Metodika odběru vz u repr onem skotu

Metodika odběru vzorků
u reprodukčních poruch
a onemocnění skotu
MVDr. Petr Václavek, Ph.D.
Státní veterinární ústav Jihlava
Seminář ČBS, Brno, 14. listopadu 2015
Reprodukční poruchy
a onemocnění skotu
Neinfekční faktory:
• toxická agens, otravy
• metabolické poruchy
• genetické abnormality
• teplotní stres
• trauma apod.
Infekční faktory:
• bakteriální patogeny
• virové patogeny
• parazitární (protozoální) patogeny
• ostatní infekční agens – chlamydie, mykoplazmata apod.
• plísně - mykotoxiny
2
Bakteriální původci reprodukčních poruch skotu
Nákaza / původce
četnost
zmetání
doba zmetání
(stádium
březosti)
opakování
zmetání
vhodné
vzorky
laboratorní
diagnostika
6-9 měsíc
většinou pouze
jednou
placenta,
zmetek,
krev matky
sérologie matky,
izolace, kultivace,
MALDI, PCR
5-8 měsíc
vzácné,
rekonvalescentní
krávy jsou
rezistentní
placenta, obsah
žaludku plodu
(abomasum),
výtěry, vaginální
a prepuciální
výplašky
izolace, kultivace
mikroskopie,
fenotypové testy
MALDI, PCR
sporadicky
4-9 měsíc
vzácné,
rekonvalescentní
krávy jsou
rezistentní
viz výše
viz výše
leptospiróza:
Leptospira interrogans,
L. hardjo,
L.grippotyphosa,
L. pomona, L. sejroe, atd.
5-40%
poslední trimestr
(L. pomona),
ostatní kdykoliv,
aborty 2-5 týdnů
po infekci
imunita k sérotypu,
který způsobil
zmetání ale
vnímavost k dalším
sétypům
placenta,
zmetek,
krev matky a
dalších krav v
chovu
mikroskopický
aglutinační test
(MAT) +
sérotypizace, ELISA,
kultivace, Real-time
PCR (patogenní
sérovary)
Listerióza:
Listeria monocytogenes
Listeria ivanovii
většinou
sporadicky,
ale může
dosáhnout
50%
2. ale většinou
3. trimestr
může se opakovat
placenta, zmetek,
obsah žaludku
plodu
(abomasum),
krev matky
kultivace /izolace z
placenty či z obsahu
žaludku, PCR,
sérologie matky
sporadicky
jakékoliv
stádium
není známo
placenta,
zmetek
kultivace /izolace z
placenty či z obsahu
3
žaludku, MALDI, PCR
brucelóza
Brucella abortus
Campylobacter fetus
veneralis
Campylobacter fetus
fetus, C. jejuni
Trueperella pyogenes
(syn. Arcanobacterium pyogenes)
do 80% inf.
v 1. nebo 2.
trimestru
>10%
Viry způsobující reprodukční poruchy skotu
Nákaza / původce
bovinní virová
diarrhoea
(virus BVD-MD)
četnost
zmetání
většinou
nízká
BHV1
5-60%
infekční bovinní
rhinotracheitida (IBR)
virus katarální horečky většinou
ovcí - bluetongue (BT) nízká
Schmallenberg virus
(SBV)
většinou
nízká
doba zmetání
(stádium
březosti)
opakování
zmetání
vhodné
vzorky
laboratorní
diagnostika
izolace, PCR, ELISA Ag,
průkaz viru v plodu,
průkaz virémie u matky
či býka, prekolostrální
protilátky u zmetaného
plodu
variabilní,
většinou do 4
měsíců
není běžné,
vytvoří se
imunita
placenta,
zmetek (např.
slezina), sérum
matky, plodu,
popř. býka
jakékoliv
stádium, ale
více od 4.
měsíce
není běžné,
vytvoří se
imunita
PCR či IHC z tkání,
placenta, plod,
izolace viru, sérologie sérum matky
párové vzorky (VNT)
variabilní
nepravděpodobné
placenta, plod,
vzorky séra
izolace viru, PCR
matky
3. trimestr
není běžné,
vytvoří se
imunita
plod (mozek),
prekolostrální
krev plodu
PCR, sérologie krve
plodu
4
Schmallenberg virus
• rod Orthobunyavirus, čeleď Bunyaviridae
• krátká virémie 1-5 dní
• u skotu jsou kritické 70-120 dny březosti, kdy ještě imunitní systém
není dodatečně vyvinutý, virus přestupuje přes placentu a může
způsobovat zmetání a malformace telat.
• virus postihuje nervový systém plodu - u telat nehybné neflexibilní
klouby, opistotonus, torticollis - zvrácený krk a páteř,
hydroencephalus, zkrácená čelist a další abnormality = „syndrom
artrogrypózy a hydroencefalu“ (AG/HE syndrom)
• postižená telata jsou od matek infikovaných před 5-7 měsíci
• infikované matky nemusí mít žádné klinické příznaky
• může být horečka, snížení dojivosti či průjem (vše max. 5 dní)
5
Schmallenberg virus
© MVDr. František Kostka
Schmallenberg virus
Vhodné diagnostické vzorky
Z živých zvířat na průkaz akutní infekce (PCR)
• EDTA krev
• sérum – min. 2 ml, transportovat chlazené
Z předčasných porodů a malformovaných telat:
detekce viru:
• mozek a mozkový kmen
• amniové tekutiny
• z živých nově narozených - amniové tekutiny a placenta (popř.
meconium)
detekce protilátek:
• tekutina z perikardu
• prekolostrální krev
• sérologie (ELISA, VNT) matky je z hlediska
abortu neprůkazná
histopatologie - fixovaný mozek a mícha
© MVDr. František Kostka
Parazitární (protozoální) patogeny způsobující
reprodukční poruchy skotu
Nákaza / původce četnost zmetání
neosporóza
Neospora caninum
Tritrichomonas
foetus
© P.J: Dubey
doba
zmetání
(stádium
březosti)
opakování
zmetání
vhodné
vzorky
vysoká u prvotelek a
když se infekce
dostane do naivního
stáda - do 30% u
prvního vzplanutí
enzooticky: 5-10%
jakékoliv
stádium, ale
nejčastěji 5-6
měsíc
sporadické
zvířata
první polovina
získávají
březosti (často
imunitu, ale ne
2-4 měsíc)
celoživotní
© B. Koudela
placenta, zmetek
klesá s paritou, (mozek, srdce,
ale vždy možné játra, těl.
tekutiny), sérum
(cca 5%)
matky
laboratorní
diagnostika
PCR, histologie mozek, IHC - tkáně,
sérologie matky
(ELISA, IFAT)
kultivace z placenty,
placenta, plodové
z obsahu žaludku,
tekutiny, zmetek,
plodových tekutin či z
vaginální výtok
vaginálních výplašků,
/výplašek
PCR
© B. Koudela
8
Další (méně časté) infekční faktory
reprodukčních poruch a onemocnění skotu
•
•
•
•
•
•
•
•
•
•
•
•
Q horečka - Coxiella burnetii (QF)
chlamydióza - Chlamydophila sp. (Chlamydophila abortus, Chlamydophila psittaci)
Mycoplasma spp. (M. bovigenitalium)
Toxoplasma gondii
Sarcocystis spp.
Salmonella spp.
Anaplasma phagocytophila
Histophilus somni
Ureaplasma diversum
Staphylococcus spp., Streptococcus spp.
bovinní herpesvirus typ 4 (BHV4)
virus parainfluenzy 3 (PI3)
plísně – mykotoxiny (přímý účinek, kumulace účinků více toxinů, imunosuprese a
následné závažnější projevy infekcí jako např. BVD, Neospora caninum apod.)
• uvádí se, že mohou být důvodem 3-10 % abortů
Ø námelové alkaloidy (Claviceps purpurea): ergotoxin, ergotamin
Ø fusariotoxiny (rod Fusarium): DON (vomitoxin), T-2 toxin, zearaleon
Ø aflatoxiny (Aspergillus flavus, A. parasiticus)
9
Správný odběr diagnostických vzorků u
reprodukčních onemocnění skotu
Matrice - biologický materiál k vyšetření:
Ø ZMETEK, PLACENTA, PLODOVÉ OBALY A TEKUTINY
Ø PREPUCIÁLNÍ A VAGINÁLNÍ VÝPLAŠEK/SEŠKRAB
Ø VÝTĚR
Ø KREV/SÉRUM
Ø KRMIVO
Obecná pravidla odběru vzorků u reprodukčních
onemocnění skotu
Je třeba brát v potaz, že např.
infekční zmetání je výsledek
infekce, která proběhla o
několik týdnů či měsíců
dříve něž nastal problém a
pokud vůbec patogen byl v
plodu, často už není v čase
zmetání detekován.
Diagnostický úspěch v laboratoři bývá pouze v 25-30%
Proto u odběru vzorků na diagnostiku zmetání platí obecné pravidlo:
„čím více, tím lépe“
Vzhledem ke složitosti průkazu původce/důvodu zmetání je ideální
odebrat k vyšetření všechny možné druhy vzorků (plod, placenta,
plodové obaly, krev zmetalky, výplach či výtěr, popř. krmivo).
11
ZMETEK, PLACENTA, PLODOVÉ OBALY A TEKUTINY
JAK a KDY a DO ČEHO?
Zásady:
ü placentu či plodové obaly balíme individuálně, ne společně se zmetkem
ü ideálně použijeme dvojitý / trojitý obal
ü plod či placentu neřežeme či jinak nedělíme, ale zašleme celé
ü plod ani placentu neomýváme
ü vzorky nezamrazujeme!
ü transport a uchování při chladničkové teplotě 2-8°C
ZMETEK, PLACENTA, PLODOVÉ OBALY A TEKUTINY
PRO JAKÁ VYŠETŘENÍ?
Zmetek a placenta jsou vhodné pro o patologickoanatomické vyšetření a
diagnostiku většiny bakteriálních, virových či parazitárních původců
zmetání, ale i na diagnostiku zmetání jiného původu (např. mykotoxiny,
alkaloidy apod.).
Průkaz patogenů ze zmetka provádíme metodami: kultivace, izolace, PCR, IFA
(imunofluorescence), IHC (imunohistochemie), ELISA Ag, histologie,
mikroskopie apod.
Pozn. zmetek slouží v diagnostice rovněž z hlediska signifikantních lézí a
změn na plodu, či pro některé patogeny charakteristický stářím plodu apod.
www.teara.govt.nz
PREPUCIÁLNÍ A VAGINÁLNÍ VÝPLAŠKY/SEŠKRABY
JAK a KDY a DO ČEHO?
Výplašky/seškraby se používají zejména k diagnostice venerálních patogenů
jako např. Tritrichomonas foetus a Campylobacter fetus:
Výplašky plemenných býků se provádí:
Ø před přesunem do OPB
Ø pravidelně na OPB
Ø pravidelně na inseminační stanici býků
•
•
nařízené preventivní vyšetření, které je součástí MKZ SVS ČR
u krav resp. jalovic se odebírají výplašky pouze pro preventivní vyšetření
(např. při exportech a prodeji) nebo při situacích s klinickými příznaky
onemocnění.
Odběr vzorků se provádí ve všední dny, pokud možno ráno či dopoledne a to
kvůli včasnému doručení do laboratoře a neprodlenému zpracování. Ve
výjimečných případech lze po telefonické dohodě s laboratoří zajistit případné
zpracování vzorků i po pracovní době.
ODBĚR VÝPLAŠKŮ U BÝKŮ
• před odběrem provedeme sedaci zvířete a zevní očistu genitálu
• k získání výplašku se zavedeme do prepucia až ke glans penis sterilní
katetr (inseminační pipeta, sterilní hadička apod.)
• vyústění prepucia pak manuálně zkomprimujeme a do prepucia se
pozvolna vstřikneme stříkačkou 30-50 ml vlažného fyziol. roztoku
• katetrem se následně provedeme mírný seškrab glans penis a masáž
prepucia po dobu 2 minut. Pak se výplašek vypustí katetrem do sterilní
nádoby (např. sterilní plastové kyvety dodávané po tel. domluvě z SVÚ).
• jeden odběr se dá použít pro oba patogeny - Campylobacter f. a
Tritrichomonas f.
TRICAMPER™SAMPLING DEVICE
© BonDurant, R.H. Diagnosis
Merck Manual
ODBĚR VÝPLAŠKŮ U KRAV
• před odběrem se provede ev. sedace zvířete, zevní očista genitálu
• k získání výplašku se zavede do vaginy sterilní katetr (inseminační
pipeta, sterilní hadička apod.)
• manuálně se uzavře vaginální otvor a pozvolna se vstříkne stříkačkou
30-50 ml vlažného fyziol. roztoku a provede se masáž
• pak se výplašek vypustí katetrem do sterilní nádoby (např. sterilní plastové kyvety)
___________________________________________________________
VÝPAŠKY / SEŠKRABY: UCHOVÁNÍ A TRANSPORT VZORKŮ?
• transport a uchování při teplotě v rozmezí 5°-38°C.
(do přepravek se vzorky je vhodné vložit PET láhev s teplou vodou)
• uložení do temna (box, krabice apod.) nutné u vzorků na
Tritrichomonas f.
• vzorek co nejrychleji (nejlépe dopoledne) doručit do laboratoře, aby
zde byla časová rezerva na zpracování vzorků (registrace, odstřeďování,
kultivace).
Vyšetření trvá 7 dní u Tritrichomonas f., resp. 5-7 dní Campylobacter f.
VÝTĚRY
Výtěry/stěry mohou sloužit jako alternativa k výplaškům např. v situacích,
kdy nelze výplašek z nějakého důvodu provést.
Vaginální výtěr
využíván k preventivnímu vyšetření na Campylobacter fetus (AMIES) či
Tritrichomonas foetus (CAT SWAB). Výtěry lze využít i na diagnostiku
dalších bakteriálních (AMIES) či virových původců abortů (Eswab).
Vaginální výtěr není zcela vhodný na stanovení původců metritid.
Výtěr z děložního krčku / z dělohy
Je využíván na diagnostiku puerperálních onemocnění, metritid apod.
VÝTĚRY/STĚRY
JAK A DO ČEHO?
Výtěry se provádí nejčastěji do těchto odběrových souprav:
Vaginální výtěry
Ø AMIES Agar Gel Medium Transport Swab - with charcoal
Ø C.A.T. SWAB fi Dispolab na Tritrichomonas fetus
Výtěry z děložního krčku
Ø Eswab - Copan Eswab™ Collection Kit
Ø Odběrová souprava fi Labmediaservis
VAGINÁLNÍ VÝTĚRY
AMIES Agar Gel Medium Transport Swab - with charcoal
Cat. No. 114C (COPAN Italia) - bakteriologické vyšetření
• nevhodný pro virologickou diagnostiku (málo matrice, médium může způsobit inhibici PCR)
• nejčastěji využíván na vaginální výtěr k prev. vyšetření na Campylobacter f.
• stěr lze provést i z orgánů zmetka (ale lépe zaslat zmetka celého do laboratoře)
Souprava obsahuje: odběrový tampon (plastová tyčinka se smotkem
syntetické bavlny) a zkumavku s médiem obsahující aktivní uhlí.
Tampon se se po odběru vloží do transportního media. Jedná se o universální
transportní půdy zaručující přežití odebraných mikroorganismů (aerobních i
anaerobních bakterií) po dobu nejméně 48 hodin, včetně náročných druhů. Tato
media udržují mikroorganismy vitální při jejich sníženém metabolismu, nepomnožují
se.
VAGINÁLNÍ VÝTĚRY
C.A.T. SWAB fi Dispolab
Doc. RNDr. Josef Reischig, CSc
•
na výtěr vaginy pro vyšetření na Tritrichomonas fetus
•
alternativa místo výplašku
•
dodává fi Dispolab nebo po telefonické domluvě SVÚ (Oddělení bakteriologie)
•
odběrový tampon se opatrně zasune do vaginy, provede se krouživým
pohybem výtěr vaginální sliznice a tampon se vloží se do transportního
media, které je součástí setu.
•
speciální odběrová souprava (plastová zkumavka s tamponem na konci
opatřeným balónkem s kultivačním médiem)
•
skladování před transportem: max. 24 hodin při pokojové teplotě (15 30 °C)
Výtěry z děložního krčku
Eswab - Copan Eswab™ Collection Kit – Cat. No 480CE (COPAN Italia)
ü vhodný pro virol. i bakteriologické vyšetření (+Leptospira spp. Chlamydophila spp.)
ü kapalné médium Eswabu uchovává jak nukleové kyseliny, tak antigeny
bakterií, virů i chlamydií
ü umožňuje přežití aerobních, anaerobních i jiných kultivačně náročných
bakterií
ü slouží pro odběr a transport stěru/výtěru z děložního krčku, vagíny,
placenty, plodových obalů a plodových tekutin
• lze použít i pro zamrazení a archivaci
především pro vyšetření/screening metodou PCR
Souprava obsahuje:
• odběrový flokovaný tampon zalamovací tyčinkou
• zkumavku s 1 ml tekutého čirého Amiesova média
Nový screeningový test pro detekci původců
abortů u skotu
SVÚ Jihlava – laboratoř molekulární biologie
PCR screeningový test
Cena: 2500,- Kč / 1 vzorek / 8 patogenů
•
•
•
•
•
•
•
•
Campylobacter fetus
Leptospira spp. – patogenní sérovary
Listeria monocytogenes
Coxiella burnetii
Chlamydophila spp.
Salmonella spp.
Anaplasma phagocytophila
bovinní herpesvirus 4
23
Výtěry z děložního krčku
Odběrová souprava - LabMediaServis s.r.o.
„Souprava na odběr vzorku pro vyšetření endometritid u dojnic“
Souprava obsahuje:
ü katetr s mandrenem a sterilní výtěrovkou
ü sáček s dezinfekcí
ü přepravní médium ve zkumavce (Amies)
• tampon je na dostatečně dlouhé tyčce (59 cm)
• opatřen speciální koncovkou, která zabraňuje
kontaminaci vzorku z vaginy nebo z vnějšího
prostředí
• vzorek je po odběru uložen do transportního
media
• získává se takto čistá bakteriální kultura
24
Hodnocení soupravy pro mikrobiologické vyšetření
endometritid u skotu (LabMediaServis s.r.o)
• 10/2014 – 3/2015 - SVÚ Jihlava (odd. bakteriologie) ve spolupráci s
firmou Zoetis (MVDr. Borkovec)
• 45 ks vzorků odebraných od dojnic z 32 chovů s reprodukčním
onemocněním dojnic (popř. klinickými příznaky endometritid)
• bakteriologické vyšetření popř. stanovena citlivost na ATB diskovou
metodou.
• vzorky ve většině případů nebyly kontaminovány mikrobiologickým
osazením pochvy dojnic, nedocházelo k přerůstání bakteriemi jako
např. Proteus sp., E. coli apod.
• prokázalo se, že přepravní médium Amies je vhodné médium pro
uchování a transport i těchto vzorků do laboratoře, k uchování
aerobních i anaerobních bakterií, a to i v širokém rozmezí teplot při
přepravě (5 – 22°C).
25
Hodnocení soupravy LabMediaServis
pro endometritidy
Běžnými kultivačními technikami byla
izolována
a
metodou
MALDI-TOF
identifikována řada bakterií, a to přímých
nebo potencionálních původců onemocnění
reprodukčního aparátu dojnic.
• většinou o oportunní, příležitostné
patogeny, u kterých závisí na imunitě
daného zvířete či stáda, jak se projeví.
• již v primokultivaci většinou nárůst téměř
čistých izolátů (usnadnění detekce bakteriálních
patogenů)
• následný antibiogram u všech izolátů – ATB
resistence
• u zájem ÚSKVBL – kvůli používání ATB s
indikačním omezením
Z výsledků vyplývá, že odběrová souprava pro
mikrobiologické vyšetření endometritid u
skotu je vhodná pro použití ve vet. praxi a je
přínosem pro bakteriologickou diagnostiku a
následnou racionální léčbu antibiotiky.
DĚLOŽNÍ VÝTĚRY 2015 - SVÚ Jihlava
Původce
Acinetobacter pittii
Acinetobacter sp
Aerococcus viridans
Bacillus sp.
Bacteroides pyogenes
Citrobacter braakii
Clostridium perfringens
Clostridium sp.
Corynebacterium sp
Enterococcus hirae
Escherichia coli
Escherichia coli var haemolytica
Histophilus somni
Klebsiella pneumoniae
Mannheimia haemolytica
Mannheimia varigena
Pasteurella multocida
Proteus mirabilis
Proteus sp.
Staphylococcus epidermidis
Staphylococcus haemolyticus
Staphylococcus chromogenes
Stenotrophomonas maltophilia
Streptococcus dysgalactiae
Streptococcus lutetiensis
Streptococcus pluranimalium
Streptococcus sp. viridující
Streptococcus uberis
Trueperella pyogenes
Počet izolací
1
3
1
3
2
1
5
1
1
1
29
7
2
2
2
1
1
5
12
1
1
4
1
3
1
5
1
15
26
21
JAK UCHOVÁVAT A TRANSPORTOVAT VZORKY VÝTĚRŮ?
AMIES Swab, Labmediaservis, C.A.T. SWAB
- při teplotě 5 – 25°C
- transport do laboratoře do 48 hodin
Eswab Collection Kit - pro virologické i bakteriologické vyšetření
- transport a uchování při teplotě 5 – 25°C , pro virologii 2 – 8°C (popř. zamrazit)
- transport do laboratoře ideálně do 48 hodin
Po odběru vzorek doručte co nejdříve do laboratoře! Nutno počítat s
časovou rezervou (např. dodání vzorků ve večerních hodinách, před
víkendem nebo před svátky) tak, aby se 48 hodinový interval zbytečně
neprodlužoval.
Správný odběr a transport ovlivňuje výsledek
bakteriologického a virologického vyšetření.
27
KREV / SÉRUM
Sérum zmetalek (popř. sérum plodu) lze použít pro přímý i nepřímý
průkaz některých patogenům způsobujících reprodukční problémy
Nepřímý průkaz (sérologie)
Ø kvalitativními testy (ELISA)
Ø kvantitativními testy prokazujícími titr protilátek (IPMA, NPLA, VNT apod.)
Samotná kvantita protilátek recentní infekci neprokazuje - neexistuje něco
jako „postinfekční“ titr protilátek.
Nutný průkaz sérokonverze z párových vzorků.
•
•
•
ze stejných zvířat odebraných v intervalu min. 3-4 týdnů (sledování
dynamiky titrů protilátek).
první odběr co nejdříve po zmetání, druhý odběr za 3 týdny.
signifikantní sérokonverze je potvrzena rozdílem v titrech mezi párovými
vzorky a to minimálně o dva až tři řády (např. 20 → 80, nebo 80 → 320, apod.)
Párové vzorky je nutné testovat najednou za stejných podmínek a se stejnou šarží
testu.
Při odesílání prvního odběru, prosím upozorněte na žádance, že k těmto vzorkům přijdou časem
další párové vzorky. Z prvního odběru pak séra zamrazí, archivují v laboratoři a vyšetřují se až
současně se séry z druhého odběru.
KREV / SÉRUM
PRO JAKÁ VYŠETŘENÍ je krev vhodná?
Sérologické vyšetření na průkaz specifických protilátek v krvi zmetalek
bakteriální původce abortů:
• Leptospira spp., Brucella abortus, Listeria monocytogenes
virové původce abortů:
• BVD, IBR (BHV1), virus katarální horečky ovcí (BTV, bluetongue)
parazitární (protozoální) původce abortů:
• Neospora caninum, Toxoplasma gondii
ostatní infekční původce abortů:
• Chlamydophila abortus, Chlamydophila spp., Coxiella burnetii (Q horečka)
Virologické vyšetření na přímý průkaz původce v krvi:
• BVD (ELISA Ag nebo PCR)
29
ZÁVĚREM:
Spolehlivá a včasná laboratorní diagnostika
nezbytná pro správnou volbu terapie, prevence a profylaxe
Výsledek laboratorní diagnostiky
ovlivněn mnoha faktory:
• správným odběrem a transportem vzorků
• zpracováním a uchováváním vzorků
• výběrem laboratorních metod
KAVALITNÍ VZOREK = ZÁKLAD PRO KVALITNÍ DIAGNOSTIKU
Děkuji za pozornost
31
STÁTNÍ VETERINÁRNÍ ÚSTAV JIHLAVA
Oddělení virologie