docTECHNIKY PCR PCR - polymerase chain reaction
download 
Stížnost Transkript
TECHNIKY PCR PCR - polymerase chain reaction
TECHNIKY PCR PCR - polymerase chain reaction -polymerázová řetězová reakce Přehled Molekulárně-biologický úvod, DNA struktura, replikace, DNA polymerasa Princip procesu PCR Optimalizace PCR Typy PCR Aplikace PCR a využití v praxi Komponenty nukleových kyselin Nukleotid DNA deoxyguanosid monofosfát (dGMP) http://ntri.tamuk.edu/cell/nucleic.html “Koncept párování bazí je striktně konzervativní“ Cytosine Guanine From Dr. John C. Perez, Professor and Director of the Natural Toxins Research Initiative, Texas A&M http://ntri.tamuk.edu/cell/dna.html Deoxyribosa a fosfát dávají DNA řetězci směr 5’ end jednotlivé řetězce duplexu jsou k sobě komplementární 5 HO konce dsDNA nejsou stejné 3’ end T 4 A 1 3 2 DNA rětězce duplexu mohou být denaturována a znovu spojena G C T A G C OH 3’ end 5’ end Tm (melting temperature) je teplota při které je dsDNA z poloviny denaturována Tm je závislá na: ¾ složení bazí ¾ rozpouštědle iontové síle pH ¾ délce DNA Singer, M., and P. Berg. 1991. Genes and Genomes. University Science Books, Mill Valley, CA. p. 49 DNA replikace in vivo vyžaduje několik enzymů separace řetězců syntéza krátkých RNA primerů syntéza dvou nových DNA helixů podílí se enzymy: DNA primasa helikasa DNA polymerasa DNA ligasa SSB-proteiny http://www.accessexcellence.org/AB/GG/collaboration.html Vlastnosti DNA polymerasy 1. POLYMERASOVÁ AKTIVITA Replikace probíhá vždy ve směru od 5´na 3´konec Nový nukleotid je přidáván tedy vždy na 3´OH konec. 2. 3'-5' exonukleasová aktivita -opravná funkce “proofreading” 3. 5´exonukleasová aktivita - odštěpuje RNA primer DNA replikace in vitro vyžaduje pouze jeden enzym DNA Polymerasa 1957 Arthur Kornberg dokázal existenci DNA polymerasy - DNA polymerase I in vitro polymerasa vyžaduje pouze: 4 deoxynukleotidy trifosfáty dsDNA templát primer - ssDNA nebo RNA s volnou 3'-OH Syntéza obou řetězců specifické dsDNA in vitro 5’ 3’ TTGAGAAAGGAATAAGCAGAATTCGTTCCAAAAAGAATGAGCTGTTGTTTGCAGAAATCGAGTATATGC AACTCTTTCCTTATTCGTCTTAAGCAAGGTTTTTCTTACTCGACAACAAACGTCTTTAGCTCATATACG 3’ 5’ Forward primer 5’ dNTPs 3’ TTGAGAAAGGAATAAGC DNA POL AACTCTTTCCTTATTCGTCTTAAGCAAGGTTTTTCTTACTCGACAACAAACGTCTTTAGCTCATATACG 3’ 5’ 5’ 3’ TTGAGAAAGGAATAAGCAGAATTCGTTCCAAAAAGAATGAGCTGTTGTTTGCAGAAATCGAGTATATGC AACTCTTTCCTTATTCGTCTTAAGCAAGGTTTTTCTTACTCGACAACAAACGTCTTTAGCTCATATACG 3’ 5’ Syntéza obou řetězců specifické dsDNA in vitro 5’ 3’ TTGAGAAAGGAATAAGCAGAATTCGTTCCAAAAAGAATGAGCTGTTGTTTGCAGAAATCGAGTATATGC AACTCTTTCCTTATTCGTCTTAAGCAAGGTTTTTCTTACTCGACAACAAACGTCTTTAGCTCATATACG 3’ 5’ 5’ 3’ TTGAGAAAGGAATAAGCAGAATTCGTTCCAAAAAGAATGAGCTGTTGTTTGCAGAAATCGAGTATATGC DNA POL TCTTTAGCTCATATACG 3’ 5’ Reverse primer dNTPs 5’ 3’ GCATATACTCGATTTCT 5’ 3’ TTGAGAAAGGAATAAGCAGAATTCGTTCCAAAAAGAATGAGCTGTTGTTTGCAGAAATCGAGTATATGC AACTCTTTCCTTATTCGTCTTAAGCAAGGTTTTTCTTACTCGACAACAAACGTCTTTAGCTCATATACG 3’ 5’ PCR: Co to je? Polymerase Chain Reaction: znamená amplifikace (mnohonásobná replikace) relativně krátkých úseků specifické DNA Základní nástroj molekulární biologie se vzrůstájícím významem i v dalších oborech (botanika, kriminalistika) The idea ¾ Ghobind Khorana 1971 ¾ Kary Mullis 1983 Nobelova cena 1993 poprvé provedená mnohonásobná in vitro replikace ve zkumavce Jak funguje PCR Řetězová reakce vychází z DNA replikace Spočívá v opakování cyklů denaturace (separace dsDNA), navázání primerů a elongace primerů (syntéza nového vlákna DNA) pomocí změn teploty ¾ potřeba silného enzymu (polymerasy) který je schopen pracovat při vysokých teplotách ¾ termofilní organismy objeveny začátkem 70tých let Jak funguje PCR ¾ Polymerasa izolovaná z termofilní baktérie (Thermus aquaticus, Pyrococcus furiosus) zkr. TAQ, PFU Polymerasa až s objevem a použitím TERMOSTABILNÍ POLYMERASY získala PCR na významu PCR komponenty Templátová DNA ¾ vzorek k amplifikaci Primery ¾ krátké specifické úseky DNA zaručující specifitu amplifikace dATP, dTTP, dCTP, dGTP ¾ volné stavební jednotky DNA Thermostabilní DNA polymerasa (e.g., Taq, Pfu) Pufr a soli (KCl, MgCl2) Proces PCR Velký nadbytek primeru, dNTPs a Taq POL k DNA templátu http://www.molbio.princeton.edu/courses/mol214/schedule.htm http://faculty.plattsburgh.edu/donald.slish/PCRmov.html Problémy: PCR je velmi citlivá na kontaminace Častý problém - nespecifická amplifikace ¾ Polymerasa pracuje i při nízkých teplotách (e.g., během nastavování reakce) ¾ “Hot start” PCR je řešení (protilátka proti Taq) Amplifikace je často možná i pro ne zcela známou sekvenci primerů např. DNA jiného biologického druhu ¾ “Degenerované primery” (multiple verze s různými bázemi v klíčové pozici (tryptofan + methionin): P R E T T Y F L Y CCA CGA GAA ACA ACA TAC TTC CTA TAC G G G G G T T G T prettyfly protein má kód degenerovaný na 11 pozicích C C C C C tzn. (4)(2)(4)(2)(4)(4)(2)(2)(2)(4)(2) = 65.536 krát T T T T T A T stupeň degenerace: ¾ “Touchdown PCR” s vyšší přesností v prvních cyklech Maximální velikost produktu +/-5000 bazí pro standardní PCR: Long PCR kits mohou amplifikovat až 35 kbazí Navrhování primerů Primery by měly být 20-25 bazí dlouhé Nutná znalost alespoň části sekvence amplifikované DNA 3’ konec primeru je důležitý: vhodné aby zde byla G nebo C báze Procentuální zastoupení G + C by mělo být 50-60% - ovlivňuje Tm (teplota kdy se váže primer na templát) Primery v jedné reakci by měli mít srovnatelné Tm Vyvarovat se repetitivním sekvencím Tm = (G+C)x4 + (A+T)x2 Vyvarovat se komplementaritě uvnitř či mezi primery degenerované primery max. 20 bp ideální do degenerace 250x Navrhování primerů Příklad navržení primerů: Konvence: DNA se vždy zapisuje ve směru od 5´ku 3´konci Cílová sekvence: (priming místo podtrženo): 5’TATAAGCCATAACGATATTGCTGAGTCAAGTCCACATATC ATATGGATGAGAAATGCTTGTGGAGCTGATGTTGATTTGG AGAGACTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTC AAACCAGTTAAAGAGTGTGCCAGTAGAG 3’ Forward Primer: 5’ATG GAT GAG AAA TGC TTG TG3’ Reverse Primer: 5’ACT GGC ACA CTC TTT AAC TGG3’ Praktické provedení PCR objem v mikrozkumavce: 25-100 ųL složení: • Templátová DNA 1-1000ng • Primery 10 -20 pmols • 10mM Tris-CL pH 9.0, 50 mM KCl • MgCl2 0.5 -3.0 mM • 50 ųM každého nukleotidu dATP, dGTP, dTTP, dCTP • 2 jednotky Taq polymerasy Praktické provedení PCR Počáteční denaturace 94oC 3-5 min denaturace 94oC 30 sec annealing ~55oC 30 sec prodlužování 72oC 1min/kilobáze počet cyklů 25-35 x Praktické provedení PCR agarozová elektroforéza Praktické provedení PCR PCR se provádí v termocyklerech kovový blok z ušlechtilého kovu snadné programování vyhřívané víko PCR Optimalizace Složka Nízká specificita Vysoká specificita AnnealingTeplota - Tm MgCl2 KCl Enzym, Primer pH Formamid látky ovlivňující kvalitu PCR: formamid, DMSO, betain atd. Nespecifická amplifikace nespecificky Základní typy PCR RT PCR (reverse transcriptase PCR) vlastní PCR předchází syntéza cDNA z mRNA pomocí RT jako primer slouží GSP (gene specific primer) oligo dT random hexamer primer hledání nových genů tvorba cDNA knihoven hledání mutací zjišťování síly exprese různých genů RACE PCR (rapid amplification of cDNA ends) vychází z RT-PCR používá se k hledání celé sekvence nového genu nutná alespoň částečná znalost sekvence hledaného genu vhodné pro klonování genů a jeho následnou funkční expresi (GMO) inverzní PCR Amplifikace neznámých segmentů DNA asymetrická PCR sekvenace DNA, příprava hybridizačních sond amplifikuje pouze jeden řetězec dsDNA SEKVENCOVÁNÍ DNA automatické sekvenátory využívající asymetrické PCR •jednozkumavková reakce •PCR s jedním primerem a dideoxyribonukleotidy (ddATP, ddGTP, ddCTP, ddTTP) •dideoxyribonukleotidy značené 4 fluorescenčními markery •velice citlivé elektroforetické rozdělení v kapiláře •fluorometr s automatickým vyhodnocením multiplex PCR více amplifikací v jedné zkumavce lékařská diagnostika nested PCR 2 po sobě jdoucí PCR zvyšování specificity PCR LA-PCR (long and accurate) amplifikace dlouhých úseků, polymerasové kokteily – např. Taq + Pfu polymerasa (180:1) Pwo polymerasa z Pyroccocus woesei DeepVent® polymerasa z Termococcus litoralis (hlubokomořská baktérie) DNA polymeráza Taq Pfu Pwo DeepVent® long PCR koktejl 5´-3´exonukleázová 3´-5´exonukleázová aktivita aktivita + + + + + + délka produktu 3 kb 3 kb 3 kb 12 kb 20 kb frekvence chyby 10-4 1.3 x 10-6 3.3 x 10-6 3.0 x 10-5 2.0 x 10-6 PROCESIVITA: jak dlouho se enzym udrží na vlákně STABILITA: kolik minut při denaturační teplotě např Taq 9 min při 97.5 °C Pwo 2 hod při 100 °C DeepVent® 8hod při 100 °C in situ RT PCR lokalizace translace a exprese genů real time PCR slouží k přesné kvantifikaci amplifikovaného produktu využití fluorescence interkalačních barviv (etBr) fluorimetr je součástí termocykleru http://pathology2.jhu.edu/MOLEC/techniques main.cfm## Využití REAL TIME PCR pro detekci jednobodové mutace (lékařská diagnostika) Aplikace PCR a využití v praxi Aplikace PCR a využití v praxi DIAGNOSTIKA V MEDICÍNĚ 1. detekce virových a bakteriálních onemocnění Aplikace PCR a využití v praxi DIAGNOSTIKA V MEDICÍNĚ 2. detekce geneticky vrozených chorob (mutace DNA) - AS PCR alelicky specifická PCR primer navržen tak, že mutace odpovídá konci primeru fragmenty DNA s nespárovanými konci se pohybují v elektrickém poli pomaleji - Real time PCR pomocí fluorescenční sondy odpovídající mutaci Např. detekce cystické fibrózy, choroba je podmíněná třínukleotidovou delecí v genu CFTR cystic fibrosis transmembrane regulator Aplikace PCR a využití v praxi KRIMINALISTIKA VNRT – variable number of tandem repeat – vyskytují se na různých lokusech chromozomů a v populací kolísají mezi jedinci v počtu opakování mezi 4-40x např. GTGTGTGT Aplikace PCR a využití v praxi ANALÝZA POTRAVIN molekulárně-genetické zhodnocení surovin živočišného a rostlinného původu, které byly vyprodukovány klasickým pěstováním (chovem) nebo s použitím genového inženýrství průkaz falšování potravin druhovou záměnou (rostlinného i živočišného původu) identifikace mikroorganismů kontaminující potraviny nebo geneticky změněných mikroorganismů používaných jako startovací nebo ochranné kultury v produkci potravin. EVOLUČNÍ BIOLOGIE ORNITOLOGIE skot ovce prase koza TEST
Podobné dokumenty
TECHNIKY PCR PCR - polymerase chain reaction
TTGAGAAAGGAATAAGC DNA POL
AACTCTTTCCTTATTCGTCTTAAGCAAGGTTTTTCTTACTCGACAACAAACGTCTTTAGCTCATATACG
Viz
Vývojová biologie (developmental biology) je poměrně novým syntetickým oborem,
pokud se týká tradice termínu a jeho zařazení mezi ostatními biologickými disciplínami.
Vývojem máme na mysli ontogene...
Návod k použití - BAG Health Care GmbH
biologické laboratoři a s typizací krevních skupin. Současné poznatky z transfuzní medicíny a určování krevních
skupin stejně jako transfuzní anamnézy musí být brány v potaz, aby se snížilo možné r...