Stanovení nitrofenolů v odpadních vodách kapilární elektroforézou

Stanovení nitrofenolů v odpadních vodách kapilární elektroforézou
Úkol
Proveďte extrakci nitrofenolů a zakoncentrování nitrofenolů z předloženého vzorku odpadní vody
a jejich následnou separaci a stanovení pomocí kapilární elektroforézy se spektrofotemetrickou
detekcí.
Teoretický úvod
Fenoly a jejich deriváty patří k tzv. prioritním polutantům, které se do životního prostředí
dostávají z různých, zejména antropogenních zdrojů. Nejčastějšími zdroji fenolů a jejich derivátů ve
složkách životního prostředí jsou průmyslová výroba (fenoly zde mohou být jako hlavními
produkty výroby, tak i odpadními produkty), pesticidní přípravky, degradační produkty neiontových
tenzidů. Fenoly a jejich deriváty (zejména jde o nitroderiváty a chlorované deriváty) patří
mezi toxické a karcinogenní látky. Z těchto důvodů je sledování jejich obsahu ve složkách
životního prostředí velmi důležité.
Stanovení nitrofenolů
Individuální stanovení nitrofenolů ve vodách se provádí podle normy ČSN EN ISO 17495 (75
7546) Jakost vod – Stanovení vybraných nitrofenolů - Metoda plynové chromatografie s
hmotnostně spektrometrickou detekcí po extrakci tuhou fází.
Norma uvádí stanovení vybraných nitrofenolů (isomery nitrofenolu, methylnitrofenoly,
dinitrofenolu, dichloronitrofenolu a dimethylnitrofenolu) po extrakci tuhou fází z okyseleného
roztoku vzorku. Po eluci rozpuštědlem z tuhé fáze náseleduje derivatizace diazomethanem a
stanovení metodou GC-MS.
Kromě uvedené normované metody je možné nitrofenoly a jejich další deriváty stanovovat pomocí
dalších instrumentálních analytických technik. Jako vhodné analytické techniky lze uvést zejména
chromatografické techniky (GC, LC) s různými typy detekcí (MS, UV-VIS, fluorescenční,
elektrochemická detekce), kapilární elektroforézu s UV-VIS spektrometrií a také voltametrické
techniky, které umožňují velmi citlivé stanovení vybraných nitrofenolů.
Kapilární elektroforéza (CE) je vysoce účinná separační metoda, které je vhodná pro separaci a
stanovení nitrofenolů. V tomto případě se využívá kyselého charakteru nitrofenolů. Nitrofenoly
vykazují obecně vyšší kyselost než fenol. Nejvíc patrný je kyselý charakter nitrofenolů, které mají
nitroskupinu v ortho- či para- poloze vůči fenolické skupině. Kyslíkový atom v nitroskupině vlivem
vysoké elektronegativity vyvolává silný tah elektronů, který se indukcí přenáší mezi kyslík a vodík
fenolické skupiny. Vodík -OH skupiny se tak snadno odštěpuje jako proton. Pro doplnění je uvedená
tabulka s hodnotami pKa pro nejběžnější nitrofenoly.
Tabulka 1: Hodnoty pak vybraných nitrofenolů
nitrofenol
pKa
nitrofenol
pKa
9,998
4,959
Fenol
2,4-dinitrofenol
7,767
4,580
o-nitrofenol
2,6-dinitrofenol
8,481
5,921
m-nitrofenol
2,3-dinitrofenol
7,155
-0,377
p-nitrofenol
2,4,6-trinitrofenol
Díky kyselému charakteru fenolické skupiny na nitrofenolech je možné nitrofenoly separovat
ve formě aniontů pomocí kapilární zónové elektroforézy. V bazickém prostředí budou
nitrofenoly dostatečně disociované a budou migrovat jako anionty. Pro separaci fenolů a
nitrofenolů kapilární zónovou elektroforézou se využívá nepokryté křemenné kapiláry, kde je v
bazickém prostředí silný elektroosmotický tok. Je tedy možné využít skutečnosti, že mobilita
katodického elektroosmotického toku je vyšší než efektivní mobility jednotlivých nitrofenolů a
nitrofenoly mohou být separovány při normální polaritě vkládané mezi elektrody (tedy od + → -).
Základní schéma kapilární elektroforézy je na obrázku 1.
Obrázek 1: Základní schéma kapilární elektroforézy
Jako detekce může být využita UV-VIS spektrofotometrická detekce, protože nitrofenoly mají ve
své struktuře několik chromoforů (benzenové jádro, nitro- a fenolickou skupinu). Spojení kapilární
elektroforézy s UV-VIS spektrofotometrickou detekcí není ale příliš citlivé (limity detekcí pro
nitrofofenoly se pohybují řádově v jednotkách mol.l-1, což pro stanovení nízkých a stopových
koncentrací těchto polutantů není dostačující. Z toho důvodů se provádí izolace a zakoncentrování
fenolů před vlastním elektroforetickým stanovením. Tato úprava vzorků navíc umožňuje odstranit
ze složitých matric (odpadní vody, půdy, ale i biologické vzorky) i balastní látky a látky, které by
mohli negativně ovlivnit separaci a stanovení.
V literatuře bylo popsáno mnoho metod pro izolaci zakoncentrování nitrofenolů od jednoduchých
L-L extrakcí až po extrakci na tuhých sorbentech. Nespornou výhodou kapilární elektroforézy je, že
zde odpadá případná derivatizace nitrofenolů, která je nutná při stanovení nitrofenolů pomocí GCMS.
Chemikálie, pomůcky a přístrojové vybavení
Chemikálie
Kyselina boritá, roztok hydroxidu sodného 50 % (w/w) a roztok hydroxidu sodného 0,1 M,
methanol, o-nitrofenol, m-nitrofenol, p-nitrofenol, 2,4-dinitrofenol, 2,3-dinitrofenol,
2,6-dinitrofenol, deionizovaná voda.
Pomůcky
Kádinky, odměrné baňky 100 ml, odměrné baňky 50 ml, odměrné baňky 10 ml, nylonové filtry s
velikostí pórů 0,45 m, teflonové míchadélko, křemenná kapilára s vnitřním průměrem 50 m a
celkové délky 48,5 cm, injekční stříkačky 5 ml, vialky a víčka pro kapilární elektroforézu, a pH
kalibrační roztoky, SPE kolonky, zařízení pro provedení SPE extrakce, dusíková bomba.
Přístrojové vybavení
Ultrazvuk, pH-metr, vypalovač detekčních okének pro kapiláry, elektromagentická míchačka,
kapilární elektroforéza Agilent HP 3D CE s UV-VIS detektorem 190 – 600 nm.
Podmínky separace nitrofenolů kapilární elektroforézou
Separaci nitrofenolů lze uskutečnit v borátovém pufru o pH 9,5 s přídavkem 10 % (v/v) methanolu,
s využitím katodického elektroosmotického toku.
Podmínky separace: nepokrytá křemenná kapilára vnitřní průměr 50 m (celková délka 48,5 cm,
efektivní délka 40 cm). U = + 20 kV, dávkování tlakem 50 mbar/5s,  = 214 nm.
Postup stanovení
Příprava elektrolytu a kapiláry před měřením
1. S pomocí vedoucího cvičení zapněte kapilární elektroforézu Agilent včetně PC a ovládací a
vyhodnocovaí stanice ChemStation.
2. Na křemenné kapiláře celkové délky 48,5 cm odměřte od jednoho konce vzdálenost 8,5 cm
a v tomto místě připravte pomocí vypalovače detekční okénko spálením vrstvy polyimidu.
Detekční okénko by mělo mít délku 3 až 5 mm. Po vypálení detekční okénko i celou
kapiláru očištěte gázou s methanolem. Kapiláru s okénkem vsuňte do detekčního nástavce a
vložte do kazety pro kapiláru. Kazetu s kapilárou opatrně zasuňte do přístroje.
3. Kapiláru v přístroji promyjte 20 minut 1M roztokem NaOH a 20 minut deionizovanou
vodou.
4. Během promývání nakalibrujte pH metr s pomocí vedoucího cvičení (postup kalibrace je
uveden i na pH metru) na rozmezí pH 7 až 10.
5. Navažte odpovídající množství kyseliny borité, tak aby mohl být připraven roztok o
koncetraci 0,05 mol.l-1 kyseliny borité v deionizované vodě o objemu 100 ml.
6. Připravený roztok kyseliny borité přelijte do kádinky, vložte teflonové míchadélko a
kádinku postavte na elektromagnetické míchadlo. Do roztoku kyseliny borité ponořte
nakalibrovanou pH elektrodu a za stáléhé míchání a kontroly hodnoty pH přikapávejte
automatickou pipetou roztok 50 % (w/w) NaOH dokud se hodnota pH nepřiblíží
hodnotě 9,5. Přesné vytitrování roztoku kyseliny borité na pH 9,5 proveďte roztokem
1 M NaOH. Po vytitrování na pH 9,5 přesně vytáhněte z roztroku pomocí magnetického
vytahovače míchadelek teflonové míchadélko a elektrolyt přelijte do zásodní láhve.
7. Elektrolyt dále zřeďte s methanolem v poměru 9:1 (elektrolyt : methanol). Tímto
připraveným borátovým pufrem s 10 % methanolem (v/v) promyjte kapiláru v kapilární
elektroforéze 20 minut.
Příprava standardních roztoků a kalibračních roztoků nitrofenolů a proměření kalibrační křivky
1. Navažte 5 mg každého nitrofenolu zvlášť a rozousťte je vždy v 50 ml methanolu. Připravíte
tak roztoky nitrofenolů o koncentraci 0,1 mg/ml v methanolu.
2. Z jednotlivých roztoků nitrofenolů připravte směsný standarní roztoky nitrofenolů o
výsledných koncentracích 1 g/ml, 0,5 g/ml, 0,2 g/ml, 0,1 g/ml a 0,08 g/ml a 0,05
g/ml. Jako rozpouštědlo použijte deionizovanou vodu. Objem těchto roztoků je 10 ml.
Ředění v jednom kroku nesmí být větší než 100x. Takto připravené roztoky budou sloužit
pro přípravu kalibrační křivky.
3. S pomocí vedoucího cvičení otevřete v softwaru ChemStation metodu nitrof.m a proměřte
všechny standardní roztoky 3x.
4. Proveďte identifikaci jednotlivých nitrofenolů medotou standardního přídavku (tzv.
spikování).
5. Odečtěte plochy pro jednotlivé nitrofenoly, vypočítejte arimtetický průměr ploch. Pro
jednotlivé separované nitrofenoly sestavte kalibrační křivku a zhodnoťte statisticky linearitu,
korelační koeficient a vypočítejte limit detekce a limit stanovitelnosti.
SPE extrakce nitrofenolů vzorku odpadní vody
SPE extrakci nitrofenolů je možné provádět v kyselém prostředí na C18 stacionární fází. Desorpci
zachycených nitrofenolů na SPE kolonce budete provádět methanolem.
1. SPE kolonku nokondicionujte nejdříve promytím 2 ml methanolu, 2 ml deionizované vody
okyselené na pH 2 kyselinou chlorovodíkovou.
2. 30 ml odpadní vody přesně odpipetujte a postupně naneste na nakondicionovanou SPE
kolonku. Přes kolonku pak byl nechte vzorek protéka rychlostí 5 mL/minutu.
3. Po převedení vzorku přes kolonku sorbent zbavte větší části vlhkosti profoukáním dusíkem
po dobu 1 minuty. Zachycené nitrofenoly fenoly desorbujte 1 ml methanolu a methanolický
extrakte odfoukejte za laboratorní teploty do sucha.
4. Odparek nitrofonolů rekonstituujte v 1 ml 10 x zřděného separačního elektrolytu,
přepipetujte do vialky a prověďte elektroforetickou separaci. Stanovení vzorku proveďte 3x
(3 x s novým podílem vzorku!).
5. Odečtěte plochy odpovídající jednotlivýcm nitrofenolům a s pomocí kalibrační křivky
proveďte vyhodnocení jejich obsahu v předložené odpadní vodě. Výsledky zaokrouhlete na
dvě platné desetinné místa a statisticky zhodnoťe (průměr, RSD).
Otázky
1. Z jakého důvodu je nutné nitrofenoly derivatizovat před stanovením pomocí GC-MS.
2. Jaký jiný typ detektoru kromě UV-VIS byste pro detekci nitrofenolů po CE separaci ještě
mohli zvolit?
3. Z jakých důvodů patří nitrofenoly do skupiny tzv. prioritních polutantů? Které další látky,
které můžeme jako prioritní polutanny označit znáte?
4. Jak byste postupovali při analýze nitroderivátů fenolů v kontaminované půdě?