textová verze přednášky

MUDr. Tomáš Stopka PhD.
Abstrakt:
Závažná lidská onemocnění jsou modelována na organizmální úrovni pro zjištění
patofyziologického podkladu onemocnění a přípravu takových léčiv, jež ovlivňují primární
patogenetické momenty onemocnění. Myš a člověk sdílejí významnou homologii stavebních
látek a biologických mechanismů, a proto modelování v myši je prioritou pro studium
genetických a epigenetických mechanismů onemocnění. Gen-inaktivační „knockout“ (1) a
transgenní (2) experimenty v myši patří mezi základní přístupy spočívající v prvém případě
v produkci geneticky manipulovaných embryonálních kmenových (ES) buněk, jež jsou
vstřikovány do embrya ve stadiu blastocysty. Genová manipulace ES buněk využívá principu
homologní rekombinace. V druhém případě jsou transgenní DNA konstrukty přímo
vstřikovány do pronukleu fertilizovaného vajíčka. Další moderní přístupy genové manipulace
v myši, především kondiciální a tkáňově specifická aktivace transgenů, kondiciální genová
inaktivace „conditional knockout“ a genově podmíněná inzerce transgenu „knock in“, budou
také představeny.
Body přednášky/klíčová slova:
1. experimentální design pro studium lidských onemocnění myšími modely.
2. genová inaktivace (knockout) v myši
a. příprava DNA konstruktů
b. „gene targeting“ v ES buňkách
c. injekce ES buněk do blastocysty, mikromanipulace
d. zpětné křížení, analýza fenotypu v myši
e. aktivace kondiciální inaktivace, indukovaná Cre-rekombinace
3. transgenní zvýšená exprese
a. příprava DNA konstruktů
b. pronukleární injekce DNA
4. příprava genově podmíněné inzerce „knock in“
a. příprava DNA konstruktů
b. „Tag and exchange strategy“
c. kondiciální aktivace transgenů
5. Shrnutí a pohled do budoucna
a. současně využívané modely, příklady
b. strategie „high throughput“ v přípravě myších modelů
Závažná lidská onemocnění jsou modelována na organizmální úrovni pro zjištění
patofyziologického podkladu onemocnění a přípravu takových léčiv, jež ovlivňují primární
patogenetické momenty onemocnění. Molekulární techniky nám v této době umožňují
uskutečňovat v zásadě jakékoli genetické modifikace v myši. Rozličné genetické modifikace
mohou být nejen uskutečněny, ale mohou být zapnuty a regulovány z časového hlediska
vzniku a tkáňově specifické exprese dané mutace a z hlediska množství mutovaného
produktu. Velmi potřebným se ukázal Cre/lox systém izolovaný z bakteriofága P1, jež je
schopen rozpoznat savcům-neznáme sekvence označované jako loxP a vyštěpit je pomocí
enzymu označovaného jako Cre rekombináza. Cre/lox systém umožňuje přesné změny DNA
a tím i vytvoření genetických myších modelů tolik potřebných pro pochopení biologie
člověka a jeho onemocnění.
Lidská onemocnění jsou způsobena nebo asociována s dysregulací expresního
programu buňky. Expresní program buňky je uskutečněn souhrou genetického a
epigenetického aparátu a jejím základním prvkem je schopnost reagovat na změnu kontextu
vnitřního a vnějšího prostředí. Genetický aparát buňky tvoří sekvence DNA, jež byla
identifikována a rozpoznána, jako tzv. „DA kód“ před takřka půl stoletím. DNA je zabalena
v buněčném jádře společně s histonovými proteiny ve struktuře označované jako chromatin
(Richmond and Davey, 2003). Intenzivní studie chromatinu ukázaly rozličné posttranslační
modifikace histonových proteinů a DNA a jejich postupné zkoumání vedlo k identifikaci
funkčních vztahů s těmito modifikacemi, jež začaly být označovány jako tzv. „histonový
kód“. Epigenetický aparát buňky tj. histonový kód (Jenuwein and Allis, 2001) a vzorec
metylace DNA spoluurčují většinu transakcí s DNA a tím ovlivňují expresivitu genetického
programu buňky (načasování a úroveň transkripce, replikační parametry, genovou opravu aj.).
Modelování genetických změn umožňuje mimikovat onemocnění manipulováním sekvence
DNA.
Lidská onemocnění lze modelovat rozličným způsobem (Wasserman, 1993).
Nejběžnějším způsob je testování určité v populaci se vyskytující mutace DNA a jejího vlivu
na zdravotní stav či vývojové parametry myši (cílená mutageneza). V případě, že nedochází
k rozpoznatelným efektům mutace na fenotyp v myši, lze předpokládat kompenzační
mechanismy, jež se často projevují například zvýšením exprese zastupujícího strukturně
podobného proteinu či snížení inhibičních mechanismů funkce mutovaného genu, popřípadě
zapnutím paralelních (často i redundantních) a ne vždy zcela stejně fungujících biologických
dráh. Molekulární pochody, jež jsou asociovány s kompenzačními mechanismy se označují
jako molekulární fenotyp. Mutace lze vytvářet cíleně a sledovat jejich fenotypy nebo lze
mutace vytvářet náhodně ve velkém množství, následně vyhledávat klony organizmů podle
fenotypu a zpětně dohledat o jakou mutaci DNA se jedná, proces obecně označovaný jako
náhodná mutageneza.
Cílená mutageneza může ovlivnit kódující sekvenci DNA (bodová mutace, delece či
přidání exonu, přidání exonů jiného genu aj.). Další možnosti mutagenezy jsou ty, jež vedou
ke genetické dysregulaci exprese např. mutací regulačních oblasti daného genu či delecí
vazebného místa pro určitý specifický transkripční faktor. V zásadě lze cílené mutace rozdělit
na ty, jež vedou k mutaci genu a ty jež ovlivní dávku exprese genu. První případ obsahuje
buď genovou inaktivaci (gene knockout, k.o.) či změnu genetické funkce vložením mutované
sekvence do daného genu (gene knock-in). Ve případě změny dávky genu postupujeme
metodou genového transgenu.
Knockout genu je možno provést buď úplný (nulová alela) nebo částečný, ve kterém
dojde k expresi mRNA, jež kóduje část původní kódující sekvence a jež má částečný efekt
(pozitivní či negativní). Pro design knockoutového modelu je důležité mít kompletní
informaci o struktuře kódující sekvence, rozložení funkčních domén, specificitě tkáňové
exprese a obsahu rozličných transkripčních variant. Genová inaktivace je uskutečněna
mechanismem homologní rekombinace (výměnou mezi genomickou DNA a konstruktem
DNA) v oblasti homologie úseků DNA a pod tlakem selekčních antibiotik. Pravděpodobnost
homologní rekombinace je závislá na struktuře DNA a pravděpodobně i na epigenetických
parametrech dané oblasti genomu.
Genová inaktivace se uskutečňuje ve třech krocích a obsahuje: 1. DA konstrukt pro
homologní rekombinaci, 2. homologní rekombinaci v embryonálních kmenových (ES)
buňkách a 3. vpravení ES buněk do embrya s následným vykřížením myšího klonu
s genetickou manipulací (GMO) (Hogan, 1994). Základem DNA konstruktu na genový
knockout je sekvence DNA, jež musí být totožná s kmenem z něhož pocházejí ES buňky
(nejčastěji kmen 129Sv). Homologní úseky DNA konstruktu jsou umístěny 5´ (proximální
rameno) a 3´ (distální rameno) od vytvořené mutace, jež je často blízko lokace selekčního
genu pro rezistenci na určitý typ antibiotika (gen rezistence na neomycin, NeoR). NeoR
zajišťuje pozitivní selekci klonů, jež obsahují plně integrovaný DNA kontsrukt v genomu ES
buněk. 3´od distálního ramene homologie se často umísťuje gen tymidin kinása, jež umožňuje
negativní selekci klonů s integrací DNA konstruktu mimo oblast homologie. V případě
kondiciálního inaktivačního modelu se nacházejí v konstruktu prvky Cre/lox systému. 5´a
3´od vybraného exonu jsou umístěna loxP místa, tj. oblasti, kde dojde po aktivaci Cre
Recombinásy k excizi a dle orientace loxP míst buď k deleci či inverzi daného exonu/ů.
Manipulace ES buněk mechanismem DNA transfekce k.o. konstruktu je podmínkou
, tj. vytvoření geneticky manipulované alely pro následnou
inaktivaci. Předpokládá se, že tato kondiciálně deletovatelná alela je normálně exprimovaná a
nepřispívá k fenotypu. Teprve po zapojení Cre/lox systému dojde k jejímu funkčnímu
projevu. V opačném případě je daný model považován jako tzv. hypomorfní systém (alela) se
sníženou expresí genu. Nutno ještě připomenout některé informace k ES buňkám, ve kterých
ke genetické manipulaci dochází. Jsou to časné pluripotentní buňky, jež jsou izolovány cca
den E3,5 z myších blastocyst před intrauterinní implantací a jež si udržují svoji kmenovost
pomocí definovaných složek (cytokin leukemia inhibitory factor – 1) a nedefinovaných složek
obsažených ve fetálním telecím séru (součást kultivačního média). Manipulace v ES buňkách
způsobí genetickou změnu v určitém lokusu, jež vyžaduje plnou charakterizaci
(genotypování) ve smyslu ověření proběhlé homologní rekombinace pomocí DNA sond na
5´a 3´konci.
Třetím stadiem ve tvorbě knockout myší je injekce ES buněk do blastocélu časného
embrya den E3,5 a následně operativní inzerce manipulovaného embrya do děložných rohů
pseudopregnantní myši (Stopka and Skoultchi, 2003). Po cca 21 dnech březosti dojde k vrhu,
jež by měl být vytvořen z původně manipulovaných blastocyst. Procento buněk derivovaných
z ES buněk je označováno jako procento chimérismu. Nejlépe se stanoví posouzením
zbarvení srsti, jelikož ES buňky pocházejí ze žlutě zbarvených myší (Agouti) a donorové
blastocysty z černých myší (C57Black6), (pozn.: akceptorové myši neposkytují blastocysty).
Maximální procento chimérismu v samčích gametách je požadováno pro přenesení mutantní
alely po zpětném křížení s C57Black6. V případě, že při prvním zpětném křížení chimérické
myši s myší C57Bl6 obdržíme fenotyp Agouti, považujeme tyto myši za plně odvozené z ES
buněk (germ line transmission). U těchto zvířat předpokládáme 50% nosičů mutované alely a
50% divokých forem (wild type).
Vytvoření knockout myší s kondiciálně deletovatelnou alelou znamená první krok
před počátkem studia daného modelu. Předně, je nutné tyto myši vzájemně křížit pro
vytvoření dvojitě manipulovaného lokusu kondiciální inaktivace a dále jej křížit s Crerekombinázu-exprimujícími jedinci, aby došlo k mutaci (deleci) genu. Ta je podmíněna
expresním profilem Cre Rekombinázy, jenž je možné ovlivnit umístěním rozličných
regulačních sekvencí do genu Cre Rekombinázy. Analýza gen inaktivačního modelu je
prováděna multidisciplinárně s využitím genetických, fyziologických a patologických metod.
Myší kmeny s kondiciálně deletovatelnou alelou se stávají součástí většího registru, který
konzervuje specifickou mutaci a dává ji k dispozici dalším vědeckým skupinám pro jejich
partikulární projekty.
Další metodou genetické manipulace genové dávky či zvýšené exprese jsou tzv.
transgenní modely. Jedná se o kódující sekvenci umístěnou za aktivní promoter ve vektoru,
který je injikován do pronukleárního stadia myši s následnou inzercí manipulovaného vajíčka
do oviduktu. Výhodou je výrazná exprese, jež může zachovávat určitou úroveň či tkáňově
specifický vzorec dle obsahu regulačních sekvencí ve vektoru. Pro transgeny se využívají
často i mutantní formy genů pro studium jejich efektu či tzv. reporterové geny (např.
obsahující zelený fluorescentní protein) jež v závislosti na přítomnosti regulačních sekvencí
může informovat o tkáňové specificitě daného úseku. Využití transgenů je relativně rychlou
metodou pro testování mutantních či dysregulovaných genů, jež má ovšem i řadu nevýhod.
Neobsahuje specifické regulační úseky určující řadu expresních a se stabilitou asociovaných
parametrů. Dále jsou transgeny umístěny v řadě kopiích a často při integraci může dojít
k disrupci určitých úseků DNA. U transgenů dochází také k progresivnímu útlumu genové
exprese transgenu, jelikož většinou dochází k inzerci vektoru do oblastí, jež podléhají
represivním epigenetickým změnám.
Další metodou genetické manipulace je vytvoření tzv. knock-in modelů. Knock-in
modely využívají inzerci mutací do myši a to do oblastí původního genu se zachováním všech
regulačních oblastí (Divoky et al., 2001). Knock-in modely operují na úrovni jedné alely (1
kopie) a často jsou konstruovány tak, aby vykazovaly kondiciální vlastnosti. Nevýhodou je
značná technická náročnost a také přítomnost některých arteficiálních sekvencí. Přesto je
modelování mutací metodou knock-in považováno za doposud „nejčistší“ způsob modelování
mutací v myši. Je ovšem nutno poznamenat, že mutace v myši se v některých případech
chovají odlišně ve srovnání s lidskými organizmy. Mezi moderní přístupy v knock-in
modelech mutací jaderných onkogenů patří použití tamoxifenem-regulovatelné části genu pro
estrogenní receptor, jež postrádá DNA vazebnou doménu a tak umožňuje sekvestraci fůzního
transgenu v oblasti jaderné periferie a k jaderné translokaci (aktivaci) dojde pouze po přidání
tamoxifénu.
V této přednášce byly shrnuty strategie a způsoby konstrukce myších modelů pro
studium lidských onemocnění. Využití myších modelů je standardem současného genetického
a epigenetického výzkumu. Využívá se pro vývoj a testování nových léků u onemocnění, jako
např. talasemie, srpkovitá anemie, leukemie, a některé solidní nádory. Testování myších
modelů je stále časově značně náročné. Proto lze očekávat zefektivnění některých částí
konstrukce biomodelů jako např. využití celogenomových přístupů pro analýzu genotypu a
fenotypu. Dotazy na: [email protected]
Reference:
Divoky, V., Liu, Z., Ryan, T.M., Prchal, J.F., Townes, T.M. and Prchal, J.T. (2001) Mouse
model of congenital polycythemia: Homologous replacement of murine gene by
mutant human erythropoietin receptor gene. Proc atl Acad Sci U S A, , 986-991.
Hogan, B.L., Beddington, R., Constantini, F., and Lacy, E. (1994) Manipulating the Mouse
Embryo: A Laboratory Anual, Cold Spring Harbor, NY.
Jenuwein, T. and Allis, C.D. (2001) Translating the histone code. Science,
, 1074-1080.
Richmond, T.J. and Davey, C.A. (2003) The structure of DNA in the nucleosome core.
, 145-150.
ature,
Stopka, T. and Skoultchi, A.I. (2003) The ISWI ATPase Snf2h is required for early mouse
development. Proc atl Acad Sci U S A,
, 14097-14102.
Wasserman, P.M., and DePamphilis, ML. (1993) Guide to Techniques in Mouse
Development. Academic Press, San Diego.