Mikrobiologické zkoušky. Vyšetřování vzorků

Mikrobiologické zkoušky.
Vyšetřování vzorků
Mikroskopické vyšetřování
• V historii mikroskopické vyšetřování, později kultivační metody, v
současnosti molekulárně biologické metody.
• Mikroorganismy pozorované v živém, tj. nativním stavu (preparát
nativní), vitálně barvené (preparáty vitálně barvené), v mrtvém
stavu (preparáty fixované), trvalé preparáty, rámování
• Tzv. nátěr, roztěr či otiskový preparát (otiskem kultury na podložní
sklo).
• Uzavírací médium (voda z přirozeného prostředí bakterií či
fyziologický roztok)
• Barvení
totální,
monochromatické,
kombinované
či
polychromatické barvení (bi-, tri-, atd.), přímé substantivní,
nepřímé adjektivní, difúzní elektivní, specifické, regresivní.
• methylenová modř, červeň kongo, erytrosin B, sůl tetrazolia,
laktofenol
• Fixace teplem a fixace chemická.
• Barvicí metody – diagnostické (G a N barvení) a cytologické
okuláry
objektivy
kondenzor
křížový
stolek
makro- a
mikrošroub
clona a
matnice
Tzv. suchý objektiv
Vzdálenost
tubusu
160/0.17
60/0.85
Zvětšení
objektivu
Tloušťka
krycího
skla
Směr
pokládání
krycího
sklíčka
Numerická
apertura
• Hloubka ostrosti, pracovní vzdálenost
• Nónius, apertura
• Typy okulárů, objektivů (suché a imerzní)
Proměřování mikroskopu
6
y´ … objektivní
měřítko
y …okulárové
měřítko
123
 y 
1dílek     0.01mm
 y
1 dílek měřicího okuláru při 20x zvětšení = 3,57 µm
rozsivka Diatoma vulgaris: 19 × 3,57 µm = 67,8 µm
Velikost zorného pole mikroskopu:
Fázový kontrast, reliéfní
kontrast
(invertovaný mikroskop)
Barvení preparátu,
použití imerze
FITC
FITC (fluorescein isothiokyanát) barví DNA.
DAPI - váže se na DNA a RNA.
Propidium Jodid - Barví DNA
(červeně).
Akridinová oranž - váže se na DNA
(barví se zeleně) a RNA (barví se
tmavě červeně).
Congo Red - váže se na amyloid
(barví se růžově).
Obrázek vlevo: Vlákna železitých bakterií (Leptothrix ochraceae) pod světelným
mikroskopem při 40 objektivním zvětšení mikroskopu.
Obrázek vpravo: Vlákna železitých bakterií (Leptothrix ochraceae) pod
fluorescenčním nástavcem při aplikaci směsi A:B (1:1), zelené zabarvení
signalizuje živé buňky, červené zabarvení signalizuje mrtvé buňky.
Obrázek vlevo: Buňky kvasinek pod fluorescenčním nástavcem při aplikaci FUN®1, žlutooranžové zabarvení cylindrických intravakuolárních struktur signalizuje živé metabolizující
buňky (buňka kvasinky v zakroužkované oblasti), oranžovo-červené zabarvení signalizuje
živé metabolizující buňky.
Obrázek vpravo: Buňky kvasinek pod fluorescenčním nástavcem při aplikaci FUN®1,
žluto-zelené zabarvení signalizuje mrtvé buňky, živé a metabolizující buňky mají celkové
oranžovo-červené zabarvení či částečně obarvené intravakuolární struktury do žlutooranžového odstínu.
Pozorování konidií pod
mikroskopem a aplikace
barviv LIVE/DEAD® Yeast
Viability Kit.
Obrázek nahoře: Konidie pod
světelným mikroskopem.
Obrázek uprostřed: Konidie s
aplikovaným barvivem
FUN®1, zapojený
fluorescenční filtr umožňující
excitaci/emisi v oblasti
480/530 nm.
Obrázek dole: Konidie s
aplikovaným barvivem
Calcofluor White M2R a
zapojený fluorescenční filtr
umožňující excitaci/emisi
v UV oblasti.
Mikrobiologická laboratoř a její vybavení
• Mikrobiologické pracoviště slouží k provádění mikrobiolog.
analýz.
• Laboratoř, varna, umývárna, likvidace odpadu.
• Dodržování zásad BOZP, čistoty a sterility prostředí.
• Dezinfekce UV germicidní lampou, pracovní oděv.
• Sklo, skleněné nádoby a pomůcky – vzorkovnice, boritokřemičitanové sklo, Petriho misky, dělené i nedělené skleněné
pipety, zkumavky, kultivační nádoby (Erlenmayerovy baňky),
nádoby na přípravu a uchovávání médií, skleněné roztírací
tyčinky dle Drigalskiho.
• K inokulaci mikroorganismů - bakteriologická klička v Kolleho
držáku, filtrační aparatura pro MF, membránové filtry, kleště,
pinzeta.
• Přístroje, zařízení a pomůcky – chladnička, očkovací box,
inkubátory či termostaty, váhy, pH metry, vodní lázně, topná
hnízda.
Mikrobiologická laboratoř:
Kultivace - očkování
Kultivační metody
• Sterilita prostředí a pomůcek – vhodný výběr
• Kultivační média – výběr a selektivita
• Odběr vzorků
• Předúprava a úprava vzorků
• Zásady ředění
Kultivační box
Důležitá je sterilita
práce a prostředí
Dezinfekce
Autokláv
Drigalskiho tyčinky, kličky,
P.misky, zkumavky
Kultivační média
• Dle konzistence - tekutá média, polotekutá média, pevná
média, absorpční podložky.
• Dle složení - přirozená (komplexní), polosyntetická.
• Dle účelu kultivace a možnosti použití - média základní
(obecná), pomnožovací média, diferenciační média, selektivní
média, elektivní média testovací média, konfirmační média
(potvrzující).
http://www.himedia.cz
Selektivita půd – koliformní bakterie:
TTC s tergitolem 7,
Chromogen Coliformen,
Rapid 2
Problémy s pH půdy
– musí se před sterilizací
upravovat.
Půdy od různých výrobců se
nechovají stejně...
různé šarže se mohou lišit...
Referenční kmeny pro testování médií - kmeny získané z CCM
Brno, České sbírky mikroorganismů MU
Provádí se pozitivní i negativní
kontrola médií
(podporuje/nepodporuje růst)
Pseudomonas aeruginosa
Legionella pneumophila (Oxoid)
http://sci.muni.cz/ccm
Médium
(stanovení)
Kontrolní kmen
Kontrola vitality
Růst
E. coli CCM 3954
+
Nutrient Agar
(mezofilní
a
psychrofilní)
Agar
s
kvasničným
extraktem
PCA
Endo agar
E. coli CCM 3954
(koliformní)
Slanetz-Bartley
Médium
(enterokoky)
Žluč-aeskulinazidový agar
(enterokoky)
Barva kolonie
+
Červené, kovový
lesk
E. faecalis CCM
4224
+
Červenohnědé
E. faecalis CCM
4224
+
Hydrolýza
aeskulinu
+ (44,5C)
-
Modré
m-FC
Agar E. coli CCM 3954
(+FD058)
E. faecalis CCM
(termotolerantní) 4224
Compact Dry
– jednoduchá aplikace vzorku
- Jednoznačné zviditelnění kolonií
Vlevo Compact Dry pro růst TC (aerobních mikroorganismů) při 36 °C. Uprostřed Compact Dry
pro růst EC (koliformních bakterií a E.coli). Vpravo Compact Dry pro růst YC (mikromycet a
plísní).
MIKROLA-testy, např.
ENTEROtest16
Nízké rozlišení. Pro přijatelnou
identifikaci by byla potřebná alespoň
90% úspěšnost identifikace.
Hodnoty +/- jsou převedeny do číselné podoby (1, 2 a 4 za pozitivní
reakce) a v případě negativní reakce 0. Po rozdělení do trojic (dvojic)
jsou hodnoty sečteny, čímž vznikne šestimístné číslo.
Zde: 400002
73,54 % jako Salmonella gallinarum, ze 7,84 % jako S. pullorum a
z 11,82 % jako Shigella serovar A,B,C.
Müller-Hintonův agar – diagnostika vlivu antibiotik na kmen bakterie - zjištění
„MIC“ (citlivý 5-10 mm, velmi citlivý >12 mm)
Horní řada – na misce naaplikovaná čistá kultura bakteriálního kmene s disky před
a následně po inkubaci.
Dolní řada – proměřování zóny (minimální inhibiční koncentrace), jedná se o velmi
citlivý kmen vůči ampicilinu a citlivý vůči penicilinu.
Odběrné láhve:
a) před sterilizací,
b) úprava láhve,
c) po odebrání vzorku
Postup ředění vzorků
1 ml
1 ml
vzorek
10-1
1 ml
10-2
1 ml
10-3
1 ml
10-4
10-5
Nárůst kolonií na půdě – různé ředění
Problémy s
doprovodnou
mikroflórou,
ředění???
Očkování vzorků
• Způsoby a technika očkování vzorků - očkování v tekutých
kultivačních médiích (klička a pipeta), očkování pevných
kultivačních médií,
šikmé agary (vpichem, přeočkování),
očkování agarových ploten (přímý výsev do kultivační půdy,
přímý výsev na povrch půdy a přímý výsev na membránový filtr,
membránová filtrace).
• Kultivační metody - kultivace v tekutých médiích (kvasná
zkouška či teplotní test, metoda MPN), na pevných médiích
(objem vzorku 1 ml, 10 ml, 100 ml) - metody přímého výsevu
do/na povrch kultivačního média či metody membránových filtrů.
• Test na přítomnost a nepřítomnost tzv. P/A test, test biologické
aktivity, screeningové metody, mikrometody.
Nalévání roztopeného agaru Přenesení filtru na
do Petriho misek
agarovou plotnu
Očkování
Petriho misky
pipetou
Očkování Petriho
misky kličkou
Nalité misky
Uložení misek v
termostatu.
Dnem vzhůru!!!!
Různé typy zkumavek s uzávěry
Příprava
šikmého agaru
Membránová filtrace
1. sterilizace
filtračního zařízení
plamenem
4. odměření vzorku (100ml)
2. umístění
filtru sterilní
pinzetou
5. zfiltrování
3. upevnění nálevky
vysterilizované
plamenem
6. aseptické
přenesení filtru na
misku s médiem
Výluh Py-4, kultivace v médiu dle Fjodorova (zde Výluh Py-14, kultivace v médiu dle Fjodorova (zde
negativní reakce), kontrola Fjodorov, CCM 80
pozitivní reakce), kontrola Fjodorov, CCM 80
Přítomnost/nepřítomnost – vizualizace reakce
Duopath x Singlepath
Chromocult - enterokoky
Příklad metody na MPN
Počet zkumavek s pozitivní reakcí
Počet zkumavek s pozitivní reakcí
3 neředěné
vzorky (310
ml)
0
3 vzorky 10
ředěné (31
ml)
0
3 vzorky 100
ředěné (30,1
ml)
1
0
1
1
MPN index
pro
100 ml
MPN index
pro
100 ml
3
3 neředěné
vzorky (310
ml)
3
3 vzorky 10
ředěné (31
ml)
0
3 vzorky 100
ředěné (30,1
ml)
0
0
3
3
0
1
39
0
0
4
3
0
2
64
1
0
1
7
3
1
0
48
1
1
0
7
3
1
1
75
1
1
1
11
3
1
2
120
1
2
0
11
3
2
0
93
2
0
0
9
3
2
1
150
2
0
1
14
3
2
2
210
2
1
0
15
3
3
0
240
2
1
1
20
3
3
1
460
2
2
0
21
3
3
2
1100
2
2
1
28
23
DST metody
Colilert- P/A
-Žlutá (P)
-Modrá (E.coli)-fluorescence
Colilert QuantiTray
Vzorek s činidlem do plata QuantiTray, QT/2000 –
zatavovačka – kultivace 24h
(Colilert-18/Quanti-Tray)
Stanovení koliformních bakterií a Escherichia coli
metodou Colilert-18/Quanti-Tray
kultivace 18 hod při 36 °C
100 ml vzorku
- plastové vzorkovnice
- suchého médium Colilert-18, promíchání
- nalití do plata Quanti Tray
- zatavení pomocí zatavovačky Quanti TrayTM
koliformní bakterie
= žluté
E. coli
= žluté + svítí pod UV
Colilert:
Enterolert:
Pseudalert:
……………… 51 komůrek celkem
Likvidace a zneškodnění odpadů
dekontaminace (sterilizace)
v autoklávu při 121°C
min. 30 minut
(vyhrazený autokláv)
média obsahující škodlivé chem. látky:
shromažďování ve speciálních nádobách
– likvidace odbornou firmou
pozn.: „neškodlivé“ půdy lze desinfikovat
přelitím chlornanem a vyhodit do kanalizace
Podstata identifikace mikroorganismů
• Cílem vyšetřování vzorků vod je zjištění přítomnosti
mikroorganismu a jeho zařazení do taxonomických skupin
• Identifikace na několika úrovních
• 1. úrovní je posouzení vzhledu narostlé kolonie mikroorganismu na
selektivním agaru
• 2. stupněm je stanovení presumptivních organismů na základě
konfirmačních testů
• 3. stupněm je identifikace metodou tzv. pestré řady, prováděné na
odborné úrovni ve speciálních laboratořích (LA-test jako
diagnostický mikrotest)
• V laboratořích - zjištění růstu mikroorganismu na selektivním
médiu  ne všechny mikroorganismy jsou hledaným indikátorem
 konfirmační (potvrzující) testy
Objekt k potvrzení
Koliformní
bakterie
BGLB
médium
35 °C
EC
médium
35 °C
celkové
fekální
EC
médium
s MUG
44,5 °C
E. coli
Intestinální
streptokoky
Aziddextróza
bujón
35 °C
Žlučaeskulinazid agar
Staphylococcus
Gram
barvení
Agar s
manitol
solí
Tryptonsója
bujón
Test
koagulázy
Test
katalázy
Pseudomonas
Clostridium
Drakeovo
médium
41,5 °C
Mléčný agar
ve zkumavce
Mléčný
agar
Gram
barvení
vyočkování presumptivních
kolonií
zřeďovací roztok
+ COLItest -proužky
4 hod při 44 °C
2. fluorescence v UV -360 nm
+
CASO agar
21  2 hod při 36 °C
1. oxidázový test
„potvrzené koliformní bakterie“
původně žluté + nemodrají při oxidázovém testu
3. test na produkci indolu
(Kovacsovo činidlo)
Výsledek: Escherichia coli!
1. je koliformní, 2. svítí pod UV
3. produkuje indol (červený kroužek)
Mikroorganismy jako indikátory pro
zjištění nezávadnosti vody
• 1855 - Snow a Budd - cholera a tyfové onemocnění kontaminací
pitné vody splaškami fekálního původu
• koncepce indikačních organismů - základ kritérií mikrobiologické
kvality vody
• V čem tato koncepce spočívá?
• Nelze patogenní organismy detekovat jednoduchým způsobem 
metody na zjištění přítomnosti dalších fekálních organismů 
pokud se organismy nevyskytují, s určitou pravděpodobností se
nevyskytují i patogenní organismy
• Indikační organismy (možné ohrožení lidského zdraví): koliformní
bakterie, intestinální streptokoky (enterokoky) a sulfát redukující
klostridie, např. Clostridium perfringens
Indikátory obecného znečištění
• umělá skupina organotrofních bakterií se schopností tvořit
kolonie na předem specifikovaném pevném kultivačním médiu
• kolonie se tvoří z jednotlivých buněk zkratka KTJ (angl.
CFU)
• slouží pouze k informacím o celkovém mikrobiálním
znečištění - slouží k ekologickému posouzení jakosti vod
1) Stanovení životaschopných mikroorganismů:
• s optimem růstu při teplotě 22 C
• s optimem růstu při teplotě 36 C
2) Stanovení organotrofních bakterií:
• stanovení mezofilních bakterií
• stanovení psychrofilních bakterií
ČSN EN ISO 6222: Stanovení kultivovatelných
mikroorganismů (počty kolonií) při 22 °C nebo 36 °C
očkováním do živného agarového média s kvasničným
extraktem
1. pipetování 1 ml vzorku
2. zalévání roztopeným médiem (45±1)°C
3. Kultivace 44 h při 36 °C a 68 h při 22 °C
shluk KTJ
(kolonii tvořící jednotka)
? jak počítat
„Nepočitatelné“ nebo
„>300 KTJ/ml“
u pitných vod
„Přerostlé“
=misky, na kterých došlo
vytvořením plazivých povlaků
(rod Bacillus, Streptomyces)
Tabulka. Příklad zaokrouhlování počtu kolonií na misce
Počet kolonií je:
Uvádění výsledku
1 KTJ až 100 KTJ
Nezaokrouhluje se.
101 KTJ až 1 000 KTJ
Zaokrouhluje se na 10.
1 001 KTJ až 10 000 KTJ
Zaokrouhluje se na 100.
10 001 KTJ až
100 000 KTJ
100 001 KTJ až
1 000 000 KTJ
Zaokrouhluje se na 1 000.
Zaokrouhluje se na 10 000.
Koliformní bakterie
• Koliformní bakterie jsou gramnegativní tyčinky z čeledi
Enterobacteriaceae, které netvoří spory, jsou schopné růst na
kultivačním médiu obsahujícím žlučové soli (na Endoagaru).
• Mají schopnost fermentovat laktózu při teplotě 36 °C ± 2 °C
se současnou tvorbou kyselin, plynu a aldehydu během 24 h
a mají negativní cytochromoxidázový test.
• Membránový filtr, který se přenese na selektivní kultivační
agarové médium s laktózou. Naočkované misky
s membránovými filtry se kultivují při 36 °C ± 2 °C po dobu
24 h. Pozitivním cytochromoxidázovým testem se vyloučí
kolonie bakterií, které nepatří do skupiny koliformních bakterií.
Čeleď Enterobacteriaceae
Skupina nekoliformních
bakterií
Shigella
Yersinia
Providencia
Salmonella
Serratia
Proteus
Skupina koliformních bakterií
Celkové
Escherichia
Citrobacter
Klebsiella
Enterobacter
Fekální
Escherichia coli
Citrobacter freundii
Klebsiella
pneumoniae
Termotolerantní koliformní bakterie
• Termotolerantní koliformní bakterie jsou gram-negativní tyčinky,
které netvoří spory, mají negativní cytochromoxidázový test.
• Za aerobních podmínek během 24 hodin kultivace a při teplotě
44 °C tvoří kolonie na selektivním diferenciačním médiu m-FC
s laktózou za současné tvorby kyselin (nebo aldehydu).
• Escherichia coli jsou termotolerantní bakterie, které mají
schopnost ve druhém stupni kultivace hydrolyzovat specifickým
enzymem, β-D-glukuronidázou, v médiu přítomný MUG (4-methylumbelliferyl-β-D-glukuronid) za vzniku 4-methyl-umbelliferonu,
který vykazuje v dlouhovlnném UV záření světle modrou
fluorescenci.
koli-titr
koli-index
 hodnota koli-indexu  znečištění 
 hodnota koli-titru indikuje 
1000
Koli  index 
Koli  titr znečištění
Intestinální enterokoky
• Intestinální enterokoky jsou grampozitivní koky vyskytující se
v párech nebo řetízcích.
• Vyskytují se ve střevním traktu člověka a zvířat. Enterokoky lze
považovat za indikátory fekálního znečištění. ALE! mohou
pocházet i z jiných zdrojů.
• Pevné kultivační medium obsahující azid sodný a bezbarvý TTC
(Slanetz-Bartley), který je činností enterokoků redukován na
červený formazan. Kultivace se uskutečňuje při teplotě 38 °C po
dobu 48 h.
• Presumptivní enterokoky všechny vyrostlé kolonie, které jsou
kaštanové, červené či růžově zbarvené.
• Typické kolonie na membránovém filtru – přenese se na
konfirmační žluč-aeskulin-azidový agar (44 °C po dobu 2 h).
• Enterokoky hydrolyzují aeskulin na 6,7-dihydroxikumarin, který
s železitými ionty dává tříslově hnědou až černou sloučeninu,
která difunduje do média.
Stanovení enterokoků, vlevo kolonie před konfirmací a vpravo
kolonie po otisknutí na žluč-aeskulin-azidový agar.
Stanovení Clostridium perfringens
• Clostridium perfringens patří mezi grampozitivní anaerobní
sporulující tyčinky. Spory se ve vnějším prostředí udržují poměrně
dlouho, a proto nález těchto bakterií ve vodě pokládáme za
ukazatele staršího znečištění.
• Na selektivní půdě m-CP médiu vytvářejí za anaerobních
podmínek charakteristické žluté koloniepři teplotě 44 °C ± 1 °C po
dobu 21 h ± 3 h, kyselá fosfatáza se potvrzuje konfirmačním
testem jejich vystavením parám amoniaku po dobu na 20 s – 30 s
kdy změní svou barvu do růžova či červena..
Příprava anaerobního hrnce pro stanovení
Clostridium perfringens, pohled na ukazatel
manometru, který musí být v záporných hodnotách
(dodržení anaerobního prostředí).
Stanovení Pseudomonas aeruginosa
• Pseudomonády jsou gramnegativní aerobní tyčinky, které rostou
na selektivním médiu obsahujícím cetrimid a produkují pyocyanin,
nebo jsou to mikroorganismy, které rostou na selektivním médiu
obsahující cetrimid, jsou oxidázapozitivní, vykazují fluorescenci
v UV záření (360 – 365 nm) a jsou schopny produkovat amoniak
z acetamidu.
• Pseudomonas aeruginosa je pro člověka příležitostný patogen,
který je schopný růst ve vodě i s velmi nízkou koncentrací živin.
Je to typový druh rodu Pseudomonas.
• Pseudomonády mají oxidační metabolismus a obvykle redukují
dusičnany na nižší oxidační stupeň, než jsou dusitany.
• Většina kmenů je schopna růstu při teplotě 42 °C, ale nikoliv při
4 °C, což odlišuje Pseudomonas aeruginosa od Pseudomonas
fluorescens, rostoucí právě při 4 °C, ale již ne při 42 °C.
• Několik potvrzovacích testů – Kingovo B médium, acetamid,
oxidáza.
Konfirmace: acetamid,
UV lampa, Kingovo B
médium, oxidáza
Tabulka. Postup potvrzení kolonií rostoucích na Pseudomonas
agar médiu/CN agaru
Vzhled
Test v
kolonie
na acetamidové
CN agaru
m tekutém
médiu
(produkce
amoniaku
z acetamidu)
Modrozelené Není nutné
provádět.
Oxidázový
test
(produkce
oxidázy)
Kingovo
médium B
(fluorescence)
Výsledek:
Potvrzeno jako
Pseudomonas
aeruginosa
Není nutné
provádět.
Není nutné
provádět.
ANO
Vykazující
fluorescenci,
ale
NE
modrozelené
Červenohně
dé
Ostatní
+
Není nutné
provádět.
Není nutné
provádět.
ANO
+
+
+
ANO
Není nutné
provádět.
Není nutné
provádět.
Není nutné
provádět.
NE
Výpočet počtu PSA potvrzených Pseudomonas aeruginosa
identifikovaných z každé plotny se vypočte podle rovnice a
zaokrouhlí na celé číslo
 cF
PSA  P  F  
 nF
•
•
•
•
•
•

 cR
  R  

 nR



P je počet modrozelených kolonií
F je počet kolonií vykazujících fluorescenci
R je počet červenohnědých kolonií
nF je počet kolonií vykazujících fluorescenci, testovaných na acetamid
cF je počet kolonií vykazujících fluorescenci, pozitivních na acetamid
nR je počet červenohnědých kolonií, testovaných na produkci amoniaku
a oxidázy a na fluorescenci na Kingově médiu B
• cR je počet červenohnědých kolonií, pozitivních na produkci amoniaku a
oxidázy a na fluorescenci na Kingově médiu B
Stanovení koagulázopozitivních stafylokoků
• Koagulázopozitivní bakterie = tvoří typické anebo atypické kolonie na
povrchu selektivní kultivační půdy a které projevují pozitivní
koagulázovou reakci při zkoušce provedené metodou specifikovanou
v ISO 6888.
• Staphylococcus aureus je fakultativně anaerobní grampozitivní kok.
• Zkoušený objem vzorku se přefiltruje přes membránový filtr, který se
pak přenese na selektivní kultivační médium podle Baird-Parkera
s přídavkem sulfamezathinu a žloutkovou emulzí s teluričitanem
draselným.
• Naočkované misky s membránovými filtry se kultivují po dobu 24 h až
48 h při teplotě 35 °C nebo 37 °C.
• Prohlížejí se misky jak po 24 h, tak i po 48 h.
• Počet koagulázopozitivních stafylokoků v patřičném objemu vzorku se
získá z počtu typických anebo atypických kolonií vyrostlých na médiu a
potvrzených pozitivním výsledkem koagulázového testu (Pastorex ™).
Staphylococcus aureus
Staphylococcus epidermidis
Stanovení stafylokoků, vzhled kolonií na agarovém Baird-Parker médiu po 24 h
(vlevo) a 48 h kultivace (vpravo).
Stanovení stafylokoků, pohled na vzhled typických kolonií (černé nebo šedé,
vypouklé se zónou projasnění) a atypických kolonií (šedé bez zóny anebo
lesklé černé s bílým okrajem či bez něho).
Latexový test, vlevo příprava PASTOREXTMSTAPH-PLUS, vpravo test
aglutinace na kartičce testu. Kruh označený „N“ slouží jako negativní kontrola,
v dalších kruzích jsou již testy se suspektními koloniemi, které byly odebrány
z Baird-Parker média tyčinkou a rozetřeny v latexu. Pouze jedna vykazuje
pozitivní reakce, na kartičce je umístěna vpravo dole (pod negativní kontrolou).
Výpočet
počtu
a
koagulázopozitivních
stafylokoků
identifikovaných z každé plotny se vypočte podle rovnice a
zaokrouhlí na celé číslo
bc
bnc
a
 cn 
 c nc
Ac
Anc
• Ac je počet typických kolonií odebraných ke koagulázovému
testu
• Anc je počet atypických kolonií odebraných ke
koagulázovému testu
• bc je počet typických kolonií koagulázopozitivních
• bnc je počet atypických kolonií koagulázopozitivních
• cc je celkový počet typických kolonií odečtených na misce
• cnc je celkový počet atypických kolonií odečtených na misce
Stanovení legionel
• V teplé a studené vodovodní vodě, v povrchové vodě (rybníky,
potoky, nádrže), ve vodovodních řadech jako součást biofilmů,
na filtrech, v chladicích okruzích, klimatizačních zařízeních,
apod.
• Gramnegativní, na selektivní GVPC médium s obsahem
antibiotik, aktivním uhlím a kvasnicovým extraktem, obsahujícím
L-cystein a trojmocné železo, po dobu 10 dní při teplotě 36 ºC,
potvrzení na selektivní půdě BCYE s cysteinem
• Během dvou dní se objeví jako bílé, purpurové, modré nebo
citrónovo zelené kolonie, pod stereomikroskopem mají sklovitý
vzhled.
ZDE ROSTOU VŠECHNY
(I TY, KTERÉ NEJSOU LEGIONELLY)
1. BCYE médium
-min. 2 dny
při 36 °C
NEVYKAZUJE RŮST
2. BCYE-Cys médium
(bez cysteinu)
-min. 2 dny
při 36 °C
Legionella neroste na médiu bez cysteinu!!!
Stanovení salmonel
• Problematické stanovení díky doprovodné mikroflóře, existuje
ČSN ISO 19250.
• Pomnožení v selektivních médiích – problém s kvantifikací na
pevných půdách
• Stanovení dle MPN, pokud jde o PCR a qPCR - vysoká mez
detekce.
• Nejlépe takto:
(1) MF a neselektivní pomnožení,
(2) pak selektivní pomnožení na alespoň 2 médiích - Rappaport
Vassilidas s malachitovou zelení a selenit cystinové médium,
(3) výsev a kultivace na selektivních diagnostických půdách (XLD
s xylózou a lysinem nebo BGA s brilantovou zelení a fenolovou
červení),
(4) biochemická a sérologická identifikace kmenů
XLD
Salmonely černé kolonie
BGA
Salmonely růžové kolonie
Patogenní organismy
• Gastrointestinální infekce
- č. Enterobacteriaceae: Shigella (podobná geneticky E.
coli), E. coli a stanovení VTEC (verocytotoxiny VT1 a VT2,
Klebsiella pneumonie, atd.
- doprovodné ke skupině: Vibrio (cholera: sérotyp O1, O139)
a Aeromonas
- Bakterie rodu Campylobacter: původně „Vibrio“, C. jejuji a
C. coli , termotolerantní, mikroaerofilní, na ČOV běžně,
norma ČSN ISO 17995, test na oxidázu a katalázu (+)
- Atypická mykobakteria: oportunní mykobakterie, PPM
(podmíněně patog.), EM (environm.), NTM (netuberk.)
- Leptospiry, listérie
- Viry
Viry
• Nerostou, nedělí se a nemetabolizují
• V hygieně vody mají význam: enteroviry, viry hepatitidy (A,
E a F) a rotaviry (kojenci průjmy, problém od 70.let 20.st.)
• Stanovení virů problém
• Enteroviry: indikátory fekálního znečištění, polioviry,
ECHOviry a coxsackie
Nár.ref.centrum laboratoří na SZÚ - sledují polioviry (ČOV,
utečenecké tábory), kontaminovaná voda, rezistence k Cl,
plaková titrace dle ČSN EN 14486.
(x enterické viry!!!! To je skupina! + adenoviry, reoviry,
rotaviry, viry hepatitidy apod.)
Stanovení plísní a kvasinek
• Mikromycety (kvasinky, plísně), drobnohledné houby, jsou
z hlediska jejich primárního výskytu v hodnoceném prostředí
autochtonními anebo alochtonními organismy.
• Autochtonní organismy jsou v případě, kdy je voda pro ně
přirozeným prostředím, jako alochtonní je označujeme, kdy se ve
vodě vyskytují sekundárně ve formě spor a trvalých buněk.
• Přímé stanovení mikromycet, jako ukazatele kvality pitné vody,
není legislativou vyžadováno.
Různé typy půd pro stanovení plísní:
SBA, Médium a bromkresolová červeň, Dichloran glycerol apod.
Různá aplikace vzorku: MF, spad, stěr
Rod Penicillium
Rod Rhizopus
Rod Fusarium (sp. poae)