zde - Katedra organické chemie

Příprava liposomálních formulací fyziologicky
účinných látek
Liposomy jsou měchýřkovité útvary (vezikuly) lamelární struktury samovolně se
tvořící z disperze fosfolipidů ve vodném prostředí. Stěnu liposomů tvoří fosfolipidová
dvojvrstva (lamela), dvě vrstvy molekul fosfolipidů uspořádaných tak, že na povrchu
membrány jsou hydrofilní polární skupiny fosfolipidů, zatímco nepolární řetězce fosfolipidů
tvoří lipofilní vnitřek membrány. Účinnou látku je pak možné umístit (inkorporovat,
enkapsulovat) podle její povahy do jádra nebo do membrány liposomů.
Liposomy jako modely biologických membrán představují nosičové systémy pro
parenterálně aplikované látky (mimo gastrointestinální trak - GIT) cíleně usměrňované
k určitému orgánu, tkáni, buňce. Protože se fosfolipidy, z nichž se liposomy skládají, v GIT
rozkládají, lze jej jako transportní systémy použit pro aplikaci parenterální formou.
V závislosti na velikosti liposomů lze danou látku aplikovat povrchově (topicky) ve formě
masti nebo emulze, kde převládají multilamelární liposomy (MLVs 500–10 000 nm). V
případě redukce těchto částic vhodnou metodou na unilamelární liposomy (SUVs 25–250
nm), lze výsledné koloidní liposomální formulace použít i injekčně.
Úloha č. 1. Příprava liposomální formulace testosteronu a stanovení jeho
koncentrace. Metoda RVO – tvorbou filmu
Testosteron – ve vodě nerozpustný androgenní hormon. K aplikaci do organizmu se
nejčastěji používají v olejových formách některé estery testosteronu s karboxylovými
kyselinami. Jinou formou jeho aplikace je ekapsulace do liposomů pomocí fosfatidylcholinu.
Chemikálie: testosteron, sojový fosfatydilcholin SPC (Lipoid S 100), isotonický fosfátový
pufr PBS (pH = 7,40; c = 50 mM), methanol
Příprava pufru PBS:
Roztok A: 0,68 g KH2PO4 a 1,5 g NaCl se rozpustí v 100 ml destilované vody.
Roztok B: 0,89 g Na2HPO4 . 2H2O a 1,5 g NaCl se rozpustí v 100 ml destilované vody.
20 ml roztoku A se smísí s 100 ml roztoku B. Výsledné pH pufru (7,40) se upraví pomocí 1M
NaOH nebo 1M HCl za použití čerstvě nakalibrovaného pH-metru.
Přístroje: pH-metr, rotační vakuová odparka (RVO), ultrazvukový homogenizátor Sonopuls
HD 3200, mikroultracentrifuga Sorval MX 120 s titanovým výkyvným rotorem S50-ST,
HPLC Dionex
Postup:
10 ml zásobního roztoku testosteronu v methanolu (5 mg/ml) se smíchá s 10 ml
roztoku fosfatydilcholinu SPC v methanolu (20 mg/ml). Výsledný roztok se přenese do 250
ml kulaté baňky, umístí na RVO a pozvolna se zakoncentrovává za následujících podmínek.
Rychlost otáčení baňky: stupeň č.2, tlak: 300 mBar, teplota lázně: 40 °C. Jakmile je většina
methanolu odpařena (cca 10 min) za vzniku homogenního filmu, pozvolna se zvyšuje vakuum
až na hodnotu tlaku: 50 mbar. Při tomto tlaku se odstraňuje zbytkový methanol ještě po dobu
20 min. K takto vytvořenému filmu uvnitř baňky se přidá 10 ml pufru PBS a krouživým
pohybem baňkou se smývá film pufrem za vzniku liposomální disperze tvořené objemnými
multilamelární liposomy (MLVs). Následně se vytvořená suspenze homogenizuje za chlazení
ledovou lázní ultrazvukovým homogenizátorem za použití 2 mm sondy ve třech
pětiminutových cyklech při 60 W (asi 30% výkonu homogenizátoru). Získá se tak směs
koloidního roztoku unilamelárních liposomů (SUVs) s inkorporovaným testosteronem a
jemně suspendovaným testosteronem, který se do liposomů nezainkorporoval. Tento volný
testosteron se odstraní z liposomální formulace převedením sonifikované směsi do
centrifugační zkumavky a centrifuguje se 30 min při 32 000 ot/min (100 000 g) při 10 °C.
Supernatant se odpipetuje od sedimentu a přesně 1,0 ml se převede do 10 ml odměrné baňky.
Odměrná baňka se doplní do celkového objemu methanolem a vloží na 10 minut do
ultrazvukové lázně (zde dochází působením methanolu a sonifikaci k destrukci liposomu a
uvolnění testosteronu do methanolu). Mírně zakalený roztok se přefiltruje přes 0,22 µm
mikrofiltr a analyzuje se 2 x na HPLC.
Uvede se koncentrace testosteronu v µg/ml formulace a µg/100 mg lipidu.
Tuto úlohu je vhodné rozšířit o studium inkorporace testosteronu při různé koncentraci
fosfatidylcholinu SPC (například při celkové koncentraci SPC: 50 mg, 100 mg, 400 mg).
Stanovení koncentrace na HPLC (Dionex, Diode array detektor)
Kolona: Grace smart RP 18 5 µm, 250 x 46 mm
Nastřikovaný objem: 20 µl
Mobilní fáze: 60% acetonitril, 40% 10 mM octanu amonného ve vodě
Eluce: isokratická
Průtok: 0,8 ml/min
Retenční čas: 6,5 min
Stanovení při: 230 nm
Příprava kalibrační křivky:
Ze zásobního roztoku testosteronu v methanolu (5 mg/ml) se připraví kalibrační roztoky
v methanolu o koncentraci: 50,100, 200, 400, 800 µg/ml.
Úloha č. 2. Příprava liposomální formulace camptothecinu a stanovení jeho
koncentrace. Metoda mrazového sušení
Camptothecin - jedná se o chinolinový cytotoxický alkaloid, který inhibuje enzym
DNA topoizomerázu. Jako účinná látka se používá ve svých přírodních zdrojích v tradiční
čínské medicíně k léčbě nádorových onemocnění. Je ve vodě špatně rozpustný a nestálý
v basických prostředích, kde se otevírá laktonový kruh a vzniká jeho neúčinná forma. Jedním
ze způsobů jak zvýšit rozpustnost je jeho inkorporace do liposomů tvořených
fosfatydilcholinem s přídavkem DOTPA v mírně kyselém pufrovaném prostředí (DOTPA
podporuje inkorporaci středně polárních látek do lipidové dvojvrstvy).
Chemikálie: capmtothecin, sojový fosfatydilcholin SPC ( Lipoid S 100), DOTAP (1,2dioleoyil-3-trimethylammonium-propan), isotonický fosfátový pufr PBS (pH = 6,00; c = 25
mM), dimethylsulfoxid (DMSO), Triton X-100
Příprava pufru PBS:
Roztok A: 0,68 g KH2PO4 a 1,5 g NaCl se rozpustí v 200 ml destilované vody.
Roztok B: 0,89 g Na2HPO4 . 2H2O a 1,5 g NaCl se rozpustí v 200 ml destilované vody.
200 ml roztoku A se smísí s 40 ml roztoku B. Výsledné pH pufru (6,00) se upraví pomocí 1M
NaOH nebo 1M HCl za použití čerstvě nakalibrovaného pH-metru.
Přístroje: pH-metr, lyofilizátor CoolSafe, ultrazvukový homogenizátor Sonopuls HD 3200,
mikroultracentrifuga Sorval MX 120 s titanovým výkyvným rotorem S50-ST, HPLC Dionex
Postup:
a) Stanovení koncentrace nasyceného roztoku campothecinu v roztoku PBS pufru:
1,0-1,5 mg campothecinu se suspenduje v 10,0 ml PBS pufru. Výsledná suspenze se
ponoří do ledové lázně a homogenizuje se ultrazvukovým homogenizátorem za použití 2 mm
sondy ve třech pětiminutových cyklech při 60 W (asi 30% výkonu). Výsledná mikrosuspenze
se převede do polykarbonátové centrifugační zkumavky v titanovém rotoru (nutno rotor
vyvážit!!!) a ultracentrifuguje se za těchto podmínek: 32 000 ot/min (100 000 g), 10°C, 20
min. Poté se z centrifugací zkumavky odebere 1,0 ml čirého roztoku a naředí na objem 10 ml
metanolem v odměrné baňce. Koncentrace capmtothecinu v pufru se pak stanoví 2 x měřením
pomocí HPLC na základě připravené kalibrační křivky. Uvede se koncentrace v µg/ml.
b) Příprava liposomální formulace camptothecinu
1 ml zásobního roztoku camptothecinu v DMSO (5 mg/ml) se smíchá s 1,8 ml roztoku
fosfatydilcholinu SPC v terc-butanolu (100 mg/ml) a 0,5 ml roztoku DOTAP v terc-butanolu
(40 mg/ml). Výsledný roztok se zmrazí na – 80°C a metodou mrazového sušení (lyofilizací)
se rozpouštědla při RT odstraní. Vzniklý pórovitý produkt se za mírného protřepávání
suspenduje PBS pufrem do celkového objemu 6 ml. Vzniklá liposomální disperze obsahující
objemné multilamelární liposomy (MLVs) se homogenizuje za chlazení ledovou lázní
ultrazvukovým homogenizátorem za použití 2 mm sondy ve třech pětiminutových cyklech při
60 W (asi 30% výkonu homogenizátoru). Získá se tak směs koloidního roztoku
unilamelárních liposomů (SUVs) s inkorporovaným camptothecinem a jemně
suspendovaného camptothecinu, který se do liposomů nezainkorporoval. Tento volný
camptothecin se odstraní z liposomální formulace převedením sonifikované směsi do
centrifugační zkumavky a centrifuguje se 30 min při 32 000 ot/min (100 000 g) při 10 °C.
Supernatant se odpipetuje od sedimentu a přesně 1,0 ml se převede do 10 ml odměrné baňky.
Odměrná baňka se doplní do celkového objemu roztokem PBS pufru s 5% Tritonu X-100
(w/w). Po 10 minutách, za občasného promíchání, se roztok přefiltruje přes 0,22 µm
mikrofiltr a analyzuje se 2 x na HPLC. Uvede se koncentrace v µg/ml formulace a µg/100 mg
lipidu.
Stanovení koncentrace na HPLC (Dionex, Diode array detektor)
Kolona: Grace smart RP 18 5 µm, 250 x 46 mm
Nastřikovaný objem: 20 µl
Mobilní fáze: 35% acetonitril, 1% triethylamin, 64% 10 mM octanu amonného ve vodě
Eluce: isokratická
Průtok: 0,8 ml/min
Retenční čas: 5,4 min
Stanovení při: 360 nm
Příprava kalibrační křivky:
Ze zásobního roztoku camptothecinu v DMSO (5 mg/ml) se připraví kalibrační roztoky
v metanolu o koncentraci: 10, 25, 50, 100, 150 a 200 µg/ml.
Příprava micelárních formulací těžce rozpustných
látek
Pro některé těžce rozpustné nebo nepolární látky se ve farmacii jako transportních
systémů používají tenzidy. Ty se obecně skládají z hydrofobní (nepolární) a hydrofilní
(polární) části, které ve vodném prostředí tvoří micely. Což jsou shluky molekul tenzidů
dispergované v kapalném médiu. Typická micela ve vodném roztoku vytváří agregáty s
hydrofilní částí molekuly orientovanou do vodného prostředí a hydrofobní částí skrytou
uvnitř. Pokud se do takového micelárního prostředí přidá nepolární látka, bude se
inkorporovat do nepolární části micely a tím se zvýší její rozpustnost ve vodném prostředí
Úloha č. 3. Příprava micelární TPGS formulce 2-fenyl-3-hydroxy-4(1H)chinolinonu
Výzkum na Katedře organické chemie PřF UP je ve značné míře věnován sloučeninám
odvozených od struktury 3-hydroxy-4(1H)-chinolinonů, coby aza analoga flavonů –
přírodních látek s širokým spektrem biologických účinků. I u zmíněných chinolinonů byla
zajímavá biologická aktivita in vivo zjištěna. Tyto sloučeniny jsou obecně málo rozpustné a
navíc nestálé ve fyziologických prostředích. Působením vzdušného kyslíku dochází k jejch
degradaci na neúčinné produkty. Jedním ze způsobů jak zvýšit rozpustnost zmíněných
chinolinonů je volba micelárních roztoků, které by svou povahou zároveň chránily tyto látky
proti oxidativní degradaci a umožnily tvorbu biodostupné micelární formulace.
Jako modelový příklad je zde uvedena úloha založena na tvorbě micel mající
antioxidační vlastnosti v nich je zainkorporován 2-fenyl-3-hydroxy-4(1H)-chinolinonu . Jako
transportní systém je zde zvolen neionogenní tenzid TPGS (d-α-tokoferyl polyethylenglykol
1000 sukcinát) mající ve své molekule zabudován antioxidační vitamín E.
Chemikálie:
2-fenyl-3-hydroxy-4(1H)-chinolinon
(QS),
TPGS
(d-α-tokoferyl
polyethylenglykol 1000 sukcinát), isotonický fosfátový pufr PBS (pH = 7.40; c = 25 mM),
Příprava pufru PBS:
Roztok A: 0,68 g KH2PO4 a 1,5 g NaCl se rozpustí v 200 ml destilované vody.
Roztok B: 0,89 g Na2HPO4 . 2H2O a 1,5 g NaCl se rozpustí v 200 ml destilované vody.
40 ml roztoku A se smísí s 200 ml roztoku B. Výsledné pH pufru (7,40) se upraví pomocí 1M
NaOH nebo 1M HCl za použití čerstvě nakalibrovaného pH-metru.
Přístroje: pH-metr, rotační vakuová odparka (RVO), mikroultracentrifuga Sorval MX 120
s titanovým výkyvným rotorem S50-ST, inkubační nádstavec TH 15, lyofilizátor CoolSafe,
HPLC Dionex
Postup:
10 ml zásobního roztoku QS v methanolu (0,1mg/ml) se smíchá s 10 ml roztoku TPGS
v methanolu (20 mg/ml). Výsledný roztok se přenese do 250 ml kulaté baňky, umístí na RVO
a pozvolna se zakoncentrovává za následujících podmínek. Rychlost otáčení baňky: stupeň
č.2, tlak: 300 mBar, teplota lázně: 40 °C. Jakmile je většina methanolu odpařena (cca 10 min)
za vzniku homogenního filmu, pozvolna se zvyšuje vakuum až na hodnotu tlaku: 50 mbar. Při
tomto tlaku se odstraňuje zbytkový methanol ještě po dobu 20 min. K takto vytvořenému
filmu uvnitř baňky se přidá 10 ml pufru PBS a krouživým pohybem baňkou se smývá film
pufrem za vzniku TPGS micelární disperze. Ta však obsahuje kromě inkorporovaného QS
v TPGS micelách i volný, mikrokrystalický QS. Ten se odstraní z formulace jejím
převedením do do centrifugační zkumavky a centrifuguje se 30 min při 32 000 ot/min
(100 000 g) při 10 °C. Odebere se přesně 1,0 ml čirého roztoku, převede se do 10 ml odměrné
baňky, doplní se methanolem po rysku a stanoví koncentrace QS na HPLC.
Za účelem testování stability zainkorporovaného QS v TPGS micelárním roztoku se
čirý supernatant nechá inkubovat při 25°C po dobu 18 hodin. Poté se roztok opět centrifuguje
30 min při 32 000 ot/min (100 000 g) při 10 °C. Odebere se přesně 1,0 ml čirého roztoku,
převede se do 10 ml odměrné baňky, doplní se methanolem po rysku a stanoví koncentrace
QS na HPLC.
Uvede se koncentrace v µg/ml TPGS formulace a µg/100 mg TPGS.
Vytvořenou chinolinovou TPGS formulaci lze dlouhodobě uchovat jejím zmražením a
následnou lyofilizací. Pro potřeby se pak jen naředí vodou.
Stanovení koncentrace na HPLC (Dionex, Diode array detektor)
Kolona: Grace smart RP 18 5 µm, 250 x 46 mm
Nastřikovaný objem: 20 µl
Mobilní fáze: 95% acetonitril, 5% roztoku HCOOH (0,1%)
Eluce: isokratická
Průtok: 0,8 ml/min
Retenční čas: 4,3 min
Stanovení při: 366 nm
Příprava kalibrační křivky:
Ze zásobního roztoku QS v methanolu (0,1 mg/ml) se připraví kalibrační roztoky v metanolu
o koncentraci: 2,5; 5; 10; 25; 50 a 100 µg/ml.
Příprava cyklodextrinových formulací těžce
rozpustných látek
Cyklodextriny (CD) jsou cyklické, ve vodě rozpustné oligosacharidy, které jsou
tvořeny α-D-glukopyranosou. Díky své cyklické struktuře glukosových jednotek tvoří útvary
s vnitřním prostorem. Tento vnitřní prostor (kavita) má hydrofobní charakter, do kterého se
mohou inkludovat nerozpustné látky za vzniku tzv. inkluzních sloučenin (komplexů). Povrch
kavity pak tvoří hydrofilní OH skupiny, jež jsou zodpovědné za rozpustnost tohoto komplexu
ve vodných prostředích.
Podle počtu glukosových jednotek se nejvic rozšířily 3 základní typy: α-cyklodextrin
(6 glukosových jednotek), β-cyklodextrin (7 glukosových jednotek) a γ-cyklodextrin (8
glukosových jednotek). Pro farmaceutické účely se používá β-CD a jeho deriváty (methyl- βCD, hydroxypropyl β-CD, sulfobutyl- β-CD). Podle typu CD lze připravit cyklodextrinové
formulace jak pro perorální, tak i parenterální aplikace.
Typy cyklodextrinů
Úloha č. 4. Srovnání míry inkorporace ketoprofenu v β-cyklodextrinu a
hydroxypropyl-β-cyklodextrinu
Ketoprofen - nesteroidní látka působící protizánětlivě. Blokuje enzym cyklooxygenázu, který ovlivňuje tvorbu prostaglandinů, látek podílejících se na rozvoji zánětlivých
reakcí. Zabráněním tvorby prostaglandinů dochází ke zmírnění příznaků zánětu. Ketoprofen k
místnímu podání se používá k symptomatické léčbě zánětu a bolesti při úrazech (podvrtnutí,
pohmoždění), zánětech šlach, osteoartróze malých kloubů (otoky a bolest v malých
kloubech), akutní bolesti dolní části zad a zánětech žil.
Ketoprofen je látka, která je špatně rozpustná ve vodě a následující modelová úloha
může ukázat, jak lze rozpustnost zvýšit za vzniku cyklodextrinové inkluzivní formulace.
Chemikálie: ketoprofen, β-cyklodextrin (mol. hmotnost 1135) , hydroxypropyl-β-cyklodextrin
(mol. stupeň substituce 0,62; mol. hmotnost 1488), fosfátový pufr (pH = 7.40; c = 60 mM)
Příprava fosfátového pufru:
Roztok A: 4,16 NaH2PO4 . 2H2O se rozpustí v 100 ml vody
Roztok B: 9,56 g Na2HPO4 . 12H2O se rozpustí v 400 ml vody. Oba roztoky se smísí a
výsledné pH pufru (7,40) se upraví pomocí 1M NaOH za použití čerstvě nakalibrovaného pHmetru.
Příprava roztoků cyklodextrinů: připraví se 100 ml zásobního roztoku jednotlivých derivátů
cyklodextrinů o koncentraci 60 mM v fosfátovém pufru.
Přístroje: pH-metr, mikroultracentrifuga Sorval MX 120 s titanovým výkyvným rotorem S50ST, spektrofotometr Helios alpha, ultrazvuková lázeň
Postup:
Příprava cyklodextrinových formulací:
Do sady 11 vialek se odváží cca po 50 mg ketoprofenu. Do jednotlivých vialek se pak
odpipetuje následující množství pufru a příslušného roztoku cyklodextrinu (ml pufru/ ml
roztoku cyklodextrinu)
1.
2.
3.
4.
0/1
1/9
2/8
3/7
5.
6.
7.
8.
9.
10.
11.
4/6
5/5
6/4
7/3
8/2
9/1
10/0
Jednotlivé vialky se položí do ultrazvukové lázně a sonifikují po dobu 15 min. Poté se
suspenze ketoprofenu ve vialkách ještě 60 minut míchá. Ketoprofen, který se nezinkorporoval
do vnitřní kavity cyklodextrinu se odstraní z formulace jejím převedením do do centrifugační
zkumavky a centrifuguje se 30 min při 32 000 ot/min (100 000 g) při 10 °C. Čirý roztok se
odpipetuje a stanoví se koncentrace ketoprofenu ve formulaci tak, že se odebere přesně 0,2 ml
čirého roztoku, převede se do 10 ml odměrné baňky, která se doplní pufrem a změří se
absorbance na spektrofotometru. Na základě kalibrační křivky se určí koncentrace v µg/ml
formulace a µg/g cyclodextrinu. Provádí se pro oba deriváty cyklodextrinu.
Stanovení koncentrace na spektrofotometru (Unicam, Helios alpha)
Příprava kalibrační křivky:
Zásobní roztok ketoprofenu se připraví rozpuštěním 10 mg ketoprofenu v 50 ml fosfátového
pufru (c = 60 mM). Z něj se patřičným naředěním připraví sada kalibračních roztoků o
koncentraci: 20, 40, 60, 80, 100 a 200 µg/ml.
Měří se v 1 cm křemenné kyvetě při vlnové délce λ = 262 nm.
Enzymatické reakce
Úloha č. 5. Redukce ethyl-3-oxobutanoátu pomocí pekařských kvasnic –
asymetrická syntéza (S)-ethyl-3-hydroxybutanoátu
Reakce ketonové karbonylové skupiny, k níž patří její redukce vedoucí k alkoholu,
jsou většinou spojeny s chemickými transformacemi, kdy vznikají racemické směsi. Je-li to
nutné, pak se musí jednotlivé antipody poměrně pracně od sebe oddělit.
Jiná situace je použijí-li se k reakci speciální asymetrická činidla, která umožní tzv.
stereospecificky připravit asymetrické molekuly. Jedním z těchto „činidel“ pocházející však
z přírodní říše a jsou stereospecificky založeny jsou látky peptidové povahy - enzymy. Níže
uvedená úloha představuje modelový příklad, kdy lze enentioselektivně redukovat
karbonylovou skupinu ve prospěch jednoho ze dvou možných enantiomerů. Jedná se o jednu
z nejstarších biochemických transformací provedených za použití enzymů, obsažených
v pekařských kvasnic.
O
pekařské kvasnice
OH
OH
COOC2H5
COOC2H5
H2O, sacharosa, 35°C
cca 93% S(+)
+
COOC2H5
cca 7% R(-)
Chemikálie: pekařské kvasnice (droždí), ethyl-3-oxobutanoát, sacharosa, ethyl-acetát,
chloroform, 1% roztok vanilinu v ethanolu
Přístroje: magnetická míchačka, inkubační nádstavec TH 15, polarimetr AP-300, RVO
Postup:
Do dvojhrdlé 500 ml baňky opatřené Bunsenovým ventilem se přidá 80 ml vody
z kohoutku, 15 g sacharosy a 10 g pekařských kvasnic. Směs se míchá při 35 °C po dobu 1
hodiny, kdy začíná proces fermentace doprovázený vývinem CO2. Poté se přidá 1 ml ethyl-3oxobutanoátu a míchá při 35 °C po dobu 24 hodin. Další den se přidá směs 10 g sacharosy a
10 g pekařských kvasnic v 50 ml teplé vodě (cca 40 °C). Po 60 min míchání při 35°C se přidá
další 1 ml ethyl-3-oxobutanoátu a v míchání při 35°C se pokračuje dalších 24-72 hodin.
Proces může být ukončen tehdy, je-li všechen keton spotřebován. Přítomnost ketonu lze určit
nanesením směsi spolu se standardem na TLC, jejím vyvinutím pomocí dichlormethanu a
detekcí roztokem vanilinu.
Do směsi se pak přidá 4 g Celitu a výsledná suspenze se přefiltruje přes skleněnou
fritu S-3 a promyje 20 ml vody. Filtrát se nasytí chloridem sodným a extrahuje se 5 x 25 ml
ethyl-acetátu. Spojené extrakty se vysuší MgSO4. Po odstranění sušidla se rozpouštědlo
odstraní na RVO a zbylá nažloutlá kapalina se vakuově předestiluje ze srdcové baňky do
předem zváženého Hickmannova nádstavce (límcovka). Sbírá se produkt při 55-70 °C za
tlaku10-12 mmHg. Výtěžek by měl být mezi 55-76%. Část předestilovaného produktu se
rozpustí v chloroformu tak, aby se získalo 10 ml roztoku o koncentraci 1,0 g /100 ml, změří se
jeho optická rotace a spočítá specifická rotace. Pokud by byl produkt enanciomerně čistý,
měla by být jeho specifická rotace [λ]25D +43,5° (c = 1, CHCl3).
Úloha č. 6. Izolace alkoholedydrogenasy z rostlinného materiálu a test její
aktivity při oxidaci benzylalkoholu
Zkratka ADH (E.C. 1.1.1.1), velmi rozšířený enzym ze třídy oxidoreduktas; katalyzuje
reakci alkohol + NAD+ → aldehyd + NADH + H+. Laboratorní úloha demonstrující izolaci
enzymu z běžně dostupného a bezpečného biologického materiálu, jenž může být využit
v preparativní organické syntéze pro enzymově katalyzovanou reakci. V této úloze je
demonstrována jeho aktivita při konverzi benzylalkoholu na benzaldehyd a jeho důkaz
metodou LCMS.
CHO
CH2OH
ADH
NAD+
NADH + H+
Chemikálie: 0,1 M fosfátový pufr (pH = 8,5) obsahující 5 mM merkaptoethanolu, 0,1 M Tris
(tris(hydroxymethyl)aminomethan), 2 M kyselina octová, 0,5 M merkaptoethanol, NAD+,
síran amonný, benzylalkohol, benzaldehyd, ethyl-acetát, acetonitril
Přístroje: pH-metr, mikroultracentrifuga Sorval MX 120 s titanovým výkyvným rotorem S50ST, inkubační nádstavec TH 15, ultrazvukový homogenizátor Sonopuls HD 3200, RVO,
magnetická míchačka, LCMS
Postup:
Tři dny naklíčená semena hrachu (10 g suchých) se homogenizuji v mixéru se 50 ml
vychlazeného extrakčního pufru (0,1 M fosfátový pufr (pH = 8,5) obsahující 5 mM
merkaptoethanolu. Získaný homogenát se přefiltruje přes 3 vrstvy gázy a pak přes skleněnou
fritu č 1. Dalším purifikačním krokem je srážení síranem amonným. K odstředěnému extraktu
se přidává po částech práškový síran amonný do 35% nasycení roztoku. Po 15 minutách stání
se směs centrifuguje 15 min při 5000 ot/min při 4 °C. Supernatant se opatrně odlije a dále sytí
síranem amonným do 60%. Poté se centrifuguje 15 min při 20 000 ot/min při 4 °C.
Supernatant se odlije a sediment, ve kterém je přítomna alkoholdehydrogenasa, se
resuspenduje v 5 ml 20 mM tris-acetátového pufru (pH = 6,5).
Test aktivity: Do 25 ml baňky se dá 5 ml 0,1 M fosfátového pufru (pH 8,5), 5 ml 0,1
M NAD+, 5 ml vody a 0,02 ml benzylalkoholu. Enzymatická reakce se nastartuje přidáním 5
ml enzymového roztoku a mícháním při 35°C po dobu 1 hod. Výsledná směs se extrahuje
ethyl-acetátem 3 x 5 ml. Spojené extrakty se vysuší MgSO4 a rozpouštědlo odstraní na RVO.
Z olejovitého odparku se odebere cca 1-2 mg produktu, rozpustí v 0,6 ml acetonitrilu a
analyzuje se spolu se stejně připraveným standardem benzaldehydu pomocí standardní
metody na LCMS. Zjišťuje se přítomnost benzaldehydu ve vzorku po enzymatické reakci.
Úloha č. 7. Enantioselektivní hydrolýza acetylové skupiny za použití PLE
esterázy (EC 3.1.1.1)
Tato úloha představuje příklad selektivní enzymatickou deacetylací jedné ze dvou
acetylových skupin na molekule. Elegantní metoda, která by klasickou hydrolýzou v kyselém
nebo alkalickém prostředí nebyla jednoznačná.
NO2
AcO
OAc
PLE
NO2
AcO
OH
fosfátový pufr
Chemikálie: (1R,2r,3S)-3-Acetoxy-2-nitrocyklohexyl-acetát, KH2PO4, KOH, ether, kyselina
octová
Přístroje: inkubační nádstavec TH 15, pH metr RVO, polarimetr AP-300, magnetická
míchačka
Postup:
Do 50 ml baňky se předloží 1,0 g jemně rozetřeného nitrodiacetátu a 30 ml 0,2 M
roztoku pufru (pH = 7,0) připraveného rozpuštěním1,1 g KH2PO4 a 0,33 g KOH v 30 ml
vody. Do míchané suspenze se přidá 5 mg PLE esterázy a míchá po dobu 18 hodin. Během
této doby se změní pH na 5,6 a ze suspenze vznikne čirý nažloutlý roztok. Konec reakce je
monitorován TLC s použitím eluční směsi toluen / ethyl acetát (40:5) a vizuální detekcí.
Roztok se extrahuje 3 x 10 ml etheru. Etherové extrakty se vysuší MgSO4 a po vysušení
přefiltrují. Po odstranění rozpouštědla za sníženého tlaku se získá bezbarvý monoacetát (0,70,8 g). Rekrystalizace se provede rozpuštěním produktu v 10 ml etheru a přidáním 25 ml
pentanu. Získá se 0,5-0,6 g čistého (1S,2S,3R)-3-hydroxy-2-nitrocyklohexyl-acetátu, t.t 9091°. Připraví se roztok v chloroformu o koncentraci 0,1 g /10 ml, změří se jeho optická rotace
a spočítá specifická rotace. Čistý produkt má specifickou rotaci [λ]25D + 9,5° (c = 1, CHCl3).
Úloha č. 8. Enzymatická regioselektivní 5-O-deacetylace peracetylované βD-ribofuranosy
Tato úloha je zaměřená na selektivním odstranění protektivní skupiny plně
acetylované ribosy. Klasickými reakcemi se dá pohodlně připravit odchráněná ribosa v poloze
1. Avšak selektivní odstranění v poloze 5 těmito reakcemi selhává. Enzymatickým způsobem
lze jednoduše připravit částečné odchráněný sacharid v poloze 5 enzymem lipása, který se dá
použít k další syntéze speciálních glykosidů.
AcO
O
AcO
OAc
OAc
lipása
DMF, fosfátový pufr
HO
O
AcO
OAc
OAc
Chemikálie: 1,2,3,5-tetra-O-acetyl-β-D-ribofuranosa, lipasa (EC 3.1.1.3; z Candida rugosa,
typ VII, Sigma L 1754), fosfátový pufr pH = 7,00, hexan, ethylacetát, DMF
Přístroje: inkubační nádstavec TH 15, pH metr, RVO, polarimetr AP-300, magnetická
míchačka, ultrazvukový homogenizátor Sonopuls HD 3200
Postup:
Roztok 1,2,3,5-tetra-O-acetyl-β-D-ribofuranosy (0,38 g) v N,N-dimethylformamidu (3
ml) se naředí 0,1M roztokem fosfátového pufru pH = 7,00. Do připravené směsi se přidá 0,6 g
lipásy, vše se sonifikuje při 20 W po dobu 5 min a pak míchá při 32°C po dobu 24 hod. Konec
reakce se kontroluje pomocí TLC za použití mobilní fáze hexan / ethylacetát (4:6); Rf = 0,25.
Vizualizace se provádí nanesením 10% ethanolického roztoku kyseliny sírové na vyvinutou
desku a zahřátím horkovzdušnou pistolí. Není-li přítomna výchozí látka směs se extrahuje
ethylacetátem (3 x 50 ml). Organické extrakty se promyjí solankou (30 ml), vysuší MgSO 4 a
zahustí na RVO. Přečištění surového produktu se provede rozpuštěním odparku ve 2 ml směsi
hexan / ethylacetát (2:1), nanesením na start chromatografické kolony (d = 3 cm, naplněné 30
g silikagelu pro sloupcovou chromatografii), elucí směsi hexan / ethylacetát (4:6). Frakce
obsahující čistou látku se spojí, přefiltrují a odpaří na RVO. Výtěžek olejovité látky by měl
být 70-80%. Kontrola čistoty se provede proměřením ethanolického roztoku pomocí
polarimetru. Proměří se roztok připravený rozpuštěním 210 mg produktu v 10 ml etanolu.
Čistý produkt má mít hodnotu specifické rotace [λ]25D - 10,4° (c = 2,1 EtOH).