Využití afinitních interakcí při purifikaci makromolekul

Využití afinitních interakcí při purifikaci makromolekul

Využití afinitních interakcí při separaci makromolekul
komplex bílkovina-ligand
specifický
stabilní
reverzibilní
Interakce mezi DNA a endonukleasou
základní typy interakcí
(iontová,hydrofilní a hydrofobní)
+
prostorové uspořádání
(3D struktura aktivního centra)
Elektrostatické interakce
CH2
NH3+
-OOC
CH2
F = 1/d2
F … přitažlivá síla
d … vzdálenost
Polární interakce
NH
CH2
O
H
O C
CH
Hydrofobní interakce
Využití afinitní interakce
• afinitní chromatografie
• afinitní srážení
• afinitní elektroforesa
• afinitní rozdělování
studium aktivního místa enzymu, modifikace, kinetická měření atd.
Afinitní chromatografie
Ideální nosič (matrice)
¾Neměl by interagovat s proteiny (separovanou látkou)
¾Velké množství funkčních skupin (připojení ligandu)
¾Mechanická a chemická stálost
¾Volná, pórovitá struktura
¾Částice stejnorodé, kulového tvaru s dobrými průtokovými vlastnostmi
celulosa
Celulosa je lineární polymer D-glukosových zbytků (až 15000)
spojených β(1,4)- glykosidovými vazbami.
Vláknitý, nestejnorodý charakter
Mikroheterogenita ( uspořádané x neuspořádané oblasti)
dextran
CH2
O
OH
OH
CH2
O
O
O
CH2
OH
CHOH
OH
O
OH
CH2
O
OH
OH
O
O CH2
Málo pórovitý
O
stabilita
0,2 M NaOH (60 oC)
0,02 M HCl
40 min 110 oC
polyakrylamid
NH2
NH2
C O
C O
CH CH2
CH2 CH CH2 CH CH2 CH
C O
C O
NH
NH2
CH2
akrylamid
CH CH2
NH
C O
C O
NH
CH2 CH CH2 CH CH2 CH
CH2
C O
C O
NH
NH
NH2
C O
CH2
CH CH2
N,N’-methylen-bis(akrylamid)
Změny objemu náplně sloupců změnou iontové síly
agarosa
OH
O
CH2OH
O
OH
O
O
CH2
O
O
n
D-galaktosa
3,6-anhydrogalaktosa
Vyšší teploty (nad 40 oC) a vysoké koncentrace látek
rušících vodíkové můstky (močovina, guanidin)
gel „taje“
spheron
CH2
CH3
CH2
CH3
CH2
CH2
C CO O CH2 CH2OH CH3 C CO O CH2 CH2OH
CH2
CH3
CH2
C CO O CH2 CH2OH CH3 C CO O CH2 CH2OH
CH2
CH3
C CO O CH2 CH2 O CO C CH3
etylendimetakrylát
C CO O CH2 CH2 O CO C CH3
CH2
CH3
CH2
CH2
CH3
CH2
hydroxyetylmetakrylát
C CO O CH2 CH2 O CO C CH3
částečně hydrofobní charakter
C CO O CH2 CH2OH
Velikost částic
5 – 100 µm
Velikost pórů
25 – 50 nm
Povrch
40 – 200 m2/g
Nosiče na bázi SiO2
Merckogel ( velikost částic 0,4 – 0,063 mm)
Silasorb (LACHEMA)
Merckogel Si (Merck)
vodní sklo
velikost
póru
m2/g
exkluzní
limit (D)
15 nm
150
50 000
50 nm
50
400 000
100 nm
15
1 000 000
(COOH)2
mlýn
síta
upravení povrchu (~ 2% NH4F)
Oddalující článek (ramínko)
přiklady
NH2
CH2
NH2
CH2
NH2
CH2
NH2
CH2
n
n
3
3
NH2
COOH
NH
NH
hydrofilnější články
Gly-Gly-Gly
Gly-Gly-Tyr
Gly-Gly-Cys
n = 4 - 12
CH2
CH2
3
3
NH2
NH CO CH2 CH2 COOH
4 a méně sterické zábrany
8 a více zvlnění „zapletení“ ramínek s ligandy
nespecifické (hydrofobní interakce)
nebezpečí denaturace
Ligand
Substrát
analog substrátu
allosterický efektor
kofaktor
inhibitor
analog inhibitoru
Nukleová kyselina
nukleotid
t-RNA
Protilátka
antigen
Protein
inhibitory proteas
enzymy
Hydrofobní ligandy
Chromofory
1. příklad
CH3
CH3
CH OH
+
+
C O
NAD
COOH
NH2
C O
+
NADH
COOH
oxamát – akompetitivní inhibitor
AC pomocí ternárních komplexů
COOH
až po nasycení NAD+
studium mechanismu reakce
(uspořádaný x náhodný)
AMP, NAD+, NADH
stabilita ligandů
laktát, pyruvát
imobilizace malých molekul
2. příklad
využití AC při separaci proteas
1. navázání bílkoviny
hemoglobin – sepharose
albumin - sepharose
2. využití přirozených inhibitorů
ovomukoid x trypsin
STI x karboxypeptidasy
trypsin
chymotrypsin
3. cílený výběr proteinů nebo peptidů s aminokyselinovou sekvencí
odpovídající specifitě dané proteasy
Chemie afinitní chromatografie
Bromkyanová metoda
OH
OH
BrCN
O C N
O
OH
O
kyanát
P NH2
C NH
NH
O C NH
P
OH
imidokarbonát
O
O
C N
P
aktivace: 20 ml agarosy
20 ml dest. vody
2-5 g BrCN
pH 11 (autotitrátor)
T
20 oC
doba aktivace 8 – 12 min
další postup:
aktivovaný gel se promyje (1 -5 l 0,1 mol/l NaHCO3)
ekvilibrace na pH následné reakce (0,1 mol/l NaHCO3)
přidá se ligand
míchání 16 – 20 hod
promytí sorbentu velkým objemem vody a 2 mol/l NaCl
karbodiimídová metoda
R1
O
C
N
O
pH 4-5
OH
NH
C
C
O
N
R1
P
SH
O
P NH2
C
C
NH
N
R2
R2
R1
N
C O
N
CH3CH2
N C N
( CH2) 3
N
CH3
CH3
1-etyl-3-(3-dimetylaminopropyl) karbodiimíd
R2
P
aldehydová metoda
-
O
O
OH
O
J O4
O
O
O
CHO
CHO
OH
P NH2
O
O
O
OH
„schiffova base“
OH
N
P
NaBH4
podmínky: 0,1 mol/l jodistan, aktivace 24 hod
použití:
aktivace nosičů na bázi sacharidů
nebo aktivace glykoproteinů
O
O
O
N
P
stálejší alkylamid
odstranění možnosti další vazby
epoxidová metoda
OH
Cl
CH2 CH
CH2
O
CH2
CH
O
O
O
CH2
CH
OH
podmínky:
zvýšená teplota
silně alkalické prostředí
CH2
CH2 NH P
silanizace
O CH2CH3
O
O
Si OH
O
CH3CH2
O
Si
O
( CH2) 3 NH2
metanol
24 oC
O
Si
O
O CH2CH3
γ-aminopropyl trietoxysilan
O CH2CH3
O
O
Si
O
( CH2) 3 NH2
O CH2CH3
Průběh chromatografické separace
1.
2.
3.
4.
příprava sorbentu (viz. výše)
naplnění sorbentu do kolony
příprava vzorku a ekvilibrace kolony
eluce a jímání separovaných proteinů
Imobilizovaná reaktivní barviva
z chemického hlediska čtyři druhy:
1. dichlortriaziny (studená barviva)
chromofor
N
H
N
N
Cl
N
Cl
2. monochlortriaziny (horká barviva)
chromofor
N
H
N
N
Cl
N
NHR
3. sulfoetery
chromofor
4. trichlorpyrimidiny
SO2CH2CH2OSO3H
chromofor
N
Cl
N
H
N
Cl
Cl
historie:
50-léta barvivo
68. značka pro GPC
71. první imobilizované barvivo
O
NH2
O
SO3H
NH2
SO3H
Cl
O
NH
NH
N
N
N
SO3H
Cl
SO3H
O
NH
NH
SO3H
Cibacronová modř
Procionová modř
HO3S
HO3S
SO3H
N
N
N
N
OH
NH
N
N
Cl
SO3H
HO
NH
HO3S
NH
N
NH
N
NH
N
N
Cl
Procionová červeň
SO3H
N
N
N
Cl
Imunoafinitní chromatografie
antigen
(protilátka)
+
protilátka
(antigen)
problémy:
1. při navázání příliš velkého množství ligandu (protilátky popř. antigenu)
můžou vznikat problémy při eluci (nemůže dojít ke konformačním změnám)
2. pozměnění vazebného místa pro antigen (protilátku) při imobilizaci na matrici
lze řešit vhodnou imobilizační technikou
nebo imobilizací komplexu antigen-protilátka
3. disociace adsorbované látky může být velmi obtížná
eluce často za „drastických“ podmínek
Orientovaná imobilizace
Orientovaná imobilizace
eluce
1. specifická desorpce (nadbytkem haptenu)
2. nespecifická desorpce
a) změna pH
b) snížení hydrofobních interakcí
c) denaturační činidla
d) chaotropní ionty
typické eluční fáze:
glycin/HCl pH 2,5
fosfát/citrát pH 2,8
1 M kys. propionová
50% etylénglykol
8 M močovina
4,5 M MgCl2 pH 7,0
SCN-, I-
hydrofobní afinitní chromatografie
hydrofobní ligand
+
imunoglobuliny
ovalbumin
BSA
β−laktoglobulin
hydrofobní x iontové interakce
1. nosič: imobilizovaný 4-fenylbutylamin (PBA)
izolovaný protein: α-chymotrypsin
eluce: 50% etylénglykol
NH CH2
2. nosič: imobilizovaný 4-aminobutan
izolovaný protein: glykogenfosforylasa b
eluce: deformující tlumivé roztoky
NH CH2
3. nosič: imobilizovaný N-(3-karboxypropionyl) aminodecyl
izolovaný protein: BSA
eluce: 0,5 M NaCl
1,5% SDS
10 % butanol
CH2
4
4
NH2
NH CH2 COO
10
2
-
Kovalentní afinitní chromatografie
1. příklad: imobilizovaný p-chlormerkuribenzoát
NHCO
..... Hg
HgCl
S
+
HS
protein
eluce nadbytkem cysteinu nebo HgCl2
2. příklad: aktivace dipyridyldisulfidem
S
+
SH
S
N
N
ekvilibrace nosiče
S
S
HS
S
N
N
N
H
HS
S
S
protein
protein
eluce nadbytkem SH-látky
SH
+
HS
protein
ligand: 2-amino- p-nitrofenylmethylfosfonát
O
NH CH2 CH2 O
P
NO 2
+
Enzym
CH3
enzym: acetylcholinesterasa
nanášení vzorku
O
NH CH2 CH2 O
P
Enzym
+
2PAM
CH3
eluční činidlo: 2-(hydroxyiminomethyl)-1-methylpyridinium jodid
eluce (min. 16 hod)
O
NH CH2 CH2 O
P
CH3
2PAM
+
Enzym
Chelatační afinitní chromatografie
Zn2+ < Cu2+ > Ni2+ > Co2+ > Fe2+ > Mn2+ > Mg2+
Chelatační sorbent
kovový ion
N-(2-pyridylmethyl) glycin
Tris (karboxymethyl) ethylendiamin
Karboxymethyl aspartát
Iminodiacetát
separovaná látka
aminokyseliny, peptidy a proteiny
s His, COO- zbytkem
O
N
O
-
OH2
N
OH2
O
O
N
N
2+
Cu
2+
Cu
O
OH2
O
O
-
O
OH2
N-(2-pyridylmethyl) glycin
Tris(karboxymethyl) ethylendiamin
O
O
O
-
O
N
OH2
OH2
N
2+
2+
Cu
O
-
Cu
OH2
O
O
O
-
O
OH2
O
Karboxymethyl aspartát
Iminodiacetát
OH2
Komplexy s chelatačně vázaným kovovým iontem
HN
O
O
-
N
NH
n+
Me
Me
O
NH
NH
n+
O
NH
R
O
R
O
komplex peptidu s COO- zbytkem
komplex peptidu s His zbytkem
OH2
n+
Me
NH2
O
-
komplex aminokyseliny
R
O
provedení
1. imobilizace kovového iontu
2. navázaní separované látky
ekvilibrace pufrem se zvýšenou iontovou silou
3. eluce
a) snížení pH
b) kompetitivní ligand (histidin, imidazol)
c) kovový iont
sorbent: iminodiacetát-Sepharosa nasycená příslušným kovovým iontem
pufry: 0.2 mol/l NaAc + 0.5 mol/l NaCl pH 7.0, 6.0, 5.0, 4,0
vzorek: hrachový homogenát
sledovaný protein: diaminoxidasa (šipka)
™ purifikace rekombinantních proteinů pomocí His tagu
™ refolding
ekvilibrace kolony:
promývání:
refolding:
purifikace:
20 mM TRIS, 0,5 M NaCl, 5mM imidazol, 6 M urea, pH 8,0
20 mM TRIS, 0,5 M NaCl, 20 mM imidazol, 6 M urea, pH 8,0
lin. gradient močoviny z 6 M na 0 M při průtoku 0,1 až 1 ml/min
20 mM TRIS, 0,5 M NaCl, 20 mM imidazol, pH 8,0
lineární gradient imidazolu do 0,5 M
výhody
-využití nosiče pro imobilizaci různých kovových iontů
-vysoká odolnost nosiče vůči bakteriální kontaminaci
-vysoká vacebná kapacitapro bílkoviny (0,1 – 10 µM/ml gelu)
-možnost HP-IMAC a tandemové chromatografie
nevýhody
-možnost nespecifických (iontových) interakcí
-možnost uvolňování kovových iontů ze sorbentu
Boronátová afinitní chromatografie
B
+
OH
2 H2O
B
OH
OH
B
HO
+
O
R2
B
HO
OH
R3
R4
H3O
+
OH
R1
OH
OH
+
OH
R1
OH
R2
O
R3
R4
R1
HO
B
OH
OH
O
R2
R2
B
HO
R3
O
R4
R1
R3
R4
O
B
R1
OH
R2
O
R3
R4
OH
NH
B
OH
OH
+
bílkovina
bílkovina
NH
NH
HO
H
HO
HO
CH2
C H
C OH
C H
C H
CH2OH
NH
B
OH
ekvilibrace: 250mmol/l acetát amonný + 50 mmol/l MgCl2
pH 8,0
eluce:
100 mmol/l TRIS + 200 mmol/l sorbitol
CH2
HO C H
H C OH
O C H
O
C H
CH2OH
L (ligand)
NAD+,NADP+
dehydrogenasy
ATP, AMP
dehydrogenasy
kinasy
Afinitní srážení (afinitní precipitace)
O
1."semi" afinitní precipitace
O
F S
O
NH2
H
N
C O C H
N3
N
N
N
O
H
OH
OH
5-p-(fluorosulfonyl) benzoyl-8-azidoadenosin
2. precipitace dehydrogenas a kinas
a/ bis NAD [N2-adipodihydrazido-bis (N6-carbonylmethyl-NAD)]
b/ bis Cibacron blue
3. precipitace využívající interakce "kov-protein"
O
C CH2
H H
H H
N C C O C C N
H H
H H
H O C CH
n
2
O
H O
CH2
CH2
O
C
O H
C
O H
O
Afinitní elektroforéza
gel bez afinitního ligandu
gel s ligandem
x'
x
-metoda vhodná pro kvantitativní studium interakce mezi proteinem a imobilizovaným
popř. volným ligandem
-získané disociační konstanty komplexu protein - ligand jsou srovnatelné s hodnotami
získanými kinetickým měřením
gel bez ligandu
gel s koncentrací ligandu L
Stanovení disociační konstanty
x'
x
3
x-vzdálenost, kterou protein urazí v
gelu bez ligandu
x'-vzdálenost, kterou protein urazí za
stejnou dobu v gelu o koncentraci
ligandu L
K-disociační konstanta komplexu
protein volný ligand
1/x-x'
2
1
-1/K
0
-0,2
0,3
6
1/L (10 l/mol)
0,8
Fázové separace
rozdělení směsi proteinů mezi dvě fáze
(nejčastěji dextran 500000 x PEG 8000)
využití: 1. dělení podle ligandu
2. dělení celých buněk
afinitní rozdělování
Postup:
1. příprava zásobních roztoků
(20% dextran, 40% PEG, 0,1 M fosfátový pufr, fáze s ligandem)
2. namíchání fází (nejčastěji 2g)
3. přidání vzorku
4. promíchání na třepačce ( cca. 5 min)
5. centrifugace (urychlení rozdělení fází) 2000g 2 min
6. odebrání frakcí a proměření aktivity
Fázový diagram PEG8000/Dx500
10
PEG
(% w/w) 5
0
0
5
10
Dextran (% w/w)
15
20
Fázový diagram PEG8000/Dx500
Vliv teploty
10
PEG
(% w/w) 5
0
0
5
10
Dextran (% w/w)
15
20
Fázový diagram PEG8000/Dx500
Vliv iontové síly
10
PEG
(% w/w) 5
0
0
5
10
Dextran (% w/w)
15
20