pdf úvodní prezentace

Růst a vývoj rostlin - praktikum
MB130C78
Blok 3
Role aktinového cytoskeletu v morfogenezi
rostlinných buněk
- analýza fenotypu
Úlohy:
1. Kvantifikace počtu zkroucených a správně tvarovaných trichomů u
prvních pravých listů jednoduchých a dvojitých mutantů Arabidopsis
thaliana s nefunkčními geny pro nukleátory aktinu ARPC5
(podjednotka komplexu Arp2/3) a formin FH1.
2. Stanovení permeability povrchu listů pomocí barvení rutheniovou
červení u jednoduchých a dvojitých mutantů Arabidopsis thaliana s
nefunkčními geny pro nukleátory aktinu ARPC5 (podjednotka
komplexu Arp2/3) a formin FH1.
3. Stanovení délek hlavního kořene a hypokotylu u jednoduchých a
dvojitých mutantů Arabidopsis thaliana s nefunkčními geny pro
nukleátory aktinu ARPC5 (podjednotka komplexu Arp2/3) a formin
FH1.
4. Analýza a porovnání fenotypů jednoduchých a dvojitých mutantů
z úloh 1.-3. Tvorba vlastní hypotézy o rolích jednotlivých aktinových
nukleátorů v rostlině.
Čím je ovlivňována morfogeneze u rostlin?
Vnější a vnitřní faktory
Mezi vnitřní faktory ovlivňující morfogenezi rostlin patří:
•
•
•
•
•
•
•
směrované buněčné dělení
směrovaný buněčný růst
signalizace fytohormony
reorganizace buněčných stěn
turgor vakuolárního systému
směrovaný endomembránový transport
reorganizace cytoskeletu
Morfogeneze rostlinných orgánů
Příklady změněné morfogeneze listu u mutací v transkripčních faktorech z rodin YABBY a KNOX
(Chan Man Ha et al., 2010)
Morfogeneze rostlinných orgánů
Příklady změněné morfogeneze kořene reagujících na rostlinné hormony v médiu
a změnu světelných podmínek růstu
Kořeny narostlé na světle
Kořeny narostlé ve tmě
Příklady změněné
morfogeneze
kořenového systému u
mutací v proteinech
spojených s nukleací
aktinového cytoskeletu
WT
arp3
Benito lab
http://www.cbgp.upm.es/lateral_root.php
Morfogeneze rostlinných buněk
Druhy růstu buněk
(Guerroero et al., 2015)
Morfogeneze trichomů
Dobře studovatelné rostlinné buňky na kterých je popisována buněčná morfogeneze
Mutanti
(A) etr2-3
(B) gl3
(C) etr2-3 gl3
(D) spy-5
(E) etr2-3 spy-5
(F) gl2
(G) etr2-3 gl2
(H) fas1
(I) etr2-3 fas1
(J) try
(K) try etr2-3
(L) try fas1-1
(Plett et al., 2009)
Cytoskelet v rostlinné buňce
Rostlinný cytoskelet je tvořen vysoce dynamickou trojrozměrnou sítí proteinů, která je
základní složkou všech eukaryotických buněk a u rostlin sestává se vzájemně
propojených sítí mikrotubulů a aktinových filament.
light-sheet microskopie – pokožkové buňky děložního listu A.t
mikrotubulární markr TUA5-mCherry
aktinový marker FABD2-GFP
spojení obrázků - porovnání
(Ovečka et al., 2015)
Role cytoskeletu v morfogenezi buněk
(Mathur a Hulskamp 2002)
Role cytoskeletu v morfogenezi pokožkových
buněk listu
mikrotubuly
aktin
(Panteris et al., 2005)
Role cytoskeletu v morfogenezi trichomů
aktinová síť v trichomu
(Hulskamp 2004)
(Mathur a Hulskamp 2002)
Role cytoskeletu v prodlužování
kořene a hypokotylu
Aktinový
cytoskelet
(zeleně) v
elongujících
buňkách
kořene A.t.
(Teichmann
/Friml lab)
buňky
hypokotylu
rostoucího ve
tmě z elongující
zóny (3 denní)
se značeným
cytoskeletem
(Sampathkumar
et al., 2011)
Aktinový
cytoskelet
(zeleně) v
elongujících
buňkách
(červeně)
hypokotylu
A.t.
(Sainsbury
lab)
aktin
mikrotubuly
merged
Nukleace cytoskeletu
Rostliny mají 2 nukleátory aktinu:
ARP2/3 komplex a forminy
Nukleace aktinu ARP2/3 komplexem
ARP2/3 komplex tvoří sedm podjednotek (ARP2, ARP3 A ARPC1-ARPC5)
Komplex ARP2/3 rozvětvuje síť stávajících aktinových filament
Actin Filament Initiation: Arp2/3 complex. Manual of Cellular and Molecular Function, The National University of
Singapore, Republic of Singapore, 2009. Illustrators: Pham Thi Phuong Thao a Theng Tze Yin Meryl
Nukleace aktinu forminy
Forminy nukleující aktin tvoří dimery
forminy katalyzují vznik přímých (nevětvících se) aktinových vláken
(Gould et al., 2011)
Actin filaments: Formin-mediated nucleation. Manual of Cellular and Molecular Function, The National
University of Singapore, Republic of Singapore, 2009 Illustrator: Theng Tze Yin Meryl.
Nuklelátory aktinu v živočišné buňce
Mutace ve forminech či u podjednotek ARP2/3 komplexu je ve většině případech pro živočišné buňky letální.
(Shrnuto v: Pollard 2007)
U živočišných buněk se nedávno porovnávala nukleace aktinových filament pomocí
ARP2/3 komplexu a pomocí forminů
V živočišných buňkách je 10x méně forminů než Arp2/3 komplexu. Profilin – protein, který se váže na
globulární aktin, reguluje rovnováhu nukleátorů aktinu upřednostňováním forminů před Arp2/3
komplexem při nukleaci nových aktinových vláken.
(Suarez et al., 2014)
Rostliny mutantní ve forminech
souhrn fenotypů
Forminy se u různých organismů účastní polarizovaného buněčného růstu a sekrece
(shrnuto v Cvrčková 2012). U rostlin jsou proto často cílem výzkumu forminů
kořenové vlásky, pylové láčky, epidermální buňky a trichomy. Například over-exprese
forminu 1 způsobuje deformace při růstu pylové láčky tabáku. Vzhledem k velikosti
rodiny proteinů s formin-like sekvencí, která je rozmanitější než u živočišných buněk,
byla zatím fenotypicky charakterizována jen malá část forminů.
Pokožkové buňky děložních listů u mutanta ve forminu 1 mají prohloubenou lobovitost buněk – Amparo Rosero/nepublikovaná data
Rostliny mutantní v ARP2/3 komplexu
souhrn fenotypů
Obecně se fenotypové projevy při mutacích v genech pro podjednotky ARP2/3 komplexu
týkají především těch buněk a pletiv, které mají komplexnější tvary (trichomy, buňky
epidermis) a jejichž morfogeneze a růst tedy vyžadují dobrou koordinaci vnitrobuněčných
procesů a modelování a růst buněčné stěny (Shrnuto v Mathur et al., 2005)
WT
arpc4
Pokožkové buňky děložního listu se značeným aktinem (FABD2-GFP),
pokožkové buňky mají méně výraznou lobovitost
(Mathur et al., 2005)
PRAKTIKUM - ÚLOHY
Úlohy:
1. Kvantifikace počtu zkroucených a správně tvarovaných trichomů u
prvních pravých listů jednoduchých a dvojitých mutantů Arabidopsis
thaliana s nefunkčními geny pro nukleátory aktinu ARPC5
(podjednotka komplexu Arp2/3) a formin FH1.
2. Stanovení permeability povrchu listů pomocí barvení rutheniovou
červení u jednoduchých a dvojitých mutantů Arabidopsis thaliana s
nefunkčními geny pro nukleátory aktinu ARPC5 (podjednotka
komplexu Arp2/3) a formin FH1.
3. Stanovení délek hlavního kořene a hypokotylu u jednoduchých a
dvojitých mutantů Arabidopsis thaliana s nefunkčními geny pro
nukleátory aktinu ARPC5 (podjednotka komplexu Arp2/3) a formin
FH1.
4. Analýza a porovnání fenotypů jednoduchých a dvojitých mutantů
z úloh 1.-3. Tvorba vlastní hypotézy o rolích jednotlivých aktinových
nukleátorů v rostlině.
ÚLOHA 1
fenotyp zkroucených trichomů
ÚLOHA 2
fenotyp permeability listu
ÚLOHA 3
fenotyp délky kořene a hypokotylu
ÚLOHA 4
Tvorba vlastní hypotézy o rolích
jednotlivých aktinových nukleátorů v rostlině
Projev mutace
Průměrný počet trichomů na list
(číslo)
Zkroucené trichomy
(ano/ne)
Permeabilita listů
(ano/ne)
Průměrná délka hypokotylu
(číslo)
Průměrná délka kořene
(číslo)
Tab. 1: Příklad tabulky fenotypů.
wt
arpc5
fh1-1
fh1-1/arpc5