud nejsou správně navržena, může být nemožné je správně interpretovat. Nejúspěšnější a nejelegantnější použití variabilní fluorescence tkví v kombinaci s jinými metodami, například s gazometrií (např. Steglich a spol. 2001, Bruyant a spol. 2005). 2.5.5 Reoxidace QAZvýšení citlivosti detektorů umožnilo sledovat pokles variabilní fluorescence okamžitě po silném záblesku (řádově v mikrosekundách). Po ST saturačním záblesku je fluorescence vyvolána krátkými měřícími záblesky a pokles variabilní fluorescence F(t) představuje množství center, na kterých je redukován plastochinon QA- (za předpokladu, že je lineární vztah mezi koncentrací QA- a variabilní fluorescencí). Reoxidace QA- může být způsobena současnou redukcí: i) plastochinonu QB či QB-, ii) zpětnou redukcí feofytinu (Pheo) a iii) 20 rekombinací za účasti donorové strany (Vredenberg a spol. 2006, viz Přílohy). První varianta znamená lineární přenos elektronů v PSII (fotochemické zhášení fluorescence). Druhá a třetí možnost zahrnují pomalou kinetiku rekombinace náboje (viz kapitola thermoluminescence), které vznikají v tzv. QB-neredukujících reakčních centrech (nQB). Jejich přítomnost by mohla vysvětlit rozdíl mezi FM ST a FM MT. U buněčných kultur mikroorganismů má tato rekombinace rychlejší kinetiku (Kasalický, nepublikovaná data). Tato centra se zřejmě podílejí na zvýšení minimálního fluorescenčního výtěžku po přidání DCMU (F0 DCMU). 21 2.6 Thermoluminescence fotosystému II 2.6.1 Historický úvod Ve tmě po silném ozáření vydávají fotosyntetické organismy slabé záření (asi 1 % fluorescence při pokojové teplotě), které má totožné spektrum s variabilní fluorescencí chlorofylu. Strehler a Arnold (1951) přišli s hypotézou, že po osvětlení je část absorbované energie uložena ve stabilních „pastech“ ve fotosyntetickém aparátu, ze kterých se vyzařuje v podobě luminescence. Protože intenzita luminescence závisela na teplotě, byla metoda nazvána „thermoluminescence (TL)“. Arnold a Sherwood (1957) popsali měření, které se v různých obměnách používá dodnes. Snížením teploty, ozářením a následným rovnoměrným zahříváním dosáhli tepelně stimulované emise záření, tzv. TL křivky vyzařování („TL glow curve“) s charakteristickými TL pásy (viz níže). Do konce osmdesátých let byly popsány hlavní TL pásy a určen jejich původ (shrnutí Vass 2003 nebo Ducruet 2003). V současné době se tato metoda posouvá do středu zájmu díky moderním přístrojům, které svou citlivostí a jednoduchostí umožňují snadná měření v laboratorních i terénních podmínkách (Ducruet 2003, Gilbert 2004, www.psi.cz). 2.6.2 Základní principy Thermoluminescence je obecnou vlastností mnoha látek. Můžeme ji definovat jako emisi záření při určité teplotě ze vzorků, jenž byly předtím vystaveny elektromagnetickému záření. Byla pozorována u minerálů, polovodičů a organických látek. Z biologických makromolekul má tuto schopnost fotosyntetický aparát PSII. Představa o mechanismu TL je založena na modelu rekombinace ze „stabilní pasti“, ve které je zachycen excitovaný elektron (ve fotosyntéze je tento model použit v Z-schématu energetického přenosu elektronů, Obrázek 2). Jeho stabilizace je podmíněna zablokováním dalšího přenosu ve fotosyntéze. K jeho vyzáření ve formě fotonu je zapotřebí i) překonání energetické bariéry pasti a ii) rekombinace s donorovou stranou. Pravděpodobnost překonání energetické bariéry lze zvýšit dodáním energie ve formě tepla. Pokud je vzorek rovnoměrně zahříván, pravděpodobnost rekombinace se exponenciálně zvyšuje. Množství stabilizovaných elektronů je však konečné. Proto při měření TL získáme pás, jehož maximum je úměrné aktivační energii rekombinace. Matematická charakteristika funkce je poměrně složitá. Ducruet (2003) charakterizuje TL pás Arrhenius-Eyringovou rovnicí, Pagonis a spol. (2001) navrhuje možnost použití Weibullovy funkce. Existují i komplikovanější řešení. 22 Obrázek 10. Schematické znázornění původu TL pásů rekombinací nábojů v reakčním centru fotosystému II (převzato z Vass a Inoue 1992). 2.6.3 Původ TL pásů Původ TL pásů v rekombinaci nábojů mezi donorovou a akceptorovou stranou (Obrázek 10) popsali Rutherford a spol. (1984). Zjistili, že intenzita TL pásu je ovlivněna počtem záblesků. Tato vlastnost souhlasí s představou o střídání S-stavů na manganovém komplexu (viz výše). Ten se může vyskytovat v tzv. stavech S0 – S3, přičemž na rekombinaci nábojů se podílejí pouze proponované stavy S2 a S3. Účast plastochinonů QA a QB v TL byla prokázána posunem maxima TL pásu k nižším teplotám po přidání herbicidu DCMU. Ten zablokuje přenos elektronů z plastochinonu QA na QB v PSII (viz výše). Za přítomnosti herbicidu je elektron stabilizován na QA, kde potřebuje nižší aktivační energii na rekombinaci než na QB bez přítomnosti DCMU. Rekombinace jsou označovány podle obou rekombinujících komponent, např. S2QA-. V současné době je charakterizováno pět základních pásů pocházejících z PSII (A, Q, B, AG a C). Kromě nich lze u fotosyntetického materiálu sledovat tři nízkoteplotní TL pásy, které pocházejí z rekombinace mezi chlorofyly ve světlosběrných anténách, a tři vysokoteplotní pásy pocházející z peroxidace lipidových membrán (Misra a spol. 2001, Ducruet 2003, Vass 2003). 2.6.4 Interpretace TL křivky Podobně jako variabilní fluorescence chlorofylu, interpretace TL křivky z fotosystému II může být značně komplikovaná. Na jejím výsledném tvaru se podílejí mechanismy 23 související s fyziologií fotosyntézy. Jejich regulace spočívá v i) množství zachyceného záření, ii) rozdělení náboje, iii) typu rekombinace. Cennou informaci nese typ TL pásu, poloha jeho maxima, intenzita i samotný tvar TL křivky. Thermoluminescence je významným nástrojem studia elektronového transportu (Rutherford a spol. 1982, Vass a Demeter 1982, Vass a Govindjee 1996, Steglich a spol. 2001, Ducruet 2005a, b), pro charakterizaci genových mutací ve fotosyntetickém aparátu (Shen a spol. 1998, Hatano-Iwasaki a spol. 2001) a je i diagnostickým nástrojem pro ekofyziologická měření (Misra a spol. 2001, Vavilin a spol. 2002). 2.6.5 Mikroorganismy v TL Komplikovanost interpretace TL měření vedla k pokusům s mikroorganismy, které již byly dobře fyziologicky charakterizovány a jsou fylogeneticky příbuzné vyšším rostlinám. Jedná se o zelené řasy rodů Chlorella (Arnold 1966, Vavilin a spol. 1998, 2002, El-Sheekh 2004), Scenedesmus (Küpper a spol. 2003, Valverde a spol. 2005), Chlamydomonas (Ohad a spol. 1990, Demeter a spol. 1995, Andronis a spol. 1998, Hatano-Iwasaki a spol. 2001, Ducruet 2005b) a Dunaliella (Zchut a spol. 2003), nebo sinice rodů Synechococcus, Synechocystis (Burnap a spol. 1992, Shen a spol. 1998) a Prochlorococcus (Steglich a spol. 2001), či krásnoočko rodu Euglena (Desai a spol. 1975). 24 3 Cíle práce Hlavním cílem mé práce bylo sledování fotosyntetické aktivity řas v proměnném světelném režimu. Ke sledování regulace aktivity fotosytému II řas vystavených dynamickému světelnému režimu jsem zvolil dvě biofyzikální metody – variabilní fluorescenci a thermoluminescenci. Tyto metody mi umožnily studovat fotochemické reakce na úrovni přenosu energie v PSII, a nepřímo také redoxního stavu plastochinonového poolu. Současně s dynamického světelného režimu jsem jako další faktor ovlivňující fotosyntézu sledoval vliv nízké koncentrace dusíku v kultivačním médiu. Biofyzikální měření fotochemických parametrů jsem doplnil o počty buněk, stanovení pigmentů a měření asimilace uhlíku. Během své magisterské praxe jsem se také podílel na měření fotosyntetické aktivity jednotlivých buněk na fluorescenčním kinetickém mikroskopu. Hlavní součást této práce představuje studium vlivu nedostatku dusíku na mořskou rozsivku Thalassiosira weissflogii (Bacillariophyceae), při kterých jsem sledoval denní změny fotosyntetické aktivity a růstové charakteristiky během přirozeného denního světelného režimu a v závislosti na koncentraci dusíku. Cílem pokusu bylo popsat změny fotosyntézy za přirozených podmínek a sledovat vliv nedostatku živin. Vlastní experiment probíhal v rámci mezinárodní spolupráce MBÚ AVČR a Oceánografické laboratoře CNRS ve Villefranche sur mer ve Francii v květnu 2004. Experimentu se dále účastnili Ondřej Prášil, Kateřina Zrotalová, Antoine Sciandra a Marcel Babin. Po skončení experimentu jsem se věnoval zpracování a interpretaci naměřených výsledků. Předkládaná studie navazuje na předchozí experiment uvedený v Havelková-Doušová (2005), ve kterém byl porovnán vliv intenzity záření na dusíkem limitované kultury T. weissflogii. Další experimenty, na kterých jsem se podílel během magisterské praxe, jsou uvedeny v příloze jako publikace nebo plakátové příspěvky na mezinárodních konferencích. Z publikací sem patří: i) „The photosynthesis of individua algal cells during the cell cycle of Scenedesmus quadricauda (Chlorophyceae) studied by chlorophyll fluorescence kinetic microscopy“ (Šetlíková a spol. 2005) a ii) „The chlorophyll a fluorescence induction pattern in chlororplasts upon repetitive single turnover excitations: Accumulation and function of QB-nonreducing centers.” (Vredenberg a spol. 2006). Plakátová sdělení: i) poster „Thermoluminescence as a tool in algal photosynthesis“ (X. Dni fyziológie rastlín, Bratislava 2004) a ii) poster „New approaches to studies of photosynthesis regulation during cell cycle in algae“ (13th International Congress on Photosynthesis, Montreal, Canada 2004). 25 4 Metody 4.1 Popis experimentů Pro hlavní pokus jsme zvolili mořskou centrickou rozsivku Thalassiosira weissflogii, která je modelovým organizmem pro studium fotosyntézy fytoplanktonu. Kultura pocházela ze sbírky Oceánografické laboratoře CNRS ve Villefranche sur mer, Francie. Rozsivka byla pěstována v kontinuální průtočné kultuře v automatickém kultivačním systému dle Malara a Sciandra (1991) a Bernard a spol. (1996). Podrobnosti o přípravě kultivačních nádob, regulaci teploty, míchání, provzdušnění a ozářenosti jsou uvedeny v Stramski a spol. (2002). Kultivační teplota byla udržována na 19°C ± 0.1°C. Ve čtyřech válcích o objemu 3 L byly pěstovány kultury v přefiltrované (filtr Milipore 0.22 μm) a autoklávované mořské vodě obohaceném o živiny odpovídající médiu f/2 (Guillard a Ryther 1962). Dvě kultury (označené C1 a C2) rostly při limitní koncentraci dusíku (60 mM) a dvě kontrolní kultury (C3 a C4) v kompletním médiu f/2. Koncentrace NO2- v médiu měřená na výstupu z válců C3 a C4 byla 600 μmol.L-1, koncentrace NO3- byla mimo detekční limit. U limitovaných kultur ve válcích C1 a C2 byly koncentrace obou forem dusíku v médiu na výstupu mimo detekční limit přístroje (<1 μmol.L-1). Osm dní před vlastním experimentem a první tři dny měření byly řasy vystaveny světelnému režimu „light-dark“ (LD) 12:12 (12h světla a 12h tmy). Intenzita fotosynteticky aktivního záření (PAR, 400-700 nm) měla během světelné fáze LD režimu sinusoidální průběh s maximální ozářeností 1000 μmol kvant.m-2.s-1. Čtvrtý den experimentu byl světelný režim po dosažení hodnoty 250 μmol kvant.m-2.s-1 změněn na konstantní (LL, „light-light“) a ozářenost byla dále udržována na této hodnotě. Tato intenzita byla zvolena tak, aby organismy dostávaly stejné kvantum záření za fotoperiodu jako v režimu LD (Obrázek 11). -2 -1 PAR (μmol kvant.m s ) 1000 Obrázek 11. Intenzita fotosynteticky aktivního záření během hlavního pokusu. Tento obrázek je základem pro použité grafy ve výsledcích. 800 600 400 200 1 2 3 4 5 6 D ny 26 7 4.2 Určení velikosti buněk, dusíku a absorpčních spekter Počty buněk, jejich průměrná velikost, koncentrace NO2- a NO3- a in vivo absorpční spektra rozsivky Thalassiosira weissflogii byly měřeny automatickým analyzátorem každých 25 minut během celého experimentu. Popis přístrojů, možnosti a omezení jejich využití jsou uvedeny v Bernard a spol. (1996) a Le Floc’h a spol. (2002). Pro stanovení uhlíku a dusíku v řasové biomase byly kultury zkoncentrované na předem vypálené skleněné filtry (Whatman GF/F). Filtry byly vysušené při 60°C a poté analyzovány na CHN analyzátoru LECO 900. Výsledná hodnota je průměrem z triplikátů. 4.3 Stanovení pigmentů Pro určení koncentrace chlorofylu a (Chl a) rozsivky Thalassiosira weissflogii jsem vzorky zkoncentroval na filtr GF/F (Whatman) a následně uložil v tekutém dusíku (77 K) do doby, než jsem je analyzoval metodou HPLC („high-performance liquid chromatography”). Pigmenty jsem extrahoval do 90% acetonu. Účinnost extrakce jsem zvýšil rozbitím buněk ultrazvukem po dobu 10 s. Extrakt jsem poté přečistil přes filtr GF/C (Whatman). HPLC analýzu jsem provedl na přístroji Beckmann Waters 990. Relativní množství chlorofylu jsem stanovil funkcí „Integrator“ v programu k HPLC. Pro výpočet absolutního množství jsem použil spektroskopické stanovení chlorofylu při absorbanci 630 a 664 nm (s korekcí na 720 nm) pomocí rovnice pro výpočet Chl a a c z Jephrey a Humphrey (1975): (5) Chl a = 11.47(A664-A720) - 0.4(A630-A720) (6) Chl c = 24.34(A630-A720) - 3.73(A664-A720) Na základě spektroskopického stanovení množství pigmentů jsem pak vypočetl absolutní množství chlorofylu v HPLC pomocí vztahu [Chl a] = 157 000.A [mgC.m-3] (kde A je integrovaná plocha absorbance (440 nm) chlorofylu v čase při průchodu kolonou). Ke stanovení koncentrace ostatních pigmentů (fucoxanthin, diatoxanthin, diadinoxanthin a β-karoten) pomocí HPLC jsem použil jako rozpouštědlo směs methanolu s interním standardem. 4.4 Měření asimilace uhlíku Asimilaci uhlíku inkorporací radioaktivního uhličitanu jsem měřil dle HavelkovéDoušové (2005). Nejprve jsem přidal radioaktivní uhličitan (Na214CO3) ke vzorkům, tak aby výsledná radioaktivita vzorku byla 1μCu/mL. Vzorky jsem poté vystavil 20 různým 27 intenzitám záření. Po 20 minutách expozice byly jsem vzorky odebral, zbytek radioaktivního uhličitanu odstranil přidáním 1 mL koncentrované HCl a nechal po čtyřicet minut třepat ve tmě, aby se skutečně všechen neasimilovaný uhlík uvolnil ze vzorku. Nakonec jsem ke vzorkům přidal 10 mL scintilačního koktejlu (Aquasol s 10% methanolem), vzorky dobře utěsnil a důkladně protřepal. Radioaktivitu jsem kvantifikoval pomocí scintilačního analyzátoru PACKARD Tricarb série 4000. Radioaktivní signál jsem poté převedl na rychlost fixace uhlíku. Dvacet různých intenzit záření jsem použil k sestrojení každé P vs. E křivky (Obrázek 7). Hodnoty potenciální fotosyntetické rychlosti za saturačního záření Ps, nárůstu rychlosti fotosyntézy za limitující ozářenosti α a fotoinhibiční parametr β jsem zjistil fitováním křivky exponenciálním modelem z Platt a spol. (1980) (rovnice 1). Maximální rychlost za saturačního záření Pmax byla vypočtena rovnicí 2. Saturační intenzita fotochemických reakcí EK jsem vypočetl rovnicí 3. Získané hodnoty byly vztaženy na koncentraci chlorofylu, počet buněk a množství uhlíku v buňce. 4.5 Měření variabilní fluorescence chlorofylu Výtěžky in vivo fluorescence chlorofylu jsme získali pomocí laboratorního fluorimetru FL-100 (P.S.I., Brno, Česká republika). Popis přístroje a způsob měření je uveden v Trtílek a spol. (1997) a v Nedbal a spol. (1999). Tento přístroj umožňuje měřit rychlou kinetiku reoxidace QA- (<100 μs po záblesku). Modré diody („light emission diodes“, LEDs) (délka záblesku 3.5 μs, maximum při vlnové délce 450 nm) byly použity k měření neaktinického minimálního (F0) fluorescenčního výtěžku. Dva metodicky odlišné přístupy jsme použili pro získání maximálního fluorescenčního výtěžku (Obrázek 9 a 12). Fluorescenční výtěžek z excitace jedním zábleskem („Single Turnover yield“, FM ST) byl měřen 100 μs po saturačním záblesku, červené LEDs (35 μs, 635 nm). Maximální fluorescenční výtěžek po „Kautského“ indukci (FM MT) byl získán pomocí sub-saturačního záření (modré LEDs, 450 nm, intenzita 300 μmol kvant·m-2·s-1). Fluorescenční signál byl filtrován přes červený filtr (RG665, Schott). Během experimentu jsme měřili minimální (F0) a maximální (FM) fluorescenční výtěžek po 2 a 30 minutách temnotní adaptace. Maximální fotochemickou účinnost fotosystému II (PSII) jsme vypočítali dle rovnice 7. Rychlost reoxidace akceptoru QA na PSII byla stanovena jako procento zbývající variabilní fluorescence po FM ST z rovnice 8, kde Ft je fluorescenční výtěžek v čase t = 1 ms. (7) FV/FM = (FM – F0) / FM 28 FQA = (Ft – F0) / (FM – F0) (8) Maximální a ustálená fluorescence ve stavu adaptovaném na světlo (FM' a FS) byla měřena při šesti různých intenzitách ozářenosti (7, 30, 70, 120, 200 a 300 μmol kvant·m-2·s-1). Tyto světelné podmínky byly vytvořeny uvnitř kyvety pomocí modrých LEDs. Každé intenzitě ozářenosti byl vzorek vystaven po 2 minuty. Z technických důvodů jsme měřili maximální fluorescenční výtěžek na FM’ světle pouze po excitaci jedním zábleskem. Naměřená data jsou průměrem pěti hodnot po sobě následujících měření. Fotochemická účinnost PSII na světle (tzv. „Gentyho parametr“, ΦPSII (Genty a spol.1989)) byla spočítána rovnicí 9. Rychlost reoxidace QA- ve stavu adaptovaném na světlo byla měřena obdobně jako pro temnotní měření, F’t je fluorescence 1 ms po saturačním záblesku (FM’). (9) ΦPSII = (FM' – FS) / FM' (10) F’QA = (F’t – FS) / (FM’ – FS) Obrázek 12. Záznam jednoho měření fluorescenčních výtěžků in vivo pomocí indukce variabilní fluorescence chlorofylu různým druhy záření. Šedá oblast nad fluorescenční křivkou odráží velikost antény PSII. Svislé čáry ukazují spouštění jednotlivých druhů záření (viz text): M – měřící záblesky, S – saturační záblesky, A – sub-saturační (aktinické) záření. Označení fluorescenčních výtěžků odpovídá významu uvedenému v textu. 4.6 Thermoluminescence 4.6.1 TL aparatura Aparaturu na měření TL tvoří řídící jednotka FL-200, „měřící hlava“ a teplotní regulátor TR2000 (Obrázek 13). Měřící hlava je vybavena citlivým fotonásobičem a modrými a červenými LEDs (Nishia Corp. NLPB-300A a Hewlett-Packard HLMP8104). Teplotu reguluje Peltierův článek umístěný pod pozlaceným kovovým držákem vzorku. Mezi 29 termočlánkem a vzorkem se nachází teplotní čidlo, které předává informaci o teplotě vzorku do teplotního regulátoru. Pro linearitu ohřevu je zapotřebí chladit Peltierův článek cirkulující vodou. Řídící jednotka FL-200 může být využita k ovládání jiných externích modulů, v našem případě řídící jednotky pro infračervené LEDs. Měřící hlava Teplotní regulátor Obrázek 13. Přístroj na měření thermoluminescence se základními částmi – měřící hlavou, řídící jednotkou a teplotním regulátorem. Řídící jednotka FL-200 4.6.2 Řídící software Program FluorWin (P.S.I., Brno) s rozšířeným modulem na měření thermoluminescence je vybaven vzorovým protokolem na měření TL. Jednoduché příkazové povely ovládající TL přístroj umožňují tento protokol snadno upravit a vytvořit vlastní protokol měření. Použitý způsob měření spolu s komentářem jsou uvedeny v podkapitole „ Měřící protokol“. Výsledná intenzita TL odpovídá napětí (V) na fotonásobiči integrovanému po dobu 60 ms. Program současně provádí měření TL a teploty pomocí dvou výstupních kanálů. 4.6.3 Příprava Buněčnou suspenzi o objemu 1 mL jsem nanesl přímo do měřící komůrky, nebo jsem zvolené množství suspenze zakoncentroval na nitrocelulózový filtr o porositě 0.7, 1.5 či 4 μm (Pragopor, Praha) dle velikosti sledovaných buněk. Při použití filtru byla mezi filtr a povrch komůrky pro zlepšení tepelného přenosu přidána kapka (50 μL) kultivačního média. Chemická aditiva v odpovídající koncentraci (inhibitory elektronového přenosu, iontové přenašeče atp.) jsem přidával do suspenze před umístěním vzorku do držáku. 4.6.4 Měřící protokol 30 Pro měření TL křivek lze použít automaticky vytvořený protokol v programu FluorWin. Použitý protokol je znázorněný na Obrázku 14 a v Tabulce 1. K rozdělení náboje v PSII jsem použil saturační záblesky emitované červenými LEDs (délka 50 μs, maximum emise 635 nm). Minimální teplota, na kterou jsem vzorky ochlazoval, byla 0°C. Pokud použijeme teploty nižší než 0°C, je nutné počítat se změnou tvaru TL křivky. Vlivem vysokého skupenského tepla tání vody se rychlost ohřevu může zpomalit v oblasti bodu tání a naopak zrychlit v oblasti 0-10°C. Mrazením vzorku může také dojít k poškození thylakoidních membrán buněk, které se projeví snížením intenzity emise a změnou tvaru TL křivky. Homman (1999) ve své práci doporučuje vzorky raději nemrazit. Některá měření ovšem vyžadují nižší teploty. Z tohoto důvodu jsou ke vzorkům přidávány kryoprotektanty, např. glycerol (Krieger a spol. 1998). 4 60 2 Teplota (°C) 50 40 5 6 1 30 3 20 10 0 0 50 100 150 200 250 300 Čas (s) Obrázek 14. Znázornění průběhu teploty (červená křivka) během měření thermoluminescence. Fáze 1-5 odpovídají popisu v Tabulce 1. Šedá oblast znázorňuje vlastní měření. Fáze 1 – Relaxace ve tmě 2 – Rychlé chlazení Teplota konstantní, kultivační, např. 20°C Popis relaxace nefotochemického zhášení, infračervené záření minimální 2°C, rychle klesající rychlé zchlazení 30 s stabilizace podmínek za nízké teploty 60 s 3 – Stabilizace teploty konstantní, 2°C 4 – Rozdělení nábojů 5 – Měření TL 6 – Návrat saturační záblesky rozdělení nábojů na PSII měření TL (zapnutý fotonásobič) lineární zvyšování teploty konstantní, 2°C plynule rostoucí do 70°C 0.5 – 1°C.s-1 rychle klesající na výchozí teplotu návrat na výchozí teplotu Tabulka 1. Popis a obvyklá délka jednotlivých fází měření thermoluminescence. 31 Délka (čas) 120 s 5 s před ohřevem dle rychlosti ohřevu 20-30 s 5 Výsledky a diskuse 5.1 Počet buněk Buněčné kultury rozsivky Thalassiosira weissflogii byly předpěstovány na dynamickém LD režimu po dobu 3 týdnů před vlastním experimentem, takže buňky byly plně přizpůsobeny dynamickému světelnému režimu a kontinuální průtokové kultury (C1 – C4) byly v ustáleném stavu. Ředící rychlost byla nastavena na ~ 1 objem nádoby za den u kontrolních a ~ 0.5 objemu nádoby za den u limitovaných kultur. Protože průměrná rychlost dělení buněk v kontinuální kultuře odpovídá ředící rychlosti, byla rychlost dělení (μ) 0.7 d-1, resp. 0.4 d-1. Koncentrace buněk v kulturách limitovaných dusíkem (C1 a C2) se pohybovala okolo 1.3x108 buněk.L-1 během celého pokusu (Graf 1a, 17.5. 18 h až 24.5. 0h). U kontrolních kultur byla průměrná koncentrace buněk nižší, v C3 ~ 8.5x107 buněk.L-1 a v C4 ~ 8x107 buněk.L-1. Výrazný pokles jejich koncentrace po prvním dnu byl způsoben nadměrným odběrem vzorku pro jednotlivé analýzy. V dalších dnech bylo proto množství odebírané biomasy sníženo. Synchronicitu buněk lze v kontinuální kultuře odhadnout podle změny buněčné koncentrace v kultivační nádobě. Kvůli zvýšenému odběru biomasy během experimentu dochází k výrazné manipulaci s celým objemem, a proto se zdají být rytmy celé populace výrazně narušeny. V tomto experimentu jsme měli sledovali buněčnou koncentraci také v období před samotným experimentem. V tyto dny (14.5. - 17.5.) docházelo k pravidelným změnám buněčné koncentrace kontrolních kultur s minimem uprostřed fotoperiody a maximem uprostřed noci. Naproti tomu u limitovaných kultur ke změně koncentrace téměř nedocházelo. Mohu tedy říci, že růst kontrolních kultur byl více synchronizovaný se světlem než limitovaných. 5.2 Velikost buněk Velikost buněk je u rozsivek dána jejich pevnou křemičitanovou schránkou, která se během růstu nemůže měnit tak pružně jako buněčná stěna např. zelených řas. Dunaliella tertiolecta mění průměr svých buněk více než o 50 % během LD režimu (Prášil, nepublikovaná data). Rozsivky jsou navíc schopné hromadit zásobní látky v centrální vakuole, což jim umožňuje překonat nepříznivé světelné období (pohyb mimo eufotickou zónu, temnou část dne) bez výrazné změny objemu. Přesto jsme pozorovali, že se průměrná velikost buněk v kultuře mění pravidelně během LD cyklu (Graf 1b). Nejmenší rozměry buněk byly naměřeny na konci temné periody LD cyklu, největší na konci fotoperiody. Tyto změny ve velikosti buněk (cca 15 %) během 32 fotoperiody jsou dány růstem buněk. Noční pokles patrně souvisí s buněčným dělením a respiračními procesy. Bohužel tyto rytmy samy o sobě neprokazují synchronicitu populace či řízení endogenními rytmy. Změny velikosti buněk byly ale patrné i během prvních dvou subjektivních dnů při LL režimu. To ukazuje, že fotosyntetické růstové procesy jsou do určité míry endogenními rytmy řízeny (viz kapitola 5.13). Po přenesení na konstantní světlo se počet buněk u všech kultur zvyšoval (počínaje první subjektivní nocí), zatímco jejich průměr se zmenšoval. Během obou subjektivních nocí jsou patrné přestávky v tomto trendu. Relativní rozdíl mezi kontrolními a limitovanými kulturami ve velikosti buněk se zachoval i po přenesení na kontinuální světlo. To ukazuje, že velikost buněk souvisí s limitací dusíkem. Nezbytnou součástí komplexního fyziologického pokusu je stanovení počtu a velikosti buněk. Díky znalosti počtu buněk jsme pak mohli stanovit buněčné koncentrace vybraných látek (pigmentů, dusíku, uhlíku) a zjistit průměrnou rychlost fotosyntézy v buňce. 1000 2e+8 800 600 1e+8 400 5e+7 200 0 11.5 11.0 10.5 10.0 9.5 9.0 8.5 8.0 13.5. 0 1000 800 600 PAR (µmol quanta.m-2.s-1) průměr buněk (μm) Buněk.L -1 2e+8 400 200 0 15.5. 17.5. 19.5. 21.5. 23.5. Datum Graf 1. Denní změny počtu a velikosti buněk v kultuře rozsivky Thalassiosira weissflogii podmíněné dynamickým a konstantním světelným režimem a nedostatkem dusíku. (a) počet buněk, (b) střední průměr buněk. Tmavé křivky znázorňují kontrolní kultury, světlé křivky dusíkem limitované kultury. Experiment začal 17.5. v 18h a skončil 24.5. v 0h. Přerušované linky znázorňují intenzitu ozářenosti. Maximum odpovídá 1000 μmolů kvant.m-2s-1. 33 5.3 Množství dusíku a uhlíku v buňce Množství a vzájemný poměr uhlíku a dusíku v buňkách řas nejsou náhodné. Jejich stechiometrie je dána provázaností metabolismu dusíku a uhlíku, složením biomasy (poměr bílkovin k zásobním uhlíkatým látkám) a dostupností živin. V průměru se poměr obou prvků řídí tzv. Redfieldovým poměrem, který udává, že C:N je zhruba 106:16 (mol/mol). Odchylky od tohoto poměru mohou naznačit příčinu limitace metabolismu buňky (Clark 2001). Denní dynamika množství uhlíku a dusíku v buňce může dát informaci o časovém průběhu asimilačních procesů (fixace uhlíku, asimilace dusíku). Průměrné množství uhlíku v buňce (Graf 2a) se dynamicky měnilo během LD režimu u všech sledovaných kultur. K akumulaci C dochází během fotoperiody - období fotosyntézy, která byla při LD režimu 12 h, zatímco při LL režimu 24h. V noci naopak dochází k úbytku množství C na buňku díky respiraci. Množství uhlíku v buňce ale ovlivňuje také dělení buněk. Množství uhlíku na konci fotoperiody bylo 160 pg C.buňku-1 v kontrolních kulturách, v kulturách limitovaných dusíkem pouze 125 pg C.buňku-1. Přesto bylo na začátku fotoperiody u všech kultur naměřeno shodné množství 80 pg C.buňku-1. Hustota uhlíku v buněčném objemu se pohybovala u kontrolních i limitovaných buněk v podobném rozmezí 160-230 fg C.μm-3. Hlavní variace během LD režimu probíhaly na začátku fotoperiody, kdy byl zaznamenán pravidelný pokles o 25 % u kontrolních kultur. Tomuto kontrastovalo zvýšení hustoty o 15 % u limitovaných buněk v prvních hodinách fotoperiody. Při buněčném dělení nedochází ke změně hustoty C, která naopak klesá respirací (získáváním energie ze zásob). Domnívám se proto, že výrazný pokles na začátku fotoperiody souvisí s vyšší metabolickou aktivitou kontrolních buněk (respirací, transkripcí genů, proteosyntézou…). U limitovaných buněk je tato aktivita tlumena nedostatkem dusíku. Po přenesení kultur na LL režim se obsah uhlíku v buňkách po prvních 12 h zvyšoval stejně jako u LD režimu, přestože po tuto dobu byly buňky vystaveny pouze polovině z celkové dávky záření oproti LD režimu. Buněčný obsah uhlíku se pak 24 hodin udržoval na maximální hodnotě a nakonec od následujících hodin až do konce experimentu docházelo k mírnému poklesu obsahu uhlíku v buňkách. Třetí den po změně světelného režimu tyto hodnoty dosahovaly 75 % rozdílu maxima a minima LD režimu, tj. 140 pg C.buňku-1 u kontrolních a 113 pg C.buňku-1 u limitovaných buněk. Hustota uhlíku v buněčném objemu se rovněž první subjektivní den LL režimu měnila podobně jako během LD režimu. Již na konci tohoto dne se však stabilizovala u všech kultur na hodnotě 210 fg C.μm-3. 34 240 b 220 140 200 120 180 100 160 80 140 1 2 3 4 5 6 1 Den 2 3 4 5 -3 a hustota C v buňce (fg.μm ) C v buňce (pg/buňku) 160 6 Den Graf 2. Množství uhlíku v buňkách T. weissflogii. (a) celkové množství v buňce, (b) hustota uhlíku v buněčném objemu. Data pocházejí z kultur limitovaných dusíkem (černé symboly) - C1 (kolečka) a C2 (trojúhelníky), a 2 kultur kontrolních (bílé symboly) - C3 (čtverce) a C4 (kosočtverce). Šedě je vyznačena intenzita ozářenosti. Šedé tečky naznačují průběh subjektivní změny ozářenosti. Množství dusíku v buňce bylo u limitovaných kultur (Graf 2b) konstantní po celou dobu experimentu, shodné pro obě kultury C1 a C2 (8 pg.buňku-1). Domnívám se proto, že tato hodnota představuje minimální, limitní buněčnou koncentraci N pro rozsivku Thalassiosira weissflogii, která určuje (limituje) i velikost buněk. U kontrolních buněk bylo množství dusíku na buňku přibližně dvakrát vyšší a měnilo se rytmicky během LD cyklu. Minimální koncentrace během LD režimu byla 14 pg.buňku-1, této hodnoty dosahovaly buňky v temné fázi. Maximální koncentrace (20 pg.buňku-1) byla dosažena vždy uprostřed fotoperiody. Rozdíl 20 % mezi maximální a minimální buněčnou koncentrací pravděpodobně souvisí s buněčným dělením nebo s exkrecí dusíkatých látek (proteinů, např. fosfatáz). Hustota dusíku v buněčném objemu se velmi výrazně měnila (50-60%) u kontrolních i limitovaných buněk během LD režimu. Tyto variace měly obdobný charakter u všech kultur, přestože v kontrolních buňkách byla hustota dusíku průkazně vyšší než v limitovaných. Ve třetí hodině fotoperiody byla zaznamenána maximální hustota dusíku – 34 fg N.μm-3 u kontrolních a 21 fg N.μm-3 u limitovaných kultur, zatímco minimální byla zjištěna pravidelně na jejím konci – 21 fg N.μm-3, resp. 14.5 fg N.μm-3. Díky dynamickému světelnému režimu dochází u limitovaných buněk k zajímavému paradoxu, kdy se mění hustota dusíku v buňce, přestože množství je stále stejné. Je pravděpodobné, že buněčná hustota dusíku má podobný význam v regulaci metabolismu jako poměr C:N (viz dále). Po přechodu na LL režim se koncentrace dusíku v kontrolních kulturách nejprve zvýšila, pak kontinuálně klesala na hodnotu 12 pg.buňku-1, tedy nižší než kdykoli během LD režimu. Hustota dusíku v buňce se nejprve měnila v souladu s předchozími cykly v LD 35 režimu a již druhý den se ustálila na 19 fg N.μm-3 pro kontrolní a 14.5 fg N.μm-3 pro N v buňce (pg/buňku) 35 20 18 30 16 25 14 12 20 10 8 15 6 1 2 3 4 5 1 6 2 3 4 5 -3 22 hustota N v buňce (fg.μm ) limitované buňky. 6 Den Den Graf 3. Množství dusíku v buňkách T. weissflogii. (a) celkové množství v buňce, (b) hustota dusíku v buněčném objemu. Černé symboly značí data z limitovaných kultur, bílé z kontrolních. Symboly stejné jako v Grafu 2. Poměr mezi uhlíkem a dusíkem v buňce (C:N) je považován za vodítko k určení limitující složky u mořských druhů rozsivek (Clark 2001). V kontinuální kultuře za dynamického světelného režimu je situace komplexnější (Graf 4). Naše kultury s dostatečnou koncentrací dusíku byly, dle schématu v Clark (2001), limitované na začátku fotoperiody uhlíkem a na jejím konci dusíkem. Vzhledem k tomu, že nebyla pozorována zvýšená koncentrace dusíku během temné periody, nemá tento efekt pravděpodobně vliv na fyziologické pochody směřující k aktivaci koncentračních mechanismů. Limitace uhlíkem může podporovat zvýšenou fotosyntetickou aktivitu na začátku fotoperiody. Poměr C:N se v našich kulturách pohyboval mezi 6 – 10 mol C.mol N-1. To jsou hodnoty vyšší než ideální poměr daný Redfieldovým poměrem. Pro obrněnky a rozsivky je uváděn vyšší poměr C:N, 8-10 (mol.mol-1) (Falkowski a Raven 1997). Tento poměr odpovídá zjištěné bilanci prvků u kontrolních kultur. 36 18 C/N (mol/mol) 16 14 12 10 8 6 1 2 3 4 5 6 Den Graf 4. Poměr uhlíku a dusíku v buňkách T. weissflogii. Přerušovaná linka – ideální Redfieldův poměr (106 C: 16 N), čerchovaná linka – ideální poměr pro rozsivku T. weissflogii z Clark (2001). Černé symboly značí data z limitovaných kultur, bílé z kontrolních. Symboly stejné jako v Grafu 2. 5.4 Množství pigmentů v buňce Rozsivky obsahují několik pigmentů, které mají světlosběrnou i ochrannou funkci. Hlavním světlosběrným pigmentem v tzv. fukoxanthin-chlorofylových proteinech (FCP) je Chl a, dále fukoxanthin, zastoupen je i Chl c. Ochrannou, fotoprotektivní funkci mají karotenoidy modifikovaného xanthofylového cyklu: diatoxanthin (DT) a diadinoxanthin (DD). Koncentrace Chl a v buňce (Graf 5) byla přibližně o 50 % nižší v limitovaných buňkách (1.5 pg.buňku-1) než v kontrolních (3.2 pg.buňku-1). Denní variace chlorofylu byly výraznější pouze u kontrolních buněk s dostatkem dusíku, amplituda denních změn dosahovala až 30% denního maxima. Po změně světelného režimu na LL se akumulace Chl a první den poněkud zvýšila, ale v dalších hodinách na kontinuálním světle koncentrace chlorofylu v buňce klesala na výsledných 2.4 pg.buňku-1 v kontrolních kulturách C3 a C4 a 1.2 pg.buňku-1 v limitovaných kulturách C1 a C2. Ačkoliv průměrná ozářenost za 24 hodin zůstala stejná, buňky se na kontinuálním světelném režimu aklimatizovaly na vyšší intenzitu záření. Obdobný průběh měly i změny v koncentraci světlosběrného karotenoidu, fukoxanthinu (Graf 5) i Chl c (data neuvedeny). Během celého experimentu jsme pozorovali výrazné oscilace v množství DD v buňce. Po dobu LD režimu byla maximální koncentrace DD dosažena vždy 3h po polovině fotoperiody. Během celé noci koncentrace DD klesala a minimální množství jsme naměřili v první polovině fotoperiody. Množství DT bylo během noci na hranici detekčního limitu, během dne však vzrostlo na hodnoty převyšující koncentraci DD. Tento nárůst byl úměrný 37 intenzitě záření, u limitovaných kultur však dosahoval výrazně nižších hodnot. Po změně světelného režimu na konstantní byla syntéza pigmentů první den zvýšena, poté však následoval pokles. Došlo ke změně kulminace diadinoxanthinu (přibližně o 12h) a úměrně tomu také k posunutí maxima jeho deepoxidované formy, diatoxanthinu (rovněž o 12h). b 1000 800 2 600 400 1 200 0 d c fukoxanthin (fg/buňku) 1200 3 0 700 diadinoxanthin (fg/buňku) a 600 600 500 500 400 400 300 300 200 200 100 100 diatoxanthin (fg/buňku) chlorofyl a (pg/buňku) 4 0 0 1 2 3 4 5 6 1 Den 2 3 4 5 6 Den Graf 5. Denní změny koncentrace pigmentů v buňce T. weissflogii. (a) Chlorofyl a, (b) fukoxanthin, (c) diadinoxanthin a (d) diatoxanthin. Černé symboly značí data z limitovaných kultur, bílé z kontrolních. Symboly stejné jako v Grafu 2. Šedě je vyznačena intenzita ozářenosti. Maximum odpovídá 1000 μmolů kvant.m-2s-1. Koncentrace všech fotosyntetických (PS – chlorofyl a, c1 a c2, fukoxanthin) a fotoprotektivních (PP – diadinoxanthin, diatoxanthin, β-karoten) pigmentů v buňce se pravidelně měnila během denního cyklu (Graf 6). Na počátku fotoperiody byl poměr PS:PP 6 molekul PS k jedné PP, na jejím konci se však tento poměr výrazně snížil na 3 u kontrolních, resp. na 4 u limitovaných buněk. Zatímco maximální ranní hodnoty PS:PP byly u obou kultur identické, minimální odpolední poměr PS:PP byl u limitovaných buněk výrazně vyšší. Deepoxidační stav xanthofylového cyklu (DEPS), který udává jaká část z pigmentů modifikovaného xanthofylového cyklu je deepoxidována, tedy aktivována pro fotoprotektivní funkci, se měnil během LD režimu v závislosti na intenzitě záření. Jeho hodnoty dosahovaly 38 k 70 % a byly téměř vždy o něco nižší u kontrolních buněk (Graf 6). S úplnou jistotou tudíž nelze říci, že rozdíl PS:PP během druhé části fotoperiody způsobuje odlišnou míru NPQ či ochrany před nadbytečným zářením. Tyto oscilace jsou způsobeny především změnami v koncentracích DD a DT, které se mění přibližně dvojnásobně. Po přepnutí světelného režimu na LL se změnila fáze cyklů PS:PP. Tento posun se projevil již po 12 h LL režimu a souvisel přímo se změnami koncentrace DD. Podobnou charakteristiku má i vývoj DEPS. Výrazný pík během subjektivní noci první i druhý den LL režimu naznačuje, že nastavená růstová ozářenost v těchto chvílích výrazně převyšovala schopnosti fotosyntézy. V této „noci“ dochází pravděpodobně ke zpomalení odtoku redukovaných koenzymů. To je pravděpodobně způsobeno asynchronicitou světlemindukovaných fotochemických syntéz a endogenních hodin řídící syntézu enzymu RUBISCO. Lze se domnívat, že u rozsivek mají endogenní rytmy velký vliv na regulaci fotosyntézy. PS:PP (mol/mol) 6.0 b a 0.8 5.5 0.6 5.0 4.5 0.4 4.0 0.2 3.5 DEPS (mol/mol) 6.5 3.0 1 2 3 4 5 6 1 Den 2 3 4 5 6 Den Graf 6. Denní změny v poměru fotosyntetických (PS) a fotoprotektivních (PP) pigmentů v buňce (a) a deepoxidačního stavu pigmentů xanthofylového cyklu (b). Data z limitované kultury C2 (černé) a kontrolní C4 (bílé symboly). Šedé linie představují denní změny ozářenosti na pravé ose. Tečkovaně jsou vyznačeny subjektivní světelné cykly při LL režimu. 5.5 Variabilní fluorescence v temnotně adaptovaném stavu Měření variabilní fluorescence chlorofylu poskytují celou řadu parametrů, které vypovídají o fotochemické a fotosyntetické aktivitě vzorků a o aktivitě fotoprotektivních a disipačních procesů (viz část 2.4). Jelikož se tyto aktivity u živých buněk řas mohou výrazně dynamicky měnit v čase a v závislosti na vnějších podmínkách (např. intenzitě světla), je třeba standardizovat podmínky odběru a uchovávání vzorků před vlastním měřením. Základními fluorescenčními parametry jsou minimální (F0) a maximální fluorescenční výtěžek (FM). Tyto dva parametry mohou být ovlivněny tzv. fotochemickým a nefotochemickým zhášením (NPQ). Zatímco fotochemická složka zhášení relaxuje ve tmě během několika milisekund, NPQ zůstává až několik desítek minut. Měření variabilní 39 fluorescence jsme proto prováděli vždy 2 a 30 minut po odběru vzorku. V období mezi těmito měřeními byly vzorky ponechány na slabém, neaktinickém světle (< 10 μmol kvant.m-2s-1), které je vhodné pro optimální relaxaci NPQ. Pro měření maximálního výtěžku FM jsme použili dva způsoby saturace PSII. Metodou „Single Turnover“ (ST) jsme sledovali elektronový přenos v PSII, neboť jsme zredukovali pouze primární chinonový akceptor QA, zatímco metodou „Multiple Turnover“ (MT) jsme zredukovali celou akceptorovou stranu PSII, včetně PQ poolu (viz kapitola Metody). Rychlost reoxidace primárního akceptoru v PSII QA jsme pro zjednodušení vyjádřili jako relativní variabilní fluorescenční výtěžek v čase 1 ms od ST saturačního záblesku (FQA). 5.5.1 Fluorescenční výtěžky Změny fluorescenčních výtěžků F0 a FM normalizované na množství chlorofylu v objemu dávají informaci mj. i o efektivní velikosti světlosběrných antén PSII, která se v průběhu denních cyklů může měnit např. díky aktivitě zhášecích procesů (NPQ) nebo díky tzv. „state-transitions“. Jak F0/Chl a, tak i FM ST/Chl a vykazovaly pravidelné změny během celého experimentu (Graf 7). Kontrolní buňky vykazovaly vždy nižší fluorescenční výtěžek na chlorofyl než buňky limitované dusíkem. NPQ. U vzorků měřených 2‘ po odběru se během fotoperiody pravidelně snížily výtěžky na 50 % nočních hodnot, a to jak pro normalizovaný výtěžek F0 (F0 (2‘) - Graf 7a), tak i pro maximální fluorescenční výtěžek měřený metodou ST (FM ST (2‘) - Graf 7b). Tento trend nebyl patrný u výtěžků F0 a FM ST měřených 30‘ po odběru (Grafy 7c,d), a poklesy lze proto vysvětlit pomocí nefotochemického zhášení, které se indukuje během fotoperiody. Aktivita PSII. Nárůst fluorescenčních výtěžků během fotoperiody byl charakteristický také pro F0 (30‘) a FM ST (30‘). Částečně byly tyto nárůsty patrny u výtěžků F0 (2‘) a FM ST (2‘) na začátku fotoperiody, kdy NPQ ještě nebylo aktivováno. Tyto denní nárůsty fluorescence mohly být způsobeny i) tvorbou nových PSII, ii) změnou velikosti antény PSII a/nebo iii) změnou jejich aktivního stavu. Po přechodu na LL režim nedošlo v první subjektivní den k tak výraznému poklesu F0 (2‘) a FM ST (2‘) jako během LD periody. To vysvětluji tím, že díky nižší ozářenosti nedošlo k aktivaci NPQ. Naopak, výrazný pokles byl pozorován u kontrolních i limitovaných buněk v první subjektivní noc a vydržel celých 24h. Teprve v druhé polovině druhého dne LL režimu se hodnoty fluorescenčních výtěžků vrátily na původní úroveň. U fluorescenčních výtěžků F0 (30‘) a FM ST (30‘) tento trend nebyl patrný. Snížení fluorescenčních výtěžků je (obdobně 40 jako během fotoperiody LD režimu) způsobeno aktivací zhášecích mechanismů (NPQ, „state-transitions“). Tento vývoj dobře koreluje s koncentrací DT. b 2 1 1 0 0 d c FM ST/Chla (a.u.) F0/Chla (a.u.) 2 3 F0/Chla (a.u.) 3 3 2 2 1 1 FM ST/Chla (a.u.) a 3 0 0 1 2 3 4 5 6 1 2 3 4 5 6 Den Den Graf 7. Denní změny fluorescenčních výtěžků normalizovaných na chlorofyl a. Minimální F0 (a, c) a maximální fluoresenční výtěžky po excitaci jedním saturujícím zábleskem FM ST (b, d) u buněk v čase 2‘ (a,b) a 30‘ (c, d) od odběru. Černé symboly značí data z limitovaných kultur, bílé z kontrolních. Symboly stejné jako v Grafu 2. 5.5.2 FM MT/FM ST Rozdíl mezi maximálním fluorescenčním výtěžkem FM MT a FM ST nebyl dosud spolehlivě objasněn (Samson a spol. 1996, Vredenberg a spol. 2006), ale patrně souvisí se stupněm redukce akceptorové strany PSII. Během našeho experimentu se poměr FM MT/FM ST dynamicky měnil během LD režimu (Graf 8). Zatímco během temné periody byl ~ 1.5, za světelné periody klesal až na ~ 0.7 (2’ relaxace, qN > 0) a na ~ 0.9 (30’ relaxace, qN ~ 0), tedy FM získané po MT záblesku bylo paradoxně nižší než při ST záblesku. Porovnání změn FM ST a FM MT nám umožňuje poznat původ nefotochemického zhášení a stav elektronového transportního řetězce. Pokud se poměr FM ST a F0 nemění, ale jsou pozorovány změny FM MT, znamená to, že účinnost fotochemických procesů PSII je konstantní a FM MT se mění v důsledku změn v průchodnosti elektronového řetězce na 41 akceptorové straně PSII. Tyto změny mohou být způsobeny aktivací fotosyntetického řetězce (MT záblesk pak není schopen plně redukovat celý PQ pool) nebo naopak zpomalením 1.4 1.4 1.3 1.3 1.2 1.2 1.1 1.1 1.0 1.0 0.9 0.9 a 0.8 b FM MT/ST (30') FM MT/ST (2') přenosu elektronů dále z QA (opět nedojde k redukci PQ poolu). 0.8 0.7 0.7 1 2 3 4 5 6 1 2 3 4 5 6 Den Den Graf 8. Denní změny v poměru maximálních fluorescenčních výtěžků zjištěné excitací jedním krátkým zábleskem (< 50 μs) a indukcí dlouhým zářením (300 μmolů kvant.m-2s-1, délka 1 s). (a) hodnoty zjištěné při měření 2 minuty po odběru a (b) 30 minut po odběru vzorku. Černé symboly značí data z limitovaných kultur, bílé z kontrolních. Symboly stejné jako v Grafu 2. Šedé plochy znázorňují intenzitu záření, maximum odpovídá 1000 μmolů kvant.m-2s-1. Po přechodu na LL režim došlo první subjektivní den ke snížení FM MT/FM ST obdobně jako během LD režimu. Vlivem kontinuální ozářenosti však tento poměr FM MT/FM ST (2‘) nenabývá stejných hodnot v první subjektivní noc jako byly pozorovány při LD režimu. Během LL režimu pak byl poměr FM MT/FM ST (2‘) i (30‘) u limitovaných buněk nižší než u kontrolních buněk. Navíc u kontrolních buněk postačuje 30‘ relaxace na výrazné vylepšení redukovatelnosti PQ poolu, zatímco u limitovaných buněk zůstává tento stav obdobný. Mohu tedy říci, že limitace dusíkem výrazný snižuje redukovatelnost PQ poolu. Výjimkou je pravidelný pokles poměru FM MT/FM ST (2‘) uprostřed obou subjektivních nocí LL režimu u obou typů kultur. Tento pokles souvisí s přetrvávajícími rytmy u rozsivek. Jedná se pravděpodobně o endogenní rytmy spojené s chlororespirací, neboť jsou přítomny i po relaxaci 30‘. Tyto rytmy se odrážejí také v maximální fotochemické účinnosti PSII (viz dále). 5.5.3 Maximální fotochemická účinnost v LD režimu Pravidelné denní změny maximální fotochemické účinnosti PSII FV/FM měřené ve tmě byly pozorovány u všech měření (Graf 9). V přirozených světelných podmínkách (LD režim) byly naměřené hodnoty FV/FM pro kontrolní i limitované buňky stejné. Limitace dusíkem se projevila teprve po změně světelného režimu na konstantní (LL režim). Maximální 42 fotochemická účinnost limitovaných buněk pak byla průkazně nižší v porovnání s kontrolními kulturami. Výrazný vliv na jejich povahu měla doba relaxace, a to za LD i LL režimu. Dlouhodobá relaxace (30‘) za LD režimu – Doba relaxace (30‘) je dostatečná pro obnovení maximálních výtěžků fotochemie PSII (Graf 9c,d). Nejvyšší hodnoty FV/FM ST i FV/FM MT byly pozorovány během prvních hodin světelné periody (0.65 a 0.7, resp.). Naopak nejnižší hodnoty pro FV/FM ST byly naměřeny na konci světelné periody, zatímco pro FV/FM MT bylo charakteristické minimum v polovině fotoperiody (0.51 a 0.56, resp.). Tyto hodnoty se pohybují v rozsahu hodnot uvedených pro stabilizovaný růst mikroorganismů (Parkhill a spol. 2001, Steglich a spol. 2001). 0.6 0.5 0.5 0.4 0.4 0.3 0.3 c d 0.7 0.6 0.6 0.5 0.5 0.4 0.4 0.3 0.3 1 2 3 4 5 6 1 Den FV/FM MT 2' (PSI) 0.7 0.6 0.7 FV/FM ST 20' dark (PSI) b a 2 3 4 5 FV/FM MT 20' dark (PSI) FV/FM ST 2' (PSI) 0.7 6 Den Graf 9. Maximální fotochemická účinnost PSII FV/FM měřená během celého experimentu. Vzorky byly měřeny po 2 minutách (a, b) a po 30 minutách od odběru (c, d). Fluorescenční výtěžky byly získány zavřením RC PSII jedním zábleskem, FV/FM ST (a, c) nebo sub-saturačním zářením 300 μmolů kvant.m-2s-1, FV/FM MT (b, d). Buňky limitované dusíkem (černé symboly), kontrolní (bílé symboly). Šedé plochy znázorňují intenzitu záření, maximum odpovídá 1000 μmolů kvant.m-2s-1. Krátkodobá relaxace (2‘) za LD režimu – Hodnoty FV/FM získané ihned po odebrání vzorku se pravidelně měnily během celého dne (Graf 9a,b). Na začátku fotoperiody bylo možné pozorovat výrazný nárůst FV/FM, obdobně jako u vzorků relaxujících 30‘. Během fotoperiody výrazně klesla FV/FM ST (2’) na hodnoty okolo 0.43. Polední pokles byl mnohem 43 výraznější pro FV/FM MT, kde tento parametr dosahoval hodnot ~ 0.3. Tento pokles zcela chybí u hodnot FV/FM 30‘. Lze tedy říci, že je způsoben světelnou aktivací NPQ (korelace s koncentrací DT a DEPS xanthofylového cyklu). Výraznější pokles FV/FM MT 2‘ než FV/FM ST 2‘ je částečně diskutován v předchozí kapitole. Zde se přikláním k vysvětlení, že příčinou nízkého FM MT bylo nedostatečné zredukování celého PQ poolu během fotoperiody - rychlost reoxidace PQH2 byla vyšší než redukce PQ. 5.5.4 Maximální fotochemická účinnost v LL režimu Zatímco v předchozí fázi experimentu byly hodnoty FV/FM pro všechny sledované kultury shodné, teprve na kontinuálním světle jsem mohl od sebe limitované a kontrolní kultury odlišit. U limitovaných kultur zůstávaly hodnoty FV/FM (2´) nízké až do konce experimentu. Hodnoty měřené po dlouhodobé relaxaci dokonce klesaly, a proto usuzuji, že limitované buňky byly na kontinuálním světle vystaveny silnému stresu (fotoinhibice). Naopak, u kontrolních buněk jsem na LL světelném režimu pozoroval po počátečním poklesu trvalý nárůst směrem k maximálním hodnotám, které byly předtím dosahovány během temné periody LD režimu. Po změně světelného režimu na LL jsem pozoroval poklesy FV/FM (2‘) během prvního subjektivního dne (podobně jako v LD režimu), a to jak pro měření se záblesky ST, tak i MT. Tyto poklesy však nebyly tak výrazné jako v LD režimu, což pravděpodobně souvisí s nižší intenzitou růstové ozářenosti během LL. K výraznějšímu snížení fotochemické účinnosti PSII došlo až na začátku první subjektivní noci. Zatímco u kontrolních kultur došlo k návratu na noční hodnoty LD cyklu již na konci třetího dne, u limitovaných kultur zůstala FV/FM 2‘ snížená do konce experimentu. Účinnost PSII je regulována podle možností uplatnění produktů fotochemických reakcí (PQH2, ATP a NADPH). V tomto případě došlo pravděpodobně ke kolizi toku světlem řízeného přenosu elektronů s endogenně řízenými rytmy. Důsledkem bylo snížení účinnosti PSII podobnými mechanismy jako na velmi vysokém světle. Zajímavé je, že jak u kontrolní, tak i u limitované kultury docházelo vedle dlouhodobých trendů (nárůst či pokles) také k periodickým změnám FV/FM 2‘. Tyto periodické změny podporují hypotézu o významném vlivu endogenních rytmů na fotosyntézu rozsivek. 5.5.5 Reoxidace QA Reoxidace QA- měřená ve tmě ukazuje, jak se mění rychlost přenosu elektronů na akceptorové straně PSII. Výsledná kinetika je tvořena příspěvky tří složek s exponenciálním průběhem: přenos elektronu na QB, na QB- a rekombinace s donorovou stranou (kapitola 5.2). 44 Pro zjednodušení jsem ji vyjádřil jen jako zbývají část z variabilní fluorescence FQA v čase 1 ms od saturačního záblesku (viz rovnice 7 a Obrázek 12). Kinetika reoxidace primárního akceptoru na PSII QA- po saturačním záblesku se periodicky měnila během celého experimentu (Graf 10). Reoxidace QA- probíhala nejrychleji (nejnižší FQA) vždy ráno a večer. Naopak nejpomaleji (nejvyšší FQA) probíhala v poledne, kdy byla ozářenost nejvyšší. Za vysoké ozářenosti dochází k fotoinhibici PSII. Ta má velký vliv na výslednou kinetiku reoxidace QA. Pravděpodobná je i účast PQ poolu, kdy nedostatek PQ se může stát limitující částí elektronového transportu. K dalšímu zpomalení reoxidace QAdocházelo uprostřed temné periody. Zpomalení reoxidace QA- v temné periodě patrně souvisí se snížením fotochemické aktivity FV/FM ST i MT (Graf 6). Tento pokles je již dlouho pozorován při terénních měřeních (Behrenfeld a Kolber 1999). Během noci pravděpodobně dochází ke zredukování PQ poolu nefotochemickými procesy. U kontrolních buněk (a částečně i u limitovaných) zůstaly patrné denní rytmy rychlosti reoxidace QA- i během LL režimu. Tyto oscilace nejsou patrné první den LL režimu, kdy je po celých 24 h reoxidace QA- zpomalená. Výsledkem je zrychlení během subjektivní fotoperiody a zpomalení během subjektivní noci. Tyto rytmy lze považovat za rytmy řízené endogenně. rychlost reoxidace QA po ST [%F] 0 .6 a 0 .5 0 .4 0 .3 0 .2 1 2 3 4 5 6 7 Den Graf 10. Denní změny reoxidace QA. Hodnoty představují zbývající % variabilní fluorescence v čase 1 ms po saturačním záblesku. Černé symboly reprezentují data z limitovaných, bílé symboly z kontrolních kultur. Šedé plochy znázorňují intenzitu záření, maximum odpovídá 1000 μmolů kvant.m-2s-1. Zvláštním případem bylo dramatické zpomalení reoxidace QA-, které bylo pozorováno třetí den LD režimu. Od té chvíle se zpomalila reoxidační kinetika i další parametry fluorescence měřené v přítomnosti aktinického světla (LAS – viz další kapitola) při nízkých intenzitách ozáření. Denní rytmy však byly zachovány i přes toto výrazné zpomalení rychlosti 45 reoxidace. Tato událost neměla vliv na měření výtěžků F0 a FM ve tmě. K podobnému jevu docházelo občas také při pokusech s jinými druhy řas. Příčinu této události nelze ze získaných výsledků vysvětlit. 5.6 Variabilní fluorescence na světle Zatímco předchozí výsledky, měřené ve tmě, využívaly variabilní fluorescence ke zjištění maximální (potenciální) fotochemické účinnosti, je v mnoha směrech důležitější poznat fotochemické vlastnosti vzorků na světle, neboť ty vypovídají o skutečné fotosyntetické schopnosti buněk. Z časových důvodů jsme měřili fluorescenční výtěžky ve stavu adaptovaném na světlo (LAS – „Light Adapted State“) pouze u kultur C1 (limitovaná dusíkem) a C3 (kontrolní). Maximální a ustálená fluorescence (F’M a FS), fotochemická účinnost PSII na světle (ФPSII) a rychlost reoxidace QA- se u obou kultur rytmicky měnily během celého experimentu (Graf 11). Oscilace ФPSII předbíhaly změny intenzity záření. Minimální hodnoty v LD režimu (0.30) byly naměřené na konci fotoperiody, maximální (0.40) na jejím počátku (3h od začátku). Znamená to tedy, že kvantová účinnost PSII se na světle během denního cyklu mění o více než třetinu. Po změně světelného režimu byl pozorován výrazný pokles fotochemické účinnosti se zachovanou rytmicitou. Na konci prvního dne LL režimu začala fotochemická účinnost ФPSII klesat až na výslednou hodnotu 0.18. Reoxidace QA- (FQA) se vykazovala opačný trend než ФPSII. Oba parametry si zachovaly shodné rytmické změny i po přenesení na konstantní světlo (LL). Je možné říci, že rychlost reoxidace QA určuje fotochemickou účinnost elektronového přenosu v PSII. b a 0.35 0.40 0.30 0.35 0.25 0.30 0.25 0.20 0.20 0.15 1 2 3 4 5 6 1 Den 2 3 4 5 QA reoxidation rate [%F] ΦPSII=(F'M-FS)/F'M 0.45 6 Den Graf 11. Denní změny fotochemické účinnosti PSII ФPSII (a) a rychlosti reoxidace v LAS (b). Aktinické záření 120 μmol kvant.m-2s-1. Černé symboly reprezentují data z limitovaných kultur C1, bílé symboly z kontrolních kultur C3. Šedé plochy znázorňují intenzitu záření, maximum odpovídá 1000 μmolů kvant.m-2s-1. 46 5.7 Rychlá kinetika indukce variabilní fluorescence Rychlá kinetika nárůstu fluorescence z hodnoty F0 na FM měřená po zapnutí kontinuálního aktinického světla je výsledkem redukce jednotlivých PSII a jejich reoxidace odčerpáváním elektronů fotosyntetickým procesem. Výsledná kinetika tedy poskytuje informaci o vzájemném poměru těchto procesů. Při použitém aktinickém světle o intenzitě 300 μmol kvant.m-2s-1 byl maximální fluorescenční výtěžek dosažen vždy ~ 250ms. Ačkoliv maximální fotochemická účinnost FV/FM MT v LD režimu byla shodná pro všechny kultury (Graf 6), nárůst fluorescence se výrazně lišil mezi kontrolními a limitovanými buňkami (Graf 12). U limitovaných kultur nebyla variabilní fluorescence v průběhu rychlého nárůstu tak účinně zhášena jako u kontrolních. Fluorescenční výtěžek byl relativně vyšší a RC PSII proto zůstávala déle zablokována. Kinetické simulace provedené D. Lazárem (Univerzita Palackého Olomouc) ukázaly, že tyto rozdíly jsou pravděpodobně způsobeny zredukováním PQ poolu ve tmě u limitovaných kultur. 1.0 1.0 N-limited 0.8 0.6 control 0.4 Fluorescence yield (r.u.) Fluorescence yield (r.u.) N-limited 0.8 control 0.6 0.4 0.2 0.2 19.5. 21h - B 19.5. 15h - B 0.0 0.0 0 200 400 600 800 1000 1200 Time (ms) 0 200 400 600 800 1000 1200 Time (ms) Graf 12. Příklady kinetiky indukce variabilní fluorescence u vzorků ponechaných na nízkém světle po dobu 30‘ minut po odběru. Ukázány jsou indukční křivky naměřené uprostřed denní periody (vlevo) a na začátku temné fáze LD světelného režimu (vpravo). Variabilní fluorescence byla normalizována na maximální hodnotu. Maximální fluorescenční výtěžek byl dosažen vždy ~ 250 ms. U dusíkem limitovaných buněk (černé linky) je zhášení fluorescence omezeno v rychlé části (< 200 ms) i v pomalé části (> 400 ms) oproti kontrolním buňkám (šedé symboly). Použité aktinické záření bylo 300 μmol kvant.m-2s-1. 47 5.8 Asimilace uhlíku Rychlost fotosyntézy jsem měřil jako inkorporaci radioaktivního izotopu uhlíku 14 C (ve formě Na214CO3) v závislosti na intenzitě světla. Buňky jsem inkuboval 20 minut na různých intenzitách záření, což mi umožnilo získat představu o hrubé fotosyntéze, neboť za takto krátkou dobu by nemělo ještě dojít k prodýchání asimilátů. Čisté fotosyntéze by pak odpovídalo zvýšení obsahu uhlíku v buňce, měřené elementární analýzou (viz kapitola 5.1.2). Hlavní parametry charakterizující světelnou závislost rychlosti fotosyntézy (fotosyntetickou křivku), Pmax, α a EK, se výrazně rytmicky měnily během LD režimu. Tyto oscilace jsem pozoroval i po přenesení na konstantní světelný režim LL. Vzhledem k tomu, že rytmy ve fotosyntéze byly přítomny i třetí den LL režimu, je pravděpodobné, že asimilace uhlíku u rozsivek je řízena endogenními rytmy. Protože denní změny a interpretace obou parametrů fotosyntetické křivky, Pmax a α závisí na tom, zda jsou vztaženy na biomasu (pigment) nebo na buňku, uvádím v dalším textu oba způsoby. 10 a b 200 180 160 140 6 120 EK Pbmax 8 100 4 80 60 2 40 c d 0.12 0.07 0.06 0.10 αb 0.04 0.06 β 0.05 0.08 0.03 0.02 0.04 0.01 0.02 0.00 1 2 3 4 5 6 1 Den 2 3 4 5 6 Den Graf 13. Denní změny fotosyntetické aktivity získané pomocí inkorporace 14C. (a) Maximální rychlost fotosytézy normalizovaná na Chl a, Pbmax, (b) fotoaklimační intenzita ozářenosti, EK, (c) sklon nárůstu rychlosti fotosyntézy ve světlem limitované části, αb, (d) fotoinhibiční parametr β. Uvedené parametry jsou v následujících jednotkách Pbmax – μg C.(μg Chl a)-1h-1, EK – μmolů kvant.m-2s-1, αb – μg C.(μg Chl a)-1h-1(μmolů kvant.m-2s-1)-1, β – bez rozměru. Černé symboly představují dusíkem limitované buňky a bílé symboly kontrolní buňky. Šedé plochy znázorňují intenzitu záření, maximum odpovídá 1000 μmolů kvant.m-2s-1. Symboly jsou stejné jako v Grafu 2. 48 5.8.1 Rychlost fotosyntézy vztažená na chlorofyl a Rychlost asimilace uhlíku vztažená na množství chlorofylu Pbmax vykazovala denní P rytmy po celou dobu experimentu (Graf 13a). Dosažené hodnoty 2 – 10 mg C.(mg Chl a)-1.h-1 se pohybovaly v rozsahu publikovaných hodnot laboratorních měření pro T. weissflogii (Havelková-Doušová 2005) i měření terénních (Babin a spol. 1996). Po změně na LL režim se snížila hodnota Pbmax na poloviční hodnotu, cirkadiální změny však zůstaly zachovány. P Po celou dobu experimentu nebylo možné pozorovat v Pbmax žádné větší rozdíly mezi P limitovanými a kontrolními kulturami. Vzhledem k nižšímu obsahu chlorofylu v limitovaných buňkách si toto vysvětluji provázaností fotosyntetické dráhy, kdy jsou světlosběrné asimilační schopnosti rozsivek v obou případech optimalizovány potřebám energie pro fixaci uhlíku. Množství chlorofylu v buňce je tedy regulováno rychlostí enzymatických reakcí CalvinBensonova cyklu. Sklon nárůstu fotosyntézy ve světlem limitované části fotosyntetické křivky αb byl v našem experimentu méně rytmický než uvádějí jiní autoři (Bruyant a spol. 2005, Havelková-Doušová 2005). Přesto lze říci, že vyšších hodnot dosahovala αb v ranní a večerní části dne, zatímco nižších hodnot bylo dosaženo během temné periody a při maximální intenzitě ozářenosti (Graf 13c). Celkově se αb pohyboval v rozmezí 0.2 – 0.8 μg C.(μg Chl a)-1h-1(μmolů kvant.m-2s-1)-1. Rozdíl mezi kulturami se projevil teprve během LL režimu, kdy limitované kultury vykazovaly pomalejší nárůst fotosyntézy za nízkých ozářeností (menší αb). Saturační parametr EK vyjadřuje intenzitu ozářenosti, od které je zvýšení fotosyntetické aktivity limitováno enzymatickými reakcemi. Hodnota EK se také uvádí jako ozářenost, na kterou jsou buňky aklimovány. Pravidelné výrazné denní změny EK po celou dobu experimentu (Graf 13 b) byly především důsledkem výrazných změn Pbmax (Graf 13a). P Hodnoty EK oscilovaly mezi 70 a 200 μmolů kvant.m-2s-1 během LD režimu (srovnej se změnou intenzity záření 0 – 1000 μmolů kvant.m-2s-1). Denní průběh změn EK znamená, že během dne je fotosyntetický aparát buněk téměř vždy saturován světlem. Během LD režimu nebyly pozorovány žádné rozdíly mezi kulturami. Rozdíly bylo možné pozorovat až na konci prvního dne LL režimu. Buňky limitované dusíkem se v důsledku snížení α fotoaklimovaly na vyšší intenzitu ozářenosti než buňky kontrolní, průměrně 110 oproti 80 μmolů kvant.m-2s-1, přičemž průměrná ozářenost v LL režimu byla 250 μmolů kvant.m-2s-1. Na konci třetího dne LL režimu byly buňky aklimovány na ½, resp. 1/3 skutečné ozářenosti. Rytmické změny EK zůstaly na LL světelném režimu zachovány u obou kultur. 49 Pokles fotosyntézy při vysokých intenzitách záření vyjadřuje fotoinhibiční parametr β. Výsledky fitování fotosyntetických křivek ukázaly, že k fotoinhibici fixace uhlíku docházelo pouze během fotoperiody při LD režimu a během první subjektivní fotoperiody po změně na LL režim (Graf 13d). V ostatních fázích dne se u fotosyntetických křivek tento parametr nepodařilo zjistit. Fotoinhibiční parametr β byl výrazně (asi 10krát) vyšší u dusíkem limitovaných kultur než u kontrolních. V důsledku fotoinhibice docházelo u limitovaných kultur na maximálním světle (okolo 1000 μmolů kvant.m-2s-1) k poklesu fotosyntézy asi o 20 %. Je zajímavé, že k výrazné fotoinhibici u limitovaných kultur dochází i během prvního subjektivního dne na LL režimu. Vzhledem k tomu, že intenzita ozářenosti byla na LL režimu jen 250 μmolů kvant.m-2s-1, nejde o přímou odezvu buněk na předchozí poškození světlem. Sklon k fotoinhibici je tedy patrně dán vnitřním regulačním parametrem. Příčinu fotoinhibice je třeba hledat v nedostatku dusíku u limitovaných kultur. 5.8.2 Rychlost fotosyntézy v jedné buňce Při normalizaci na buňku vyniknou ty změny Pmax,a α, které souvisí s rozdílným obsahem chlorofylu v buňkách a s jeho denními změnami (viz Graf 3a). Maximální rychlost fotosyntézy, Pcellmax, je u kontrolních buněk zhruba dvakrát větší, neboť limitované buňky P mají poloviční obsah chlorofylu (Graf 14a). Výraznější jsou denní rytmy αcell po celou dobu experimentu (Graf 14b). Vyšší αcell mají kontrolní buňky na konci fotoperiody, zatímco dusíkem limitované na jejím začátku. To může souviset se sníženou schopností opravy poškozených RC PSII. 35 0.30 30 Pcellmax 0.20 20 0.15 15 αcell 0.25 25 0.10 10 0.05 5 1 2 3 4 5 6 1 Den 2 3 4 5 6 Den Graf 14. Denní změny fotosyntetické aktivity získané pomocí inkorporace radioaktivního 14C. Uvedené parametry jsou v Pcellmax – μg C.(buňku)-1h-1, αcell – μg C.(buňku)-1h-1(μmolů kvant.m-2s-1)-1. Šedé plochy znázorňují intenzitu záření, maximum odpovídá 1000 μmolů kvant.m-2s-1. Bílé symboly představují data z kontrolních kultur, černé symboly z limitovaných. Rozdíl mezi kulturami zůstal zachován i po změně světelného režimu na LL. První den LL režimu výrazně vzrostla rychlost fotosyntézy na buňku v světlem limitované oblasti 50 (parametr αcell) u kontrolních buněk. Tento nárůst lze vysvětlit zvýšeným množstvím fotosyntetických pigmentů (Chl a, fucoxanthin). U limitovaných buněk zůstal zachován rytmus s vyšším αcell v první části subjektivní fotoperiody. Tímto se ještě výrazněji se projevil rozdíl mezi typy kultur v dynamice αcell. Pravidelné rytmy v obou parametrech zůstaly zachovány po všechny tři dny experimentu. Od druhého dne však došlo k výraznému snížení maximální fotosyntetické schopnosti v buňce Pcellmax o 60 % a zatímco rychlost světlem P limitované fotosyntézy v buňce αcell klesla pouze o 30 % u obou typů kultur během subjektivní fotoperiody. 5.8.3 Vztah mezi fotosyntézou limitovanou a saturovanou zářením (α a Pmax) Fotosyntézu charakterizují dva základní biochemické pochody – přeměna světelného záření v thylakoidní membráně a enzymatické reakce Calvinova cyklu. Limitujícím prvkem fotosyntézy za nízké intenzity ozáření je nedostatek vytvářených redukovaných koenzymů a energie ve formě ATP. Za vysoké ozářenosti je rychlost fotosyntézy dána množstvím enzymů a jejich rychlostními konstantami. Mezi α a Pmax lze odlišit dva způsoby variací – variabilitu na EK závislou a na EK nezávislou (Behrenfeld a spol. 2004). Při první se výrazně mění saturační parametr EK a souvisí s fotoaklimací. Původ druhé kovariace mezi α a Pmax je nejasný. 14 EK = 154 12 Pbmax 10 EK = 90 8 EK = 88 6 4 2 0 0.00 0.02 0.04 0.06 α 0.08 0.10 b Graf 15. Kovariace fotosyntetických parametrů αb a Pbmax pro všechna měření dohromady (N=360). Data jsou rozdělena podle fází v LD režimu – fotoperioda (otevřená kolečka), temná perioda (černá kolečka). Data z LL režimu (šedé trojúhelníky). První subjektivní den v LL režimu je rozdělen podle režimu LD. 51 Z našich výsledků je patrné, že u rozsivky T. weissflogii je možné pozorovat kovariaci mezi αb a Pbmax , která je nezávislá na EK (graf 15). Na EK-nezávislé změny parametrů αb a Pbmax se pohybují v rozsahu čtyřnásobku ranních hodnot pro oba dva parametry. Dynamika P těchto změn je podobná pro limitované a kontrolní buňky, pro vytvoření přesvědčivého závěru by bylo nezbytné mít víc sledování. Kromě toho však existují i fotoaklimační změny αb a Pbmax závislé na změně EK během dne. Získaná data je možné rozdělit na temnou (Graf 15, černé symboly) a světelnou fázi (Graf 15, bílé symboly) denního cyklu LD režimu. Takto pak vznikly dvě odlišné skupiny, každá s odlišnou hodnotou poměru Pbmax a αb (tzn. EK). P Z toho lze usoudit, že tento poměr je řízený jinými zásadami během temné fáze a jinými během fotoperiody. Do utvořených skupin přesně zapadla také data z prvního dne LL režimu. Znamená to, že tento poměr není vytvořený aktuální intenzitou ozářenosti, ale je výsledkem vnitřních procesů regulace fotosyntézy. Ostatní dva dny LL režimu byla kovariace Pbmax a αb P podobná temné fázi LD cyklu (Graf 15, šedé symboly). Nízký vzájemný poměr si vysvětluji si relativně nízkou intenzitou ozářenosti (250 μmolů kvant.m-2s-1) na konstantním světle. 5.9 Thermoluminescence Thermoluminescence z PSII je nástroj umožňující sledování energetiky rekombinačních pochodů uvnitř reakčního centra PSII (kapitola 2.4). Některá reakční centra PSII mohou být dočasně zablokována, redoxní energie jednotlivých přenašečů může být pozměněna v důsledku konformačních změn či poškození fotoinhibicí. To se projeví na odlišném charakteru TL křivky. Sledováním změny intenzity emise TL a jejích charakteristických teplotních maxim (pásů) lze dobře určit relativní zastoupení aktivních center PSII i energetiku přenosu elektronů. Z časových důvodů jsme měřili TL pouze u limitované kultury C1 a kontrolní kultury C3. 5.9.1 Thermoluminescenční křivky Pro TL emisi rozsivky T. weissflogii byl charakteristický TL pás s maximem 21°C (po excitaci 2 záblesky a rychlosti ohřevu 1°C.s-1). U jiných organismů je tento pás popsán jako pás B pocházející z rekombinace S2/3QB- v PSII (např. Ducruet 2003). Během sledování změn TL v průběhu denního cyklu s přirozeným světelným režimem jsem tuto formu TL křivky („LIGHT“, Graf 16a) detekoval pravidelně během fotoperiody. Po změně světelného režimu na LL byl pás B přítomen ve všech měřeních. Během temné části LD světelného režimu jsem pak pozoroval TL křivku se dvěma maximy, 21°C a 36°C (forma „DARK“, Graf 16a). Toto druhé maximum pochází pravděpodobně z rekombinace S2/3QB+e- (e- pochází ze zpětné redukce elektronem z PQ poolu). Jde o tzv. AG - „afterglow“ pás (Ducruet 2003). Jeho 52 intenzita dosahovala asi 60 % pásu B. Tento pás se vyskytuje po excitaci infračerveným zářením a při nepřítomnosti chlororespirační aktivity enzymů FQR a NDH (Havaux 2005). Domnívám se proto, že přítomnost AG pásu u rozsivek během temné periody znamená, že v tomto období nedochází k chlororespiraci. 5.9.2 Intenzita thermoluminescence Celkovou intenzitu TL emise po dvou záblescích, v oblasti teplot rekombinace aktivních center PSII (S2/3QB-) 2-45°C, jsem normalizoval na množství chlorofylu a. Tato hodnota představuje relativní zastoupení aktivních a rekombinujících center PSII ve vzorku. .Celková intenzita TL se během přirozeného denního režimu u obou kultur výrazně měnila (Graf 16b). Intenzita TL normovaná na chl byla vyšší u limitovaných kultur, rozdíl byl patrný zvláště v temné periodě. Maximum TL emise jsem pravidelně pozoroval v první polovině fotoperiody, minimum vždy na začátku temné periody. Hodnota maximální TL emise byla ~3krát vyšší v porovnání s minimální. První den LL režimu došlo k prodloužení odbobí kdy jsme pozorovali maximální TL emisi, který si vysvětluji tím, že díky nižší ozářenosti při LL režimu nedošlo k polednímu poklesu aktivity PSII (fotoinaktivaci). Denní změny v TL emisi si po dobu celého experimentu zachovaly cirkadiální rytmus. Tento rytmus velmi pravděpodobně souvisí s endogenními rytmy fotosyntézy u rozsivek. Výsledky naznačují, že se jedná o charakteristický projev přítomen i u dalších organismů Scenedesmus quadricauda, Synechococcus marinus (nepublikované výsledky). Nicméně další výzkum v oblasti popisu TL křivek jednotlivých řas a sinic se zdá jako nezbytný. dark light intenzita TL/Chla (a.u.) a 1200 b 1000 1.0 800 0.8 600 0.6 400 0.4 200 0.2 0 1 2 3 4 5 6 Den Graf 16. Denní změny intenzity TL emise a tvaru TL křivek rozsivky T. weissflogii. (a) typický tvar TL křivky získaný během temné fáze (plná linka) nebo během fotoperiody LD režimu a celého LL režimu (tečkovaná linka). (b) celková intenzita TL emise v oblasti teplot 2-45°C, normovaná na chlorofyl. Dusíkem limitované buňky z kultury C1 (černé symboly), kontrolní buňky z kultury C3 (bílé symboly). Šedé plochy znázorňují intenzitu záření, maximum odpovídá 1000 μmolů kvant.m-2s-1. 53 PAR (µmol kvant.m-2s-1) 1.2 5.10 Synchronizace buněčné kultury Populace může být synchronizována LD světelným režimem. Synchronizované buňky pak procházejí jednotlivými fázemi buněčného cyklu ve stejný čas. Fyziologické vlastnosti synchronních kultur pak mohou být považovány za vlastnosti jednotlivých buněk a mohou lépe přispět k porozumění časové souslednosti fotosyntetických dějů (Šetlík a spol. 1972, Zachleder a Šetlík 1990, Bruyant a spol. 2005). U coenobia zelené řasy Scenedesmus quadricauda i jeho jednotlivých buněk byly popsány fotosyntetické vlastnosti v každé z osmi fází buněčného cyklu. Výsledky ukazují, že ve fázi růstu mají všechny buňky velmi podobné vlastnosti. Naopak během buněčného dělení se mohou od sebe fyziologicky lišit nejen různá coenobia, ale i jednotlivé mateřské buňky uvnitř jednoho organismu. Jednotlivé buňky se od sebe liší aktivitou PSII a intenzitou nefotochemického zhášení (Šetlíková a spol. 2005). Práce se synchronizovanými buňkami sinice Prochlorococcus sp. (Bruyant a spol. 2005) ukázala, že jednotlivé fáze buněčného cyklu měly významný vliv na jejich fotosyntetické vlastnosti. Se začátkem dělení buněk došlo k poklesu elektronového přenosu na thylakoidních membránách. U rozsivek je situace složitější, neboť jen málo synchronizují svůj buněčný cyklus se změnami světla a tmy (Nelson a Brandt 1979). K jejich rozdělení dochází až po dosažení určité velikosti, přičemž ji provází tvorba menší části jejich křemičitanové schránky (hypovalvy). Protože tímto způsobem dochází k neustálému zmenšování buněčného objemu, je nezbytné, aby jednou za čtyři až pět cyklů buňky prošly pohlavním cyklem dělení a znovu dosáhly maximální velikosti. Naše výsledky však ukazují, že je celá populace určitým způsobem synchronizována. Obě kontrolní (C3 a C4) i limitované kultury (C1 a C2) ukazují shodné rytmy téměř ve všech sledovaných parametrech. Takto reprodukovatelné výsledky jsou výjimečné a poskytují stabilní základ pro interpretaci fyziologických procesů. Zvláštní případem této „synchronicity“ jsou denní změny průměrné velikosti buněk v populaci rozsivek. Tyto změny jsou asi 15 % objemu buněk shodně pro limitované i kontrolní kultury (Graf 1b). Víme však, že rychlost dělení u limitovaných kultur byla poloviční než u kontrolních kultur. Společným znakem pro obě kultury je např. meiotické dělení. Pokud by bylo omezené pouze na určitou fázi LD režimu docházelo by k pravidelným změnám nezávisle na počtu buněk. Jiné vysvětlení by mohlo být, že tyto změny souvisí s buněčným metabolismem a respiračními procesy a následnou změnou velikosti křemičité schránky. 54 5.11 Limitace dusíkem Limitace dusíkem ovlivňuje rozsivky na úrovni celkové koncentrace uhlíku, dusíku a pigmentů v buňce, má vliv na množství asimilovaného uhlíku na buňku, zvyšuje několikanásobně fotoinhibiční parametr z fotosyntetické křivky a PQ pool je u limitovaných buněk mnohem více redukován než u buněk kontrolních. Poslední dva rozdíly dokládají propojení dusíkového metabolismu a fotosyntézy na úrovni chloroplastů. Řasy si vyvinuly různé dusíkové koncentrační mechanismy, které reagují na formu dusíku i na jeho koncentraci v bezprostředním okolí buňky (Shehawy a Kleiner 2000). Rozsivky dominují v míchaných, na dusík bohatých vodách oceánů (Babin a spol. 1996), ale vyskytují se i v prostředí s nízkou koncentrací dusíku. Na rozdíl od jiné početné skupiny řas, obrněnek (Cryptophyceae), rozsivky účinně přijímají dusík i během noci (Clark a spol. 2002). Naše výsledky ukazují, že hlavní příjem dusíku u kontrolních kultur je v denní fázi cyklu a je spojen s množstvím získané energie z fotochemických reakcí. Avšak vyloučit nemohu ani jeho příjem během noci. Dusíkem limitované buňky se dělily v průměru jednou za dva dny, nutně tedy musely aktivně přijímat dusík. Protože jsem u nich nezaznamenal žádné denní změny v koncentraci dusíku, asimilace dusíku probíhala (i) průběžně během celého cyklu nebo (ii) během dělení buněk. Bohužel časové období této fáze lze jen těžko určit, pravděpodobně buněčné dělení nebylo u limitovaných buněk synchronní. Po dobu nedostatku dusíku může být rovněž omezena exkrece enzymů. Přidání dusíku do limitovaných kultur způsobuje neendogenní synchronizaci buněčných rytmů u rozsivek (Elrifi a Turpin 1986). Steglich a spol. (2001) vysvětlují tuto synchronizaci ve vztahu k transkripční aktivitě genů. Velkou roli zřejmě hraje relativní koncentrace dusíku – koncentrace na objem buňky, či poměr C:N. V případě T. weissflogii je buněčná koncentrace dusíku nejvyšší na začátku fotoperiody (u obou typů kultivačních podmínek). V tomto období je také poměr C:N u buněk na LD režimu nejnižší – u kontrolních kultur nižší než ideální poměr C:N v Clark (2001) a stejný jako Redfieldův poměr. Pravidelné zvyšování koncentrace dusíku v buněčném objemu může stimulovat expresi fotosyntetických genů v době kolem začátku fotoperiody. Vnitrobuněčná koncentrace dusíku by tak mohla během přirozeného světelného režimu hrát významnou roli v cirkadiálních rytmech fotosyntézy. 55 600 Diadinoxanthin 700 4.0 1200 Diatoxanthin 1100 500 600 Chlorofyl a Fukoxanthin 3.5 1000 400 500 3.0 900 300 400 800 300 200 700 200 100 600 100 0 2.5 2.0 0 0.7 6 12 18 0 0 FV/FM ST 2' 6 12 18 0 0 0.7 0.6 0.5 0.4 0.4 6 FV/FM MT 2' 12 18 0 0 220 Pmax 9 0.6 0.5 1.5 500 180 7 160 12 18 0 EK 200 8 6 140 6 120 5 100 4 80 0.3 3 0.3 0 4 8 12 16 20 0 0 4 8 Time (h) 16 20 0 0.0 0.2 0.4 Time (h) FV/FM ST 30' 0.7 12 60 0.7 0.8 1.0 0.0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 0.8 1.0 Time 0.06 alpha 0.07 0.6 0.6 Time beta 0.05 0.6 0.06 0.5 0.5 0.4 0.4 0.3 0.3 FV/FM MT 30' 0.04 0.03 0.05 0.02 0.04 0.01 0 4 8 12 16 20 0 0.03 0.00 0 4 8 Time (h) FV MT/ST 2' 1.8 12 16 20 0 0.0 0.2 0.4 Time (h) 1.6 0.45 0.6 0.8 1.0 0.0 0.2 0.4 Time FQA (2') 0.45 0.40 0.6 Time 1.2 F'QA TL emise 1.0 0.40 1.4 0.8 0.35 1.2 1.0 0.35 0.6 0.30 0.30 0.8 0.4 0.25 0.25 0.6 0.2 0.20 0.00 0.25 0.50 Time 0.75 1.00 0 4 8 12 16 20 0 Time (h) 0 4 8 12 Time (h) 16 20 0 0 4 8 12 16 20 0 Time (h) Graf 17. Denní změny koncentrace pigmentů a fotosyntetických parametrů u rozsivky Thalassiosira weissflogii. Černé symboly značí data z limitovaných kultur, bílé z kontrolních. Symboly stejné jako v Grafu 2. Jednotky jsou uvedené výše v textu. Šedé plochy znázorňují intenzitu záření, maximum odpovídá 1000 μmolů kvant.m-2s-1. 56 5.12 Denní rytmy - shrnutí Pravidelné denní rytmy fotosyntetických parametrů, koncentrace pigmentů i látkového složení jednotlivých buněk mořské rozsivky Thalassiosira weissflogii jsem pozoroval během všech tří experimentálních dnů přirozeného světelného režimu. Hlavní denní trendy uvádím pro lepší přehled v Grafu 12. Podobné denní změny byly pozorovány za posledních 25 let již mnohokrát (Prézelin a Ley 1980), nicméně studie srovnatelného rozsahu byla publikována pouze u mořského prokaryotního organismu Prochlorococcus (Bruyant a spol. 2005). 5.13 Endogenní rytmy Během tří dnů po změně světelného režimu na konstantní jsem pozoroval rytmické změny v koncentraci fotoprotektivních pigmentů, maximální schopnosti fixace uhlíku, fotochemické účinnosti PSII (ΦPSII), rychlosti reoxidace primárního akceptoru v PSII, rychlosti reoxidace PQ poolu a intenzity TL emise z PSII. Zatímco endogenní rytmy fotosyntetické asimilace uhlíku jsou dlouho známy a detailně popsány (Nassoury a spol. 2001), endogenní rytmy ostatních parametrů (fotoprotektivní pigmenty a fotochemické vlastnosti PSII) jsou zde popsány zcela nově. Je otázkou, zda jde skutečně o rytmy nezávislé nebo nakolik jsou pozorované rytmy důsledkem hlavního endogenního rytmu fixace uhlíku. Například o fotoprotektivních pigmentech je dobře známo, že signálem pro jejich tvorbu je přeredukování elektronového fotosyntetického řetězce. Je proto možné, že k tomuto přeredukování dochází ve dne právě v důsledku rytmických změn účinnosti fixace uhlíku. Nalézt přímou spojitost mezi dalšími rytmy, jako je např. intenzita TL emise PSII a fixace uhlíku, je obtížnější. Je proto možné, že i fotochemické vlastnosti fotosytému II jsou řízeny endogenním rytmem. Nelze ovšem zcela vyloučit, že některé rytmy pozorované během konstantního světelného režimu jsou způsobeny doznívajícími rytmy buněčného cyklu. Bruyant a spol. (2005) popisuje významný vliv buněčného cyklu na denní rytmy fotosyntézy synchronizovaných kultur. V našem experimentu lze proto očekávat podobné interakce u synchronizovaných kontrolních kultur. Buněčný cyklus dusíkem limitovaných kultur byl synchronizován mnohem méně, a tak cirkadiální rytmy vyskytující se i během LL režimu jsou pravděpodobně řízeny endogenně. 5.14 Regulace fotosyntézy v přirozeném světelném režimu Přirozený denní světelný režim přináší pravidelné rytmy v intenzitě ozářenosti. Její neustálé změny však pro fotosyntetické organismy znamenají nutnost přizpůsobit životní styl aktuální světelné nabídce. Během tohoto světelného režimu fotosyntéza neustále podléhá 57 regulaci. Rozsivky jsou organismy, u nichž se předpokládá velká schopnost fotoaklimace. A to nejen ve stabilních podmínkách laboratoří, ale právě v dynamickém světě oceánu. Fotoaklimace probíhá na několika úrovních (MacIntyre a spol. 2001): (i) příjem světelného záření, (ii) tok elektronů a (iii) asimilace uhlíku. 5.14.1 Příjem světelného záření V této práci popisuji denní změny všech pigmentů u rozsivek, a to fotosyntetických (chlorofyl a + c, fukoxanthin) i fotoprotektivních (diadinoxanthin, diatoxanthin a β-karoten). Pravidelné denní změny koncentrace fotosyntetických a fotoprotektivních pigmentů u všech kultur ukazují, že oba druhy pigmentů jsou podřízeny velmi citlivé regulaci a že jejich poměr není náhodný. Poměr PS:PP byl po dobu celého experimentu překvapivě shodný pro všechny kultury pěstované v různých podmínkách, s výraznějším rozdílem pouze na konci fotoperiody. Je tedy možné, že jejich relativní koncentrace souvisí se světelnými podmínkami během experimentu. Tuto domněnku podporují rovněž změny, které následovaly po změně světelného režimu – opět shodný vývoj pro dusíkem limitované a kontrolní kultury. Světlosběrné antény rozsivek (FCP) tvoří dvě různé skupiny funkčních oligomerů lišících se pigmentovým složením (Guglielmi a spol. 2005). Menší frakce obsahuje DD, zatímco větší je obohacená o fukoxanthin a Chl c. Ze zjištěných koncentrací pigmentů v buňce by tak bylo možné rekonstituovat složení světlosběrných antén během dne. K nárůstu koncentrace fukoxanthinu a Chl c v buňce dochází u T. weissflogii na začátku a konci fotoperiody. Při nejvyšší ozářenosti jsou naopak tyto pigmenty degradovány. Buněčná koncentrace pigmentů DD+DT se zvyšuje pouze během fotoperiody, s maximálním přírůstkem odpovídajícím maximální intenzitě ozářenosti. Role fotoprotektivních pigmentů proto jasně souvisí s denními změnami intenzity záření. Usuzuji tedy, že na začátku a na konci dne tvoří většinu světlosběrných antén u rozsivek větší a efektivnější oligomery FCP, zatímco uprostřed dne převládají menší oligomery s fotoprotektivní funkcí. Na základě dostupných informací nelze říci, jedná-li se o celkovou nebo jen funkční přestavbu vnějších antén. První hypotézu podporuje zatím jediné sledování cirkadální exprese genů fcp u rozsivek (Oeltjen a spol. 2004). U rozsivky Cyclotella cryptica byla sledována cirkadiální exprese genů fcp2 a fcp6. Exprese genu fcp2 má podobný průběh jako sledované změny koncentrace DD+DT. K transkripci genu fcp6 dochází naopak na začátku fotoperiody, stejně tak ke změnám v koncentraci fukoxanthinu a Chl c. U T. weissflogii byl dosud popsán pouze jeden gen fcp (Leblanc a spol. 1999) s maximem transkripce 6-8 hodin po přenesení kultury na světlo. 58 NPQ je u rozsivek výrazně ovlivněno koncentrací fotoprotektivních pigmentů (Ouyang a spol. 1998) a jejich deepoxidačním stavem (DEPS) (Lavaud 2002). V našem případě se jedná pravděpodobně o DEPS, který určuje intenzitu NPQ, neboť jsem nepozoroval téměř žádný rozdíl mezi kulturami ani v DEPS ani v maximální fotochemické účinnosti FV/FM (2‘). 5.14.2 Tok elektronů přes PSII Vliv stresových podmínek na fotosyntetické organismy se může projevit snížením FV/FM (Parkhill a spol. 2001). Naše výsledky dobře dokládají, že stresovým faktorem může být i změna světelného režimu. Ve většině fotosyntetických vlastností se tento stres projevil druhý subjektivní den. Uvedená data podporují tuto teorii. Pouze parametry FV/FM ST 2‘ a FV/FM MT 2‘ (viz Metody) reagují již na konci prvního subjektivního dne. Předpokládáme-li, že první z nich postihuje fotochemickou účinnost PSII a druhý více odráží účinnost PQ poolu, pak lze tyto výsledky interpretovat tak, že fotosyntéza je limitovaná v temné periodě schopnostmi PSII a ve fotoperiodě redoxním stavem PQ. Stále panuje velký rozpor mezi denními změnami maximální fotochemické účinnosti PSII, FV/FM, zjištěnými laboratorně (např. Parkhill a spol. 2001) a při terénních měřeních (např. Behrenfeld a Kolber 1999). Tyto rozdíly jsou vysvětlovány stabilitou růstu řasové populace (Parkhill a spol. 2001), limitací živinami (Behrenfeld a Kolber 1999), interakcí buněčného cyklu (Bruyant a spol. 2005) a heterogenitou populace (Šetlíková a spol. 2005). Tyto práce shodně ukazují, že nejvyšší hodnoty FV/FM jsou pozorovány těsně před začátkem fotoperiody. Z pohledu fotosyntézy by tak byla nejvýznamnější první polovina dne. V této práci mám možnost porovnat buňky jednoho organismu pěstované za různých podmínek. Mám možnost porovnat FV/FM a další fluorescenční parametry měřené v různý čas po odběru. Díky těmto měřením jsem dospěl k závěru, že ustáleně rostoucí řasové kultury mají během LD režimu shodné fluorescenční parametry bez ohledu na to, je-li jejich růst limitován dusíkem. Z praktického hlediska se proto měření maximální fotochemické aktivity PSII FV/FM zdá být neúčinným nástrojem pro zjišťování dlouhodobé limitace dusíkem při LD režimu (tedy za přirozených podmínek). Jediným fluorescenčním znakem postihujícím limitaci dusíkem je forma nárůstu křivky při indukci variabilní fluorescence. Teprve během LL režimu se projevuje limitace dusíkem na poklesu FV/FM. Dočasné snížení a s ním spojené přechodové jevy jsou více patrné u vzorků měřených 2‘ po odběru než u 30‘ relaxovaných vzorků. 59 5.14.3 Asimilace CO2 Výsledkem toku světelné, fotochemické a redukční energie je nárůst biomasy. Asimilace CO2 a nitrátu využívá stejné prostředky – světelnou energii. Propojení obou asimilačních drah se odehrává na úrovni kompetice o redukované koenzymy a energii z ATP. Nicméně ke konkurenci dochází pouze za velmi nízkého záření (Lara 1992, Padmasree a Raghavendra 2000). V této práci předkládám důkazy, že maximální fotosyntéza normalizovaná na množství chlorofylu v buňce (Pbmax) je nezávislá na limitaci dusíkem. P Limitace dusíkem je zřetelná teprve při vztažení fotosyntézy na počet buněk či buněčnou koncentraci uhlíku. Z toho vyplývá, že během přirozeného světelného režimu je maximální schopnost fotosyntézy u rozsivek evidentně optimalizována na koncentraci chlorofylu. Nicméně buněčná schopnost fixovat uhlík je nedostatkem dusíku limitována. Fotoinhibiční parametr β je záhadou. Pravděpodobně příčinou fotoinhibice není snížení aktivity PSII, ale proces na na úrovni PQ poolu či kompetice o energii z redoxních reakcí a ATP. Právě zde se prolínají procesy asimilace uhlíku, metabolismus dusíku a respirační pochody. Do nitrátové dráhy vstupuje také regenerační cyklus fotorespirace poskytující amonium pro dusíkový metabolismus (Oliver 2000). U vyšších rostlin je tento tok dusíku v chloroplastu významnější než samotná asimilace z floému. Pro fotosyntetické mikroorganismy a vodní rostliny tento tok dusíku není tak významný, nicméně fotorespirace zde existuje a může za extrémních podmínek plnit fotoprotektivní roli (Falkowski a Raven 1997). Složité řečiště energetických toků zahrnující fotosyntézu, respiraci, redukci nitrátu a fotorespiraci při dlouhodobém nedostatku dusíku lze jen velmi obtížně rozplést. 60 6 Závěr V této magisterské práci jsem sledoval denní změny fotosyntetické aktivity v proměnném světelném režimu u mořské rozsivky Thalassiosira weissflogii pěstované v ustáleně rostoucí kontinuální kultuře. Podařilo se mi zjistit pravidelné denní rytmy v koncentraci pigmentů v buňce, aktivitě fotosystému II, maximální fotochemické účinnosti, kinetice reoxidace primárního akceptoru QA ve fotosystému II, maximální rychlosti fixace CO2, fotoaklimaci buněk a dalších měřených parametrech. Mnohé z těchto parametrů byly patrny i po změně světelného režimu na konstantní. Jako jeden z prvních jsem pozoroval výrazné denní rytmy v intenzitě thermoluminescence z fotosystému II, i ve změně tvaru thermoluminescenční křivky. Intenzita thermoluminescence může být citlivým nástrojem ke zjištění denních rytmů aktivity PSII. Během tohoto experimentu jsem také porovnával denní rytmy buněk, jejichž růst byl limitován nedostatkem dusíku. Přes výrazně menší velikost buněk, pomalejší růst, nižší koncentraci pigmentů, uhlíku a dusíku v buňce vykazovaly tyto kultury shodné rytmy i hodnoty fotosyntetických parametrů jako buňky rostoucí na plném médiu. Metoda variabilní fluorescence chlorofylu se ukázala být neúčinným nástrojem pro zjištění limitace dusíkem v těchto podmínkách. Tento fakt však na druhou stranu umožňuje odhalit účinnou regulaci fotosyntézy za dlouhodobé limitace. Rychlost fotosyntézy je za daných světelných podmínek optimalizovaná, čemuž odpovídá buněčná koncentrace chlorofylu. 61 7 Literatura Andronis C, Kruse O, Deak Z, Vass I, Diner BA & Nixon PJ (1998): Mutation of residue threonine-2 of the D2 polypeptide and its effect on photosystem II function in Chlamydomonas reinhardtii. Plant Physiology 117(1), 515-524. Armbrust EV, Berges JA, Bowler C, Green BR, (...) & Rokhsar DS (2004) The Genome of the Diatom Thalassiosira pseudonana: Ecology, Evolution, and Metabolism. Science 306, 79-86 Arnold W (1966): Light reaction in green plant photosynthesis: a method of study. Science 154, 1046-1049. Arnold W & Sherwood HK (1957): Are chloroplasts semiconductors? Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 43, 105-114. Babin M, Morel A, Claustre H, Bricaud A, Kolber Z & Falkowski PG (1996): Nitrogenand irradiance-dependent variations of the maximum quantum yield of carbon fixation in eutrophic, mesotrophic and oligotrophic marine systems. Deep-Sea Research Part I: Oceanographic Research Papers 43 (8), 1241-1272. Beardall J & Giordano M (2002): Ecological implications of microalgal and cyanobacterial CO2 concentrating mechanisms, and their regulation. Functional Plant Biology 29 (2-3), 335-347. Behrenfeld MJ & Kolber Z (1999): Widespread iron limitation of phytoplankton in the South Pacific Ocean. Science 283 (5403), 840-843. Behrenfeld MJ, Prášil O, Babin M & Bruyant F (2004): In search of a physiological basis for covariations in light-limited and light-saturated photosynthesis. Journal of Phycology 40(1), 4-25. Benett J (1991): Protein phosphorylation in green úůant chloroplasts. Annual Review of Plant Physiology 42, 281-311. Bernard O, Malara G & Sciandra A (1996): The effects of a controlled fluctuating nutrient environment on continuous cultures of phytoplankton monitored by computers. Journal of Experimental Marine Biology and Ecology 197 (2), 263-278. Bhaya D & Grossman AR (1993): Characterization of gene clusters encoding the fucoxanthin chlorophyll proteins of the diatom Phaeodactylum tricornutum. Nucleic Acids Research 21 (19), 4458-4466. Bonaventura C & Myers J (1969): Fluorescence and oxygen evolution from Chlorella pyrenoidosa. Biochimica and Biophysica Acta 189, 366-383. Bruyant F, Babin M, Genty B, Prášil O, Behrenfeld MJ, Claustre H, Bricaud A, Garczarek L, Holtzendorff J, Koblížek M, Doušová H & Partensky F (2005): Diel variations in the photosynthetic parameters of Prochlorococcus strain PCC 9511): Combined effects of light and cell cycle. Limonlogy and Oceanography 50(3), 850-863. Burnap RL, Shen JR, Jursinic PA, Inoue Y & Sherman LA (1992): Oxygen yield and thermoluminescence characteristics of a cyanobacterium lacking the manganese-stabilizing protein of Photosystem-II. Biochemistry 31(4), 7404-7410. 62 Clark DR (2001): Growth rate relationships to physiological, indices of nutrient status in marine diatoms. Journal of Phycology 37(3), 249-256. Clark DR & Flynn KJ (2002): N-assimilation in the noxious flagellate Heterosigma carterae (Raphidophyceae)): Dependence on light, N-source, and physiological state. Journal of Phycology 38(2), 503-512. Cooley JW & Vermaas WFJ (2001): Succinate dehydrogenase and other respiratory pathways in thylakoid membranes of Synechocystis sp. strain PCC 6803: Capacity comparisons and physiological function. Journal of Bacteriology 183 (14), 4251-4258. Cournac L, Latouche G, Cerovic Z, Redding K, Ravenel J & Peltier G (2002): In vivo interactions between photosynthesis, mitorespiration, and chlororespiration in Chlamydomonas reinhardtii. Plant Physiology 129 (4) 1921-1928. Cruz JA , Avenson TJ, Kanazawa A, Takizawa K, Edwards GE & Kramer DM (2005): Plasticity in light reactions of photosynthesis for energy production and photoprotection. Journal of Experimental Botany 56 (411), 395-406. Demeter S, Nugent JHA, Kovacs L, Bernat G & Evans MCW (1995): Comparative EPR and thermoluminescence study of anoxic photoinhibition in Photosystem II particles. Photosynthesis Research 46(2), 213-218. Demmig-Adams B (1990): Carotenoids and photoprotection in plants: A role for the xanthophyll zeaxanthin. Biochimica et Biophysica Acta - Bioenergetics 1020 (1), 1-24. Desai TS, Sane PV & Tatake VG (1975): Thermoluminescence studies on spinach leaves and Euglena. Photochemistry and Photobiology 21 (5), 345-350 Dodd AN, Salathia N, Hall A, Kévei E, Tóth R, Nagy F, Hibberd JM, (...) & Webb AAR (2005): Cell biology: Plant circadian clocks increase photosynthesis, growth, survival, and competitive advantage. Science 309 (5734), 630-633 Ducruet JM (2003): Chlorophyll thermoluminescence of leaf discs: simple instruments and progress in signal interpretation open the way to new ecophysiological indicators. Journal of Experimental Botany 54(392), 2419-2430. Ducruet JM, Roman M, Havaux M, Janda T & Gallais A (2005a): Cyclic electron flow around PSI monitored by afterglow luminescence in leaves of maize inbred lines (Zea mays L.)): correlation with chilling tolerance. Planta 221(4), 567-579. Ducruet JM, Roman M, Ortega JM & Janda T (2005b): Role of the oxidized secondary acceptor Q(B) of Photosystem II in the delayed 'afterglow' chlorophyll luminescence. Photosynthesis Research 84(1-3), 161-166. Durnford DG, Aebersold R & Green BR (1996): The fucoxanthin-chlorophyll proteins from a chromophyte alga are part of a large multigene family: structural and evolutionary relationships to other light harvesting antennae. Molecular and General Genetics 253 (3), 377-386. Durnford DG, Deane JA, Tan S, McFadden GI, Gantt E & Green BR (1999): A phylogenetic assessment of the eukaryotic light-harvesting antenna proteins, with implications for plastid evolution. Journal of Molecular Evolution 48 (1), 59-68. El-Sheekh MM (2004): Inhibition of the water splitting system by sodium chloride stress in the green alga Chlorella vulgaris. Brasilian Journal of Plant Physiology 16 (1), 25-29. Elrifi IR & Turpin DH (1986): Nitrate and Ammonium Induced Photosynthetic Suppression in N-Limited Selenastrum minutum. Plant Physiology 81, 273-279. 63 Eppard M & Rhiel E (1998): The genes encoding light-harvesting subunits of Cyclotella cryptica (Bacillariophyceae) constitute a complex and heterogeneous family. Molecular Genomics and Genetics 260, 335-345. Falkowski PG & Raven JA (1997): Aquatic photosynthesis. Blackwell Science, Oxford. Falkowski PG, Sukenik A & Herzig R (1989): Nitrogen limitation in Isochrysis galbana (Haptophyceae). II. Relative abundance of chloroplast proteins. Journal of Phycology 29, 471-478. Field CB, Behrenfeld MJ, Randerson JT & Falkowski PG (1998): Primary Production of the Biosphere: Integrating Terrestrial and Oceanic Components. Science 281(5374), 237 – 240. GenBank, www.ncbi.nlm.nih.gov Gilbert M, Wagner H, Weingart I, Skotnica J, Nieber K, Tauer G, Bergmann F, Fischer H & Wilhelm C (2004): A new type of thermoluminometer: A highly sensitive tool in applied photosynthesis research and plant stress physiology. Journal of Plant Physiology 161(6), 641651. Giordano M, Beardall J & Raven JA (2005): CO2 concentrating mechanisms in algae: Mechanisms, environmental modulation, and evolution. Annual Review of Plant Biology 56, 99-131. Graham LE & Wilcox LW (2000): Algae, Prentice-Hall, New Jersey. Guglielmi G, Lavaud J, Rousseau B, Etienne A-L, Houmard J & Ruban AV (2005): The light-harvesting antenna of the diatom Phaeodactylum tricornutum: Evidence for a diadinoxanthin-binding subcomplex. FEBS Journal 272, 4339-4348. Guillard RRL & Ryther JH (1962): Studies on marine planktoic diatoms. I. Cyclotella nana Hustedt and Detonula conferacea (Cleve). Grand Canadian Journal of Microbiology 8, 229-239. Guy RD, Vanlerberghe GC, Stitt M & Turpin DH (1989): Singnificance of phosphoenolpyruvate carboxylase during ammonium assimilation. Carbon isotope discrimination in photosynthesis and respiration by the N-limited green alga Selenastrum minutum. Plant Physiology 89, 1150-1157. Harding LW, Prézelin BB, Sweeney BM & Cox JL (1981): Diel oscillations of the photosynthesis-irradiance relationship of a marine diatom. Journal of Phycology 17, 389-394. Hasting JW & Sweeney BM (1958): A persistent diurnal rhythm of luminescence in Gonyaulax polyedra. Biololgical Bulletin (Woods Hole, Mass.) 111, 440-458. Hatano-Iwasaki A, Minagawa J, Inoue Y & Takahashi Y (2001): Two functionally distinct manganese clusters formed by introducing a mutation in the carboxyl terminus of a photosystem II reaction center polypeptide, D1, of the green alga Chlamydomonas reinhardtii. Biochimica et Biophysica Acta - Bioenergetics 1504(3), 299-310. Havaux M, Rumeau D & Ducruet JM (2005): Probing the FQR and NDH activities involved in cyclic electron transport around Photosystem I by the 'afterglow' luminescence. Biochimica et Biophysica Acta - Bioenergetics 1709(3), 203-213. Havelková-Doušova H (2005): Photoacclimation of phytoplankton under natural irradiance conditions. Doctoral thesis, p. 206, České Budějovice. 64 Homman PH (1999): Reliability of Photosystem II thermoluminescence measurements after sample freezing: Few artifacts with Photosystem II membranes but gross distortions with certain leaves. Photosynthesis Research 62 (2-3), 219-229. Howitt CA, Udall PK & Vermaas WFJ (1999): Type 2 NADH dehydrogenases in the cyanobacterium Synechocystis sp. Strain PCC 6803 are involved in regulation rather than respiration. Journal of Bacteriology 181 (13), 3994-4003. Jeffrey & Humphrey (1975): New spectrophotometric equations for determinig Chl a. b, c1 and c2 in higher plants, algae, and natural phytoplankton. Biochemistrie und Physiologie der Pflantz 167, 191-194. Johnson GN (2004): Cyclic electron transport in C3 plants: Fact or artefact? Journal of Experimental Botany 56 (411), 407-416. Joliot P & Joliot A (2002): Cyclic electron transfer in plant leaf. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 99 (15), 10209-10214. Joliot P & Joliot A (2005): Quantification of cyclic and linear flows in plants. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 102 (13), 4913-4918. Kaftan D, Meszaros T, Whitmarsh J & Nedbal L (1999): Characterization of photosystem II activity and heterogeneity during the cell cycle of the green alga Scenedesmus quadricauda. Plant Physiology 120 (2), 433-441. Keeling PJ, Burger G, Durnford DG, Lang BF, Lee RW, Pearlman RE, Roger AJ & Gray MW (2005): The tree of eukaryotes. Trends in Ecology and Evolution 20 (12), 670-676 Krieger A, Rutherford AW & Jegerschold C (1998): Thermoluminescence measurements on chloride-depleted and calcium-depleted photosystem II. Biochimica et Biophysica Acta Bioenergetics 1364(1-2), 46-54. Kolber Z & Falkowski PG (1993) Use of active fluorescence to estimate phytoplankton photosynthesis in situ. Limnology and Oceanography 38 (8), 1646-1665. Küpper H, Šetlík I, Trtílek M & Nedbal L (2000): A microscope for two-dimensional measurements of in vivo chlorophyll fluorescence kinetics using pulsed measuring radiation, continuous actinic radiation, and saturating flashes. Photosynthetica 38(2-3), 553-570. Küpper H, Šetlík I, Šetliková E, Ferimazová N, Spiller M & Küpper FC (2003): Copperinduced inhibition of photosynthesis: Limiting steps of in vivo copper chlorophyll formation in Scenedesmus quadricauda. Functional Plant Biology 30 (12), 1187-1196. Lara C (1992): Photosynthetic Nitrate Assimilation: Interaction with CO2 respiration. Trends in Photosynthetic Research, 195-208. Lavaud J, Rousseau B, van Gorkom HJ & Etienne AL (2002): Influence of the diadinoxanthin pool size on photoprotection in the marine planktonic diatom Phaeodactylum tricornutum. Plant Physiology 129(1), 1398-1406. Lazár D, Tomek P, Ilík P & Nauš J (2001): Determination of the antenna heterogeneity of Photosystem II by direct simultaneous fitting of several fluorescence rise curves measured with DCMU at different light intensities. Photosynthesis Research 68 (3), 247-257. Leblanc C, Falciatore A, Watanabe M & Bowler C (1999): Semi-quantitative RT-PCR analysis of photoregulated gene expression in marine diatoms. Plant Molecular Biology 40 (6), 1031-1044. 65 Le Floc'h E, Malara G & Sciandra A (2002): An automatic device for in vivo absorption spectra acquisition and chlorophyll estimation in phytoplankton cultures. Journal of Applied Phycology 14 (6), 435-444. Leu S, White D & Michaels A (1990): Cell cycle-dependent transcriptional and posttranscriptional regulation of chloroplast gene expression in Chlamydomonas reinhardtii. Biochimica et Biophysica Acta - Gene Structure and Expression 1049 (3), 311-317. MacIntyre HL, Kana TM, Anning T, Geider RJ (2001): Photoacclimation of photosynthesis irradiance response curves and photosynthetic pigments in microalgae and cyanobacteria. Journal of Phycology 38 (1), 17-38. Malara G & Sciandra A (1991): A multiparameter phytoplanktonic culture system driven by microcomputer. Journal of Applied Phycology, 3, 235-241. Masojídek J, Kopecký J, Koblížek M & Torzillo G (2004): The xanthophyll cycle in green algae (Chlorophyta): Its role in the photosynthetic apparatus. Plant Biology 6(3), 342-349. Matsubayashi T, Wakasugi T, Shinozaki K, Yamaguchi-Shinozaki K, Zaita N, Hidaka T, Meng BY, (...) & Kato A. (1987): Six chloroplast genes (ndhA-F) homologous to human mitochondrial genes encoding components of the respiratory chain NADH dehydrogenase are actively expressed: determination of the splice sites in ndhA and ndhB premRNAs. Molecular and General Genetics 210 (3), 385-393. Maxwell K & Johnson GN (2000): Chlorophyll fluorescence - A practical guide. Journal of Experimental Botany 51 (345), 659-668. Misra AN, Dilnawaz F, Misra M & Biswal AK (2001): Thermoluminescence in chloroplasts as an indicator of alterations in photosystem 2 reaction centre by biotic and abiotic stresses. Photosynthetica 39(2), 1-9. Munekage Y, Hashimoto M, Miyake C, Tomizawa K-I, Endo T, Tasaka M & Shikanai T (2004): Cyclic electron flow around photosystem I is essential for photosynthesis. Nature 429 (6991), pp. 579-582 Müller P, Li X-P & Niyogi KK (2001): Non-photochemical quenching. A response to excess light energy. Plant Physiology 125 (4), 1558-1566. Nassoury N, Fritz L & Morse D (2001): Circadian changes in ribulose-1,5-bisphosphate carboxylase/oxygenase distribution inside individual chloroplasts can account for the rhythm in dinoflagellate carbon fixation. Plant Cell 13 (4), 923-934. Nedbal L, Trtílek M & Kaftan D (1999): Flash fluorescence induction: A novel method to study regulation of Photosystem II. Journal of Photochemistry and Photobiology B: Biology 48 (2-3), 154-157. Nelson DM & Brandt LE (1979): Cell division periodicity in 13 species of marine phytoplankton on a light:dark cycle. Journal of Phycology 15, 67-75. Oeltjen A, Krumbein WE & Rhiel E (2002): Investigations on transcript sizes, steady state mRNA concentrations and diurnal expression of genes encoding fucoxanthin chlorophyll a/c light harvesting polypeptides in the centric diatom Cyclotella cryptica. Plant Biology 4 (2), 250-257. Oeltjen A, Marquardt J & Rhiel E (2004): Differential circadian expression of genes fcp2 and fcp6 in Cyclotella cryptica. International Microbiology 7, 127-131. Ohad I, Adir N, Koike H, Kyle DJ & Inoue Y (1990): Mechanism of photoinhibition in vivo. A reversible light-induced conformational change of reaction center II is related to an 66 irreversible modification of the D1 protein. Journal of Biological Chemistry 265 (4), 19721979. Olaizola M, La Roche J, Kolber Z & Falkowski PG (1994): Non-photochemical fluorescence quenching and the diadinoxanthin cycle in a marine diatom. Photosynthesis Research 41 (2), 357-370. Oliver (2000): Photorespiration and C2 cycle. In: Photosynthesis. A Conprehensive Treatise. Raghavendra (ed.), Cambridge University Press, Cambridge. Ouyang Y, Andersson CR, Kondo T, Golden SS & Johnson CH (1998): Resonating circadian rhythms. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 95, 8660-8664. Owens TG, Falkowski PG & Whitledge (1980): Diel Periodicity in Cellular Content in Marine Diatoms. Marine Biology 59, 71-77. Padmasree K & Raghavendra AS (2000): Interaction with respiration and nitrogen metabolism. In: Photosynthesis. A Conprehensive Treatise. Raghavendra (ed.), Cambridge University Press, Cambridge. Pagonis V, Mian SM & Kitis G (2001): Fit of first order thermoluminescence glow peaks using the weibull distribution function. Radiation Protection Dosimetry 93 (1), 11-17. Parkhill JP, Maillet G & Cullen JJ (2001): Fluorescence-based maximal quantum yield for PSII as a diagnostic of nutrient stress. Journal of Phycology 37(4), 517-529. Peltier G & Cournac L (2002): Chlororespiration. Annual Review of Plant Biology 53(3), 523-550. Platt T, Galleos CL & Harrison WG (1980): Photoinhibition of photosynthesis in natural assemblages of marine-phytoplankton. Journal of Marine Research 38(4), 687-701. Post AF, Dubinsky Z, Wyman K & Falkowski PG (1984): Kineticks of light-intensity adaptation in a marine planktonic diatom. Marine Biology 83 (3), 231-238. Prášil O, Kolber Z, Berry JA & Falkowski PG (1996): Cyclic electron flow around Photosystem II in vivo. Photosynthesis Research 48 (3), 395-410. Prézelin BB & Ley AC (1980): Photosynthesis and Chlorophyll a Fluorescence Rhythms of Marine Phytoplankton. Marine Biology 55, 295-307. Rivkin RB & Putt M (1988): Seasonal pattern of diel periodicity in photosynthesis by polar phytoplankton: species-specific response. Journal of Phycology 24 (3), 369-376. Pyszniak AM & Gibbs SP (1992): Immunocytochemical localization of photosystem I and the fucoxanthin-chlorophyll a/c light-harvesting complex in the diatom Phaeodactylum tricornutum. Protoplasma 166 (3–4), 208 – 217. Raymond J & Blankenship RE (2003): Horizontal gene transfer in eukaryotic algal evolution. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 100 (13), 7419-7420. Roháček K (2002): Chlorophyll fluorescence parameters: the definitions, photosynthetic, meaning, and mutual relationships. Photosynthetica 40(1), 13-29. Roháček K & Barták M (1999): Technique of the modulated chlorophyll fluorescence: basic concepts, useful parameters, and some applications. Photosynthetica 37(3), 339-363. 67 Rutherford AW, Crofts AR, Inoue Y (1982): Thermo-luminescence as a probe of Photosystem-II photochemistry – the origin of the flash-induced glow peaks. Biochimica et Biophysica Acta 682(3), 457-465. Rutherford AW, Inoue Y (1984): Oscillation of delayed luminescence from PSII – recombination of S2QB-, and S3QB-. FEBS Letters 165(2), 163-170. Samson G & Bruce D (1996): Origins of the low yield of chlorophyll a fluorescence induced by single turnover flash in spinach thylakoids. Biochimica et Biophysica Acta Bioenergetics 1276 (2), 147-153. Shehawy RM & Kleiner D (2000): Nitrogen limitation. In: Algal Adaptation to Environmental Stress, Rai LC & Gaur JP (eds), Springer, Heidelberg. Shen JR, Qian M, Inoue Y & Burnap RL (1998): Functional characterization of Synechocystis sp. PCC 6803 Delta psbU, and Delta psbV mutants reveals important roles of cytochrome c-550 in. Biochemistry, 37(6), 1551-1558. Smetacek VA (1999): Diatoms and the ocean carbon cycle. Protist, 150, 25-32. Smith RG, Vanlerberghe GC, Stitt M & Turpin DH (1989): Short-term metabolite chnages during transient ammonium assimilation by the N-limited green alga Selenastrum minutum. Plant Physiology 91, 749-55. Steglich C, Behrenfeld M, Koblížek M, Claustre H, Penno S, Prášil O, Partensky F & Hess WR (2001): Nitrogen deprivation strongly affects Photosystem II but not phycoerythrin level in the divinyl-chlorophyll b-containing cyanobacterium Prochlorococcus marinus. Biochimica et Biophysica Acta - Bioenergetics 1503(5403), 341-349. Stramski D, Sciandra A & Claustre H (2002): Effects of temperature, nitrogen, and light limitation on the optical properties of the marine diatom Thalassiosira pseudonana. Limnology and Oceanography 47 (2), 392-403. Strasser RJ & Stirbet AD (2001): Estimation of the energetic connectivity of PSII centres in plants, using the fluorescence rise O-J-I-P - Fitting of experimental data to. Mathematics and Computers in Simulation 56(4-5), 451-461. Strehler & Arnold (1951): Light production by green plants. Journal of Gentetics and Physiology 34, 809-820. Suzuki L & Johnson CH (2001): Algae know the time of day: circadian and photoperiodic programs. Journal of Phycology 37, 933-942. Sweeney BM (1987): Rhytmic phenomena in plants, Second edition, Academic Press, Inc., London. Šetlík I, Berková E, Doucha J, Kubín S, Vendlová J & Zachleder V (1972): The coupling of synthetic and reproduction processes in Scenedesmus quadricauda. Arch. Hydrobiol. Suppl., 41, Algological Studies, 7, 172-213. Šetlíková E, Šetlík I, Küpper H, Kasalický V & Prášil O (2005): The photosynthesis of individual algal cells during the cell cycle of Scenedesmus quadricauda studied by chlorophyll fluorescence kinetic microscopy. Photosynthesis Research 84(1-3), 113-120. Tréguer P, Nelson DM, Van Bennekom AJ, DeMaster DJ, Leynaert A & Quéguiner B (1995): The silica balance in the world ocean: A reestimate. Science 268 (5209), 375-379. Trtílek M, Kramer DM, Koblížek M & Nedbal L (1997): Dual-modulation LED kinetic fluorometer. Journal of Luminescence 72-4(2), 597-599. 68 Valverde F, Ortega JM, Losada M & Serrano A (2005): Sugar-mediated transcriptional regulation of the Gap gene system and, concerted photosystem II functional modulation in the microalga. Planta 221(6), 937-952. Vass I (2003): The history of photosynthetic thermoluminescence. Photosynthesis Research, 76(1-3), 303-318. Vass I & Inoue Y (1992): Thermoluminescence in the study of Photosystem two. In: Topics in Photosynthesis. Volume 11. The Photosystems: Structure, Funcition and Molecular Biology. Barber J (ed). Elsevier, Amsterdam. Vass I & Demeter S (1982): Classification of Photosystem-II inhibitors by thermodynamic, characterization of the thermo-luminescence of inhibitor treated. Biochimica et Biophysica Acta, 682(3), 496-499. Vass I & Govindjee (1996): Thermoluminescence from the photosynthetic apparatus. Photosynthesis Research 48(1-2), 117-126. Vavilin DV, Ducruet JM, Matorin DN, Venediktov PS & Rubin AB (1998): Membrane lipid peroxidation, cell viability and Photosystem II activity in the green alga Chlorella pyrenoidosa subjected to various stress conditions. Journal of Photochemistry and Photobiology B- Biology 42(7), 233-239. Vavilin DV, Matorin DN & Rubin AB (2002): High-temperature thermoluminescence of chlorophyll as a method to study, lipid peroxidation in planktonic algae. Archiv Für Hydrobiologie 153(4), 685-701. Vega-Palas MA, Flores E & Herrero A (1992): NtcA, a global nitrogen regulator from the cyano-bacterium Synechococcus that belongs to the Crp family of bacterial regulators. Molecular Microbiology 6 (13), 1853-1859. Vredenberg WJ (2000): A three-state model for energy trapping and chlorophyll fluorescence in, photosystem II incorporating radical pair recombination. Biophysical Journal 79(1), 26-38. Vredenberg WJ, Kasalický V, Durchan M & Prášil O (2006): The chlorophyll a fluorescence induction pattern in chlororplasts upon repetitive single turnover excitations: Accumulation and function of QB-nonreducing centers. Biochimica et Biophysica Acta – Bioenergetics 1757, 173-181. Whitmarsh J & Govindjee (2002): Photosysthem II. Encyklopedia of Life Sciences, www.els.net. Zachleder V & Šetlík I (1990): Timing of events in overlapping cell reproductive sequences and their mutual interactions in the alga Scenedesmus quadricauda. Journal of Cell Science 97 (4), 631-638. Zchut S, Keren N, Ohad I & Pick U (2003): Cold-acclimation protects photosystem II against freezing damage in the, halotolerant alga Dunaliella salina. Journal of Plant Physiology 160(2), 185-192. www.molecadr.com www.psi.cz 69 8 Zkratky Zkratka Definice; použité jednotky Chemické látky Ant antimycine AOX alternativní oxidáza ATP adenosin trifosfát CAB protein protein vážící chlorofyl a a b CP 43 protein vnitřní antény fotosystému II CP 47 protein vnitřní antény fotosystému II Cyt b6f cytochrom b6f DCMU 3-(3‘,4‘-dichlorophenyl)-1,1-dimethyl-urea FCP protein tvořící vnější světlosběrné antény rozsivek, fukoxanthin-chlorofyl c vážící protein fcp FNR FQR gen pro FCP, světlosběrné antény rozsivek + ferredoxin-NADP -reduktáza ferredoxin-plastochinon-reduktáza GOGAT 2-oxoglutarát aminotransferáza GS glutamin syntáza mRNA "messenger RNA" + NADP , NADPH nikotin amid dinukleotid fosfát, oxidovaná a redukovaná forma NDH NAD(P)H-PQ oxidoreduktáza NH4+ amonium - nitrit - nitrát NO2 NO3 ntcA gen kódující endogenní senzor dusíku u sinic PCy plastocyanin Pheo pheophytin PQ, PQH2 plastochinon, plastochinol psbA gen kódující D1 protein ve fotosytému II psbB gen kódující D2 protein ve fotosytému II PSI fotosystém I PSII fotosystém II PTOX rostlinná terminální oxidáza QA, QB primární a sekundární chinonový akceptor ve fotosystému II RC reakční centrum B RUBISCO ribulózo-1,5 bisfosfát karboxyláza-oxygenáza TH transhydrogenáza Tyr tyrosin, funkční donor elektronů ve fotosystému II Thermoluminescence pás AG - termoluminescenční pás z rekombinace S2/3QB + e pás B termoluminescenční pás z rekombinace S2/3Q TL thermoluminescence - B Pigmenty Chl a chlorofyl a; pg.buňku-1 Chl c chlorofyl c DEPS deepoxidační stav pigmentů xanthofylového cyklu; mol/mol DD diadinoxanthin; fg.buňku-1 DT diatoxanthin; fg.buňku-1 PP fotoprotektivní pigmenty PS fotosyntetické pigmenty PS:PP poměr fotosyntetických a fotoprotektivních pigmentů; mol/mol Viol violaxanthin Zea zeaxanthin 70 Variabilní Fluorescence DAS stav adaptovaný na tmu F0 základní fluorescenční výtěžek FM maximální fluorescenční výtěžek FM MT maximální fluorescenční výtěžek získaný zavřením RC PSII dlouhým pulsem (~ 800 ms); V FM ST maximální fluorescenční výtěžek získaný zavřením RC PSII jediným krátkým zábleskem (< 50 us); V FQA relativní výtěžek variabilní fluorescence v určitém čase od saturačního záblesku; relativní jednotky FS ustálený fluoresceční výtěžek v LAS F(t) fluorescenční výtěžek v určitém čase FV výtěžek variabilní fluorescence FV/FM maximální fotochemická účinnost PSII u vzorků adaptovaných na tmu; relativní jednotky fí2 maximální fotochemická účinnost PSII u vzorků adaptovaných na světlo; relativní jednotky MT více-obrátková excitace PSII, "mutliple turnover" n množství komplexů PSII NPQ nefotochemické zhášení nQB QB neredukující RC PSII σPSII funkční absorbční průřez PSII ST jednoobrátková excitace PSII, "single turnover" STF krátký puls (< 50 us) způsobující jedno zablokování PSII B Fotosyntetické parametry světlem limitovaný nárůst fotosyntetické křivky α α b α cell světlem limitovaný nárůst fotosyntetické křivky vztažený na chlorofyl a; -1 -1 -2 -1 -1 μg C.(μg Chl a) h (μmolů kvant.m s ) světlem limitovaný nárůst fotosyntetické křivky vztažený na buňku; -1 -1 -2 -1 -1 μg C.(buňku) h (μmolů kvant.m s ) β fotoinhibiční parametr; bez rozměru EK saturační index fotosyntézy, fotoaklimační parametr; μmolů kvant.m s Pmax maximální rychlost fotosyntézy -2 -1 -1 -1 P b max maximální rychlost fotosyntézy vztažená na chlorofyl a; μg C.(μg Chl a) h P cell max maximální rychlost fotosyntézy vztažená na buňku; μg C.(buňku) h -1 -1 Ostatní C1 a C2 dusíkem limitované kultury C3 a C4 kontrolní kultury CET cyklický elektronový transport CNRS francouzská akademie věd, "Centre National de la Recherche Scientific" ETR rychlost přenosu elektronů v thylakoidních membránách f/2 označení média napodobující mořskou vodu GF/C a GF/F označení skleněných filtrů firmy Whatman HPLC vysokotlaká kapalinová chromatografie LAS stav adaptovaný na světelné podmínky LD (režim) světelný režim se střídáním světla a tmy, "light:dark" LEDs světelné diody, "light emission diodes" LHC světlosběrné antény, "light harvesting complex" LL (režim) světelný režim konstantního světla, "light:light" MBÚ AVČR Mikrobiologický Ústav Akademie Věd České Republiky OEC kyslík vyvíjející komplex na fotosystému II PAR fotosynteticky aktivní záření; μmolů kvant.m s P.S.I. firma Photon Systém Instruments, Brno -2 -1 71 9 Přílohy 72
Podobné dokumenty
Z/2003/Female/Bay/Canabis Z x Robin II Z
Využití fluorescence sinic a řas při hodnocení kvality vod
rozšíření FluoroProbe pro hodnocení fytobenthosu (na
povrchu sedimentů, kamenů atd.)
Monarchistický zpravodaj
bylo také jen symbolické gesto, pro přiblížení problému českým občanům, jako záchrana pár set "Wintonových dětí", odpověděl europoslanec za KDU - ČSL Tomáš Zdechovský, že Česko má možnost si vybrat...
biologie šternberk - Střední škola logistiky a chemie
fotosyntézou)
CHEMOTROFNÍ (získávají E oxidací anorganických látek chemosyntézou)
HETEROTROFNÍ bakterie- získávají E oxidací organických látek (živin)
SAPROFYTI - z odumřelých těl nebo výměšků
PARA...
Eliminace reoxidace 23
8. Atlas vměstků 25
FYZIOLOGIE ROSTLIN
mnohonásobně převyšovat dýchání, čímž se v rostlině hromadí asimiláty. Jsou-li
podmínky fotosynt. nad kompenzačním bodem, je možno stanovit rozdíl mezi
celkovou fotosyntet. produkcí sušeny a spotře...
Number 16