Strategie pro strukturní analýzu receptorů lidských NK buněk alias

Strategie pro strukturní analýzu receptorů
lidských NK buněk
alias
293. pokus jak zvýšit výtěžek a dosíci se struktury
Ondřej Vaněk
Katedra biochemie
Přírodovědecká fakulta UK Praha
Laboratoř strukturní biochemie imunitní odpovědi
...aneb od genu k proteinu, od proteinu k jeho struktuře a funkci!
rozpustných forem receptorů NK buněk a jejich ligandů pro
: Využití
přípravu nových protinádorových imunoterapeutik (2015-2017)
[email protected]
Obsah přednášky
• NK buňky a jejich receptory
• Kultivace a transfekce HEK293S GnTI- suspenzní
buněčné linie
• Produkce a struktura LLT1
• 293. pokus – příběh NKRP1
• Strategie…
• Aplikace v imunoterapii rakoviny
NK buňky
Natural-killer cells = vrození zabijáci
Velké granulární lymfocyty (CD16+, CD56+, CD3-), 15% cirkulujících lymf.
Rychlá likvidace nádorových a virově infikovaných buněk
Stimulační x inhibiční receptory
Výsledný signál může aktivovat
cytotoxickou odpověď
• Missing-self hypotéza: ztráta inhibice
snížením exprese MHC gp I. vede
k aktivaci cytotoxické odpovědi
•
•
•
•
•
NK(T) buňky tvoří most mezi vrozenou (A) a adaptivní (B) imunitou, mají důležité regulační
funkce (sekrece IFNγ, dozrávání DC), vlastní imunologickou paměť a významnou roli v
protinádorové a protivirové imunitní odpovědi vs. autoimunitní onemocnění, transplantace
NK(T) buňky tvoří most mezi vrozenou (A) a adaptivní (B) imunitou, mají důležité regulační
funkce (sekrece IFNγ, dozrávání DC), vlastní imunologickou paměť a významnou roli v
protinádorové a protivirové imunitní odpovědi vs. autoimunitní onemocnění, transplantace
Receptory NK buněk
(Vivier E. et al., Science, 2011)
Receptory NK buněk
• Imunoglobulinům podobné
– NKp30, NKp44 a NKp46 aktivační receptory
– Ligandy nádorového a virového původu
• C-lektinům podobné
– CD69, NKG2D, CD94/NKG2A, NKRP1, LLT1, NKp80, KACL, AICL
– Inhibiční i aktivační funkce
– Tvoří evolučně spřažené
receptor – ligandové páry
Iizuka K. et al., Nat Immunol 4, 801-807 (2003); Bartel Y. et al., Front Immunol 4, 362 (2013); Li Y. et al., J Exp Med 208, 703-714 (2011)
Receptory NK buněk
• Imunoglobulinům podobné
– NKp30, NKp44 a NKp46 aktivační receptory
– Ligandy nádorového a virového původu
• C-lektinům podobné
– CD69, NKG2D, CD94/NKG2A, NKRP1, LLT1, NKp80, KACL, AICL
– Inhibiční i aktivační funkce
– Tvoří evolučně spřažené
receptor – ligandové páry
Iizuka K. et al., Nat Immunol 4, 801-807 (2003); Bartel Y. et al., Front Immunol 4, 362 (2013); Li Y. et al., J Exp Med 208, 703-714 (2011)
Receptory NK buněk
• Imunoglobulinům podobné
– NKp30, NKp44 a NKp46 aktivační receptory
– Ligandy nádorového a virového původu
• C-lektinům podobné
– CD69, NKG2D, CD94/NKG2A, NKRP1, LLT1, NKp80, KACL, AICL
– Inhibiční i aktivační funkce
– Tvoří evolučně spřažené
receptor – ligandové páry
Iizuka K. et al., Nat Immunol 4, 801-807 (2003); Bartel Y. et al., Front Immunol 4, 362 (2013); Li Y. et al., J Exp Med 208, 703-714 (2011)
Receptory NK buněk
• NKRP1 (CD161, klrb1)
– NK a NK-T buňky, hemi-ITAM signální motiv, inhibiční funkce
• LLT1 (OCIL, clec2d)
– Lidské NK buňky, T a B lymfocyty, antigen prezentující buňky
– Přirozený funkční ligand NKRP1, kostimulační funkce
– Zvýšená exprese na glioblastomech – únik před NK buňkami
NK
buňka NKRP1
LLT1
T lymfocyt
Potlačení cytotoxické reakce
Receptory NK buněk
• NKRP1 (CD161, klrb1)
– NK a NK-T buňky, hemi-ITAM signální motiv, inhibiční funkce
• LLT1 (OCIL, clec2d)
– Lidské NK buňky, T a B lymfocyty, antigen prezentující buňky
– Přirozený funkční ligand NKRP1, kostimulační funkce
– Zvýšená exprese na glioblastomech – únik před NK buňkami
NK
buňka NKRP1
LLT1
Glioblastom
Potlačení cytotoxické reakce
Rekombinantní exprese proteinů
- proč: izolace z přirozeného materiálu zpravidla obtížná až
nemožná vs. snadná purifikace a hlavně možnost zavedení nových
vlastností (od bodových mutací, přes fúzní proteiny až po např.
„structure-based design“)
- jak:
- „cell free“ systémy – buněčné extrakty z čehokoli
- bakterie – No. 1 forevermore
- kvasinky – S. cerevisiae nebo P. pastoris & MeOH
- rostliny – magnICON – tranzientní infekce tabáku
- prvoci – LEXSY – Leishmania tarentolae
- hmyzí buňky – Sf9 & MultiBac; S2 & stabilní & Cu2+
- savčí buňky – CHO & RMCE; HEK293 – viz dále…
Buňky HEK293 (Human Embryonic Kidney 293)
• HEK293E nebo 293-6E – nejvyšší produktivita díky epizomální replikaci, ale také nejvíce
citlivé na zacházení…
• HEK293T – velmi robustní linie, adherentní i suspenzní kultivace
• HEK293S GnTI- – homogenní glykosylace, jasná volba pro strukturní biologii
MALDI-MS of N-linked glycans from s19A from HEK 293T cells. David J. Harvey, Max Crispin
University of Oxford
Manipulace N-glykosylace v HEK293 linii
Kifunensine
293T
Glycan Biosynthesis Pathway
a-M I
293S
GnT1-/-
oligomannose
glycans
oligomannose glycans
GnT1
Swainsonine
or Lec36
High expression
Hybrid sugars
Endo H cleavable
paucimannose glycans
Low expression
Uniform sugars
Endo H+D cleavable
Sf9
Golgi
complex glycans
293T
Moderate expression
Uniform sugars
Endo H cleavable
hybrid glycans
293T
a-M II
High expression
Uniform (large) sugars
Endo H cleavable
High Expression
Complex sugars
NOT cleavable
Veronica T. Chang, Solving the glycosylation problem, Structure, 2007.
Manipulace N-glykosylace v HEK293 linii
Kifunensine
293T
Glycan Biosynthesis Pathway
a-M I
293S
GnT1-/-
oligomannose
glycans
oligomannose glycans
GnT1
Swainsonine
or Lec36
High expression
Hybrid sugars
Endo H cleavable
paucimannose glycans
Low expression
LLT1
Uniform sugars
Endo H+D cleavable
Sf9
Golgi
complex glycans
293T
Moderate expression
Uniform sugars
Endo H cleavable
hybrid glycans
293T
a-M II
High expression
Uniform (large) sugars
Endo H cleavable
High Expression
Complex sugars
NOT cleavable
Bláha et al., Expression and purification of soluble and stable ectodomain of natural killer cell receptor LLT1 through highdensity transfection of suspension adapted HEK293S GnTI- cells. Protein Expr. Purif. 109, 7-13, 2015.
HEK293 suspenzní kultivace
Buňky v suspenzi na třepačce (135 rpm / 19
mm či 180 rpm / 50 mm orbit) v 5% CO2 ve
skleněných Schott-Duran láhvích s víčky s
0,22 μm prodyšnou membránou (lze
autoklávovat) v ExCELL293 / F17 bezsérových
médiích od 1 ml – po litry (standardní
kultivační objem produkce 0.4 l).
293S: transfekce za vysoké buněčné hustoty
Standardní transfeckce v HEK293S GnTI- linii nefunguje, ale za vysoké
buněčné hustoty ano, bez ohledu na médium a inkubaci DNA:PEI směsi
A)
B)
C)
(A) DNA:PEI optimization
(B) Secreted protein production (measured as SEAP activity) and
(C) transfection efficiency (GFP+ viable cells)
of suspension adapted HEK293T cells (yellow) and HEK293S GnTI- cells (cyan) transfected at density
of 2.0×106 cells/ml and HEK293S GnTI- cells transfected at density of 20×106 cells/ml with transfection
complex formed a priori (gray) or in situ (magenta) was monitored 3 days post-transfection.
Bláha et al., Expression and purification of soluble and stable ectodomain of natural killer cell receptor LLT1 through highdensity transfection of suspension adapted HEK293S GnTI- cells. Protein Expr. Purif. 109, 7-13, 2015.
Produkce LLT1 v 293S linii
A280
Finální produkční protokol:
- 20·106 b/ml transfekce v ExCELL293
- 2 µg DNA na 1·106 buněk
- DNA:PEI 1:2
- Transfekční směs:
- 10% pTW5-p27
- 2% pTW5-aFGF
- 88% pTW5sec_LLT1
- 3-4 hod po transfekci 2·106 b/ml produkce
- valproová kyselina do 2 mM konc.
• Vysoká hustota
• p27+aFGF+VPA
= 150-200% více!!!
V, ml
Strategie 1
• Optimalizujte svůj expresní systém!
Exprese rozpustné formy LLT1
• Transmembránový protein II. typu, C-lektinům podobná rodina
• Glykoprotein, kovalentní homodimer
MHDSNNVEKDITPSELPANPGCLHSKEHSIKATLIWRLFFLIMFLTIIVCGMVAALSA
IRANCHQEPSVCLQAACPESWIGFQRKCFYFSDDTKNWTSSQRFCDSQDADLAQVESF
QELNFLLRYKGPSDHWIGLSREQGQPWKWINGTEWTRQFPILGAGECAYLNDKGASSAR
HYTERKWICSKSDIHV
COOH
Lectin-like domain
5 Cys
5 Cys
--S—S--
Stalk (dimerization)
--S—S--
Transmembrane region
Intracellular region
NH2
Exprese rozpustné formy LLT1
1
2
3
LLT1
His 176
4
5
6
Exprese rozpustné formy LLT1
C75
C75
C75
C86
C103 C163 C176 C184
C86 C103 C163 H176 C184
C86 C103 S163 H176 C184
Strategie 2
• Optimalizujte svůj expresní systém!
• Spárujte cysteiny, zbavte se jedináčků!
CD
SPR
Krystalizace LLT1
 LLT1(Q72-V191) H176C – jednoduchá glykosylace (HEK293S GnTI-), 13,8 mg/ml
 PEG 300 40%, 0,1M citrát-fosfát pufr; pH 4,2
•
4 různé kryst. struktury, rozlišení: 1,7 – 2,7 Å, asym. jednotka: monomer / nekovalentní dimer
•
konfigurace disulfidických můstků v souladu s MS daty a teorií
Skálová et al., Four crystal structures of human LLT1, a ligand for human NKR-P1,
in varied glycosylation and oligomerization state. Acta Cryst D71, 578-591, 2015.
Skálová et al., Four crystal structures of human LLT1, a ligand for human NKR-P1,
in varied glycosylation and oligomerization state. Acta Cryst D71, 578-591, 2015.
Vybráno jako jeden ze čtyř Instruct „success stories“ na jeho dvouročním kongresu;-)
293 pokusů o expresi lidského NKRP1
• receptor lidských NK a NK-T lymfocytů, přirozený vazebný partner LLT1
• exprese v E. coli – inkluzní tělíska – refolding selhal…
• exprese v HEK293T – výtěžek pouze cca 0,1 mg/l a z HEK293S GnTIlinie ještě méně…  
• Instruct @ OPPF v Oxfordu – knihovna 46 konstruktů (různé délky
expresního konstruktu, různé afinitní kotvy) – expresní test v E. coli
opět selhal   
• následně doma expresní test knihovny v HEK293T linii – exprese tu je,
ale není to o nic lepší, než co už jsme měli sami předtím    
• později v OPPF expresní test knihovny v Sf9 hmyzích buňkách s
bakuloviry – zase nic     
• Co tedy dělat? Expresní konstrukt máme správný, expresní systém taky,
jen ten výtěžek…???
293 pokusů o expresi lidského NKRP1
• receptor lidských NK a NK-T lymfocytů, přirozený vazebný partner LLT1
• exprese v E. coli – inkluzní tělíska – refolding selhal…
purification
of E. coli
expression
• expreseNiNTA
v HEK293T
– výtěžek
pouze
cca 0,1 screen
mg/l a–zsoluble:
HEK293S GnTIlinie ještě méně…

E. coli B834
E. coli Rosetta
GFP control
• Instruct @ OPPF v Oxfordu – knihovna 46 konstruktů (různé délky
expresního konstruktu, různé afinitní kotvy) – expresní test v E. coli
45
36 opět selhal   
MW
66
29
• následně doma expresní test knihovny v HEK293T linii – exprese tu je,
20 ale není to o nic lepší, než co už jsme měli sami předtím    
24
• později v OPPF expresní test knihovny v Sf9 hmyzích buňkách s
6.5 bakuloviry – zase nic     
14.2
= expected product
• Co tedy
dělat? Expresní konstrukt máme správný, expresní systém taky,
jen ten výtěžek…???
293 pokusů o expresi lidského NKRP1
• receptor lidských NK a NK-T lymfocytů, přirozený vazebný partner LLT1
• exprese v E. coli – inkluzní tělíska – refolding selhal…
• exprese v HEK293T – výtěžek pouze cca 0,1 mg/l a z HEK293S GnTIlinie ještě méně…  Stalk-region construct library
• Instruct @ OPPF v Oxfordu – knihovna 46 konstruktů (různé délky
expresního konstruktu, různé afinitní kotvy) – expresní test v E. coli
opět selhal   
• následně doma expresní test knihovny v HEK293T linii – exprese tu je,
Expected product
ale není to o nic lepší, než co už jsme měli sami předtím    
• později v OPPF expresní test knihovny v Sf9 hmyzích buňkách s
bakuloviry – zase nic    ↑

S75-S225
• Co tedy dělat? Expresní konstrukt máme správný, expresní systém taky,
jen ten výtěžek…???
Anti-His Western Blot 72h post infection of Sf9 cells
293 pokusů o expresi lidského NKRP1
• receptor lidských NK a NK-T lymfocytů, přirozený vazebný partner LLT1
• exprese v E. coli – inkluzní tělíska – refolding selhal…
• exprese v HEK293T – výtěžek pouze cca 0,1 mg/l a z HEK293S GnTIlinie ještě méně…  
• Instruct @ OPPF v Oxfordu
– knihovna 46 konstruktů (různé délky
Stalk-region construct library
expresního konstruktu, různé afinitní kotvy) – expresní test v E. coli
opět selhal   
• následně doma expresní test knihovny v HEK293T linii – exprese tu je,
Control
ale není to o nic lepší, než co už jsme měli sami předtím    
• později v OPPF expresní test knihovny v Sf9 hmyzích buňkách s
bakuloviry
– zase
nic post
 transfection
   of HEK293T cells
Anti-His
Western
Blot 72h
• Co tedy dělat? Expresní konstrukt máme správný, expresní systém taky,
jen ten výtěžek…???
Strategie 3
• Optimalizujte svůj expresní systém!
• Spárujte cysteiny, zbavte se jedináčků!
• Nevzdávejte se! Když jsou dveře zamčené, vlezte
oknem…
Řešení: HEK293S GnTI- stabilně!
• Instruct @ OPPF – přesun knihovny do pOPINTTGneo plazmidu
• Pro nejlepší konstrukt selekce na 0,1 mg/ml G418: stabilní polyklonální linie
sekretující NKR-P1 až 6 mg/l!!!
CMV promoter 129..756
Tripartite leader 756..980
Adenoviral ML enhancer 1056..1167
Splice acceptor site 1251..1280
Neo 6797..7591
SV40 NeoR cassette 6392..7904
pOPINTTGneo
8008 bp
Ampicillin 4345..5191
MW kDa
205
67
29
24
20
14,2
polyA site 1846..1956
oriP replicon 2358..4066
4-12% SDS PAGE
SEC elution fractions
ENDO Hf ►
Souhvězdí Malý vůz

piggyBac indukovatelné stabilní linie
Strategie 4
• Optimalizujte svůj expresní systém!
• Spárujte cysteiny, zbavte se jedináčků!
• Nevzdávejte se! Když jsou dveře zamčené, vlezte
oknem…
• Tranzientní vztahy mohou být krásné, ale když jde do
tuhého, je třeba navázat více stabilní partnerství;)
Fúzní imunoaktivní konstrukty
(A) Design of B7-H6:7D8 genetic construct. CMV, CMV immediate early promotor; S,
secretion leader; IgV and IgC, B7-H6 Ig V-like and Ig C-like subdomains, respectively; VL and
VH, cDNA sequences coding for the variable regions of Ig L and H chains of scFv 7D8,
respectively; L, sequences coding for a (G4S)4 linker; M and H, sequences coding for cmyc
and hexa-histidine tags, respectively. (B) Ribbon drawing according to homology models of
B7-H6:7D8. Kellner C. et al., J. Immunol., 2012
Arnon T.I. et al., PLoS ONE, 2008 – NKp30 Fc IgG fusion therapy of prostate cancer cell line
Imunoaktivní polymerní konjugáty
Peptide K
Polymer
Recombinant
protein
Peptide E
Coiled-coil
heterodimers
• Pechar M. et al., Biomacromolecules, 2011; Pechar M. et al., Biomacromolecules, 2014
Shrnutí
• Optimalizujte svůj expresní systém!
• Spárujte cysteiny, zbavte se jedináčků!
• Nevzdávejte se! Když jsou dveře zamčené, vlezte
oknem…
• Tranzientní vztahy mohou být krásné, ale když jde do
tuhého, je třeba navázat více stabilní partnerství;)
• Nebojte se používat HEK293S GnTI- linii pro
strukturní biologii! 
Díkuvzdání…
• studenti: Jan Bláha, Petra Celadová, Edita Poláchová, Anna
Dvorská, Helena Pucholtová, Romana Čuperková, Jiří Nový,
Barbora Kalousková, Samuel Pažický, Ondřej Skořepa
• spolupracovníci: Tereza Skálová, Jan Dohnálek, Petr Novák
• Univerzita Karlova (UNCE 204025/2012,
SVV 260079/2014, GA UK 161216 a 927916)
• GA ČR (15-15181S), FRVŠ (669/2013)
• COST (CA15126)
• SPINE2:Complexes, P-CUBE, BioStruct-X, Instruct
• E-mail: [email protected]
Díkuvzdání…
• studenti: Jan Bláha, Petra Celadová, Edita Poláchová, Anna
Dvorská, Helena Pucholtová, Romana Čuperková, Jiří Nový,
Barbora Kalousková, Samuel Pažický, Ondřej Skořepa
• spolupracovníci: Tereza Skálová, Jan Dohnálek, Petr Novák
• Univerzita Karlova (UNCE 204025/2012,
SVV 260079/2014, GA UK 161216 a 927916)
• GA ČR (15-15181S), FRVŠ (669/2013)
• COST (CA15126)
• SPINE2:Complexes, P-CUBE, BioStruct-X, Instruct
• E-mail: [email protected]