chondroitin sulfat

copyright © 2008 Farmakon Press, spol. s r.o
reprint
ročník 4 ❙ 4/2008 ❙ stránka 418–421
Hodnocení chondroitin
sulfátu v potravinových
doplňcích v České republice
Nicola Volpi, Francesca Maccari ❙
Department of Biologia Animale, Biological Chemistry Section,
University of Modena and Reggio Emilia, Itálie
❙ farmakoterapeutické postupy
Hodnocení chondroitin
sulfátu v potravinových
doplňcích v České republice
Nicola Volpi, Francesca Maccari ❙
Department of Biologia Animale, Biological Chemistry Section,
University of Modena and Reggio Emilia, Itálie
Úvod
Chondroitin sulfát (CS) je velmi komplexní polydisperzní přirozený glykosaminoglykan (GAG), vysoce heterogenní
z hlediska relativní molekulové hmotnosti, hustoty elektrického náboje, struktury a biologické a farmakologické aktivity, tvořený alternujícími sekvencemi kyseliny D-glukuronové
a odlišně sulfatovanými zbytky N-acetyl-D-galaktosaminu,
které jsou spojeny β(1→3) vazbami.1,2 Jsou známy formy
CS s odlišnými sacharidovými řetězci založenými na disacharidech. Častěji se vyskytují polymery CS chondroitin-4-sulfát, CSA, tvořený disacharidy se sulfatovanou 4-hydroxylovou skupinou, a chondroitin-6-sulfát, CSC, tvořený převážně disacharidovou jednotkou sulfatovanou v poloze 6 Nacetyl-D-galaktosaminu (obrázek 1). Třebaže známé vzorky
CS jsou složeny převážně z různých procentních podílů
těchto dvou druhů disacharidových jednotek, je také možné,
že v polysacharidových řetězcích jsou v různém procentu
zastoupeny disacharidy s různým počtem a pozicí sulfátových skupin (obrázek 1).
Evropská liga proti revmatismu – European League
Against Rheumatism – EULAR3,4 doporučuje CS v Evropě
jako SYSADOA pro léčbu artrózy (OA) kolena, kyčle
a ruky.5–7 Navíc se CS – samotný, nebo v kombinaci s glukosaminem – používá jako potravinový doplněk.7,8 To vedlo ke zvýšení jak počtu farmaceutických přípravků s obsahem CS, tak i jejich lékových forem – tablet a kaplet,
tobolek, očních roztoků a tekutých přípravků.9–11
V předchozích studiích bylo popsáno stanovení CS v surovinách a různých nutraceutických přípravcích;9–10 čistota
a kvalita těchto přípravků obecně neodpovídaly specifikacím uvedeným v označení produktů. V tomto článku popisujeme stanovení obsahu CS, jeho kvality a možného původu v několika českých vzorcích nutraceutik pomocí
stejných analytických postupů, jaké se používají pro hodnocení CS v potravinových doplňcích v USA.11
Materiál a metody
obrázek 1 Struktura jednotlivých typů chondroitinu
OR1
COOH
O
O
O
H
OH
H
H
OR3
H
H
CH2OR2
O
H
H
H
O
H
NHCOCH3
R1 = R2 = R3 = H: nesulfatovaný chondroitin
R1= SO3– a R2 = R3 = H: chondroitin-4-sulfát, CSA
R2= SO3– a R1 = R3 = H: chondroitin-6-sulfát, CSC
R2= R3 = SO3– a R1 = H: chondroitin-2,6-disulfát, CSD
R1= R2 = SO3– a R3 = H: chondroitin-4,6-disulfát, CSE
R1= R3 = SO3– a R2 = H: chondroitin-2,4-disulfát, CSB
R1= R2 = R3 = SO3–: chondroitin trisulfát
Na českém trhu byly získány různé vzorky potravinových doplňků ve formě tablet nebo tobolek obsahující CS
v různých formulacích a množstvích (tabulka 1). V těchto
analýzách byl jako standard použit referenční standard pro
CS Evropského lékopisu (EPCS), vyráběný firmou Bioiberica
(www.bioiberica.com/) a schválený Evropskou lékopisnou
komisí v roce 2004 jako chemická referenční látka (Chemical Reference Substance – CRS). Tento standard CS se vyrábí z bovinní chrupavky analyzované pomocí HPLC,12 a výrobce deklaruje obsah CS převyšující 98 %.12 Pomocí
gelové chromatografie (gel-permeation) byly připraveny
frakce CS s odlišnými hodnotami molekulové hmotnosti
v analýze HPSEC, a tyto frakce byly následně hodnoceny
pomocí analytického odstředění vysokými rychlostmi.13
Chondroitináza ABC, chondroitin ABC lyáza z Proteus vulgaris (EC 4.2.2.4), 0,5–2 jednotky/mg, a chondroitináza
ACII, chondroitin AC lyáza z Arthrobacter aurescens
(EC 4.2.2.5) byly získány od firmy Sigma. Nenasycené
418
farmakoterapeutické postupy ❙
CS/DS disacharidy (∆Di-0S: ∆UA-[1→3]-GalNAc, ∆Di-6S:
∆UA-[1→3]-GalNAc-6S, ∆Di-4S: ∆UA-[1→3]-GalNAc-4S,
∆Di-2,6diS: ∆UA-2S-[1→3]-GalNAc-6S, ∆Di-4,6diS:∆UA[1→3]-GalNAc-4S,6S, ∆Di-2,4diS: ∆UA-2S-[1→3]-GalNAc4S) byly získány od firmy Seikagaku. Agaróza s vysokým
rozlišením, schválená pro molekulární biologii, byla získána
od společnosti Sigma. Všechna další reagencia měla kvalitu
požadovanou pro analytická vyšetření.
Všechna použitá nutraceutika obsahovala různá množství dalších přísad, zejména glukosamin, kolagen, vitaminy
a/nebo MSM (tabulka 1). Analýza byla prováděna v pečlivě
připravených výchozích (pracovních) roztocích (10 mg/ml)
všech přípravků. Nebyla prováděna žádná předběžná příprava, s výjimkou odstředění (10 000 otáček/min po dobu
10 minut) k odstranění nerozpustných materiálů, pocházejících převážně z pomocných látek a solí obsažených v přípravcích, a proteolýzy k odstranění možných rušivých bílkovin. Referenční standard EPCS byl rozpuštěn ve vodě s cílem
připravit autentický roztok CS (10 mg/ml).
Analytické techniky, které byly použity při kvantitativním a kvalitativním hodnocení CS v potravinových doplňcích, již byly podrobně popsány.11 Pro kvantitativní analýzu
byla provedena elektroforéza na agarózovém gelu a byla
použita HPLC k separaci nenasycených disacharidů CS získaných působením chondroitináz ABS a ACII.11,14–17 Tyto
metody byly validovány podle průmyslových směrnic Guidance for Industry Bioanalytical Method Validation, U.S.
Department of Health and Human Services, Amerického
úřadu pro potraviny a léčiva (Food and Drug Administration
– FDA), Center for Drug Evaluation and Research (CDER)
Center for Veterinary Medicine (CVM), které byly publikovány v květnu 2001,18 se zahrnutím limitů pro specificitu, linearitu, detekci (LOD) a kvantifikaci (LOQ), a zkoušek přesnosti, správnosti, zotavení a robustnosti (viz11). Dále byla
použita HPLC disacharidů CS s cílem posoudit možný původ CS v nutraceutických přípravcích.11,12,19 Stanovení parametrů molekulové hmotnosti CS bylo provedeno pomocí
vysokoúčinné gelové chromatografie (high-performance
size-exclusion chromatography – HPSEC).11–13
Výsledky
Jako první krok byl na základě zjištění skutečné hmotnosti tablet/tobolek stanoven přesný teoretický obsah CS,
s opakováním postupu s cílem získat statistické kolísání
a vypočítat teoretický procentní podíl CS ve všech potravinových doplňcích. Deklarované procentní podíly CS byly
zjištěny od 1,5 až do 47,2.
Po separaci CS obsaženého v deseti nutraceuticích byla
provedena kvantifikace pomocí elektroforézy na agarózovém gelu, bez natrávení proteázami a při natrávení proteázami, a odstředění k odstranění nerozpustného materiálu.
Kvalitativní výsledky získané tímto analytickým přístupem
jsou uvedeny v tabulce 2.
Vzorky potravinových doplňků CS byly zpracovány přidáním chondroitináz ABC a ACII, což vedlo ve skutečnosti
ke vzniku stejných disacharidů a byla potvrzena nepřítom-
419
tabulka 1 Přehled složení a uvedeného obsahu
chondroitin sulfátu u analyzovaných vzorků
potravinových doplňků
Vzorek
A
Uvedený obsah
chondroitin sulfátu
Složení
250 mg/kapsle
Glukosamin
Kolagen
Sacharidy
B
250 mg/tableta
Glukosamin
C
25 mg/tableta
Glukosamin
MSM
Kolagen
MSM
D
200 mg/tableta
Glukosamin
E
200 mg/tableta
Glukosamin
F
67 mg/kapsle
Glukosamin
MSM
Kolagen
MSM
Vitamin C
Vitamin E
G
200 mg/tableta
Glukosamin
H
400 mg/tableta
Glukosamin
I
25 mg/tableta
Glukosamin
MSM
Kolagen
MSM
L
75 mg/tableta
Glukosamin
Kolagen
nost kyseliny iduronové a dermatan sulfátu, která byla popsána na základě elektroforézy na agarózovém gelu. Obsahový vzorec nenasycených disacharidů ve vzorcích nutraceutik s obsahem CS uvádí tabulka 2. Je tedy zřejmé, že pro
přípravu nutraceutik byl použit CS různého původu: bovinní, prasečí a z paryb (tj. ryb s chrupavčitým skeletem).11,12,19
SAX-HPLC byla použita také pro kvantitativní stanovení (tabulka 2) disacharidů konstituujících CS.11 Získané relevantní výsledky jsou víceméně shodné s výsledky získanými
elektroforézou.
Nakonec byly u omezeného počtu (pro velmi nízký obsah CS) z deseti posuzovaných vzorků nutraceutik stanoveny parametry molekulové hmotnosti, zejména MWn, MWw,
MWz, a polydisperzita (tabulka 2). Tento analytický přístup
však ukazuje na možnou přítomnost depolymerizovaného
nebo degradovaného CS. Bylo dokonce zjištěno, že hodnoty molekulové hmotnosti CS v nutraceuticích jsou podobné těmto hodnotám ve vzorcích CS purifikovaných
z prasečích nebo bovinních chrupavek a z paryb,12 což potvrzuje, že tyto polymery nebyly v průběhu přípravy potravinových doplňků degradovány.
Za zmínku stojí, že ve vzorku L byla detekcí v agarózovém gelu, analýzou disacharidů a vyšetřením HPSEC zjištěna přítomnost příbližně 2 % kyseliny hyaluronové s vysokou molekulovou hmotností.
❙ farmakoterapeutické postupy
tabulka 2 Kvalitativní výsledky obsahu jednotlivých vzorků
Parametry
Udaný obsah
chondroitin
sulfátu
Potravinové doplňky
A
B
C
D
E
F
G
H
I
L
47,2 %
16,9 %
1,5 %
12,4 %
24,1 %
12,3 %
12,3 %
30,7 %
1,6 %
6,0 %
Obsah chondroitin sulfátu
Agaróza-gel
0,12 %
0,34 %
1,54 %
0,62 %
10,20 %
4,87 %
10,12 %
28,50 %
1,36 %
0,75 %
SAX-HPLC
< 0,20 %
0,74 %
2,71 %
0,67 %
11,42 %
3,00 %
12,85 %
28,56 %
1,09 %
1,93 %
Průměr
< 0,2 %
0,9 %
2,1 %
0,9 %
10,7 %
3,9 %
11,8 %
29,1 %
1,4 %
0,8 %
Parametry molekulové hmotnosti
MWn
Nezjištěno
Nezjištěno
Nezjištěno
Nezjištěno
18 400
Nezjištěno
12 990
18 980
29 400
191 370
MWw
Nezjištěno
Nezjištěno
Nezjištěno
Nezjištěno
52 600
Nezjištěno
26 250
45 160
117 670
726 260
MWz
Nezjištěno
Nezjištěno
Nezjištěno
Nezjištěno
161 520
Nezjištěno
76 240
174 650
868 120
Nezjištěno
Disperzita
Nezjištěno
Nezjištěno
Nezjištěno
Nezjištěno
2,8577
Nezjištěno
2,0212
2,3796
4,0029
Nezjištěno
∆Di-0s
Nezjištěno
Nezjištěno
Nezjištěno
Nezjištěno Nezjištěno Nezjištěno Nezjištěno
6,9
7,4
Nezjištěno
∆Di-6s
Nezjištěno
27,1
17,7
38,0
44,5
33,0
21,8
20,9
16,0
20,3
∆Di-4s
Nezjištěno
72,9
82,3
62,0
33,0
67,0
78,2
72,2
76,6
∆Di-2,6dis
Nezjištěno
Nezjištěno
Nezjištěno
Nezjištěno
19,4
Nezjištěno Nezjištěno Nezjištěno Nezjištěno
Nezjištěno
∆Di-4,6dis
Nezjištěno
Nezjištěno
Nezjištěno
Nezjištěno
1,5
Nezjištěno Nezjištěno Nezjištěno Nezjištěno
Nezjištěno
∆Di-2,4dis
Nezjištěno
Nezjištěno
Nezjištěno
Nezjištěno
1,6
Nezjištěno Nezjištěno Nezjištěno Nezjištěno
Nezjištěno
R
Nezjištěno
1,00
1,00
1,00
1,22
1,00
1,00
0,93
0,94
1,0
Poměr 4s/6s
Nezjištěno
2,69
4,65
1,63
0,74
2,03
3,59
3,45
4,79
3,93
Původ
Nezjištěno
Hovězí/
Vepřový
Vepřový
Hovězí
Rybí
Hovězí
Vepřový
Vepřový
Vepřový
Vepřový
Disacharidy
Diskuse
V dřívější studii11 jsme kvantifikovali a popsali CS přítomný v několika nutraceutických přípravcích ve formě kaplet, tablet a tobolek distribuovaných na americkém trhu
pomocí specifické a senzitivní elektroforézy na agarózovém
gelu a HPLC analýz. Metody elektroforézy a SAX-HPLC byly
validovány a byla potvrzena jejich použitelnost při kvantifikaci CS v hotových přípravcích, a to i v přítomnosti různých
přísad a pomocných látek. Za zmínku stojí, že kvantitativní
stanovení byla provedena při použití vysoce čistého referenčního standardu CS vyhovujícího Evropskému lékopisu,
který má v podstatě stejné vlastnosti jako vzorky CS v potravinových doplňcích. Obsah CS vyráběného z bovinní
chrupavky je v tomto referenčním standardu dokonce vyšší
než 98 %.12
Obsah CS v deseti českých dietních doplňcích byl stanoven bez jakéhokoliv zpracování, nebo po proteolýze, jejímž
cílem bylo odstranit bílkoviny, které by mohly narušit stanovení obsahu CS – výsledky byly velmi podobné. Bylo zejména zjištěno, že vzorek A, deklarující 47% obsah CS, neobsahuje prakticky žádný CS, tj. méně než 0,2 %. Vzorek B
obsahoval přibližně 1 % (deklarováno 17 %), vzorek D přibližně 1 % (deklarováno 12 %), vzorek E přibližně 11 % (deklarováno 24 %), vzorek F přibližně 4 % (deklarováno 12 %)
a vzorek L přibližně 1 % (deklarováno 6 %). V tomto posledním vzorku byla nalezena asi 2 % kyseliny hyaluronové.
Vzorky C, G, H a I odpovídaly specifikacím uvedeným v ozna-
79,7
čení přípravku. To znamená, že čtyři ze zkoumaných potravinových doplňků obsahovaly přibližně 0 až 1 % CS, na rozdíl
od údajů dekladovaných v označení, které byly 47 %, 17 %,
12 % a 6 %, a dva přípravky skutečně obsahovaly 30–45 %
uváděného CS.
Obsahový vzorec disacharidů použitý k určení původu
CS a parametry molekulové hmotnosti ke zjištění nepřítomnosti degradace byly hodnoceny ve vzorcích, v nichž byl
detekován CS. Nalezený CS měl vysokou molekulovou
hmotnost, což ukazuje, že během přípravy potravinových
doplňků nedošlo k degradaci, a jeho původ byl převážně
bovinní a prasečí. Pouze jeden pocházel z paryb, v jednom
případě nebyl původ prokázán pro velmi nízký obsah CS.
CS je podobně jako další přirozené polysacharidy získáván ze zvířat extrakčními a purifikačními procesy,1,2,12 a je
známou skutečností, že jeho struktura se mění podle tkáně, orgánu a zvířecího druhu.1,2,12 To znamená, že celkový
biologický a farmakologický účinek těchto látek je ovlivňován zdrojovým materiálem, výrobními procesy, přítomností
znečišťujících látek a mnoha dalšími faktory. Na základě
těchto analytických výsledků lze říci, že kvalita (zejména obsah CS) několika českých dietních doplňků je špatná, a za
zmínku stojí, že klinické studie a účinnost CS byly hodnoceny při použití velmi čistého produktu, který měl specifické vlastnosti a fyzikálně-chemické charakteristiky požadované různými národními ústavy zdraví (NIH).1,3,4 Nejde však
zdaleka o první zprávu o kvalitě CS v potravinových doplňcích. Hodnocení kvality surovin a hotových přípravků vy-
420
farmakoterapeutické postupy ❙
znělo žalostně na korejském trhu,10 a hodnocení dvanácti
přípravků v Japonsku zjistilo velké kolísání původu CS
a obecně se neshodovalo s nároky v označení produktů
v případech, kde byly deklarovány.20 Jde o důležitý bod,
vzhledem ke známému kolísání biologických a farmakologických vlastností v závislosti na složení, absorpci po perorálním podání, parametry biologické dostupnosti a farmakokinetické parametry mohou být ovlivněny odlišnými
strukturálními charakteristikami a původem,21,22 a je zde zejména možné riziko druhově specifických nemocí. Byla dokonce formulována přísná zákonná omezení, jejichž úkolem je zajistit, že materiál získaný ze savců určený k výrobě
léků bude připraven ze zdravých savců, neboť je zde riziko
přenosu bovinní spongiformní encefalopatie (BSE), slintavky a kulhavky, šíření ptačí chřipky a dalších zvířecích nemocí. Nejsou však žádná jasně vymezená omezení pro původ
obsahových látek v nutraceuticích. Původ těchto látek v přírodních přípravcích je nejdůležitějším faktorem pro zajištění kvality, a tím bezpečnosti a účinnosti.
Literatura
1 Volpi N, ed. Chondroitin sulfate: structure, role and pharmacological activity. Amsterdam, Boston, Heidelberg, London,
New York, Oxford, Paris, San Diego, San Francisco, Singapore,
Sydney, Tokyo, Academic Press, 2006.
2 Sugahara K, Mikami T, Uyama T, et al. Recent advances in the
structural biology of chondroitin sulfate and dermatan sulfate. Curr Opin Struct Biol 2003;13:612–20.
3 Jordan KM, Arden NK, Doherty M, et al. EULAR Recommendations 2003: an evidence based approach to the management of knee osteoarthritis: Report of a Task Force of the
Standing Committee for International Clinical Studies Including Therapeutic Trials (ESCISIT). Ann Rheum Dis
2003;62:1145–55.
4 Zhang W, Moskowitz RW, Nuki G, et al. OARSI recommendations for the management of hip and knee osteoarthritis, part I:
critical appraisal of existing treatment guidelines and systematic review of current research evidence. Osteoarthritis
Cartilage 2007;15:981–1000.
5 Volpi N. The pathobiology of osteoarthritis and the rationale
for the use of chondroitin sulfate for its treatment. Curr Drug
Targets Immune Endocr Metab Disord 2004;4:119–27.
6 Volpi N. Therapeutic applications of glycosaminoglycans. Curr
Med Chem 2006;13:1799–810.
7 Sarzi-Puttini P, Cimmino MA, Scarpa R, et al. Osteoarthritis:
an overview of the disease and its treatment strategies. Semin
Arthritis Rheum 2005:35(1 Suppl 1):1–10.
421
Užívání CS jako nutraceutika je rozšířené. S rostoucím
počtem přípravků obsahujících CS je na místě požadavek
zavést přísnější a přesnější hodnocení a přísnější zákonné
požadavky na kontrolu kvality ve vztahu k výrobě produktů vysoké kvality. Regulační požadavky by navíc měly být
prosazovány ve vztahu k výrobcům, a sledovat cíl, aby tito
výrobci uváděli správně obsahové látky a jejich původ,
a měly by být zákonně prosazeny speciální a přesné analytické postupy kontroly produktů vysoké kvality, jejichž provádění by měly zajišťovat laboratoře pro kontrolu kvality,
které by potvrzovaly čistotu a nároky v označení CS v surovinách a nutraceuticích. Kvalita českých potravinových
doplňků je v současné době velmi špatná a zákazník nemá
možnost ověření obsahu a původu CS. Po dobu čekání na
přísnější právní úpravy pro kontrolu kvality důrazně doporučujeme používat místo obecných potravinových doplňků
farmaceutické přípravky schválené národním ústavem
zdraví v příslušné zemi.
8 McAlindon TE, LaValley MP, Gulin JP, et al. Glucosamine and
chondroitin for treatment of osteoarthritis: a systematic quality assessment and meta-analysis. JAMA 2000;283:1469–75.
9 Sim JS, Jun G, Toida T, et al. Quantitative analysis of chondroitin sulfate in raw materials, ophthalmic solutions, soft capsules and liquid preparations. J Chromatogr B Analyt Technol
Biomed Life Sci 2005;818:133–9.
10 Sim JS, Im AR, Cho SM, et al. Evaluation of chondroitin sulfate
in shark cartilage powder as a dietary supplement: Raw
materials and finished products. Food Chem 2007;101:532–9.
11 Volpi N, Maccari F. Quantitative and qualitative evaluation of
chondroitin sulfate in dietary supplements. Food Anal Chem
2008. In press.
12 Volpi N. Analytical aspects of pharmaceutical grade chondroitin
sulfates. J Pharm Sci 2007;96:3168–80.
13 Volpi N, Bolognani L. Glycosaminoglycans and proteins: different behaviour in size exclusion-high performance liquid chromatography. J Chromatogr 1993;630:390–6.
14 Volpi N. Disaccharide analysis and molecular mass determination to microgram level of single sulfated glycosaminoglycan
species in mixtures following agarose-gel electrophoresis.
Anal Biochem 1999;273:229–39.
15 Volpi N, Maccari F. Electrophoretic approaches to the analysis
of complex polysaccharides. J Chrom B 2006;834:1–13.
16 Volpi N, Maccari F, Titze J. Simultaneous detection of submicrogram quantities of hyaluronic acid and dermatan sulfate on
agarose-gel by sequential staining with toluidine blue and
Stains-All. J Chrom B 2005;820:131–5.
17 Volpi N, Maccari F. Detection of submicrogram quantities of
glycosaminoglycans on agarose-gels by sequential staining
with toluidine blue and Stains-All. Electrophoresis
2002;23:4060–6.
18 Biopharmaceutics Coordinating Committee in the Center for
Drug Evaluation and Research (CDER) in cooperation with the
Center for Veterinary Medicine (CVM) at the Food and Drug
Administration. Guidance for Industry, Bioanalytical Method
Validation. May 2001.
19 Volpi N. Disaccharide mapping of chondroitin sulfate of different origins by high-performance capillary electrophoresis and
high-performance liquid chromatography. Carbohydr Polym
2004;55:273–81.
20 Sakai S, Otake E, Toida T, et al. Identification of the origin of
chondroitin sulfate in “health foods”. Chem Pharm Bull (Tokyo) 2007;55:299–303.
21 Volpi N. Oral bioavailability of chondroitin sulfate (Condrosulf®) and its constituents in healthy male volunteers. Osteoarthritis Cartilage 2002;10:768–77.
22 Volpi N. Oral absorption and bioavailability of ichthyic origin
chondroitin sulfate in healthy male volunteers. Osteoarthritis
Cartilage 2003;11:433–41.