Bakterie III. - Gramovo barvení a imerzní mikroskopie

Praktický průvodce mikrosvětem I.
116. Bakterie III. - Gramovo barvení a imerzní mikroskopie
116. Bakterie III. - Gramovo barvení a imerzní mikroskopie
Parametry úlohy
Obtížnost:
těžké
Časová náročnost:
80 minut
Materiálová náročnost:
středně náročné
Druh materiálu:
ostatní
Čím pozorujeme:
mikroskop
Téma:
Bakterie a sinice
Roční období:
září, říjen, listopad, prosinec, leden,
únor, březen, duben, květen, červen
MUDr. Jana Šmejkalová
Praktická lékařka, Tábor
Teoretický úvod
Barvení podle Grama je tzv. diagnostické barvení, to znamená, že pomáhá diagnostikovat – určovat bakterie a zařazovat je do
systému. Gramova reakce je založena na reakci některých látek v buněčné stěně bakterií s určitými barvivy. Buněčné stěny některých
bakterií obsahují kyselinu teichovou, která po obarvení krystalovou violetí a moření Lugolovým roztokem vytvoří pevný barevný
komplex (kyselina, barvivo, jód z IIK), který se nevymývá rozpouštědlem (alkoholem nebo acetonem či jejich směsí). V preparátu mají
tyto bakterie barvu krystalové violeti – fialovou až modofialovou. Jsou grampozitivní – G+. Druhá skupina bakterií neobsahuje
kyselinu teichovou v buněčné stěně, takže zmíněný komplex se netvoří a modrá violeť se rozpouštědlem vymývá. Po dobarvení
světlejším barvivem např. karbolfuchsinem nebo safraninem se tyto bakterie obarví na růžovo (příp. růžovočerveno). Jsou
gramnegativní – G-. Za určitých podmínek (stáří bakteriálních kultur, nevhodné kultivační podmínky apod.) se některé bakterie
mohou jevit jako gramlabilní anebo se z grampozitivních mění na gramnegativní. Gramovo barvení je tedy metodou potvrzující, nikoli
vyvracející. Jiný výsledek gramova barvení sám o sobě nevyvrátí zařazení druhu do systému, pokud není podpořen dalšími zkouškami,
např. biochemickými testy apod.
Imerzní mikroskopie je často používanou metodou v mikrobiologii, kde pozorované objekty mají velmi malé rozměry. Užívá se
pro zvýšení rozlišovací schopnosti. Mezi čočku objektivu a pozorovaný objekt se dává imerzní olej (např. oleum cedri = cedrový olej) –
kapalina, jejíž index lomu je stejný jako index lomu skla, nedochází proto ke zkreslení tvarů a zvyšuje se ostrost pozorovaných
objektů – získáme věrný obraz. U velmi podrobných pozorování se používá dvojitá imerze (imerzní olej se dává i mezi čočku
kondenzoru a sklíčko). Imerzní mikroskopii lze provozovat pouze u mikroskopu, který je vybaven imerzním objektivem (označen
jedním, častěji dvěma černými proužky; zvětšení zpravidla 100×).
Pro přípravu většiny barvených preparátů (zvláště při barvení bakterií) je třeba objekty fixovat. Účelem fixace je usmrcení buněk
(mrtvé buňky snáze přijímají barvivo) a lepší přilnutí buněk k podkladu, aby nebyly při barvení či oplachování odplaveny. Bakterie
fixujeme nejčastěji plamenem.
© 2010 Občanské sdružení Ve škole i mimo ni
1/3
http://mikrosvet.mimoni.cz
Praktický průvodce mikrosvětem I.
116. Bakterie III. - Gramovo barvení a imerzní mikroskopie
Materiál
Bílý jogurt s živou jogurtovou kulturou, případně kyselé mléko, kefír, zakysaná smetana či jiný mléčný výrobek obsahující
bakterie mléčného kvašení; senný nálev založený cca 2 týdny před praktickým cvičením; brambora v anaerobním rozkladu (založeno
cca týden před praktickým cvičením).
Pomůcky
Mikroskop, podložní a krycí sklíčko, lihový kahan, bakteriologická klička, kapátko, voda; barviva a činidla: krystalová violeť,
lugolův roztok, aceton – ethanolová odbarvovací směs, karbolfuchsin nebo safranin, imerzní olej.
Úkoly
Příprava před praktickým cvičením
●
●
●
Zhruba dva týdny před konáním praktického cvičení dejte do sklenice hrst sena a zalijte jí vodou z rybníka, potoka nebo sudu
(ne chlorovanou vodou z vodovodu). Senný nálev nechte stát při pokojové teplotě. Na povrchu nálevu se vytvoří bakteriální
blanka.
Zhruba týden před praktickým cvičením připravíme bramboru – do středně vělké omyté brambory vyvrtáme (vyřízeme) otvor
a naplníme jej zahradní zeminou. Takto upravenou bramboru dáme do zavařovací lahve nebo větší kádinky, nádobu naplníme
až po okraj vodou a necháme stát v teple (např. při pokojové teplotě). V průběhu několika dní můžeme pozorovat tvorbu
plynu: na hladině se utváří bakteriální blanka, brambor po několika dnech vyplave k hladině a páchne. Rozklad bramboru
zapříčila anaerobní bakterie Clostiridium butyricum, která by měla být převažujícím druhem při pozorování.
3 – 4 dny necháme vzorek kravského mléka stát v teple, aby mléko zkyslo (pro kysnutí je nutné používat mléko získané přímo
od krávy, mléka s dlouhou trvanlivostí prodávaná např. v krabicích schopnost pravého kysnutí ztrácejí).
1. Pozorování bakterií mléčného kvašení v preparátu barveném metodou Gramova barvení
Z jogurtu či jiného mléčného výrobku, případně zkyslého mléka odeberte vyžíhanou bakteriální kličkou vzorek a přeneste jej do
kapky vody na podložním sklíčku. Pomocí kličky vzorek v kapce rozmíchejte a rozetřete po ploše sklíčka. Fixujte plamenem – to
znamená, že několikrát protáhnete sklíčko s rozetřeným preparátem těsně nad hořícím plamenem kahanu a to vzorkem nahoru nikoliv
do plamenu (sklíčko se nesmí příliš zahřát, protože vzorek nesmí být připálený – protahujte rychle a mezi jednotivými protaženími
chvilku počkejte, za fixovaný považujte preparát, ze kterého se působením tepla plamenu odpařila voda, tzn. že sklíčko je suché a je na
něm vidět zaschlý vzorek). Preparát nyní obarvěte následujícím postupem: kápněte kapku krystalové violeti a nechte působit
20 sekund. Bez opláchnutí přikápněte kapku Lugolova roztoku, který slijte i s původním barvivem (violetí) a hned poté znovu nakapte
dostatečné množství Lugolova roztoku a nechte působit 20 – 30 sekund. Následně preparát odbarvujte aceton-ethanolovou směsí
(pipetou, odbarvovací směs lijte opatrně na zešikmené sklíčko nad nátěr, přes preparát nechejte volně stékat a opakujte, dokud je
zřejmé, že se barvivo vymývá – tedy stékající tekutina je obarvená) a dobře opláchněte vodou (stříčkou nebo pipetou, proveďte opatrně
stejný postup jako při odbarvování). Preparát pak ještě dobarvěte zředěným karbolfuchsinem (event. safraninem) 30 – 60 sekund.
Nakonec preparát znovu opláchněte a nechte oschnout či opatrně osušte filtračním papírem. Připravený preparát pozorujte
s použitím imerze: Na obarvený suchý preparát bez krycího sklíčka kápněte kapku cedrového oleje; preparát umístěte na stolek
mikroskopu a zvolte imerzní objektiv! Opatrně přibližujte objektiv, až čočku namočíte do kapky oleje (sledujte ze strany, dejte si
pozor na proražení sklíčka!). Během pohlížení do okuláru oddalujte velmi pomalu mikrošroubem objektiv. Sloupec kapaliny oleje mezi
sklíčkem a čočkou se nesmí přerušit. Pokud jste objektiv příliš oddálili, opakujte postup (nikdy nepřibližujte objektiv při pohlížení do
okuláru, vždy kontrolujte pohledem z boku). Zakreslete tvary pozorovaných bakterií, zaznamenejte, zda jsou modré (grampozitivní),
nebo růžové/červené (gramnegativní). Po skončení pozorování dobře očistěte objektiv, případně i stolek mikroskopu a kondenzor
roztokem ethanolu. Stejně tak i sklíčka.
2. Pozorování bakterií máselného kvašení v preparátu barveném metodou Gramova barvení
Ze spodní strany povrchové blanky vytvořené ve sklenici s hnijícím bramborem odeberte bakteriologickou kličkou vzorek a
přeneste jej do kapky vody na podložním sklíčku. Rozetřete, fixujte plamenem, barvěte podle Grama a pozorujte v imerzi. Zakreslete
tvary pozorovaných bakterií, zaznamenejte, zda jsou modré (grampozitivní), nebo růžové/červené (gram negativní). Po skončení
pozorování dobře očistěte objektiv, případně i stolek mikroskopu a kondenzor roztokem ethanolu. Stejně tak i sklíčka.
3. Pozorování bakterií ze senného nálevu v preparátu barveném metodou Gramova barvení
Z povrchové blanky vytvořené ve sklenici se senným nálevem odeberte bakteriologickou kličkou vzorek a přeneste jej do kapky
vody na podložním sklíčku. Rozetřete, fixujte plamenem, barvěte podle Grama a pozorujte v imerzi. Zakreslete tvary pozorovaných
bakterií, zaznamenejte, zda jsou modré (grampozitivní), nebo růžové/červené (gram negativní). Po skončení pozorování dobře očistěte
objektiv, případně i stolek mikroskopu a kondenzor roztokem ethanolu. Stejně tak i sklíčka.
Výsledky pozorování
V preparátu získaném z jogurtu či jiného mléčného výrobku pozorujeme bakterie modré. Všechny mléčné bakterie, které se
používají v mlékárenském průmyslu, jsou grampozitivní. Na obrázcích je vidět koky, diplokoky, streptokoky i tyčinky (bacily). Na naší
fotografii vpravo jsou bakterie spíš fialové než modré (pravděpodobně nedošlo k dostatečnému vymytí karbolfuchsinu). V preparátu
z bramboru jsme našli tyčinky obarvené do modra – grampozitivní. V některých tyčinkách je zřetelně vidět bílé oválné spóry. Umístění
spór na jednom konci buňky je typické pro bakterie rodu Clostridium. Na obrázku jsou pak vidět i růžové – gramnegativní buňky zcela
vyplněné spórami. V preparátu ze senného nálevu převažují bakterie gramnegativní, většinou tyčinkovité, v menší míře lze pozorovat
i grampozitivní kulovité buňky (koky, střeptokoky) nebo tyčinky.
© 2010 Občanské sdružení Ve škole i mimo ni
2/3
http://mikrosvet.mimoni.cz
Praktický průvodce mikrosvětem I.
116. Bakterie III. - Gramovo barvení a imerzní mikroskopie
Obrazová dokumentace
Bakterie mléčného kvašení (Lactobacillus sp.; Streptococcus sp.) – Grampozitivní tyčinky a koky.
Vlevo a uprostřed: Jogurt Activia; Vpravo: kyselé kravské mléko. Fixovaný preparát. Barveno podle
Grama; Pozorováno v imerzi. Mikroskop LP 3012-T; objektiv 100/okulár 10 + Nikon Coolpix L20
1 – streptokok (modrý = G+); 2 – diplokok (modrý = G+); 3 – tyčinka – bacil (modrá = G+)
Bakterie máselného kvašení (Clostridium butyricum) – Grampozitivní i gram negativní tyčinky se
spórami. Fixovaný preparát. Barveno podle Grama; Pozorováno v imerzi. Mikroskop LP 3012-T;
objektiv 100/okulár 10 + Nikon Coolpix L20
1 – tyčinka (modrá = G+); 2 – krátká tyčinka (růžová = G-); 3 – spóra
Bakterie senného nálevu (Bacteria) – Grampozitivní i gram negativní tyčinky a koky. Fixovaný
preparát. Barveno podle Grama; Pozorováno v imerzi. Mikroskop LP 3012-T; objektiv 100/okulár 10 +
Nikon Coolpix L20
1 – tyčinka (růžová = G-); 2 – streptokok (modrý = G+); 3 – tyčinka (modrá = G+); 4 – diplokok
(modrý = G+); 5 – spóra
© 2010 Občanské sdružení Ve škole i mimo ni
3/3
http://mikrosvet.mimoni.cz