37. PSS přednáška Kubizniaková

Bakterie mléčného kvašení a kultivační
metody jejich detekce - srovnávací studie
Petra Kubizniaková
Kubizniaková, Dagmar Matoulková
Matoulková
Výzkumný ústav pivovarský a sladařský, a.s., Praha
Pivovarsko-sladařský seminář, Plzeň,
23. – 24. října 2014
2
Bakterie mléčného kvašení a pivo
pivo je nápoj s vysokou mikrobiologickou stabilitou
jeho složení zabraňuje rozvoji většiny mikroorganismů včetně patogenů
kvasinky, mléčné bakterie a striktní anaeroby mají schopnost kazit pivo
nejvíce škodlivé rody – Lactobacillus a Pediococcus
60 – 90 % mikrobiálního kažení piva v Evropě v období 1980 – 2002
nejvíce rizikové druhy L. brevis a P. damnosus – 50 %
mikrobiálního kažení piva
schopnost kazit pivo = tolerance k hořkým chmelovým látkám,
nižšímu pH, vyššímu obsahu alkoholu a CO2
Bakterie mléčného kvašení a pivo
v různých fázích výroby
primární kontaminace
hlavní kvašení a dokvašování
produkce nežádoucích chutí a aromat
kyselina mléčná, octová, diacetyl,..
snížení výtěžnosti alkoholu
inhibice množení kvasinek, zpomalení kvašení
v další fázi výroby odstraněna ne však její produkty
sekundární (post-pasterační) kontaminace
hotový výrobek
znehodnocení piva tvorbou zákalu, případně sedliny
produkce nežádoucích chutí a aromat
L. brevis
super-attenuace
4
Lactobacillus
grampozitivní, chemoorganotrofní, nesporulující, katalasa-negativní
striktně fermentativní metabolismus
fakultativně anaerobní, ke kyslíku značně tolerantní
2-53 °C, optimum 30-40 °C
optimální pH 5,5-6,2 produkcí kyselin mohou pH prostředí snížit na 4,0
tyčky, variabilní velikost i tvar
podle konečné fermentace cukrů
homofermentativní
fakultativně heterofermentativní
heterofermentativní
L. brevis, L. plantarum, L. paracasei, L. backii, L. buchneri
Pediococcus
grampozitivní, chemoorganotrofní, nesporulující, katalasa-negativní
fakultativně anaerobní
25-35 °C, 8-30 °C pro P. damnosus
optimální pH 5,5
koky uspořádané v tetrádách, jednotlivě či dvojicích (nikdy v řetízcích)
homofermentativní
P. damnosus, P. dextrinicus
6
Půdy pro detekci mléčných bakterií
mléčné bakterie pro svůj růst vyžadují komplexní nutričně bohatá média
obsahující jednoduché cukry, aminokyseliny, peptidy, vitamíny, soli,..
univerzální kultivační půda umožňující rychlou a spolehlivou detekci pivu
škodících mléčných bakterií neexistuje
půdy jsou kompromisem mezi selektivitou, citlivostí a rychlostí růstu
součástí půd jsou inhibitory zabraňující rozvoji kvasinek, gramnegativních
bakterií, plísní
- actidion, β-fenyletanol, azid sodný
kultivace za anaerobních podmínek, 28-30 °C, 5-7 dn í
Kultivační půdy
Půda WLD (Wallerstein Laboratories Differencial - agar)
- komplexní médium obsahující bromkresolovou zeleň jako
indikátor pH, glukosu jako zdroj uhlíku a přídavek aktidionu
- za anaerobních podmínek umožňuje detekci bakterií
mléčného kvašení
- doporučována EBC, komerčně běžně dostupná
Deanovo médium
- půda založená na extraktu piva obohacená o kvasničný
extrakt
Williamsovo L-médium
- půda obsahující pivo, maltosu a extrakt z jater
8
MRS agar (de Man Rogosa Sharpe)
- jedna z nejvíce používaných půd
- komplexní médium, zdrojem uhlíku je glukosa
- pro kultivaci, detekci, izolaci a uchovávání širokého spektra mléčných
bakterií
- doporučována EBC, komerčně běžně dostupná
VLB-S7
- půda založená na pivu, zdrojem uhlíku jsou maltosa, fruktosa a
xylosa
- původně navržená pro detekci pediokoků, později byl prokázán
spolehlivý růst laktobacilů
- komerčně dostupná ve stužené formě, rozšířená v Německu
UBA (Universal beer agar)
- obsahuje pivo, rajčatový džus a glukosu
- pro detekci pivu škodících MO (kvasinky, mléčné a octové bakterie)
- nastavením kultivačních podmínek a přidáním aktidionu – mléčné
bakterie
- komerčně běžně dostupná
Raka-Ray No.3
- komplexní médium obsahující maltosu a fruktosu, neobsahuje
pivo
- komerčně běžně dostupná, doporučována EBC i BCOJ k
rutinním kontrolám piva
- informační charakter, méně selektivní k neškodícím bakterií a
současně menší záchyt škodících kmenů
NBB (Nachweismedium für bierschädliche Bakterien)
- komplexní půda obsahující glukosu a maltosu 1:1, pivo a
chlorfenolovou červeň jako indikátor změny pH
- komerčně dostupná v různých formách, doporučována EBC
- velmi rozšířená
B-MRS (beer-MRS)
- základní MRS médium obohacené 25 % přídavkem piva
- vyšší záchyt pivu škodících mléčných bakterií
PDM (Pediococcus damnosus medium)
- modifikovaná B-MRS půda obsahující L-cystein hydrochlorid
(0,3 mg/l)
- navržená pro detekci pivu škodící bakterie P. damnosus
BMB (Barney-Miller Brewery)
- kultivační půda obsahující rajčatový džus, maltosu, pivo a L-cystein-HCL
- mléčné bakterie na ní rostou rychleji než na MRS a NBB
- doporučována ASBC, v Evropě není běžně komerčně dostupná
ABD (advanced beer-spoiler detection)
- médium obsahující pouze pivo, octan sodný a aktidion
- navržené k detekci pivu škodících a hůře kultivovatelných mléčných bakterií L.
lindneri a L.paracollinoides
- neumožňuje růst pivu neškodících mléčných bakterií
- autory doporučováno k průkazu těch kmenů bakterií, které jsou hůře
detekovatelné běžnými kultivačními půdami
Použité kmeny
Rod
Lactobacillus – 43 kmenů
ze sbírek RIBM, CCM, DSMZ
Rod
Pediococcus – 10 kmenů
ze sbírek CCM, DSMZ
Kultivační podmínky
27-30 °C, 5-7 dní, anaerobn ě
kmen
WLD
DM
WmL
MRS
VLB
UBA
R-R
NBB
BMRS
PDM
BMB
ABD
kultivační média – detekce bakterií (dny)
Druh
L. amylolyticus
DSM 11664T
9
-
6
4
3
9
9
6
4
4
4
-
L. backii
DSM 18080T
6
-
-
5
6
-
-
-
6
-
7
-
RIBM 2-4
3
-
4
2
3
3
3
2
2
2
3
-
RIBM 2-16
2
-
3
2
2
2
3
2
2
2
2
-
RIBM 2-9
4
-
3
2
4
4
3
2
3
3
3
-
RIBM 2-26
3
-
3
2
3
3
3
2
2
2
2
-
RIBM 2-30
3
-
7
2
3
5
3
2
3
3
3
-
L. coryniformis
CCM 4618T
3
-
3
2
3
2
3
3
2
2
3
-
L. curvatus
CCM 7558T
4
-
-
2
3
-
5
3
2
3
3
-
L. delbrueckii
CCM 7191T
3
-
4
3
3
3
3
3
3
3
3
-
L. fermentum
CCM 7192T
2
-
3
2
2
2
2
2
2
2
2
-
L. fructivorans
CCM 7700
3
-
3
2
3
2
3
2
2
2
3
-
L. hilgardii
CCM 7701
3
-
3
2
3
3
2
3
2
3
3
-
L. lindneri
DSM 20690T
10
-
6
5
5
5
4
4
4
5
4
-
L. malefermentans
DSM 5705T
-
-
4
2
3
-
6
3
2
2
3
-
L. paracollinoides
DSM 15502T
-
-
-
5
-
-
-
-
-
-
-
-
RIBM 2-29
2
-
5
2
2
2
2
2
2
2
2
-
RIBM 2-91
2
-
5
2
2
2
2
2
2
2
2
-
P. acidilactici
CCM 3449
4
-
3
4
4
4
4
4
4
4
4
-
P. claussenii
DSM 14800T
L. brevis
L. buchneri
L. casei/paracasei
L. plantarum
4
-
3
4
4
4
4
4
4
4
4
-
P. damnosus
CCM
3453T
-
-
6
6
7
7
7
7
6
7
7
-
P. dextrinicus
CCM 3457T
4
-
3
2
3
4
4
3
2
3
3
-
P. inopinatus
T
CCM 3451
7
-
5
3
3
-
7
3
3
3
3
-
P. parvulus
CCM 3450T
6
-
-
4
5
7
6
5
5
4
5
-
P. pentosaceus
CCM 7796T
3
-
3
2
3
3
2
2
2
2
2
-
kmen
WLD
DM
WmL
MRS
VLB
UBA
R-R
NBB
BMRS
PDM
BMB
ABD
kultivační média – velikost kolonií (mm)
Druh
L. amylolyticus
DSM 11664T
<1
-
<1
2,2
2,0
1,0
<1
1
1,9
1,6
1,1
-
18080T
1,0
-
-
2,0
1,0
-
-
-
2,2
-
1,2
-
L. backii
DSM
L. brevis
RIBM 2-4
1,0
-
1,8
2,3
1,6
<1
<1
2,1
1,6
1,2
1,1
-
RIBM 2-16
2,4
-
2,6
3,0
3,1
2,3
2,5
2,8
3,8
3,1
3,2
-
L. buchneri
RIBM 2-9
1,2
-
1,6
2,6
1,1
<1
1,9
2,1
1,6
2,2
1,0
-
L. casei/paracasei
RIBM 2-26
<1
-
1,6
2,0
1,0
<1
<1
1,5
1,5
<1
1,3
-
RIBM 2-30
<1
-
2,0
2,1
1,3
<1
1,0
2,0
1,4
1,2
1,0
-
L. coryniformis
CCM 4618T
1,0
-
2,0
2,2
1,6
1,1
1,4
1,6
2,0
1,6
1,2
-
L. curvatus
CCM 7558T
<1
-
-
4,1
2,0
1,5
<1
3,0
4,0
3,8
2,5
-
L. delbrueckii
CCM 7191T
1,6
-
<1
1,4
2,3
1,0
1,3
1,0
1,2
1,2
1,6
-
L. fermentum
CCM
7192T
2,0
-
2,8
3,0
2,5
1,5
1,0
1,5
2,5
1,0
1,1
-
L. fructivorans
CCM 7700
1,9
-
1,5
3,0
1,4
1,0
1,2
2,5
2,5
2,5
2,0
-
L. hilgardii
CCM 7701
2,5
-
2,6
3,7
2,7
2,4
3,0
3,3
3,3
3,2
2,6
-
L. lindneri
DSM 20690T
1,0
-
<1
2,0
2,5
2,0
2,0
2,0
2,5
1,0
1,5
-
-
-
<1
1,5
1,5
-
<1
1,0
2,5
1,1
1
-
-
-
-
2,0
-
-
-
-
-
-
-
-
5705T
L. malefermentans
DSM
L. paracollinoides
DSM 15502T
L. plantarum
RIBM 2-29
1,0
-
2,0
1,9
1,4
1,0
1,2
2,0
1,6
1,2
1,0
RIBM 2-91
1,1
-
3,0
2,8
1,1
1,0
1,1
2,0
1,7
1,8
1,4
-
P. acidilactici
CCM 3449
1,0
-
<1
2,0
1,5
<0,5
1,0
2,0
1,0
1,5
1,5
-
P. claussenii
DSM 14800T
<1
-
1,7
1,0
<1
<1
<1
1,0
1,0
<1
1,0
P. damnosus
CCM 3453T
-
-
<1
1,3
1,8
<1
<1
1,0
1,0
1,0
1,0
-
P. dextrinicus
CCM
3457T
2,1
-
2,0
2,1
2,0
<1
<1
2,0
2,0
1,8
1,8
-
P. inopinatus
CCM 3451T
<1
-
<1
1,3
1,0
-
<1
1,0
1,0
1,0
1,0
-
T
P. parvulus
CCM 3450
<0,5
-
-
1,5
1,0
<0,5
<0,5
<1
1,5
1,0
<1
-
P. pentosaceus
CCM 7796T
1,0
-
1,0
2,6
1,4
1,3
1,7
1,6
2,6
1,8
1,0
-
Souhrn výsledků
Závěr
100 % kmenů Lactobacillus pouze na MRS
100 % kmenů Pediococcus na MRS, VLB, BMRS, PDM, BMB
Deanovo médium (DM) a ABD – nerostl žádný kmen
nejrychlejší růst – MRS, NBB
největší kolonie – MRS
nejmenší záchyt – WmL, UBA
nejpomalejší růst – WmL, R-R, UBA
nejmenší kolonie – UBA, R-R, WLD
WmL, BMB – pracná příprava
UBA, R-R, DM, WmL – náchylnější ke kontaminaci plísní
Nejvhodnější půdy pro průkaz mléčných bakterií – MRS, NBB
Děkuji za pozornost
Problematika detekce bakterií mléčného kvašení bude zpracována do formy publikací v
časopise Kvasný Průmysl:
Kubizniaková, P., Matoulková, D.: Brewing microbiology – lactic acid bacteria and cultivation
methods for their detection – Part I. Kvasný Průmysl 61(1), 2015
Kubizniaková, P., Matoulková, D.: Brewing microbiology – identification of lactic acid bacteria –
Part II. Kvasný Průmysl 6, 2015
Výsledky byly získány s využitím institucionální podpory
Ministerstva zemědělství České republiky na dlouhodobý koncepční rozvoj VÚPS
- Výzkum kvality a zpracování sladařských a pivovarských surovin (RO1914).