37. PSS přednáška Benešová

Studium vybraných „emerging“
mykotoxinů v ječmeni a ve sladu
Karolína Benešová, Martina Bolechová, Sylvie Běláková
Sladařský ústav Brno, Mostecká 7, 614 00
ÚKZÚZ, Národní referenční laboratoř, Hroznová 2, 656 00
Brno
„Emerging“ mykotoxiny
• V současné době nové mykotoxiny
• Významní producenti:
F. subglutinans, F. proliferatum, F. avenaceum, F. tricinctum, F. acuminatum,
F. oxysporum, F. sporotrichioides a F. sambucinum.
• Nejdůležitější mykotoxiny:
•
•
•
•
Enniatiny
Beauvericin
Moniliformin
Fusaproliferin
• o jejich výskytu a toxických účincích je známo jen velmi málo
• pro posouzení však zatím chybí dostatek relevantních dat o jejich výskytu.
• v roce 2009 vydána Evropským úřadem dozorujícím nad bezpečnostní
potravin (European Food Safety Autority – EFSA) výzva ke sledování těchto
mykotoxinů a poskytování dat o jejich výskytu.
37. Pivovarsko – sladařský seminář, 23. - 24. 10. 2014
Struktura enniatinů a beauvericinu
Mají podobnou chemickou strukturu:
• cyklické hexadepsipeptidy skládající se ze střídajících se jednotek D-αhydroxy-isovaleryl- (2-hydroxy-3-methylbutanové kyseliny) a
aminokyselin
R1
Beauvericin fenylmethyl
Enniatin A sec-butyl
Enniatin A1 sec-butyl
Enniatin B iso-propyl
Enniatin B1 iso-propyl
37. Pivovarsko – sladařský seminář, 23. - 24. 10. 2014
R2
fenylmethyl
sec-butyl
sec-butyl
iso-propyl
iso-propyl
R3
fenylmethyl
sec-butyl
iso-propyl
iso-propyl
sec-butyl
Enniatiny a beauvericin
• působí jako ionofory, které narušují fyziologickou iontovou
rovnováhu a pH tím, že vytvoří dimerické struktury, které
přepravují monovalentní ionty přes buněčnou membránu
• enniatiny jsou popisovány jako rostlinné toxiny s antibiotickou a
insekticidní aktivitou
• beauvericin vykazuje cytotoxicitu a může způsobit apoptózu
(programovanou buněčnou smrt) a fragmentaci DNA
• jejich případná akutní ani chronická toxicita doposud nebyla
potvrzena a toxické působení těchto látek je stále předmětem
výzkumu
37. Pivovarsko – sladařský seminář, 23. - 24. 10. 2014
Sledované mykotoxiny (celkem 17):
•
•
•
•
•
•
•
Aflatoxiny B1, B2, G1, G2
Ochratoxin A
Fumonisiny B1, B2
Deoxynivalenol
Nivalenol
Zearalenon
T-2 a HT-2 toxin
• „emerging“ mykotoxiny
• Beauvericin
• Enniatiny A, A1, B, B1
37. Pivovarsko – sladařský seminář, 23. - 24. 10. 2014
Metoda stanovení:
• Extrakce - modifikovaná metoda QuEChERS
• UPLC s MS/MS detekcí
• UPLC Acquity s trojitým kvadrupólem Xevo TQ MS (Waters)
• Kolona: UPLC BEH C18 (50 mm × 2,1 mm × 1,7 μm) s předkolonou
• Mobilní fáze: A - 0,1% (v/v) kyselina mravenčí ve vodě, B - 0,1% (v/v) kyselina
mravenčí s 1mM octanem amonným v methanolu, gradientová eluce.
• Teplota kolony 40°C, průtok mobilní fáze 0,4 ml/min, nástřik 2,5 μl.
• Detekce: ESI+, MRM mód
• Sběr a vyhodnocení dat – program MassLynx.
• Metoda byla validována a ověřena pomocí izotopicky značených standardů.
Kvantifikace obsahu mykotoxinů byla provedena s využitím matricové kalibrace.
37. Pivovarsko – sladařský seminář, 23. - 24. 10. 2014
Chromatogram 17 mykotoxinů
37. Pivovarsko – sladařský seminář, 23. - 24. 10. 2014
Meze detekce a kvantifikace
Mykotoxin
µg/kg NIV DON
AF
G2
AF
G1
LOD
24
15
0,75 0,75 0,3 0,3
1,5
3,0
1,5
LOQ
80
50
2,5
5,0
10,0 5,0
2,5
AF AF
HT-2 FB1 T-2 ZON
B2 B1
1,0 1,0
OTA
FB2
Enn
B
Beauvericin
Enn
B1
Enn
A1
Enn
A
3,0
1,5
6,0
1,5
1,5
1,5
1,5
1,5
10,0
5,0
20,0
5,0
5,0
5,0
5,0
5,0
37. Pivovarsko – sladařský seminář, 23. - 24. 10. 2014
Výběr vzorků:
1. Série - 22 vzorků různých odrůd z různých lokalit v ČR
Ječmeny ze sklizně 2012, ve kterých byl metodou ELISA stanoven
DON v množství > 250 µg/kg
2. Série - kontrolní- 6 vzorků z různých lokalit v ČR
Ječmeny ze sklizně 2012, ve kterých byl metodou ELISA stanoven
DON v množství < 250 µg/kg
3. Série - 12 vzorků ječmene + 12 vzorků sladu
4 sladovnické odrůdy (Malz, Bojos, Sebastian a Xanadu) ze 3 lokalit
(Čáslav, Uherský Ostroh a Jaroměřice nad Rokytnou), tyto vzorky
byly zesladovány v mikrosladovně Sladařského ústavu v Brně.
Celkem tedy bylo analyzováno 52 vzorků ječmene a sladu.
37. Pivovarsko – sladařský seminář, 23. - 24. 10. 2014
Výskyt mykotoxinů ve zkoumaných vzorcích:
• V žádném ze zkoumaných 52 vzorků ječmene a sladu nebyl
nalezen ani jeden ze čtyř aflatoxinů, ani ochratoxin A.
• Fumonisin B1 se vyskytl v jediném vzorku ječmene z 1. série,
fumonisin B2 a zearalenon se vyskytly pouze ve 2 vzorcích.
• V každém vzorku se vyskytl alespoň jeden mykotoxin
37. Pivovarsko – sladařský seminář, 23. - 24. 10. 2014
Porovnání obsahu DON stanoveného metodou ELISA a LC/MS/MS
DON ELISA
DON MS
1000
900
800
700
600
500
400
300
200
100
Bojos
Bojos
Malz
Malz
Bojos
Bojos
Bojos
Malz
Xanadu
Blanik
8
Radegast
7
Blanik
Bojos
6
Radegast
Malz
5
Malz
Malz
1 2 3
4
Marthe
Blanik
Blanik
Bojos
Bojos
0
9 10 11
12 13 14
15 16 17
18 19
20 21
22
37. Pivovarsko – sladařský seminář, 23. - 24. 10. 2014
Spektrum mykotoxinů ve vzorcích ječmene z 1. série (DON pozitivní)
37. Pivovarsko – sladařský seminář, 23. - 24. 10. 2014
Spektrum mykotoxinů ve vzorcích ječmene z kontrolní série
(DON negativní)
37. Pivovarsko – sladařský seminář, 23. - 24. 10. 2014
Dynamika přechodu enniatinů (a beauvericinu) do sladu a piva není doposud
příliš prozkoumána
• Jen 2 publikace do roku 2014:
• Vaclavikova, M., Malachova, A., Veprikova, Z., Dzuman, Z., Zachariasova,
M., & Hajslova, J. (2013). 'Emerging' mycotoxins in cereals processing
chains: changes of enniatins during beer and bread making. Food Chemistry,
136, 750-757.
• Hu, L., Gastl, M., Linkmeyer, A., Hess, M., & Rychlik, M. (2014). Fate of
enniatins and beuavericin during the malting and brewing process
determined by stable isotope dilution assays. LWT-Food Science and
Technology, 56, 469-477
• Enniatiny do piva nepřecházejí, nebo jen velmi malé množství (0,1 – 0,2 %)
• Vysoké hladiny enniatinů byly detekovány ve sladovém květu a v mlátu
37. Pivovarsko – sladařský seminář, 23. - 24. 10. 2014
Přechod enniatinů a beauvericinu z ječmene do sladu – odrůdy Malz, Bojos,
Sebastian a Xanadu - průměrné hodnoty ze 3 lokalit (2013)
Citace: Bolechová, M., Benešová, K., Běláková, S., Čáslavský, J., Pospíchalová,
M., Mikulíková, R.: Determination of seventeen mycotoxins in barley and malt
in the Czech Republic. Food Control 47 (2015) 108 - 113
37. Pivovarsko – sladařský seminář, 23. - 24. 10. 2014
Závěr:
• Obsah enniatinů a beauvericinu ve vyrobených sladech se buď
snižoval nebo výrazně neměnil
• Pouze ve sladech vyrobených z ječmenů z lokality Uherský
Ostroh došlo k výraznému nárůstu koncentrací
• Možné vysvětlení je kontaminace mikrosporami již na poli a
produkce mykotoxinů během sladování
37. Pivovarsko – sladařský seminář, 23. - 24. 10. 2014
Poděkování:
Ing. Sylvii Bělákové, Ph. D.
Ing. Martině Bolechové – Čumové
37. Pivovarsko – sladařský seminář, 23. - 24. 10. 2014
Děkuji za pozornost
37. Pivovarsko – sladařský seminář, 23. - 24. 10. 2014