Metody molekulové spektrometrie pro kvantitativní analýzu léčiv

Evropský sociální fond
Praha & EU: Investujeme do vaší budoucnosti
11.Metody molekulové
spektrometrie pro kvantitativní
analýzu léčiv
Vadym Prokopec
[email protected]
11.Metody molekulové spektrometrie pro kvantitativní analýzu léčiv
12.NMR spektrometrie při analýze roztoků
13.Kvantitativní NMR spektrometrie
14.Hmotnostní spektrometrie pro identifikaci farmaceutických látek
Chemometrie
Chemometrie v IČ spektroskopii
Jednoduchý Lambert-Beerův zákon
• Použití této metody vyžaduje měření výšky nebo plochy jediného pásu pro
každou komponentu
• každá komponenta musí mít nejméně dvě koncentrační hodnoty
• Pro každou komponentu je vytvářena samostatná kalibrační závislost
• Tímto způsobem je možno řešit jednoduché analytické problémy:
• pásy jednotlivých komponent se nepřekrývají (pokud ano, tak jen málo)
stálá základní linie
• závislost mezi absorbancí a koncentrací je lineární nebo téměř lineární
• mezi komponentami není, nebo je velmi malá chemická interakce (maxima
pásů se příliš nepohybují)
• matrice vzorků je dobře definovaná (v neznámých vzorcích se neobjevují
nenadále nové komponenty)
Jednoduchý Lambert-Beerův zákon
• Výhody metod vyvinutých podle Lambert-Beerova
zákona
- jejich matematická podstata je snadno
pochopitelná
- nevyžadují velké množství standardů
• Nevýhody metod vyvinutých podle Lambert-Beerova
zákona
- nepoužitelné, pokud se pásy, nebo oblasti
komponent významně překrývají
- přesné pouze pro koncentrační rozpětí, pro které
je kalibrační závislost lineární
Multivariační analýza dat
 použití mnoha proměnných zároveň
 základem tabulka - matice dat
 řádky - vzorky
 sloupce - proměnné
proměnné - závislé - např. koncentrace
proměnné - nezávislé - spektrální data
proměnné - klasifikační(„category“)
- třídění vzorků do skupin
Označení metod multivariační
analýzy
CLS - classical least squares
ILS - inverse least squares
MLR - multiple linear regression
PCA - principal component
analysis
• PCR - principal component
regression
• PLS1 - partial least squares 1
• PLS2 - partial least squares 2
•
•
•
•
Regrese CLS
• klasická metoda nejmenších
•
•
•
•
čtverců - „K-matrix“
předpoklad platnosti
Lambertova-Beerova zákona
při všech frekvencích absorbance je funkcí koncentrace
chyby modelu jsou přiřazeny
chybám v určení absorbancí
použitelná i pro celá spektra
všechny komponenty musí být
známy a zahrnuty do kalibrace
Regrese CLS
• Kalibrační model může být založen na výšce nebo ploše spektrálního pásu
může však také použít soubor mnoha bodů ve spektrálním rozsahu širším
než je izolovaný pás
• Metoda může používat data s překrývajícími se pásy komponent
• Úspěch kalibrace je závislý na splnění těchto podmínek :
• každá kalibrovaná komponenta má alespoň jednu měřenou oblast (pro
komponentu je možno použít současně více oblastí, přičemž každá oblast
může být současně použita pro několik komponent)
• každá složka přispívající k absorbanci v dané oblasti je zahrnuta jako
komponenta do metody
• počet kalibračních standardů je minimálně roven počtu komponent
• koncentrace komponent v kalibračních standardech se musí měnit
nezávisle (nevhodné je generování kalibračních standardů ředěním
základního roztoku)
Regrese CLS
• Výhody CLS metody:
• - možnost využití pásů komponent, které se významně
překrývají
• - potřeba menšího množství standardů než PLS nebo PCR
metoda
• - přesnější výsledky než při použití Beerova zákona, protože
jsou využity všechny datové body v analytickém regionu
použitém pro výpočet
• Nevýhody CLS metody:
• - nemůže řešit výskyt neočekávaných nečistot ve vzorku
• - interference pro jednu komponentu mohou ovlivňovat
ostatní komponenty
Regrese PLS
• Výhody PLS metodiky
• - umožňuje kalibrace za použití pásů nebo regionů
komponent, které se silně překrývají
• - řeší interference neznámých komponent (nečistot)
• - k výpočtům jsou použity všechny datové body
v analyzovaném regionu
• - uživatel nepotřebuje specifikovat zvláštní oblast pro každou
komponentu
• Nevýhody PLS metodiky
•
•
- vyžaduje velké množství standardů
- pochopení jejího matematického principu je obtížné
Analýza hlavních komponent
• analýza samotných spektrálních dat
• hledání struktury dat
• určení hlavních komponent PC’s transformace spekter do jiného
systému souřadnic
• uspořádání dat podél PC’s - SCORES
• hledání spektrálních intervalů
významně přispívajících k distribuci
dat - ZÁTĚŽE - loadings
Analýza hlavních komponent
transformace souřadnicového
systému
Principal Component (PC)
Regrese PCR
• regrese hlavních komponent
PCA + regresní krok ILS
• modely pro více sledovaných
analytů zároveň multikomponentní
• separátní modely pro
jednotlivé komponenty
(počítány zároveň)
nemusí být známy všechny komponenty
• modely pro celá spektra či
široké spektrální intervaly
Hledání optimálního počtu
hlavních komponent
• VYHODNOCENÍ „PRESS“
 prediction error sum of squares
 počítáno pro všechny zvažované
počty hlavních komponent
 nalezení minima na křivce
závislosti „PRESS“ na počtu
hlavních komponent
PCA: příklad interpretace výstupů analýzy
PCA: příklad interpretace výstupů analýzy
•
•
Graf „skóre“ (ve své podstatě je
to rozptylový diagram) ukazuje
umístění vzorku podél každé
modelované komponenty a
může být využit k detekci
zákonitostí vzájemného
rozmístění vzorků, jejich
struktury, seskupování,
podobností a odlišností.
Obvykle je zobrazována
závislost PC1 na PC2, obecně
dvou po sobě jdoucích
komponent
PCA: příklad interpretace výstupů analýzy
• Graf „zátěží“ ukazuje, jak se od sebe
liší hodnoty dat, když se posouváme
podél modelované komponenty
• Pro spektroskopická data graf x-zátěží
(x-Loadings) popisuje příspěvek
měřené intenzity signálu podél
spektrální proměnné (vlnočtu) ke
struktuře dat ve směru dané hlavní
komponenty
• Grafy zátěží mohou být využity ke
sledování příspěvku jednotlivých
proměnných k významným
odchylkám v datech a k interpretaci
příbuznosti (vzájemného vztahu)
proměnných
PCA: příklad interpretace výstupů analýzy
• graf průměrných hodnot skóre
Graf skóre
• každý bod odpovídá sadě spekter
pro specifický SERS substrát
• souřadnice jsou vztaženy
k průměrným hodnotám skóre
podél první (PC1) a druhé (PC2)
hlavní komponenty
• standardní odchylky hodnot skóre
pro jednotlivé (odpovídající
stejnému substrátu) spektrální
podskupiny (podmnožiny) jsou
znázorněny chybovými úsečkami.
Postup
přípravy B
Postup
přípravy A
PCA: příklad interpretace výstupů analýzy
• Jednodimenzionální grafy zátěží pro
spektrální data zobrazují příspěvek měřené
intenzity signálu podél spektrální proměnné
(Ramanův posuv, vlnočet) k variabilitě
spektrálních dat podél zvolené hlavní
komponenty
• 1-D graf pro první hlavní komponentu má
hodně společných rysů se SERS spektry 4ABT na povrchu substrátů
• umístění jednotlivé spektrální podskupiny
(SERS-aktivního substrátu) podél PC1 je
předurčeno porovnáním kompletní
spektrální informace (např. vzhled všech
zaznamenaných Ramanových pásů, jejich
intenzity, tvar spektrálního pozadí, poměr
signálu k šumu) v rámci celkového datového
souboru.
PC2: rozdíly v intenzitách vybraných
pásů
1D grafy zátěží
PC1: celková spektrální
informace
Strategie při chemometrické analýze
spektroskopických dat
Kalibrační standardy
Nejběžnější zdroje chyb
Příklad kvantitativního stanovení v MIR
Stanovení obsahu jodobenzenu, 2,4-lutidinu a dibutyloxalátu
v třísložkové směsi
I
N
CH3
CH3
2,4-lutidin
jodbenzen
CH3
CH2
CH2
CH2
O
C
O
CH3
CH2
CH2
CH2
O
C
O
dibutyloxalát
Příklad kvantitativního stanovení v MIR
• MIR spektra měřena na MCT/A detektoru v
rozsahu 400 – 4000 cm-1 při rozlišení 1 cm-1
• pro kalibraci použito 6 kalibračních a 2 validační
standardy
• výpočet podle Beerova zákona z plochy
vybraných pásů
• měření prováděno v kyvetě z KBr
Příklad kvantitativního stanovení v MIR
Kalibrační tabulka
Vzorek č. jodbenzen (%) 2,4-lutidin (%) dibutyloxalát (%)
1
15,2
32,6
52,2
2
23,1
41,0
35,9
3
32,7
26,2
41,1
4
6,1
34,1
59,8
5
19,3
29,1
51,6
6
27,8
38,7
33,5
7
9,9
37,0
53,1
8
11,1
27,5
61,4
Příklad kvantitativního stanovení v MIR
Spektra jednotlivých složek směsi
1, 0
i odo ben z en e
Abs
0, 8
0, 6
0, 4
0, 2
2,4 -lut idin e
Abs
1, 0
0, 5
1, 0
dib uty l ox alat e
Abs
0, 8
0, 6
0, 4
0, 2
4 000
3 000
2 000
W av e num be rs (c m-1 )
1 000
Příklad kvantitativního stanovení v MIR
Výběr vhodného pásu pro stanovení jodbenzenu
jodbenzen - substituovaná aromatická sloučenina
2,4-lutidin - substituovaná heterocyklická sloučenina
rozdílné umístění mimorovinných deformačních C-H vazeb šestičlenného kruhu v oblasti 850 – 700 cm-1
pro stanovení jodbenzenu výběr pásu 654 cm-1
1, 0
i odo ben z en e
65 4,2 c m-1
Abs
0, 8
0, 6
0, 4
0, 2
2,4 -lut idin e
Abs
1, 0
0, 5
1, 0
dib uty l ox alat e
Abs
0, 8
0, 6
0, 4
0, 2
8 50
8 00
7 50
7 00
W av e num be rs (c m-1 )
6 50
6 00
5 50
Příklad kvantitativního stanovení v MIR
Výběr vhodného pásu pro stanovení
2,4-lutidin charakteristický ostrý pás v (C-C) vibrací pyridinového kruhu při 1607 cm-1
obdobné vibrace aromatického kruhu jodbenzenu posunuty na 1571 cm-1
pro stanovení 2,4-lutidinu výběr pásu 1607 cm-1
i odo ben z en e
157 1,7 c m-1
Abs
1, 0
0, 5
2, 0
2,4 -lut idin e
160 7,4 c m-1
Abs
1, 5
1, 0
0, 5
dib uty l ox alat e
Abs
1, 0
0, 5
1 680
1 660
1 640
1 620
1 600
1 580
1 560
W av e num be rs (c m-1 )
1 540
1 520
1 500
1 480
Příklad kvantitativního stanovení v MIR
Výběr vhodného pásu pro stanovení
spektrum dibutyloxalátu má dva karbonylové pásy při 1770 a 1744 cm-1
spektrum jodbenzenu má v této oblasti overtonové pásy substituovaného benzenového kruhu,
ty jsou však velmi malé a stanovení dibutyloxalátu významně neovlivní
pro stanovení dibutyloxalátu výběr pásů 1770 a 1744 cm-1
0, 5
i odo ben z en e
Abs
0, 4
0, 3
0, 2
0, 1
2,4 -lut idin e
Abs
1, 0
0, 5
dib uty l ox alat e
177 0,3 c m-1
174 4,7 c m-1
Abs
1, 0
0, 5
1 900
1 850
1 800
1 750
W av e num be rs (c m-1 )
1 700
1 650
Příklad kvantitativního stanovení v MIR
Stanovení jodbenzenu – výběr regionu
Příklad kvantitativního stanovení v MIR
Stanovení jodbenzenu – kalibrační graf
Příklad kvantitativního stanovení v MIR
Stanovení 2,4-lutidinu – výběr regionu
Příklad kvantitativního stanovení v MIR
Stanovení 2,4-lutidinu – kalibrační graf
Příklad kvantitativního stanovení v MIR
Stanovení dibutyloxalátu – výběr regionu
Příklad kvantitativního stanovení v MIR
Stanovení dibutyloxalátu – kalibrační graf
Příklad PCA analýzy NIR spekter
Příklad PCA analýzy NIR spekter
Příklad PCA analýzy Ramanových
spekter biologických vzorků
Vzorek: rakovinné buňky epitelové
tkáně plic
Příklad PCA analýzy Ramanových
spekter biologických vzorků