Metody detekce a kvantifikace cyanotoxinů

METODY DETEKCE A KVANTIFIKACE CYANOTOXINŮ
Luděk Bláha 1,2), Pavel Babica 1,2), Blahoslav Maršálek 1,2)
1) RECETOX - Výzkumné centrum pro chemii životního prostředí a ekotoxikologii,
Masarykova univerzita, Kamenice 3, 625 00 Brno, e-mail: [email protected]
2) Botanický ústav AV ČR, Květná 8, 603 65 Brno
Pro stanovení cyanotoxinů bylo navrženo a v literatuře lze najít velké množství metod. Vlastní metody se liší především
podle typu toxinu, jehož analýza je cílem studie (rozdílné přístupy je třeba využít pro stanovení neurotoxických
alkaloidů a peptidických microcystinů apod.). Další různé metody je nutno využít pro analýzy v různých matricích
(biomasa sinic vs. volná voda vs. svalovina ryb apod.).
Diskutované metody lze využít k nejrůznějším účelům
1) preparace toxinů (tj. izolace a přečistění ze směsí);
2) studia toxického působení čistých cyanotoxinů;
3) k rychlé detekce a kvantifikace.
Nejobecněji lze oddělit 1) metody chemické - instrumentální a 2) metody biologické. Zatímco chemické metody jsou
založeny pouze na chemické struktuře biotoxinu, jeho velikosti, sterických vlastnostech a interakcích příslušné látky s
jinými chemickými individui; biologické metody reflektují specifický osud a efekty daného toxinu v živém organismu
(složky živého organismu - buňky, enzymy - nebo celé organismy jsou často využívány jako vlastní detekční systém).
Mezi oběma skupinami potom figurují detekční systémy založené na detekci pomocí protilátek - imunochemické
metody. Ačkoliv příprava protilátek nezbytně vyžaduje využití živých organismů, vlastní detekce je již obvykle rutinní
instrumentální analýzou.
V následujícím textu jsou shrnuty a diskutovány všechny tři hlavní skupiny metod. Komplexní přehled metod lze najít v
dostupné vědecké literatuře (Chorus and Bartram 1999), (Chorus 2001); dále v pracech autorů tohoto příspěvku (např.
Maršálek et al. 1996, Bláha and Maršálek 2000), ale také na internetovém serveru sdružení Flos-Aquae
(www.sinice.cz). Rozsáhlá knihovna relevantní literatury je k dispozici u autorů příspěvku - kromě anglické literatury
jsou dostupné i diplomové a dizertační práce v českém jazyce.
1. Chemické instrumentální metody
Z instrumentálních metod, které jsou v současnosti nejvíce využívány k průkazu a kvantifikaci biologických toxinů lze
jmenovat zejména 1) kapalinovou chromatografii (zejména její současnou modifikaci - vysokoúčinnou kapalinovou
chromatografii - HPLC), 2) plynovou chromatografii (GC). Zjednodušenému postupu při využití obou metod je
věnována hlavní část této podkapitoly.
Mezi moderní instrumentální metody patří dále například kapilární elektroforéza, která však v rutinních analýzách
doposud nemá pevné místo. Některé biotoxiny jsou s úspěchem semikvantitativně analyzovány pomocí tenkovrstevné
chromatografie (TLC); metoda byla využita např. pro rychlý průkaz sinicových toxinů - microcystinů.
O metodě, která bude použita pro detekci příslušného biotoxinu, rozhoduje chemická povaha dané látky a v mnoha
případech může být pro detekci jedné látky využito jak HPLC tak GC:
HPLC a GC
Pomocí obou chromatogratických metod lze dobře prokázat a kvantifikovat většinu organických nízkomolekulárních
látek (tj. cca o molekulové hmotnosti 1000 - 2000 a menší). Metoda HPLC vyžaduje aby látky byly dostatečně stabilní
v tekutém rozpouštědle, naopak u GC je předpokladem, aby studovanou látku bylo možno uvést do plynného
skupenství.
Vzorek (tj. nejčastěji hrubý extrakt) lze před analýzou (a to i před analýzou pomocí biologické metody) předčistit.
Předčistění vzorků využívá (obdobně jako vlastní analýza) znalostí o chemických vlastnostech studovaného
cyanotoxinu a ho (a chemicky jemu přibuzné látky) od ostatních složek směsi. (tj. od složek nepodstatných, balastních).
Součástí předčistění může být rovněž převedení velkého objemu extraktu do menšího množství vzorku, tj.
zakoncentrování. Nejběžnějšími metodami předčištění vzorků ve kterých předpokládáme cyanotoxiny jsou:
1) metody využívající kolon naplněných gely o definovaných porech nebo mikro- a ultrafiltrací - metody jsou založeny
na dělení složek podle velikosti molekuly - molekulové hmotnosti (zpravidla je cílem separovat nízkomolekulární
biotoxiny od proteinů, které jsou univerzální součástí extraktů biologických vzorků);
2) metody extrakce na pevné fázi (SPE, Solid Phase Extraction) využívají kolon naplněných charakteristickými typy
sorbentů. Po nanesení vzorku na připravenou kolonu, dochází podle typu sorbentu k interakcím s komponentami
naneseného vzorku - některé komponenty jsou se sorbentem nekovalentně vázány silněji než jiná individua. Např. často
užívané oktadecylové sorbenty (označované např. jako C18 kolony) umožňují oddělit látky (tj. předčistit vzorek) podle
hydrofobicity. Jiné sorbenty mohou využívat různě intenzivních interakcí bazických a kyselých komponent ve vzorku
apod.
Po eventuálním předčistění je vzorek nanesen na analytickou kolonu. V případě HPLC je vzorek po aplikaci unášen
proudem kapaliny, u GC proudem plynu. Kapalina při HPLC (plyn při GC) tvoří tzv. mobilní fázi, zatímco náplň
analytické kolony je nazývána fází stacionární. Během unášení vzorku přes kolonu dochází ke kontaktu jednotlivých
složek vzorku s náplní kolony a separaci jednotlivých složek
Výsledek (úspěšnost) separace závisí zejména na
1) zvolené kombinaci mobilní fáze / stacionární fáze (nejčastěji používanou modifikací HPLC pro detekci cyanotoxinů microcystinů je reverzně fázová chromatografie na oktadecylových sorbentech (C18) v kombinaci s mobilní fází
tvořenou kombinací voda/metanol/acetonitril); 2) rychlosti pohybu mobilní fáze; 3) složení vzorku (obsahuje-li vzorek
množství látek, které jsou chemicky velmi podobné studovanému toxinu, bude separace obtížnější); 4) dalších
parametrech (teplota apod.).
Po separaci na koloně nutně následuje krok zviditelnění jednotlivých komponent - tj. detekce. Mobilní fází
unášené separované složky vzorku vstupují do detektoru, kde mohou být "zviditelněny" díky dalším charakteristickým
chemickým vlastnostem:
1) absorbance - pohlcení světla látkou při pohybu přes monochromatický paprsek v detekční cele je zaznamenáno v
UV-VIS detektorech
2) pokročilou podobou UV-VIS detektorů s nastavitelnou vlnovou délkou paprsku jsou detektory s diodovým polem
(označované např. PhotoDiode Detectors, PDA; DiodeArray Detector, DAD); při průchodu látky detekční celou je
zaznamenána absorbance při různých vlnových délkách a získaného absorbčního spektra lze využít např. pro potvrzení,
že v daném čase vystupuje z kolony opravdu příslušná látka (srovnáním s absorbčním spektrem čistého standardu) PDA detektory jsou nejčastěji využívány při analýzách microcystinů (viz také dále)
3) fluorescencí chemické látky (fluorescenční detektory);
4) elektrochemický detektor (ECD, základní detektor k GC) zaznamenává při průchodu látky detekční celou změny v
elektrickém oblouku
5) radiometrický detektor sleduje intenzitu ionizujícího záření (aplikace radiometrického detektoru vyžaduje přítomnost
radioaktivními nuklidy značených látek ve vzorku; např. přídavky značeného toxinu apod.)
4) hmotnostní spektrometr (MS) je volitelnou nástavbou, která je častou součástí sestav GC, ale v současnosti i HPLC.
MS mimo jiné umožňuje na základě stanovení molekulové hmotnosti iontů (fragmentů parentálním molekuly) potvrdit,
že v daném retenčním čase vystupuje z analytické kolony opravdu studovaný analyt (toxin).
Pro kvantifikaci se nejčastěji využívá metoda externího standardu (je připravena kalibrační ředící řada čisté látky
(standardu) a pro každou koncentraci je provedena analýza). Po sestavení kalibrační křivky (absorbance vs.
koncentrace) lze potom u neznámého vzorku přepočítat pozorovanou změnu na koncentraci. Při kvantifikaci interním
standardem je neznámý vzorek rozdělen na dva díly a do jednoho je přidáno známé množství čisté látky; po analýzách
obou vzorků lze od sebe odečíst získané záznamy (chromatogramy) a vyhodnotit koncentraci v neznámém vzorku.
Microcystiny a nodulariny.
Nejpoužívanějšími metodami pro analýzu hepatotoxinů jsou vysokoúčinná kapalinová chromatografie (HPLC),
kapilární elektroforéza (CE) a vysokoúčinná chromatografie na tenké vrstvě (HPTLC). Z méně používaných metod lze
jmenovat "liquid secondary ion mass spectroscopy" (LSIMS) (Reinhart a kol., 1988) nebo kombinaci "frit fast atom
bombardment liquid chromatography / mass spectroscopy" (FRIT FAB LC/MS; Kondo a kol., 1992). I když se jedná o
vysoce citlivé a selektivní metody, jsou omezeny pouze na specializované a náročně vybavené laboratoře, neboť se
jedná o velmi drahé přístroje (Bláha, Maršálek, 2000). HPTLC je při analýze hepatotoxinů používána jako
semipreparativní metoda a pro kontrolu čistoty purifikovaných toxinů. Výhodou této metody je možnost analyzovat
vzorky sinic s podílem nečistot, které neabsorbují v UV oblasti (Lanaras, Cook, 1994).
CE je metodou, která prožívá intenzivní instrumentální a aplikační rozvoj. Umožňuje rychlé a účinné separace analytů s
jejich následnou kvantifikací a případně analýzou chemické struktury (spojení s hmotnostním detektorem). Problémem
CE je nižšší citlivost připojených UV-VIS detektorů, daná krátkou optickou dráhou (přibližně trojnásobek rozměru
kapiláry). Využití detektoru s diodovým polem (Diode Array Detector DAD) je tedy omezeno na poměrně
koncentrované vzorky. Zvýšení citlivosti na úroveň požadovanou pro analýzu nízkých koncentrací lze dosáhnout
použitím fluorescenčního detektoru s laserovým buzením. Metoda vyžaduje ovšem derivatizaci nefluorescenčních
toxinů vhodným činidlem (OPA, dansylchlorid). Tak lze analyzovat současně některé hepatotoxiny a neurotoxiny
(Bláha, Maršálek, 2000; Harada a kol., 1999).
Zařízení pro HPLC je dnes, na rozdíl od CE, běžným vybavením analytických laboratoří a HPLC je nejpropracovanější
a také nejrozšířenější metodou pro purifikaci a stanovení hepatotoxinů (Harada a kol., 1999). Nejčastější aplikací
stanovení je reverzně fázová HPLC na oktadecylových kolonách. Microcystiny a nodulariny mají charakteristické
absorbční maximum při 238 nm, proto lze pro detekci využít UV-VIS detektor. S výhodou jsou pro identifikaci různých
forem microcystinů ve vzorku využívány PDA detektory. Analyt s charakteristickým spektrem (pokles v absorbanci v
intervalu 200 - 230 nm, maximum při 238 a opět pokles v absorbanci již do 250 nm a dále) lze ve vzorku extraktu sinic
přímo označit za microcystin bez nutné validace dalšími metodami. Příklad komplexního HPLC-DAD chromatogramu
vzorku sinic s 9 různými variantami microcystinů a jejich charakteristickými UV-VIS spektry je na obrázku 1.
Obr. 1. Chromatogram analýzy microcystinů v biomase sinic (HPLC-DAD). Podle UV-VIS spekter (horní část
obrázku) identifikováno 9 variant microcystinů - u všech je charakteristické absorbční maximum při 238 nm.
Sinicové neurotoxiny.
V literatuře lze nalézt aplikace využívající GC k detekci environmentálně významného neurotoxinu produkovaného
vybranými rody sinic - anatoxinu(a). Tento nejdéle známý sinicový neurotoxin je ve vybraných světových laboratořích
detekován v biomase sinic pomocí kombinací GC s ECD, resp. ECD/MS. Byla popsána také podobná metoda pro
současný průkaz anatoxinu(a) a saxitoxinů (další sinicové neurotoxiny) pomocí GC spojeného s ESI/MS.
2. Imunochemické metody
Imunochemické metody jsou založeny na rozpoznávání prostorových struktur analyzovaných objektů (cyanotoxinů)
pomocí specifických protilátek, tj. vysokomolekulárních proteinů, které jsou produkovány buňkami imunitního systému
obratlovců (B-lymfocyty) a podle typu vykazují protilátky selektivní afinitu k různým strukturám (antigenům), resp.
jejich substrukturám (epitopům).
Před kteroukoliv imunochemickou analýzou pro detekci antigenu je nutné získat protilátku, která byla připravena
specificky proti příslušnému antigenu (tj. cyanotoxinu). V současnosti lze komerčně získat protilátky proti
microcystinům z různých zdrojů:
1) pomocí imunizace velkých zvířat (opakovanou injekční aplikací netoxických dávek toxinu do králíků, ovcí, koz,
krav, koní apod. se po určité době v krevní plazmě naindukují vysoké koncentrace (titry) anti-toxinových protilátek;
zvíře je poté usmrceno a po vykrvení se získává polyvalentní (polyklonální) sérum, které lze následně využít pro
detekci toxinu);
2) přípravou monoklonálního myšího séra (po opakované imunizaci myší toxinem jsou izolovány jednotlivé
lymfocyty; následně jsou imortalizovány fúzí s nádorovými buňkami; selekční procedurou je poté izolován jediný klon
buněk, který lze dlouhodobě kultivovat a který do média produkuje právě jednu formu protilátky, která selektivně
rozpoznává studovaný toxin).
Imunologické metody využívající značku jsou nejrozšířenější variantou metod využívajících protilátky. pro detekci
cyanotoxinů. Před vlastní detekční reakcí (tj. před stanovením) se protilátka "označí", tj. chemicky váže s dobře
detekovatelnou "značkou". Takovou značkou jsou nejčastěji kovalentně vázané fluorescenční látky (imunofluorescenční
stanovení - FIA, jako značka se nejčastěji využívá fluoresceinisothiokyanát, FITC); jako značka může sloužit
radioaktivní atom (radioimunologická stanovení - RIA, jako značka se užívá 125I, 3H nebo 14C); jako značku lze užít i
jiný protein - enzym (imunoenzymová stanovení - EIA, nejrozšířenějšími značkami jsou na protilátku kovalentně
vázaná křenová peroxidáza nebo bakteriální alkalická fosfatáza).
Nejčastější aplikací je průkaz toxinů v mikrotitračních destičkách - heterogenní imunoenzymová analýza
(heterogenní = vyžadující oddělení vzniklých imunokomplexů od volné značené protilátky). Nejběžnější metodou EIA
v mikrodestičkách je tzv. ELISA (enzyme-linked immunosorbent assay), která, jak již vysvětlení zkratky napovídá,
využívá sorbce jedné ze složek reakce (antigenu nebo protilátky) na povrch mikrodestičky. Byla vyvinuta celá řada
modifikací pro nejrůznější typy významných biotoxinů - komerčně jsou dostupné ELISA kity pro průkaz sinicových
hepatotoxinů (microcystinů). Některé z protilátek, jejichž charakterizaci lze nalézt v odborné literatuře a které byly
připraveny původně pro vědecké účely, jsou dnes součástí komerčních souprav. Tyto umožňují instrumentálně
nenáročně prokázat a kvantifikovat microcystiny v povrchových vodách apod. Ačkoliv samotný průkaz je již
instrumentálně nenáročný, cena komerčních souprav je díky náročné přípravě a purifikaci specifických protilátek
vysoká (kvantifikace jednoho vzorku - tj. zpravidla stanovení 3-4 koncentrací se pohybuje v řádu několika tisíců korun).
Nejlépe dostupným ELISA nástrojem pro stanovení microcystinů je v současnosti kit americké společnosti
ENVIROLOGIX (www.envirologix.com). Jeho detekční limit je v oblasti 0.1 ppb a je velmi vhodným nástrojem pro
rychlou detekci cyanotoxinů ve vodných vzorcích nebo komplikovaných matricích (byly publikovány práce stanovení
microcystinů pomocí ELISA v tkáních organismů, sedimentech apod.). Mezi hlavní nevýhody využití ELISA metod
patří problém stanovení fragmentů nebo konjugátů microcystinů, které již nemusí vykazovat toxickou reakci (ELISA
detekuje prostorové strukturní charakteristiky a ne chemická individua). Další nevýhodou je možnost cross-reaktivity s
podobnými strukturami a tím identifikace falešně pozitivních vzorků.
3. Toxikologické přístupy stanovení cyanotoxinů
Mezi toxickými produkty sinic byly doposud nejvíce studovány dva typy toxických látek - hepatotoxické a
neurotoxické metabolity. Kromě těchto dvou typů toxických produktů však sinice mohou produkovat celou řadu
toxických metabolitů, které sice nemusí působit akutní intoxikace nebo smrt, ale v důsledku dlouhodobých působení
nízkých koncentrací může docházet k jiným obtížněji sledovatelným změnám fyziologického stavu organismu.
Mezi chornicky působícími toxiny byly z hlediska zdraví savců a člověka doposud prokázány zejména imunosupresivní
látky a také produkty způsobující nespecifickou toxicitu proti savčím buňkám - cytotoxiny. Inhibice, suprese či naopak
hyperstimulace funkcí imunitního systému může mít mnohé nebezpečné vedlejší efekty - kromě nebezpečí tvorby
nejrůznějších alergií může dojít také k vytvoření stabilně suprimovaných stavů, kdy je organismus snadno a často
napadán patogenními organismy (bakteriemi, viry) nebo v horším případě také organismy, které jsou pro zdravý
organismus zcela neškodné.
Mimo to lze při studování toxicity metabolitů sinic vodního květu prokázat látky působící jako specifické inhibitory
řady enzymů, tvorbu nádorů podporující metabolity a také látky s embryotoxickými a teratogenními vlastnostmi.
Dalšími specifickými aktivitami toxických metabolitů sinic je interakce s detoxikačními enzymy jater. Mnohé cizorodé
látky přítomné v prostředí jsou v organismu obratlovců transformovány právě těmito enzymy, které tak umožňují jejich
detoxikaci, snadnější vyloučení z těla apod. Na druhé straně však po transformaci některých látek (např.
polyaromatických uhlovodíků) dochází ke zvýšení toxicity nebo ke vzniku nových typů toxického působení genotoxicita, mutagenita apod. Ačkoliv byla u hrubých extraktů sinic prokázána specifická interakce s detoxikačními
enzymy, je tento směr výzkumu toxických sinicových metabolitů doposud opomíjen.
Dalším specifickým mechanismem toxicity, který byl prokázán v extraktech sinic je stimulace oxidačních procesů
(oxidativní stres). Při procesech oxidativního stresu dochází na jedné straně k poškozování funkcí a struktury
cytoplazmatických membrán v somatických buňkách. Na druhé straně však oxidační procesy zasahují do regulačních
drah proliferace tělních buněk a mohou tak v důsledku vést i ke vzniku buněk dělících se nekoordinovaně - vyvolání
tvorby nádorů.
V posledních letech nabývají na důležitosti také informace o přítomnosti xenoestrogenních látek v prostředí. Jedná se o
cizorodé metabolity působící v savčím organismu podobně jako pohlavní hormony - jejich prostorová struktura je
podobná struktuře hormonů a xenoestrogení látky tak v organismu maskují jejich funkci. Bylo prokázáno, že přítomnost
takových látek v prostředí způsobuje narušení hormonální rovnováhy v těle s následnými až fatálními důsledky
(sterilita, malformace apod.). Přestože lze s velkou pravděpodobností předpokládat produkci podobných metabolitů také
u sinic vodního květu, nebyla doposud ve vědecké literatuře podána žádná informace v tomto směru.
Vodní květy jsou velmi komplexní směsí různých druhů organismů, které svou metabolickou činností produkují velkou
řadu toxických látek s různým mechanismem. Současný výskyt takových metabolitů se navíc často potencuje a dochází
ke vzniku a rychlejšímu rozvoji toxických a zdraví poškozujících projevů. Jako příklad lze uvést současné působení
imunosupresivních látek a látek způsobujícíh oxidační stres, kdy je významně zvýšena pravděpodobnost vzniku
různých typů nádorů.
Nastíněné skutečnosti prokazují nezbytnost komplexního studia toxických nebo jiných aktivit produktů sinic
vodního květu. Zatímco instrumentální metody poskytují informace o přítomnosti a množství chemických individuí,
biologické (toxikologické) postupy umožňují stanovení skutečné toxicity ve vzorku (=celkové toxicity nebo toxického
potenciálu vázaného na určitý mechanismus toxického efektu). I přes zmíněnou heterogenitu toxických efektů
identifikovaných v biomase sinice je studium toxinů sinic doposud omezeno na hepatotoxické microcystiny a
neurotoxické anatoxiny. Zřejmým důvodem je fakt, že tyto dva typy toxinů byly prostudovány a často jsou
produkovány ve vysokých množstvích a lze tak při testech akutní toxicity prokázat přímý toxický efekt. Podcenění nebo
opomenutí jiných spíše chronicky působících metabolitů může vést k ne zcela zřejmě pozorovatelným efektům, na
druhé straně však vede k celkovému zhoršení zdravotního stavu organismu.
V následujících částech textu jsou podrobněji diskutovány metody a způsoby sledování toxických aktivit hlavních
identifikovaných toxických produktů vodních květů - tj. hepatotoxinů (microcystiny a nodulariny) a neurotoxinů
(anatoxin-a, anatoxin-a(S) apod.). Současně jsou zmíněny metody a typy toxicity, které jsme v naší laboratoři v
současné době schopni realizovat a metody vyvíjené.
3.1 Stanovení hepatotoxinů
Dlouholetým mezinárodním výzkumem bylo ukázáno, že hepatotoxické metabolity sinic mají převážně strukturu
cyklických peptidů a byly podle chemické struktury a rodů sinic, které je nejčastěji produkují označeny jako
microcystiny (r. Microcystis) nebo nodulariny (r. Nodularia).
Z hlediska mechanismu působení nejčastějších sinicových hepatotoxinů - microcystinů bylo ukázáno, že působí jako
inhibitory 2 typů enzymů - proteinfosfatáz 1 a 2A. Tyto enzymy se vyskytují v různé strukturní variabilitě v naprosté
většině živých organismů. Tyto enzymy katalyzují odštěpení fosfátové skupiny přítomné ve struktuře jiných proteinů a
jejich hlavním posláním a funkcí je zabezpečovat rovnováhu v buňkách. Odštěpování fosfátů z molekuly proteinů je
jedním z mnoha buněčných regulačních mechanismů a dojde-li k inhibici fosfatáz je narušena regulační rovnováha a v
konečném důsledku hrozí buněčná smrt, nebo v opačném případě zvrhnutí buňky a vytvoření buňky nádorové. Uvedená
fakta ukazují na důležitost sledování selektivní toxicity hepatotoxinů přítomných v biomase sinic, protože jejich
přehlížení může vést až k tvorbě jaterních nádorů. V odborné literatuře byla řada takových případů popsána.
Nejčastější způsob sledování selektivní in vitro hepatotoxicity v sinicové biomase je založen právě na znalosti
mechanismu toxicity microcystinů. V testu inhibice fosfatáz 1 (nebo 2A) se sleduje aktivita enzymu, ke kterému byl
přidáván extrakt ze sinicové biomasy. Další metodou zaměřenou na specifické stanovení in vitro hepatotoxicity je
sledování toxicity na základě aktivit izolovaných jaterních buněk.
Stanovení hepatotoxinů - testy inhibice proteinfosfatáz
Forma - radioaktivní stanovení
1. Čistý purifikovaný enzym (k dispozici je komerčně od několika firem) se podle své optimální aktivity ředí v pufru a k
pufru s enzymem přidává extrakt z biomasy sinic ve vhodné ředící řadě.
2. Po předepsané době inkubace se k enzymu přidává modelový substrát enzymu značený radioaktivním fosforem (k
dispozici komerčně). Po předepsané vhodné reakční době (kdy enzym štěpí modelový substrát a uvolňuje fosforylovou
skupinu) se v počítači radioaktivních částic stanoví aktivita fosforu uvolněného do média, nebo zbytková aktivita
značeného substrátu.
3. Z porovnání s aktivitou původního značeného substrátu se vyvodí míra inhibice enzymu - hepatotoxicita
microcystinů. V případě přítomnosti microcystinů ve vzorku, došlo k inhibici fosfatázy a množství odštěpeného
radioaktivního fosforu z modelového substrátu je nižší ve srovnání s kontrolním pokusem.
Vzhledem k nutnosti práce s radioaktivitou není tato metoda nyní často využívána a k dispozici jsou další modifikace
(viz dále).
Forma - kolorimetrické stanovení
1. Stejný postup jako v případě radioaktivního stanovení.
2. Po předepsané době inkubace se k enzymu přidává modelový substrát enzymu (k dispozici komerčně), jehož
absorbční vlastnosti se mění v průběhu enzymové reakce fosfatázy. V případě, že je ze substrátu odštěpena fosforylová
skupina má nově vzniklá látka (bez fosforu) jinou barvu a absorbuje v jiné části spektra. Na spektrofotometru (resp.
readeru mikrotitračních destiček) se sleduje rychlost tvorby barvy nové látky.
3. Z porovnání rychlosti tvorby nového barevného produktu s kontrolním pokusem se stanoví míra inhibice fosfatázy.
V případě přítomnosti microcystinů ve vzorku, došlo k inhibici fosfatázy a barevný produkt se tvoří pomalu nebo v
případě 100% inhibice nedochází k jeho tvorbě vůbec.
Modifikaci metody jsme schopni metodicky zvládnout (laboratoře jsou vybaveny veškerými potřebnými přístroji) a na
jejím možném zavedení se v současné době pracuje. Dochází však současně k posouzení citlivosti metody s další
modifikací této metody.
Forma - luminometrické stanovení
1. Stejný postup jako v případě radioaktivního stanovení.
2. Po předepsané době inkubace se k enzymu přidává modelový substrát enzymu - luciferin fosfát (k dispozici
komerčně). V případě, že je ze substrátu odštěpena fosforylová skupina má nově vzniklá látka (bez fosforu)
luminiscenční vlastnosti a v případě přítomnosti enzymů luminiscenčního systému izolovaného ze světlušek lze
následně na luminometru (resp. luminiscenčním readeru mikrotitračních destiček) stanovit produkci světelných kvant luminiscenci.
3. Z porovnání luminiscence s kontrolním pokusem se stanoví míra inhibice fosfatázy. V případě přítomnosti
microcystinů ve vzorku, došlo k inhibici fosfatázy a míra luminiscence je snížena. V případě 100% inhibice nelze
produkci světla stanovit.
Luminiscenční formu metody jsme schopni metodicky zvládnout (laboratoře jsou vybaveny veškerými potřebnými
přístroji). Luminiscenční metody jsou obecně vysoce citlivé, nákladnost jejich provedení je však s výše uvedenou
kolorimetrickou modifikací výrazně vyšší.
Stanovení hepatotoxinů - v buněčné kultuře hepatocytů
Provedení tohoto typu stanovení hepatotoxicity microcystinů vyžaduje zvládnutí práce s buněčnými kulturami a také
přístrojové vybavení umožňující sledování změn jednotlivých aktivit v buňkách, které byly exponovány extraktu ze
sinic. Existují buněčné linie, které lze fakticky neomezeně kultivovat, uchovávat a využívat v laboratorní praxi. Tyto
buňky mají narušenu regulaci buněčného dělení - jedná se o buňky, které byly izolovány z nádorů. K dispozici je
několik typů takových buněk připravených z jaterních nádorů, které by tak mohly sloužit jako modelový systém pro
sledování in vitro hepatotoxicity. Nevíhodou plynoucí z narušené regulace těchto buněk jsou však nežádoucí změny v
aktivitách oproti původním - „zdravým“ jaterním buňkám, které využití permanentních linií odvozených z jaterních
buněk pro sledování toxicity microcystinů neumožňují.
Byla však vypracována metodika, využívající čerstvě izolovaných jaterních buněk - hepatocytů, které sice nelze
uchovávat a kultivovat po delší dobu, jejich vlastnosti a aktivity se však maximálně blíží aktivitám buněk přímo v těle.
Ačkoliv je nutno před každým stanovením izolovat z jater laboratorních zvířat nové hepatocyty, je tato metoda stále
eticky velmi příznivá ve srovnání s testy toxicity přímo na myších, protože na buňkách izolovaných z jednoho
laboratorního zvířete lze současně stanovit v dostatečném počtu opakování velké množství vzorků. V případě přímého
testu toxicity na myších je pro stanovení toxicity pouze jednoho vzorku nutno využít nejméně 9 myší.
Metodu stanovení hepatotoxicity na buněčné kultuře hepatocytů v současnosti provádíme.
Vlastní provedení sleduje následující postup. Laboratorní zvíře je podrobeno totální anestezi injekcí narkotika. Poté jsou
metodou dvoukrokové jaterní perfuze izolovány jaterní buňky - hepatocyty. Zvíře je v úplné narkoze usmrceno.
Hepatocyty se ve vhodné koncentraci v kultivačním médiu dávkují do předem připravených kultivačních nádob
(mikrotitrační desky) a poté se několik hodin stabilizují v termostatu.
K buňkám je následně vyměněno médium a ve vhodné ředící řadě jsou přidány se přidává sledovaný vzorek. Po vhodné
době inkubace (24 - 48 hodin) se pomocí biochemických a molekulárně-biologických metod sledují parametry buněčné
vitality.Existuje velké množství parametrů charakterizujících poškození buněk a v naší laboratoři jsme schopni sledovat
několik z nich:
1. stanovení aktivity oxidoredukčních enzymů - MTT test Aktivitu oxidoredukčních enzymů (oxidoreduktáz) lze
poměrně citlivě stanovit pomocí modelových substrátů, podobně jako bylo popsáno v případě stanovení inhibice
fosfatáz kolorimetrickou metodou. Oxidoreduktázy redukují modelový substrát a tím mění jeho barevné vlastnosti dochází k tvorbě nových barevných produktů, které lze na spektrofotometru stanovit. V případě kdy došlo k toxickému
působení látek přítomných v extraktu ze sinic je narušena buněčná rovnováha a aktivita oxidoreduktáz je snížena pozorujeme pomalejší tvorbu barevného produktu.
2. stanovení celkového poškození buněk . Jako při vyšetřování poškození jater u člověka - tzv. jaterními testy, kdy se
vyšetřuje přítomnost jaterních enzymů v krvi, lze obdobnou metodiku využít pro stanovení in vitro hepatotoxicity
sinicových metabolitů. U zdravých buněk, které nebyly poškozeny jsou aktivity tzv. jaterních enzymů prokazatelné
pouze uvnitř buněk - v cytoplazmě. Dojde-li však k poškození nebo destrukci buněk, jsou tyto enzymy vyplaveny a lze
jejich aktivity měřit i v okolním médiu. Mezi takovými enzymy, na základě kterých lze odvodit hepatotoxicitu se
stanovuje laktátdehydrogenáza (LDH), aspartáttransferáza (AST), alanintransferáza (ALT) a další. Stanovení aktivit
těchto enzymů v okolním médiu laboratorně kultivovaných buněk se provádí po vhodné expozici pomocí speciálních
kolorimetrických modelových substrátů (kdy dochází k tvorbě nových barevných produktů obdobně jako v případě
sledování inhibice fosfatáz).
3. stanovení selektivní propustnosti buněčné membrány. U živých a zdravých buněk je buněčná membrána selektivně
propustná pouze pro některé látky. V případě kdy dojde k poškození buňky (nebo k jejímu usmrcení), přestanou
mechanismy řídící selektivní propustnost fungovat a buněčná membrána se stává plně propustnou. Tohoto faktu
využívá test stanovení selektivní propustnosti buněčné membrány pomocí modelové látky (propidiumiodid - PI), která u
zdravých buněk nedokáže překonat buněčnou membránu, naopak vniká do buněk poškozených a následně ji lze
prokázat ve vnitřním buněčném prostoru - v cytoplazmě. Vlastní stanovení se provádí na průtokovém cytometru,
přístroji, který měří individuální parametry jednotlivých buněk a dokáže také rozlišit na základě fluorescence buňky
poškozené (obsahující PI v cytoplazmě) od zdravých - nefluoreskujících buněk.
3.2 Stanovení neurotoxinů vodních květů
Na základě výsledků mezinárodního výzkumu bylo zjištěno, že neurototoxické metabolity sinic mají nejen různou
chemickou strukturu, ale také různé mechanismy toxického působení proti nervovému systému. V následující části jsou
popsány jednotlivé známé neurotoxiny sinic a jejich mechanismy toxicity a možnosti jejich stanovení v biomase
vodních květů.
Anatoxin-a
Anatoxin-a je látkou, která má v nervovém systému podobné vlastnosti jako přirozený přenašeč nervových signálů acetylcholin. Jeho toxicita se projevuje v nadměrné dráždivosti nervových zakončení, protože jeho aktivita není
regulována (oproti aktivitě přirozenému acetylcholinu). Neřízené dráždění nervových zakončení vede u obratlovců ke
křečím a následné smrti. Vzhledem ke zcela zvláštnímu mechanismu toxicity anatoxinu-a nebyla doposud vypracována
alternativní metoda stanovení toxicity. Jedinou možnou metodou v současnosti zůstává test toxicity na myších.
Anatoxin-a(S)
Anatoxin-a(s) působí jako inhibitor acetylcholinesterázy, enzymu, který je zodpovědný za regulaci přenosu nervového
signálu mezi buňkami. V případě, kdy je aktivita acetylcholinesterázy inhibována, dochází k nekontrolovatelnému
dráždění nervových zakončení vedoucí v živém organismu k smrti v křečích. Stanovení anatoxinu-a(s) je založeno na
měření aktivity purifikovaného enzymu, který byl exponován vzorku biomasy sinic. Jako modelový substrát se využívá
modelový ester, který je enzymem štěpen a vzniká barevný produkt, který je stanoven spektrofotometricky. Metoda je
velice citlivá a v současnosti je jedinou alternativou využití testu toxicity na myších. Problémem však je častá falešná
pozitivita toxicity vyvolaná přítomností jiných inhibitorů acetylcholinesterázy, mezi které patří hojně používané
organofosforové insekticidy.
Saxitoxiny a aphanotoxiny
Saxitoxiny a aphanotoxiny jsou zvláštními skupinami sinicových neurotoxinů. Jejich struktura i mechanismus toxicity
je obdobný jako u toxinů mořských měkkýšů, způsobující tzv. paralytic shellfish poisons (PSPs). Tyto látky fungují na
buněčné úrovni jako blokátory sodíkových kanálů přítomných na povrchu nervových buněk (v cytoplazmatické
membráně). Řízený proces vypouštění a nasávání iontů sodíku (Na+) je důležitým procesem při šíření nervového
signálu po nervovém vlákně. Zablokování sodíkových kanálů vede k zastavení přenosu nervových signálů, což se
nejdříve vizuálně projeví na vegetativních funkcích - zejména dýchání. Výsledkem intoxikace saxitoxiny je nejčastěji
udušení. Pro stanovení specifické toxicity tohoto typu toxinů sinic byla vypracována a v naší laboratoři je zavedena
metoda využívající kulturu permanentní buněčné linie myších neuroblastů, které nesou ve své cytoplazmatické
membráně sodíkové kanály, podobně jako zdravé nervové buňky v organismu. Metoda využívá právě faktu, že
saxitoxiny a jim příbuzné toxiny fungují jako blokátory sodíkových kanálů.
Pro experiment se nakultivují neuroblasty ve vhodné koncentraci. Do jejich média se následně přidává modelová látka kanálový enhancer, která vyvolá nekoordinovaný únik sodíkových iontů z buněk přes sodíkové kanály. Kompletní vylití
iontů ve svém důsledku znamená smrt buňky. Současně se však k buňkám přidává extrakt ze sinicové biomasy. Jestliže
je přítomen saxitoxin nebo aphanotoxin, dojde k zablokování sodíkových kanálů a buňky přežijí. Následně se stanoví
vitalita buněk pomocí některého jednoduchého testu - např. kolorimetrického testu aktivity oxidoreduktáz (viz nahoře).
Z rozdílu vitality různě ošetřených buněk lze následně usoudit na přítomnost nervových blokátorů v sinicové biomase a
jejich toxicitu.
4. Aspekty kvantifikace microcystinů ve vodním prostředí
Mezi nejprostudovanější cyanotoxiny patří microcystiny, jejichž kvantifikace je nejvíce propracována. Microcystiny
zřejmě nejsou cyanobaktériemi aktivně vylučovány vůbec anebo jen v omezené míře a jejich únik ze zdravých buněk je
minimální. Do prostředí se uvolňují ze senescentních nebo lyzujících buněk sinic (Sivonen and Jones 1999; Welker et
al. 2001). Nejčastějším způsobem vyjádření obsahu intracelulárních toxinů je jejich hmotnost v mikrogramech vztažená
na gram suché biomasy sinic, méně často na obsah chlorofylu-a, na objem čerstvé biomasy nebo na buňku (Fastner et
al. 2001). Při znalosti množství biomasy sinic v nádrži vyjádřené v příslušných jednotkách je pak možné vypočítat
koncentraci intracelulárních toxinů v mikrogramech na litr vody. Nejsou-li k dispozici chemické analýzy, počítá se u
vodních květů Microcystis s průměrným obsahem 0,2 pg microcystinů na buňku nebo 0,4 pg na µg chlorofylu-a (WHO
1998). Koncentrace intracelulárních microcystinů se mohou pohybovat od nulových hodnot až po několik mg.l-1 ve
velmi hustých vodních květech nebo sinicích navátých u pobřeží (Sivonen and Jones 1999; Chorus and Fastner 2001).
Stanovení extracelulárních, tj. ve vodě rozpuštěných microcystinů, není zatím zcela běžnou záležitostí. Jejich
koncentrace se vyjadřují v mikrogramech na litr vody a v pelagiálu, mimo oblasti kumulace sinic, dosahují většinou
hodnot od nedetekovatelných koncentrací do několika µg.l-1 a jen příležitostně více než 10 µg.l-1 (Ueno et al. 1996;
Duy et al. 2000; Chorus 2001). V místech hromadění sinic je obvykle většina microcystinů přítomna ve formě vázané v
buňkách a významné koncentrace extracelulárních microcystinů jsou výjimečné; omezeny na případy náhlého kolapsu
vodních květů, kdy mohou dosáhnout až stovek µg.l-1 (Jones and Orr 1994; Welker et al. 2001). Mezi koncentrací
extracelulárních a intracelulárních microcystinů nebyl pozorován žádný vztah (Fastner et al. 2001) a jejich poměr
zřejmě závisí na aktuální situaci (proudění vody, rychlost degradace microcystinů) a stavu populace sinic (stáří, podíl
odumírajících buněk). Celková koncentrace microcystinů ve vodě je pak dána součtem koncentrací extracelulárních a
intracelulárních microcystinů.
Poděkování
Autoři vysoce hodnotí trvalou podporu od sdružení Flos-Aquae (Brno) a Botanického ústavu AV ČR. Výzkumná
činnost je v současnosti podporována Grantovou agenturou ČR (grant č. 206/03/1215).
Použitá literatura
[1] BLÁHA L, MARŠÁLEK B. (2000). Metods for detection and quantification of cyanobacterial toxins-a review.
Algological Studies 99: 1-22.
[2] DUY TN, LAM PKS, SHAW GR, CONNELL DW (2000). Toxicology and risk assessment of freshwater
cyanobacterial (blue-green algal) toxins in water. Rev Environ Contam Toxicol 163: 113-186.
[3] FASTNER J, WIRSING B, WIEDNER C, HEINZE R, NEUMANN U, CHORUS I (2001). Microcystins and
hepatocyte toxicity. Cyanotoxins - Occurence, Causes, Consequences. I. Chorus. Berlin, Springer-Verlag: 22-37.
[4] CHORUS I (2001). Cyanotoxin occurence in freshwaters - a summary of survey from different countries.
Cyanotoxins - Occurence, Causes, Consequences. I. Chorus. Berlin, Springer-Verlag: 75-82.
[5] CHORUS I, ED. (2001). Cyanotoxins - Occurence, Causes, Consequences. Berlin, Springer-Verlag.
[6] CHORUS I, BARTRAM J, EDS. (1999). Toxic Cyanobacteria in Water: A Guide to Public Health Significance,
Monitoring and Management. London, E&FN Spon.
[7] CHORUS I, FASTNER J (2001). Recreational exposure to cyanotoxins. Cyanotoxins - Occurence, Causes,
Consequences. I. Chorus. Berlin, Springer-Verlag: 190-199.
[8] JONES G, ORR PT. (1994). Release and degradation of microcystin following algicide treatment of Microcystis
aeruginosa bloom in a recreational lake, as determined by HPLC and protein phosphatase inhibition assay. Water
Research 28: 871-876.
[9] MARŠÁLEK B, KERŠNER V, MARVAN P (1996). Vodní květy sinic. Brno, Nadatio flos-aquae.
[10] SIVONEN K, JONES G (1999). Cyanobacterial toxins. Toxic Cyanobacteria in Water: A Guide to Public Health
Significance, Monitoring and Management. I. Chorus and J. Bartram. London, E&FN Spon: 41-111.
[11] UENO Y, NAGATA S, TSUTSUMI T, HASEGAWA A, YOSHIDA F, SUTTAJIT M, MEBS D, PUETSCH M,
VASCONCELOS V. (1996). Survey of microcystins in environmental water by a highly sensitive immunoassay based
on monoclonal antibody. Natural Toxins 4: 271-276.
[12] WELKER M, STEINBERG C, JONES G (2001). Release and persistence of microcystins in natural waters.
Cyanotoxins - Occurence, Causes, Consequences. I. Chorus. Berlin, Springer-Verlag: 83-101.
[13] WHO (1998). Chapter 7: Freshwater algae and cyanobacteria. Guidelines for Safe Recreational-water
Environments, Volume 1: Coastal and Freshwaters, Draft for Consultation, World Health Organization: 125-209.