Identifikace a exprese Polo kináz během buněčného cyklu

1
Akademie věd České republiky
Ústav živočišné fyziologie a genetiky
Liběchov
Martin Anger
Identifikace Polo kinázy a její exprese v průběhu buněčného
cyklu
Školitel: Prof. MVDr. Jan Motlík, DrSc.
Školitel specialista: Ing. Michal Kubelka, CSc.
2
Poděkování
Rád bych touto cestou poděkoval svým školitelům Prof. MVDr. Janu
Motlíkovi, DrSc., a Ing. Michalu Kubelkovi, Csc., za zajištění optimálních
pracovních podmínek a odborné vedení při experimentální práci. Za inspirující
úvod do vědecké práce na samém jejím počátku bych rád poděkoval Doc.
MVDr. Josefu Derkovi, Csc., vedoucímu disciplíny imunologie na Ústavu
mikrobiologie a imunologie, fakultě VVL, VFU Brno. Za kritické zhodnocení
dosažených výsledků vděčím Ing. Josefu Fulkovi, CSc. Za spolupráci na
přípravě, provedení a hodnocení experimentů bych rád poděkoval
spolupracovníkům, Mgr. Jiřímu Klímovi, MVDr. Radkovi Procházkovi, CSc., a
Mgr. Milanu Ešnerovi. Za vždy spolehlivou a precizně provedenou technickou
pomoc bych rád poděkoval paní Lence Trávníčkové. Za laskavé přijetí ve své
laboratoři a za pomoc s vedením experimentů bych rád poděkoval Ing. Petru
Dvořákovi, CSc. a MVDr. Aleši Hamplovi, CSc., z Laboratoře Molekulární
Embryologie MZLU Brno. Dokonalým zajištěním mé laboratorní práce a
vřelým přijetím ve své laboratoři se velkou měrou na těchto experimentech
podíleli spolupracovníci z laboratoře Oddělení Biotechnologie, TZV FAL
v Mariensee, Německo. Jmenoval bych alespoň za všechny: Prof. Heiner
Niemann, PhD., Dr. Joseph W. Carnwath, PhD., Dr. Wilfried Kues, PhD., a
slečna Doris Herrmann.
3
Obsah:
1. Současný pohled na molekulární děje buněčného cyklu, rodina Polo
kináz (jednotlivé kapitoly obsahují obrazovou přílohu)
1.1. Vstup buňky do buněčného cyklu
4
1.2. Fáze buněčného cyklu
5
1.3. Cykliny a na cyklinech závislé kinázy
7
1.4. Regulace aktivity komplexů cyklin/CDK
9
1.5. Regulace aktivity MPF
11
1.6. Přirozené proteinové inhibitory
13
1.7. Kontrolní body buněčného cyklu
14
1.8. Buněčný cyklus zárodečných buněk
16
1.9. Meiotická kompetence oocytů
16
1.10. Znovuzahájení meiozy
18
1.11. Aktivita MPF a jeho regulátorů v meioze
20
1.12. Úloha MAP kinázy a MOS v meioze
22
1.13. Úloha cyklinů jiných než cyklin B v průběhu meiozy
24
1.14. Rodina Polo kináz
26
1.15. Distribuce Plk mRNA
27
1.16. Sekvenční příbuznost Polo kináz
28
1.17. Exprese Plk proteinu
28
1.18. Lokalizace Plk během buněčného cyklu
31
1.19. Dosud známé molekuly interagující s Plk
32
1.20. Vztah Plk k aktivaci MPF
32
1.21. Ostatní doposud identifikované molekuly Polo rodiny
35
2. Cíl práce
37
4
3. Použité metody a laboratorní postupy
38
3.1. Klonování fragmentu cDNA prasečího Plk, Fnk, Snk
38
3.2. Izolace prasečích fetálních fibroblastů, kultivační podmínky,
synchronizační protokol, FACS analýza
39
3.3. Měření Exprese mRNA Plk, izolace RNA, semikvatitativní
multiplex RT-PCR, RPA
40
3.4. Kultivace prasečích oocytů
42
3.5. Příprava antisér a monoklonálních protilátek
42
3.6. Imunobloting
45
3.7. Imunoprecipitace
45
4. Výsledky a publikované vědecké práce
47
4.1. Sekvence publikované v GeneBank –vložen text
4.2. Publikace zaměřené na synchronizaci prasečích fetálních fibroblastů a
expresi Plk v těchto buňkách – vložen text
4.3. Předběžné výsledky analýzy exprese Plk v in vitro maturovaných
prasečích oocytech na úrovni mRNA a proteinu.
48
5. Závěr
52
6. Použité literární prameny
56
5
1. Současný pohled na molekulární děje buněčného cyklu
1.1 Vstup buňky do buněčného cyklu
Vývoj mnohobuněčných organismů byl podmíněn vznikem mechanismů
umožňujících striktní kontrolu nad množením buněk. Události odehrávající se
při množení buněk na molekulární úrovni jsou nesmírně komplikované a
zdaleka ne plně poznané. Tyto procesy jsou souhrnně nazývány buněčným
cyklem (Alberts et al. 1994). O tom, zda buňka vstoupí do buněčného cyklu a
dojde tedy k jejímu rozdělení se rozhoduje u mnohobuněčných organismů již na
úrovni tkání a orgánů. Buněčné dělení je proces ve většině případů vyžadující
jednak kontakt buňky s okolím (zejména s mezibuněčnou hmotou ECM ) a pak
také přítomnost mitogenních signálů v jejím bezprostředním okolí. To že buňka
pro zahájení dělení vyžaduje více potvrzujících signálů je efektivní pojistka proti
spontánní multiplikaci . Takto je umožněno mnohobuněčným organismům
koordinovat složité pochody růstu a diferenciace tkání a orgánů v rámci celého
organismu. Je známo, že zhoubné bujení není způsobeno pouze vyšší
proliferační schopností buněk, je způsobeno množením buněk v místech, kde k
tomu normálně nedochází, tj. když se buňky stávají nezávislé na kontrole
proliferace (Huang a Ingber 1999). Jak si ukážeme v následujících kapitolách,
zahájení buněčného dělení závisí na faktorech prostředí ve kterém se buňka
vyskytuje, avšak samotný proces dělení je kontrolován vnitřními buněčnými
faktory (Masui 1992).
6
1.2. Fáze buněčného cyklu
Bylo zjištěno, že u buněk v průběhu buněčného cyklu dochází ke změnám
stavu jaderné membrány a chromatinu. Tato původní pozorování, uskutečňovaná
za pomoci světelného mikroskopu, umožnila roztřídit aktivity buňky probíhající
při její multiplikaci do takzvaných fází buněčného cyklu. (Alberts et al. 1994):
Klidová fáze (G0) je pravděpodobně nejméně prozkoumaným stavem
buňky, jak ukázaly nedávné pokusy o její charakterizaci v souvislosti s
přenosem jader (Wilmut a Campbell 1998). Tento stav lze navodit v tkáňových
kulturách snížením hladiny fetálního séra v kultivačním médiu (Kues et al.
2000). Pro přechod do fáze G1 somatická buňka vyžaduje mitogenní signály a
zpravidla také potvrzující kontakt s ECM (Alberts et al. 1994).
Do G1 fáze se buňka dostane buď z M fáze po proběhlé mitoze v případě
kontinuální proliferace, nebo z G0 fáze cyklu po předchozí stimulaci
příslušnými růstovými faktory. Je to zpravidla nejdelší fáze buněčného cyklu (s
výjimkou například krátké G1 u embryonálních kmenových buněk) a buňka
v jejím průběhu velmi aktivně syntetizuje RNA a proteiny. Tato fáze buněčného
cyklu je také klíčová z hlediska regulace buněčného dělení. Pokud je buňka
v G1fázi v kontaktu s ECM a je vystavena působení rozpustných růstových
faktorů, dojde u ní na molekulární úrovni k procesům zahajujícím buněčné
dělení. Buňka překoná takzvaný Restrikčního bod (R point) (viz níže), vstoupí
do S fáze a zahájí replikaci DNA (Alberts et al. 1994).
I přes intenzivní výzkum v této oblasti jsou známy pouze některé
mechanismy, které jsou pro vstup buňky do S fáze rozhodující. Klíčovou roli u
somatických buněk zde hrají kontakty s ECM nebo jinými buňkami a rozpustné
růstové signály působící přes membránové receptory. Pro překonání
Restrikčního bodu a vstup do S fáze je přítomnost obou faktorů, tedy přímých
kontaktů i rozpustných signálů zároveň, nezbytná (Huang a Ingber 1999).
Signály generované těmito stimuly jsou následně signálními drahami přeneseny
do jádra, kde dojde k příslušným změnám spojeným zejména s genovou expresí
7
a do cytoplasmy, kde dochází k aktivací klíčových molekul buněčného cyklu cyklinů a na cyklinech závislých kináz (CDK). Poměrně dobře prozkoumaným
mechanismem, klíčovým pro zahájení S fáze, je fosforylační modifikace
molekul náležících do rodiny Retinoblastomových proteinů, zejména pRb
(Planas-Silva a Weinberg 1999). Tato molekula se nachází v ranné G1 fázi
v hypofosforylovaném stavu, který umožňuje vazbu transkripčních faktorů
nezbytných k aktivaci genů nutných pro zahájení S fáze . Komplexy cyklinů D a
Cdk 4 a 6, později také cyklinu E a Cdk2 aktivované mitogenními signály jsou
schopny fosforylovat pRb proteiny. Tato fosforylace změní prostorovou
konformaci molekuly pRb, přičemž tato nová konformace už neumožňuje vazbu
transkripčních faktorů. Pod vlivem uvolněných transkripčních faktorů dojde
k aktivaci genů nutných pro zahájení S fáze. Molekulární podstatou kontrolního
bodu nazvaného Restrikční bod je tedy konformační změna pRb způsobená jeho
fosforylací. Další procesy dělení buňky probíhají již víceméně nezávisle na
signálech z jejího okolí (Alberts et al. 1994, Planas-Silva a Weinberg 1999),
jinými slovy průběh buněčného cyklu je po překonání Restrikčního bodu vnitřní
záležitostí buňky a organismus již nemá možnost do jeho událostí aktivně
zasáhnout.
Během S fáze buňka replikuje DNA. Tento proces je pečlivě
zpětnovazebně kontrolován. Případné chyby vedou k zastavení buněčného cyklu
a k aktivaci opravných mechanismů, jestliže není možno chybu odstranit,
aktivují se apoptotické dráhy vedoucí k apoptóze (Moore et al. 1996, Alberts et
al. 1994). Pokud je DNA replikována správně, buňka vstoupí do M fáze, což se
morfologicky projeví kondenzací chromozomů a rozpadem jaderné membrány.
V průběhu M fáze jsou DNA i cytoplasma rozděleny do nově vzniklých buněk
za účasti velkého množství různých molekul a buněčných struktur, patrná je
především účast mikrotubulárního aparátu. I tyto procesy jsou buňkou pečlivě
monitorovány zpětnovazebně kontrolovány tak, aby došlo ke správné distribuci
cytoplazmatického i genetického materiálu.
8
1.3. Cykliny a na cyklinech závislé kinázy
Zahájení a průběh jednotlivých fází buněčného cyklu je umožněn řízenou
aktivací katalytických komplexů složených z cyklinů a na cyklinech závislých
kináz (CDK).
Tyto komplexy přenášením fosfátových skupin modifikují vlastnosti
proteinových substrátů, a jsou tak na molekulární úrovni zodpovědné za řadu
procesů odehrávajících se v průběhu buněčného cyklu, jako například replikaci
DNA, rozpuštění jaderné membrány, formování dělícího vřeténka, segregaci
9
chromozomů atd. Pomocí signálních kaskád jsou tyto komplexy napojeny na
vnější prostředí buňky (Graňa 1995).
Je zřejmé, že tak významné faktory by mohly být při ztrátě kontroly
nebezpečné jak buňce tak i celému organismu. Aktivita těchto komplexů je
proto kontrolována na mnoha úrovních. Na úrovni DNA a RNA řízenou
transkripcí a translací, a na úrovni proteinů zejména posttranslačními
modifikacemi a specifickou destrukcí označených molekul (Boulikas 1996,
Brandeis a Hunter 1996). Zejména fosforylace, náležející mezi posttranslační
modifikace je významným způsobem kontroly a můžeme říci, že kvantitativně i
kvalitativně hraje klíčovou roli v regulaci mnoha buněčných procesů, buněčné
dělení samozřejmě nevyjímaje (Mordret 1993, Hunter 1995). Kinázovofosfatázové dráhy využívající fosforylace se také zásadním způsobem podílí na
přenosu signálu z povrchu buňky. Fosforylace během přenosu signálu umožňuje
jeho amplifikaci, jako příklad je možno uvést aktivaci p90rsk drahou
ERK1/ERK2 (Extracellular Regulated protein Kinases), nazývanou také MAPK
(Mitogen Activated Protein Kinases), kde dochází k amplifikaci signálu až 10
000x (Hunter 1995). Stimuly z vnějšího prostředí jsou přes membránové
receptory napojeny na MAP kinázové dráhy, kdy v reakci na podněty z vnějšího
prostředí aktivované molekuly MAPK fosforylují široké spektrum substrátů
účastnících se mnoha pochodů uvnitř buňky. Substrátem MAPK jsou
cytoplazmatické i nukleární proteiny (Gotoh et al. 1995). MAP kinázovou dráhu
můžeme považovat za centrální signální a fosforylační dráhu proteinů v buňce
(Mordret 1993, Errede et al. 1995).
Je známo že kinázy závislé na cyklinech (CDK) se vyznačují značnou
fylogenetickou konzervativností a kontrolují obdobným způsobem, ve vazbě na
cykliny, průchod jednotlivými fázemi buněčného cyklu u všech doposud
zkoumaných eukaryot (Murray 1994). Všechny CDK jsou strukturně příbuzné,
zejména v doméně o velikosti 300 aminokyselin, ale i mimo tuto doménu je
sekvenční homologie velmi vysoká a pohybuje se okolo 40%. Mimo sekvenční
10
příbuznosti jsou si podobné i molekulární hmotností, která se pohybuje okolo
30-40 kDa (Heitz et al. 1997). Všechny jsou aktivní pouze v komplexu
s cyklinovou podjednotkou (Nigg 1995) u kterých je známá také vysoká
sekvenční příbuznost (zejména ve 100 aminokyselinové doméně nazývané
„cyklin box“), také i molekulární hmotnost je u cyklinů podobná, pohybuje se
v rozmezí 30-80 kD (Heitz et al. 1997). V průběhu buněčného cyklu dochází k
aktivaci rozdílných komplexů CDK a asociovaných cyklinů (Nigg 1995).
1.4. Regulace aktivity komplexů cyklin/CDK
Regulace aktivity komplexů cyklin/CDK umožňuje zdárný průběh
jednotlivých fází buněčného cyklu. Tato regulace je závislá na několika
klíčových faktorech. Mezi nejdůležitější z nich patří především typ cyklinů,
který společně s CDK tvoří katalytický komplex. Exprese různých cyklinových
molekul je pomocí regulace transkripce a translace a také posttranslačními
modifikacemi řízena v průběhu buněčného cyklu tak, že jednotlivé komplexy
cyklin/CDK jsou katalyticky aktivní pouze v určité fázi buněčného cyklu (Nurse
1994, Nigg 1995). Při přechodu buňky z G0 do G1 fáze buněčného cyklu hrají
prvořadou roli cykliny typu D, jejichž exprese je stimulována růstovými faktory.
11
Nejvyšší hladiny i aktivity dosahují tyto molekuly v pozdní G1 fázi. Jejich
partnerskými kinázami jsou CDK4 a CDK6. Následuje exprese cyklinu E, která
se zčásti kryje s expresí D cyklinů, ale přetrvává déle, až do S fáze. Cyklin E je
typickým G1 cyklinem a vrchol jeho exprese je v pozdní G1. Kináza
asociovaná s cyklinem E je CDK2. Oba dva typy cyklinů, D i E se rozhodujícím
způsobem podílejí na zahájení S fáze fosforylací molekul náležejících do rodiny
Retinoblastomových proteinů. Hladina cyklinu E klesá po zahájení S fáze cyklu
v důsledku jeho degradace a kináza CDK2 je dále asociovaná s cyklinem A.
Syntéza cyklinu A je zahájena v pozdní G1 fázi uvolněním specifických
transkripčních faktorů doposud vázaných na Retinoblastomové proteiny,
kinázová aktivita je poprvé detekovatelná v S fázi a přetrvává až do G2/M.
Lokalizace cyklinu A během S i G2/M fáze je v jádře, v místě syntézy DNA,
což by mohlo znamenat, že cyklin A ovlivňuje proteiny podílející se na replikaci
DNA. Vstup do mitozy je řízen MPF (mitotic promoting factor), který je složen
z CDK1 a cyklinu B (Motlík a Kubelka 1990, Graňa 1995, Nigg 1995, Hunter
1995, Tieb et al. 1997 ), podrobněji viz níže.
Cyklinová podjednotka komplexu cyklin/CDK determinuje lokalizaci
celého komplexu, tím i samozřejmě i výběr substrátů ke kterým má navázaná
kináza přístup (Nigg 1995, Heitz a kol. 1997). Je známo, že některé cyklinové
molekuly jsou různě distribuovány v buňce v důsledku vazby na rozdílné
buněčné struktury. Typickým příkladem je cyklin B nacházející se v G2 a M fázi
na centrosomu, v jádře, případně i volně v cytoplazmě (De Souza et al. 2000).
Během buněčného cyklu se také mění fosforylační stav komplexů
cyklin/CDK. Mimo řízenou expresi je to nejčastější způsob regulace aktivity
těchto komplexů. Ve většině případů je fosforylačně regulovaná kinázová
podjednotka komplexu, i když u některých organismů (mořská hvězdice,
Xenopus, myš) dochází i k fosforylaci cyklinů. (Derua et al. 1997, Mitra a
Schultz 1997).
12
1.5. Regulace aktivity MPF
Nejlépe byla prozkoumána fosforylační regulace u CDK1 (Nigg 1995,
Hunter 1995). Aktivita CDK1 je fosforylací regulována pozitivně i negativně
v závislosti na místě fosforylace. Obdobná fosforylační místa slouží k regulaci i
jiných CDK (Nigg 1995). V případě CDK1 je známo, že fosforylace na
threoninu 14 a tyrozinu 15 (ležících uvnitř vazebného místa pro ATP) způsobí,
že komplex cyklin B/CDK1 je neaktivní až do G2/M, kdy aktivovaná fosfatáza
CDC 25C tyto fosfátové skupiny odejme a komplex aktivuje (Nigg 1995).
Naopak, fosforylace CDK1 na treoninu 161 prostřednictvím CAK (Cyclin
Activating Kinase) je nezbytným faktorem aktivace celého komplexu (Nigg
1995; Hunter 1995; Andersen et al. 1997). Toto fosforylační místo se nachází
uvnitř domény označované jako T-loop a účastní se vazby komplexu cyklinCDK1 na substrát. CAK je opět katalytický komplex složený z cyklinu H a
CDK 7, jehož aktivita je také regulována fosforylačně (Shuttleworth 1990, Nigg
1996, Hunter 1995, Anderson et al. 1997). Aktivita CAK je u kultivovaných
savčích buněk konstantní v průběhu celého cyklu (Hunter 1995, Martinez et al.
1997).
13
Časová posloupnost regulačních dějů u MPF je taková, že nejprve je
nefosforylovaná CDK1 asociovaná s cyklinem a ihned poté je CDK1
fosforylována na všech třech fosforylačních místech. Obě inhibiční fosfátové
skupiny udržují MPF komplex neaktivní až do té doby, než dojde ke
kontrole bezchybné replikace DNA (Nigg 1996). Nakonec je defosforylací na
Tyr-15 a Thr-14 komplex aktivován v době, kdy je buňka připravena vstoupit do
M fáze (Gautier et al. 1991).
Přítomnost dvou fosfátových skupin na různých aminokyselinách u CDK
1 je regulačně velmi výhodné, neboť pouze fosfatáza s duální aktivitou (CDC
25C) může tyto fosfátové skupiny odejmout a je tak zajištěno, že nemůže dojít
k předčasné aktivaci komplexu jinými fosfatázami v buňce přítomnými (Hunter
1995). Kinázy fosforylující CDK1 na Tyr-15 a Thr-14 jsou WEE1 a MIK1
(Nigg 1995, Hunter 1995) a jejich aktivita je také řízena fosforylačně. Bylo
zjištěno, že molekuly WEE1/MIT1 i CDC 25C jsou intenzivně fosforylovány
v G2/M, avšak zatímco fosforylace WEE1/MIT1 jejich aktivitu snižuje,
fosforylací CDC 25C je její fosfatázová aktivita zvýšena (Derua et al. 1997).
CDC 25C je na přechodu G2/M fáze na N konci mnohočetně fosforylovaná což
vede k 3-5 násobnému zvýšení její aktivity (Hunter 1995).
14
U savců jsou známy tři typy fosfatáz CDC 25: CDC 25 A, B a C, které
jsou vysoce homologní v C terminální části, odlišují se však N koncem
molekuly. CDC 25A se objevuje v G1/S fázi cyklu, CDC 25C v G2/M fázi, a
funkce CDC 25B není zatím příliš prozkoumána (Hunter1995, Wickramasinghe
1995). U myši byla popsána také tkáňově specifická exprese genů pro CDC 25
nejen během embryonálního vývoje ale i u dospělce (Wickramashinge et al.
1995).
Mezi MPF a CDC 25C existuje velmi úzký vztah který může vést
k vzájemné aktivaci. Posloupnost těchto aktivačních dějů je pravděpodobně
taková: malé množství fosforylované a tedy i aktivní CDC 25C defosforyluje
prahové množství molekul MPF, který zpětně aktivuje více CDC 25C a tímto
způsobem je pozitivní zpětnou vazbou aktivováno stále více MPF až dojde
k typickým morfologickým projevům vysoké aktivity komplexu MPF (Hunter
1995). Je zřejmé, že tato vzájemná aktivace mezi MPF a CDC 25C je pouze
jakási amplifikační zpětná vazba, a že aktivace prvních molekul CDC 25C je
kontrolována doposud neznámou proteinkinázou (Derua et al.1997).
1.6. Přirozené proteinové inhibitory
Na regulaci aktivity komplexů cyklin/CDK se podílí také přirozeně se
vyskytující proteinové inhibitory. Jedním z nich u nějž byla prozkoumána jeho
funkce u obratlovců je p21. Tento protein inhibuje nejrůznější komplexy
cyklin/CDK a to pravděpodobně blokováním interakce komplexu ze substrátem,
popřípadě s CAK. Tvorba proteinu p21 může být stimulovaná proteinem p53 po
detekci poškození DNA. Dojde k zastavení buněčného cyklu, viz níže. U
terminálně diferencovaných buněk se však p21 exprimuje nezávisle na p53 a
blokuje tak cyklus trvale (Graňa 1995). Dalším známým inhibitorem CDK je
p27. Je známo, že jeho tvorba je stimulována TGF-β nebo kontaktní inhibicí
růstu. Další z přirozených proteinových inhibitorů je p57, který také reaguje
s různými komplexy cyklin/CDK, je rovněž nadměrně exprimován v terminálně
15
diferencovaných liniích a zastavuje buňky v G1 fázi. Proteinové inhibitory p16 a
p15, na rozdíl od předchozích inhibitorů, inhibují pouze aktivitu komplexů
cyklinů D s CDK4 a CDK6 (Nigg 1996). V poslední době je těmto přirozeným
proteinovým inhibitorům věnována značná pozornost. Závěrem lze říci, že
přirozené inhibitory CDK hrají důležitou roli při ovlivňování buněčného cyklu
negativními signály z vnějšího či vnitřního prostředí. Mohou tak zastavit buňku
v různých částech G1 fáze buněčného cyklu při řízení růstu a diferenciace buněk
na úrovni tkání a orgánů. V pozdějších částech cyklu jsou součástí kontrolních
mechanismů a mohou zastavit průběh buněčného cyklu v reakci na poruchy
detekované vnitřními kontrolními mechanismy buňky (Graňa, 1995).
1.7. Kontrolní body buněčného cyklu
Poruchy vzniklé při replikaci, popřípadě distribuci genetického materiálu
by mohly mít pro buňku a organismus katastrofální následky. Aby byla
pravděpodobnost vzniku těchto poruch snížena na minimum jsou procesy
buněčného cyklu mnohačetně zpětnovazebně kontrolovány vnitřními
mechanismy buňky. Nejdůležitější mechanismy kontroly byly nazvány kontrolní
body (checkpoints) (Graňa 1995). Můžeme říci, že hlavní kontrolní body
buněčného cyklu se nachází v G1 a G2/M. První z obou kontrolních bodů
nacházející se v G1 byl již diskutován v souvislosti s G1 fází buněčného cyklu,
v literatuře je znám jako Restrikční bod. Kontrolní bod v G2/M brání rozdělení
chybně replikované DNA v M fázi. Jedním z důležitých faktorů účastnících se
v kontrole procesů replikace DNA, tedy v kontrolním bodu G2/M je molekula
p53. Je známo, že tvorba p53 může být indukovaná ozářením buňky
krátkovlnným zářením, které poškozuje DNA. Protein p53 je transkripční faktor,
který indukuje expresi p21 a GADD45. Obě tyto molekuly se podílejí na
zastavení replikace DNA a buněčného cyklu. Buňky s defektním p53 (například
změněným mutací) tedy replikují DNA bez kontrolních mechanismů tohoto typu
a může dojít k amplifikaci mutací (Graňa 1995). U buněk s poškozenou DNA je
16
v G2/M kontrolním bodě blokováno zahájení mitózy. Mezi prokázané účinky
tohoto G2/M bloku patří například inaktivace centra pro organizaci mikrotubulů
(MTOC), což je struktura nutná pro vybudování dělícího vřeténka a segregaci
chromozomů (Su a Widwans, 2000).
17
1.8. Buněčný cyklus zárodečných buněk
Během časného embryonálního vývoje obratlovců dochází k oddělení
skupiny buněk označovaných jako primordiální zárodečné buňky. Tyto buňky
posléze migrují do základů pohlavních orgánů. Zde dochází nejprve k jejich
pomnožení mitotickou proliferací, po kterém následuje redukce počtu
chromozomů v průběhu meiozy. Výsledkem všech těchto procesů jsou vysoce
specializované buňky schopné vzájemnou kombinací obou pohlaví dát vznik
totipotentní buňce ze které se vyvine během embryonálního vývoje celý
organismus.
Vzhledem k tomu, že obou linií zárodečných buněk jsou patrné rozdíly
v průběhu meiozy, zaměřím se dále pouze na samičí buňky. Fáze mitotického
množení oocytů probíhá u samic savců ještě během intrauterinního vývoje a je
také ještě intrauterinně ukončena v diplotenním stadiu profáze I meiotického
dělení, kdy množství DNA je 4C (Motlík a Kubelka 1990).
1.9. Meiotická kompetence oocytů
Další vývoj oocytu pokračuje takzvanou růstovou fází. Během této velmi
dlouhé periody oocyty zvětšují svou velikost, probíhá syntéza a akumulace
proteinů, RNA a organel, které tvoří zásobu pro pozdější meiotickou maturaci i
časný preimplantační vývoj (Motlík a Kubelka 1990, Schultz 1996). Například
oocyty myši zvětší svůj průměr z 15 na 80 µm, prasat z 30 na 120 µm (Hirao et
al. 1995). Jakmile oocyty dosáhnou plné velikosti, čekají na hormonální signál
ke znovuzahájení meiozy (Taieb et al. 1997, Mitra a Schultz 1996).
Během růstu oocyty postupně získávají meiotickou kompetenci, která
souvisí s velikostí, morfologickými změnami jádérka (kompaktizace) a s
přeměnou folikulů, ve kterých se oocyty nachází na preantrální a antrální
(Motlík a Kubelka 1990, Schultz 1996). Růstová fáze vývoje oocytu je aktivitou
buňky porovnatelná s G1 fází mitotického cyklu (Motlík a Kubelka 1990) i když
by se dalo říci, že se spíše jedná o atypickou G2, vzhledem k tomu, že oocyt má
18
DNA již replikovanou. Naproti tomu výskytem některých molekul, například
cyklinů typu D je znovuzahájení meiozy podobné přechodu G0/G1 mitotického
cyklu (Moore et al. 1996; Taieb et al. 1997). Před dosažením plné meiotické
kompetence nejsou oocyty schopny ještě plnohodnotně reagovat na hormonální
stimuly, což podle zjištění u Xenopa, není dáno nedostatkem receptorů, ale spíše
neschopností tento signál zpracovat (nedostatečným množstvím MPF) (Motlík a
Kubelka 1990). Meiotická kompetence jako funkční stav oocytu se nevyvíjí
najednou, ale postupně, během růstu. Jak bylo zjištěno, oocyt, který je na hranici
kompetentnosti k meioze, může prodělat GVBD (germinal vesicle breakdown,
rozpuštění jaderné membrány), kondenzovat chromozomy, zformovat metafázní
vřeténko a může přejít i do metafáze I. Není však schopen pokračovat dále za
metafázi I ani při dlouhodobé kultivaci. Bylo zjištěno, že oocyt nemůže opustit
metafázi I v důsledku vysoké aktivity MPF (Hampl a Eppig, 1995).
19
1.10. Znovuzahájení meiozy
V reakci na hormonální stimulaci může plně vzrostlý oocyt nacházející se
v profázi prvního meiotického dělení znovuzahájit meiozu. Tímto stimulem u
savců je hormonální stimulus (LH peak) nebo ukončení inhibičního vlivu
folikulárních buněk (Motlík a Kubelka 1990, Taieb et al. 1997). Morfologické
projevy znovuzahájení meiozy (GVBD) nejsou patrné bezprostředně po
hormonálním stimulu, ale je zde různě dlouhá doba latence, jejíž trvání je
druhově závislé (1-2 hodiny u myši, 18-20 hodin u prasete). Tato doba je nutná
k přetransformování hormonálního impulsu signálními kaskádami na aktivní
komplex MPF, který je zodpovědný za morfologické projevy znovuzahájení
meiozy u všech eukaryot (De Vantéry et al. 1996).
20
21
1.11. Aktivita MPF a jeho regulátorů meioze
Mezi hlavní morfologické projevy aktivity MPF při znovuzahájení
meiozy patří GVBD (germinal vesicle breakdown)- kondenzace chromozomů a
rozpad jaderné membrány. V některých experimentech však bylo prokázáno, že
GVBD může být v oocytech ošetřených kyselinou okadaikovou způsobeno i
aktivitou MAPK (Gavin et al. 1994). Aktivita MPF kolísá v průběhu
meiotického zrání. Po indukci znovuzahájení meiozy musí nejprve dojít
k aktivaci MPF fosfatázou CDC25C. Po GVBD zůstává aktivita MPF vysoká až
do přechodu mezi metafází I a II, kde je možné detekovat pokles aktivity. Za
tento pokles je odpovědné snížení hladiny cyklinu B, způsobené APC (anaphase
promoting complex), který destruuje cyklin B. Tato změna v aktivitě MPF
ovšem není tak markantní jako po proběhlé anafázi mitotického cyklu (Hampl a
Eppig 1995, Taieb et al. 1997). Při vstupu do druhé metafáze aktivita MPF opět
vzrůstá a zůstává vysoká u oocytů blokovaných v metafáze II působením CFS
(cytostatic factor). Po aktivaci oocytu, ke které dochází během fertilizace opět
rychle poklesne.
22
Podle dostupných údajů (de Vantéry et al. 1996) se množství CDK1 a
cyklinu B u oocytů mění v průběhu růstové fáze. To bylo potvrzeno i v dalších
experimentech, ve kterých bylo zjištěno, že v meioticky nekompetentních
oocytech je pouze 17,5% CDK1 ve srovnání s kompetentními oocyty, naopak
koncentrace cyklinu B1 je 6x větší v nekompetentních oocytech. Lze tedy říci,
že během růstu oocytů koncentrace cyklinu B klesá a koncentrace CDK1 roste,
koncentrace CDC 25C jako aktivátoru MPF roste 2-3x a koncentrace WEE1,
inhibitoru MPF, klesá 2,5x. (Mitra a Schultz 1996).
Z těchto údajů je zřejmé, že pro dosažení meiotické kompetence je u
oocytů rozhodující spíše změna lokalizace, tedy i lokální koncentrace MPF,
CDC 25C a WEE1/MIT1, než jejich absolutní množství. Zajímavé je, že ačkoli
hladina a lokalizace těchto regulátorů buněčného cyklu se mění, množství RNA
pro tyto proteiny zůstává stejné, takže rozdíly v množství proteinů musí být
dány jinými mechanismy. Je možné, že mRNA jsou překládány s jinou
účinností, nebo že některé molekuly jsou stabilnější.
23
1.12. Úloha MAP kinázy a MOS v meioze
Signály generované hormonální stimuly, nutné ke znovuzahájení meiozy,
jsou šířeny v oocytech cestou proteinkinázových kaskád- MAP kinázy, c-raf
(Motlík a Kubelka 1990, Taieb et al. 1997) nebo p90rsk (Kalab 1996). U
jednotlivých obratlovců se časový sled aktivace MPF a MAPK poněkud liší,
v závislosti na druhu. Bylo zjištěno, že u Xenopa a prasete je MAPK a MPF
aktivována ve stejnou dobu (těsně před GVBD), zatímco u myši aktivace MPF
(těsně před GVBD) předchází aktivaci MAPK (Motlík a Kubelka 1990). U
Xenopa bylo zjištěno, že předčasná aktivace MAPK zabrání inaktivaci
mikroinjikovaného komplexu cyklin B/CDK1. Je možné, že MAPK inaktivuje
fosforylací WEE1/MIT1 (Abrieu et al. 1997).
V oocytech Xenopa dochází po progesteronovém impulsu k aktivaci
MAPK buď signální drahou vyžadující MOS (proteinový produkt
protoonkogenu c-mos), nebo drahou s nutnou účastí Raf1 (Abrieu et al. 1997).
Naproti tomu v oocytech myši (Verhlac et al. 1996), je k aktivaci MAPK MOS
nutný vždy, neboť tato kináza se neaktivuje v oocytech MOS -/- . Bylo zjištěno,
že Raf1 se na aktivaci MAPK u myši nepodílí (Verhlac et al. 1996). Jak již bylo
shora uvedeno, MAPK se u myši aktivuje o něco později než MPF. MOS a
MAPK se nepodílí ani na reaktivaci MPF na přechodu z M I do M II. Ukázalo
se však že se obě kinázy podílí na organizace mikrotubulů a dělícího vřeténka
během meiozy myšího oocytu (Verhlac et al. 1996).
Po proběhlé meioze zůstavají oocyty u obratlovců blokovány v metafázi
II, s vysokou aktivitou MPF pod kontrolou CSF (cytostatic factor) (Jessus et al.
1993, Mitra a Schultz 1996, Furuno et al. 1997). CSF stabilizuje cyklin B proti
degradaci a brání tak spontánnímu poklesu aktivity MPF. Tento blok vyžaduje
aktivitu MAPK. Na CSF bloku u Xenopa se podílí i MOS jehož mRNA je
v oocytech přítomna během oogeneze, avšak protein je možné detekovat až po
progesteronovém impulsu (Gebauer a Richter, 1997). MOS je během zrání
oocytů fosforylován, maximální aktivity dosahuje v době od GVBD až do
24
metafáze II (Masui, 1992). MOS je v oocytech Xenopa pravděpodobně přímo
schopen aktivovat MEK (kináza nadřazená MAPK) a tak i MAPK (Sagata,
1997). Z uvedených experimentálních zjištění je zřejmé, že MOS je v ocytech
Xenopa nutný pro zahájení zrání, pro přechod mezi dvěma fázemi meiozy,
zahájení druhého meiotického dělení, pro blok v metafázi II jako základní
komponenta CSF a zřejmě i pro udržení aktivního MPF (Sagata, 1997).
Také oocyty myši jsou blokovány vysokou aktivitou CSF v bloku
metafáze II. U myší je vysoká aktivita MPF v metafázi II způsobená
rovnováhou mezi syntézou cyklinu B a jeho degradací neboť jak bylo zjištěno,
inhibice syntézy proteinů aktivuje myší oocyty (Kubiak a kol, 1993). CSF u
myší je vícesložkový komplex s nezastupitelnou účastí MOS a MAPK. RNA pro
MOS se tvoří hlavně v době růstové fáze oocytů, hladina proteinu se zvýší po
znovuzahájení meiozy a akumuluje se během celého meiotického zrání oocytů.
MOS je také u myši faktorem nezbytným pro průběh meiozy. Mos -/- myši jsou
schopné projít GVBD, ale nedojde u nich k vytvoření bloku v metafázi II a
pokračují do metafáze III. Protein MOS je nutný pro aktivaci MAPK,
předpokládá se tedy, že MOS je schopen udržet vysokou aktivitu MAP kinázy
25
v metafázi II blokovaných oocytech a tím zabránit v degradaci cyklinu B s
následným poklesem aktivity MPF a přechodem do G1 (Hirao a Eppig, 1997).
V průběhu meiotické maturace myších oocytů je MOS , tak jako u Xenopa,
fosforylován (Gebauer a Richter, 1997). U myši, vzhledem k tomu, že MAPK a
MOS jsou aktivovány později než MPF lze říci, že se MAPK a MOS
pravděpodobně nepodílí na aktivaci MPF v GV oocytech (Sagata, 1997), není
tedy nezbytným pro zahájení meiotického zrání, ale je nutnou součástí bloku
v metafáze II. U myši i u Xenopa zabraňuje partenogenetické aktivaci
neoplodněného vajíčka a vzniku haploidního genomu (Sagata, 1997).
1.14. Úloha cyklinů jiných než cyklinu B v průběhu meiozy
Méně je známo o účasti jiných cyklinů než cyklinu B v meiotické
maturaci oocytů. Cyklin E je v oocytech Xenopa přítomen a jeho hladina stoupá
do meiozy II současně s množstvím CDK2 (Tieb et al. 1997, Furuno et al.
1997) V oocytech Xenopa blokovaných v metafázi II je hladina cyklinu E vyšší
než hladina A1, B1 a B2. Cyklin E je asociován s CDK2 a tento komplex se z
26
20% podílí na celkové aktivitě H1 kinázy (ostatní komponenty H1 kinázové
aktivityjsou cyklin B/CDK1 a cyklin A/CDK1) (Taieb et al. 1997), naproti
tomu u myši je všechna H1 kinázová aktivita připisována pouze MPF (Mitra a
Schultz 1996). V oocytech Xenopa je možno detekovat i fosforylovanou formu
cyklinu E. Cyklin E ve spojení s CDK2 pravděpodobně také inhibuje
proteolytickou destrukci jiných cyklinů (Taieb et al. 1997) a podílí se tak na
stabilizaci bloku v metafázi II (Poon et al. 1994).
Na význam CDK2 pro maturaci oocytů existují protichůdné názory.
Zatímco při použití antisense oligonukleotidů k inaktivaci CDK2 bylo zjištěno,
že CDK2 je nutným faktorem bloku v metafázi II u Xenopa (Gabrielli et al.
1993), experimenty kdy byl použit p21 jako inhibitor CDK2 neprokázaly
nezbytnost CDK2 v tomto bloku (Furuno et al. 1997).
Cyklin A se začíná akumulovat v oocytech Xenopa během GVBD a je
destruován z 80% po M I, ve stejném čase jako cyklin B (Taieb et al. 1997).
Hladina cyklinu A, která by byla nutná ke spuštění GVBD je 2-3x vyšší než u
cyklinu B. Uvádí se, že koncentrace cyklinu A v oocytech blokovaných
v metafázi II u Xenopa je 10x nižší než cyklinu B (Jones a Smythe, 1996). Není
známo proč v oocytech Xenopa je cyklin A asociován s CDK1 a ne s CDK2
jako v mitoickém cyklu a jaký význam má toto zjištění. Možné vysvětlení by
mohlo být, že o vazbu na CDK2 je nucen cyklin A soutěžit s cyklinem E,
kterého je ovšem několikanásobně více. Aktivita cyklinu A nemá
pravděpodobně, vzhledem k jeho nízké hladině, význam pro zahájení první
meiozy, nelze však vyloučit možnost, že by komplex cyklinu A/CDK1mohl
fungovat jako spouštěcí mechanismus autokatalytické aktivace mezi MPF a
CDC25C a tímto způsobem se podílet na GVBD (Sweeny et al. 1996, Taieb et
al. 1997).
Je známo, že u některých druhů, například u Xenopa (Howe a kol.1995) a
myši (Sweeny et al. 1996), existují dva typy molekuly cyklinu A , A1 a A2,
vykazující rozdílnou tkáňovou expresí. A1 se objevuje u dospělých jedinců
27
těchto druhů pouze v ováriích a v testes, tedy tam, kde se vyskytují buňky
procházející meiozou, dále v embryu až do stádia gastrulace. A2 je
detekovatelný v somatických buňkách, ale i v oocytech a embryích obou druhů.
Zatímco u myši byl cyklin A1 detekován také v oocytech ve stadiu GV, u
Xenopa syntéza cyklinu A1 nenastává dříve než v GVBD, což by mohlo
znamenat, že kinázová aktivita asociovaná s cyklinem A1 není u Xenopa, na
rozdíl od myši, nutná k GVBD (Ravnik a Wolgemuth, 1996, Sweeny a kol.
1996). Přesnější údaje o úloze cyklinu A během meiozy dosud chybějí.
Bylo zjištěno, že oocyty Xenopa obsahují konstitutivně aktivní CAK
během oogeneze, meiotické maturace a během prvních mitotických
embryonálních cyklů. Toto zjištění vysvětluje, proč mikroinjekce cyklinu A
nebo B vede k formování aktivního cyklin/CDK1 komplexu. (Taieb et al. 1997)
1.15. Rodina Polo kináz
Kinázy strukturně odlišné od CDK a nezávislé na cyklinech hrají
důležitou roli v průběhu buněčného cyklu, zejména ty, které regulují aktivitu
CDK. Jednou z nově identifikovaných skupin proteinkináz tohoto typu je rodina
Polo kináz, viz níže. Tyto kinázy jsou nezbytné pro zdárný průběh buněčného
cyklu u tak odlišných organismů jako jsou hmyz, kvasinky a savci (Sunkel a
Glover 1988, Glover et al. 1996, Lane a Nigg, 1997, Golsteyn et al. 1998,
Glover et al. 1998, Nigg 1998).
28
První molekula této skupiny byla identifikována koncem 80-tých let u
Drosophila melanogaster u mutace polo (odtud byl odvozen název celé
proteinkinázové rodiny, rodina Polo kináz), která vykazovala abnormální
morfologické aberace v mitóze i meioze jako například chybnou segregaci
chromozomů s poruchami mikrotubulárního aparátu v cytokinezi. Bylo dále
zjištěno, že tyto poruchy úzce souvisí s funkcí dělícího vřeténka (Sunkel a
Glover 1989, Fenton a Glover 1993, Lane a Nigg, 1997, Carmenet al. 1998). U
savců byla molekula analogická k Polo kináze identifikována nejprve u myši
(Clay et al. 1993, Clay et al. 1997) jako kináza objevující se při diferenciaci a
buněčném cyklu hematopoetických progenitorových buněk, byla nazvaná Plk
(Polo-like Kinase), později byla molekula Plk popsána i u člověka (Golsteyn et
al. 1994).
1.16. Distribuce Plk mRNA
Měření úrovně exprese RNA ukázala vysoký výskyt Plk mRNA v
proliferujících buňkách. Z tohoto důvodu je vyšší výskyt této molekuly ve
všech embryonálních tkáních, avšak s postupujícím vývojem zárodku a následně
pak u dospělců se exprese v tkáních snižuje. Jako vhodný příklad mohou
posloužit myocyty srdečního svalu, které mají během embryonálního vývoje
poměrně vysokou hladinu Plk, po narození však PLK téměř neexprimují
(Georgescu et al. 1997).Výjimkou jsou ovária a testes dospělých jedinců kde je
možno Plk mRNA detekovat ve vysoké koncentraci i u dospělých jedinců
(Matsubara et al. 1995). Údaje o expresi naznačují, že se jedná o faktor
významný pro dokončení meiozy a vývoj časného embrya. V některých studiích
bylo prokázáno, že Plk RNA vymizí při indukované terminální diferenciaci
erytroidních buněk (Lake a Jelinek 1993). Kritickým faktorem pro regulaci
hladiny mRNA Plk je polyadenylační signál na 3 konci mRNA, který je
odstraněn po navozené terminální diferenciaci, transcript je pak rychle
degradován (Lake a Jelinek 1993).
29
Maximální hladina mRNA je detekovatelná v G2/M fázi buněčného
cyklu, naopak v G1 fázi Plk mRNA chybí . Je zjištěno, že úroveň exprese Plk
mRNA je regulována promotorem, který je aktivován na konci G1 fáze a
zůstává aktivní až do G2/M (Brauninger et al. 1995, Uchumi 1997, Lane a
Nigg, 1997). Mikroinjekcí mRNA Plk lze stimulovat fibroblasty
synchronizované v G0 ke vstupu do mitozy a konstitutivní exprese vede
k nádorové transformaci myších fibroblastů (Smith et al. 1997).
1.17. Sekvenční příbuznost Polo kináz
Všechny doposud známé Polo kinázy jsou sekvenčně příbuzné, homologie
je vyšší na N konci. Motiv 30 aminokyselin ležící těsně za polovinou na počátku
C části molekuly označovaný jako Polo box, je vysoce fylogeneticky
konzervativní. Tato doména je přítomna u všech polo kináz a je tedy znakem
molekul náležejících do rodiny Polo kináz. Tento sekvenční motiv je
pravděpodobně zodpovědný za lokalizaci molekuly v průběhu buněčného cyklu
(Lee et al. 1998). C terminální část molekuly obsahuje regulační doménu
nezbytnou pro inhibici aktivity Plk (Mundt et al. 1997).
1.18. Exprese Plk proteinu
Exprese proteinu kolísá tak jako exprese mRNA v rámci buněčného cyklu
– není detekovatelný v G1, roste během S fáze, zůstává konstantní během G2/M
a rychle klesá po M fázi (Holtrich et al. 1994). V některých experimentech bylo
poukázáno na to, že Plk má u savčích buněk nějaký vztah k syntéze DNA
v S fázi (Hamanaka et al. 1994). Tato zjištění byla ovšem v rozporu s novějšími
nálezy (Lane a Nigg, 1996), kdy při mikroinjekci protilátek proti Plk do
kultivovaných buněk nebyl pozorován vliv na průběh replikace DNA.
Nejnovější experimenty ovšem prokázaly spojitost mezi Plk a replikací DNA.
Tato spojitost je ovšem uskutečněna až v G2/M v kontrolním bodě
monitorujícím už proběhlou replikaci DNA (Smits et al. 2000). viz níže.
30
Během G2/M je Plk fosforylována na serinu což vede ke zvýšení její
kinázové aktivity. Bylo zjištěno, že defosforylace sníží aktivitu Plk 5-10x.
Kinázovou aktivitu Plk je možno měřit za použití kaseinu jako substrátu
(Hamanaka et al. 1995).V in vitro podmínkách může být Plk fosforylována
aktivním komplexem MPF. Načasování aktivity Plk v G2/M u savců je stejné
jako načasování aktivity MPF, naproti tomu u Drosophily je aktivita polo kinázy
posunuta směrem k telofázi (Hamanaka et al. 1994).
31
Vzhledem k vysoké hladině Plk u rychle se množících buněk se zdá, že by
exprese Plk mohla být měřítkem proliferační aktivity některých nádorů a mohla
tak tedy odrážet stupeň jejich malignity (Holtrich et al. 1994, Wolf et al. 1997,
Yuan et al. 1997). Nejnovější práce se zabývají i možností ovlivnit expresi,
32
popřípadě aktivitu Plk k ošetření nádorových buněk v rámci protinádorové
terapie (Elez et al. 2000).
1.19. Lokalizace Plk během buněčného cyklu
Práce zaměřené na lokalizaci Plk během buněčného cyklu ukázaly, že Plk
je v S fázi distribuovaná volně v cytoplazmě i v jádře. V M fázi buněčného
cyklu se během profáze a metafáze nachází na dělícím vřeténku, během anafáze
se přesouvá do ekvatoriální roviny dělícího vřeténka a v telofázi a během
cytokineze je detegovatelná na postmitotických můstcích (Lane a Nigg, 1997,
Arnaud et al. 1998, Wianny et al. 1998, Logarinho a Sunkel 1998). Podle
některých údajů se nachází i na kinetochorách (Maro B., prezentace na EMBO
pracovním setkání Meiotic maturation, září 4-7.9. 1997, Cuenca, Španělsko).
Dá se proto předpokládat, že Plk se podílí nějakým způsobem na kontrole
dynamiky dělícího vřeténka a segregaci chromozomů (Golsteyn et al. 1995,
Lane a Nigg, 1996).
33
1.20. Dosud známé molekuly interagující s Plk
Mezi molekuly, které byly identifikovány jako substráty Polo kináz,
popřípadě molekuly, se kterými se Plk váže v některých stádiích buněčného
cyklu patří: α, β i γ tubulin, kinesin-like-protein CHO1/MKLP-1 (Lee et al.
1995,Lane a Nigg, 1997, Tavares et al. 1996). Z dalších možných substrátù byly
studovány WEE1/MYT1, tedy kinázy regulující aktivity MPF a CDC27 (jako
složka APC) (Lane a Nigg, 1997, Kotani et al. 1998) a). Nejnověji byla
identifikována interakce s Hsp 90 (Simizu a Osada 2000).
1.21. Vztah Plk k aktivaci MPF
Z některých experimentů vyplývá, že Plk by mohla mít vztah i k aktivitě
MPF (Brassac et al. 2000) (Lane a Nigg, 1996, Karaiskou et al. 1998,
Descombes a Nigg 1998, Qian et al. 1998 Abrieu et al. 1998).
34
Pro tuto možnost svědčí substrátová specificita Plk, načasování aktivity
během buněčného cyklu a prostorová lokalizace v G2/M. Jak již bylo uvedeno,
autokatalytická aktivační smyčka mezi MPF a CDC25 vyžaduje buď startovní
množství aktivního MPF, nebo CDC25. V G2/M jsou však oba v neaktivním
stavu. Zahájit tento proces může buď kináza aktivující základní množství CDC
25C, nebo fosfatáza schopná aktivovat MPF. Vzhledem k tomu, že pro aktivaci
MPF by byla nutná fosfatáza s duální aktivitou, neboť fosfátové skupiny se
nachází na dvou různých aminokyselinách, zdá se pravděpodobnější, že nejprve
je aktivovaná CDC 25C. To znamená, že aktivátorem by mohla být kináza se
serin/treonin kinázovou aktivitou, která se nachází ve stejném buněčném
kompartmentu a její aktivita se shoduje i časově s aktivací MPF. U Xenopa se
podařilo prokázat, že takovou aktivující kinázou je kináza Plx, což je homolog
Polo kinázy u tohoto druhu (Kumagai a Dunphy, 1996). Z dalších experimentů
vyplývá, že tato kináza je schopná fosforylovat CDC25 nejen in vitro, ale i po
přidání PLx do oocytárních extraktů Xenopa lze na SDS PAGE pozorovat
fosforylovanou formu CDC 25C. Plx dále zvyšuje schopnost CDC25
defosforylovat a tím aktivovat MPF. Plx ale není schopná bez CDC 25C
aktivovat v extraktech MPF přímo (Karaiskou et al. 1998, Karaiskou et al.
1999). Nejnovější experimenty ukázaly, že regulace aktivity Plk je závislá na
replikaci DNA (Smits et al. 2000). Hypotetický model tedy vypadá tak, že
v případě bezchybné replikace DNA se Plk podílí prostřednictvím CDC25C na
aktivaci MPF a vstupu do mitózy. V případě, že replikace DNA neproběhla
úspěšně, Plk není aktivována a nemůže tak aktivovat CDC25C a tedy nedojde
ani k zahájení M fáze. Není však doposud zřejmé jaká je posloupnost aktivace
Plk, MPF a CDC25C v tomto kontrolním bodě.
35
Exprese Plk byla za použití inhibitorů CDK studována i v v oocytech
myši, kde bylo zjištěno, že mezi metafazí II a prvním mitotickým cyklem
k destrukci proteinu Plk nedochází (Pahlavan et al. 2000). V mitotickém cyklu je
36
Plk u savců obdobně jako jiné molekuly buněčného cyklu destruována
specifickou ubikvitinací (Ferris et al. 1998).
1.22. Ostatní doposud identifikované molekuly Polo rodiny
Zatímco u Drosophily, Saccharomyces a Schizosaccharomyces existuje
pouze jeden zástupce této rodiny, u obratlovců je počet členů Polo rodiny vyšší
(Lane a Nigg). Další identifikované kinázy, nazvané Fnk u myši (FGFInducible Kinase), Prk (Proliferation-Related Kinase) u člověka (Li et al. 1996,
Chase et al. 1998) a dále Snk (Serum Inducible Kinase) u myši i u člověka patří
mezi geny časné odpovědi (Simmons et al. 1992; Donohue et al. 1995), to
znamená, že se ve formě mRNA objevují už za krátkou dobu po mitogenní
stimulaci buněk nachazejících se v G0 a zároveň to, že k expresi RNA u nich
není třeba proteosyntézy. Obě kinázy se nachází v nerůznějších tkáních a
orgánech, ale vždy se jedná o omezenou buněčnou populaci. Z několika nových
experimentů se zdá, že tyto molekuly se neúčastní v buněčném cyklu tak jako
Polo kináza, spíše souvisí s diferenciací buněk. Zcela recentně bylo zjištěno, že
se podílí na mechanismech buňky monitorujících kontakt buňky s povrchem
(Kauselmann et al. 1999, Holtrich et al. 2000). Dalšími příbuznými kinázami
jsou Sak-A (Serum Activated Kinase) a Sak-B. Obě se vyskytují v rychle se
množících tkáních během embryonálního vývoje, u dospělců se nachází
exkluzivně v testes (Fode, et al. 1994; Fode a kol. 1996). Jejich funkce je
doposud neznámá. Tyto dvě kinázy také, jako jediné, nemají ve své sekvenci
takzvaný Polo box, typický pro všechny Plk, i když sekvenčně do této rodiny
proteinkináz náleží.
37
38
2. Cíl práce
Nové poznatky o molekulárních mechanismech řízení buněčného cyklu u
prasete neslouží jen jako srovnávací studie k obvyklým modelovým zvířatům,
zejména hlodavcům. Prase je v dnešní době stále častěji využíváno jako
modelový organismus biomedicínského výzkumu, neboť svou stavbou i funkcí
jednotlivých tkání, orgánů a orgánových systémů nám umožňuje se při studiu
fyziologie i patologie životních procesů daleko více přiblížit k poměrům
panujícím v lidskému organismu.
Cíle naší práce jsme si stanovili takto:
1. Izolovat prasečí fetální fibroblasty a vypracovat optimální podmínky jejich
kultivace in vitro. Pokusit se o jejich chemickou synchronizaci v různých
stádiích buněčného cyklu.
2. Charakterizovat některé důležité regulátory buněčného cyklu prasečích
fetálních fibroblastů náležící do nově popsané rodiny polo kináz. Získané
poznatky budou použity ke studiu možností cíleného ovlivnění průběhu
buněčného cyklu.
3. Prostudovat expresi molekul náležících do rodiny Polo kináz v různých
fázích buněčného cyklu u synchronizovaných prasečích fetálních
fibroblastů s přihlédnutím k praktickému využití kvantitativních změn v
expresi jako markeru specifických fází buněčného cyklu a proliferační
aktivity buněk.
4. Na modelu meitotické maturace prasečích oocytů in vitro prozkoumat vztah
Plk zejména k aktivaci MPF a jeho regulátorů CDC25 a WEE1/MIT1.
39
3. Použité metody a laboratorní postupy:
Pokud není uvedeno jinak, veškeré použité chemikálie byly dodány firmou
Sigma.
3.1. Klonování fragmentu cDNA prasečího Plk, Fnk, Snk:
Pro zaklonování fragmentů uvedených molekul byla použita PCR metoda. Aby
bylo na minimum omezeno množství chybně inkorporovaných nukleotidů
použili jsme polymerázy Pfu (Stratagene). Tento enzym má velmi malou
inkorporaci chybných nukleotidů za optimálních reakčních podmínek.
1µg celkové RNA isolované z prasečích fetálních fibroblastů pomocí RNeasy
kit od (Qiagen) byl použit jako templát pro reverzně transkripční reakci. Reakční
mix byl následujícího složení: PCR pufr II 1X (Perkin Elmer), 5mM MgCl 2
(Gibco), dNTPs 1mM každý (USB), RNase inhibitor 1 U/1 µl (Perkin Elmer),
MuLV Reverse Transcriptase 2.5 U/1 µl (Perkin Elmer), oligo d(T)16 2.5 mM
(Gibco), DEPC voda do objemu 40 µl. Reakce proběhla za následujících
podmínek: 5 min 65°C, 10 min 25 °C (v tomto bodě byla přidána reverzní
transkriptáza ), 1 hodina 42°C, 5 min 75°C. Pro následující Pfu PCR bylo
použito 5 µl RT reakce jako templát pro 100 µl PCR reakci. PCR reakce (100
µl) byla následujícího složení: reakční pufr pro klonovanou Pfu DNA
polymeráza 1x (Stratagene), dNTPs 0.2 mM každý (USB), primery: horní 5CGG ATC CGG CGA AAG AGA TCC CGG AGG TCC TAG T-3; dolní 5CCT CGA GTT ACG GCT GGC CAG CTC CTT GCA GCA-3; 0.5 µl každého
o koncentraci 100 µM (MWG zákaznický servis); klonovaná Pfu DNA
polymeráza (Stratagene) 2.5 U. PCR program byl následující: 94°C 45 sec, 60°C
45 sec, 72°C 3 min, závěrečná extenze 72°C 10 min, 29 cyklů. Výsledné
fragmenty bez primerových sekvencí (Plk 1579, Fnk 1007, Snk 952) byly poté
40
přečištěny na agarozovém gelu a zaklonovány do pGEM vektorů za použití kitu
pGEM-T easy cloning kit (Promega), který je postaven na specifickém T-A
klonování. Plazmidy byly poté použity k transfekci E. coli kmene DH5α. Dva
nezávislé klony z každé molekuly byly osekvenovány komerčním servisem
(TopLab, Německo).
3.2. Izolace prasečích fetálních fibroblastů, kultivační podmínky,
synchronizační protokol:
FCS bylo dodáno Pracovištěm speciálních kultivačních sér, VFU, Brno.
Primární fibroblasty byly izolovány z 25 denních prasečích fétů. Jednotlivé féty
byly operačně vyjmuty z dělohy březí prasnice a byly z nich odstraněny břišní a
hlavové části spolu s končetinami. Hřbetní části byly sterilně rozstříhány
v předehřátém HBSS s trypsinem a po dobu 20 min byly ponechány tkáně v
trypsinu. Po této době byla reakce ukončena přidáním FCS do koncentrace 10%.
Větší zbytky tkáně byly odstraněny dekantací. Buňky byly promyty 3x v
DMEM a poté inkubovány 20 min v kompletním DMEM z FCS 10%
v termostatu s řízenou atmosférou 5% CO2 , 37°C. Po této době bylo odstraněno
médium spolu s nepřisedlými buňkami. Adherentní buňky byly použity k další
kultivaci. Fibroblasty byly pasážovány 2x v DMEM obsahujícím 10% FCS, 1
mM L-glutamin a penicillin/streptomycin. Po druhé pasáži byly buňky
trypsinovány a uchovány v tekutém dusíku až do dalšího použití. Pro každý
synchronizační experiment byly buňky 3 pasáže rozmraženy a kultivovány do
80% konfluence a následně synchronizovány dle synchronizačního protokolu.
Synchonizační protokol:
1. buňky synchronizované ve fázích G0/G1 byly získány redukcí FCS (0,2%) ve
DMEM po dobu 48 hodin.
2. buňky synchronizované na začátku S fáze byly získány za použití buněk
synchronizovaných v G0/G1, které byly následně stimulovány 10% FCS
v DMEM obsahujícím 6 µM Aphidicolin po dobu 14 hodin.
41
3. buňky v G2/M. K této synchronizaci byly použity buňky, které byly podle
předchozího protokolu synchronizovány na začátku S fáze. Tyto buňky byly
následně stimulovány 10% FCS v médiu bez Aphidicolinu po dobu tří hodin a
pak synchronizovány 100 µM Butyrolactonem I (Affinity) v DMEM s 10%
FCS po dobu 5 hodin.
4. buňky částečně synchronizované v různých částech buněčného cyklu byly
získány stimulací buněk synchronizovaných v G0/G1 10% FCS po různě
dlouhou dobu.
Měření obsahu DNA
Každý synchronizační experiment byl kontrolován pomocí FACS. K analýze
buněk na tomto zařízení byl použit následující postup: buňky rostoucí na
kultivačních lahvích byly 2x opláchnuty předehřátým PBS, trypsinovány a
cetrifugovány 1000g/5min. Po resuspendování v PBS byly fixovány metanolem
vymraženým předem na -20°C. RNA ve fixovaných buňkách byla odstraněna
RNasou A (1mg/ml) po dobu 30 min. DNA byla obarvena pomocí propidium
jodidu (20µg/ml). Profil DNA byl měřen pro každý experiment na průtokovém
cytometru Becton Dickinson FACScan.
3.3 Měření Exprese mRNA Plk byla měřena ve vzorcích synchronizovaných
prasečích fetálních fibroblastů za použití dvou metod sloužících ke kvantifikaci
RNA: enzymatické RT-PCR a neenzymatické RPA.
Izolace RNA Po ošetření buněk podle synchronizačního protokolu byl proveden
jejich oplach předehřátým PBS 3x na kultivační láhvi. Kultivační láhve byly
uchovány v -80°C až do následné izolace RNA. K izolaci celkové RNA byl
použit RNeasy Mini Kit (Qiagen). Po izolaci byla změřena koncentrace RNA,
následně byla RNA alikvotována podle potřeby a zamražena na -80°C.
Semikvatitativní multiplex RT-PCR: K RT reakci bylo použito 0.5 µg celkové
RNA jako templát a objem reakce byl 40 µl. RT mix byl následující: PCR Pufr
42
II (Perkin Elmer) 1X, 5mM MgCl2 (Gibco), dNTPs (USB) 1mM každý, RNase
inhibitor (Perkin Elmer) 1 U/1 µl, MuLV Reversní transkriptáza (Perkin Elmer)
2.5 U/1 µl, Náhodné Hexamery (Perkin Elmer) 2.5 mM, a DEPC voda do výše
uvedeného celkového objemu. RT reakce byla provedena za následujících
podmínek: počáteční denaturace 5 min na 65°C, pak 10 min na 25 °C (v tomto
kroku byla přidána reverzní transkriptáza), 1 hodina na 42°C a nakonec 5 min na
75°C. Výsledná cDNA byla uchována na -30°C až do zpracování. Ke
kvantifikaci Plk mRNA byla použita semikvantitativní multiplex RT-PCR byla
použita s GAPDH jako vnitřním standardem. Sekvence primerů pro Plk byly
následující: horní- 5-CTC CTG GAG CTG CAC AAG AGG AGG AA-3,
spodní 5-TCT GTC TGA AGC ATC TTC TGG ATG AG-3. Sekvence primerů
pro GAPDH byly: horní 5-GTT CCA GTA TGA TTC CAC CCA CGG CAA
GTT-3 dolní 5-TGC CAG CCC CAG CAT CAA AGG TAG AAG AGT.
Reakční objem PCR reakce byl 20 µl, 5 µl RT reakce bylo použito jako templát.
PCR mix obsahoval: 1X PCR pufr (Gibco), 0.2 mM každého dNTP (USB), 1.5
mM MgCl 2 (Gibco), primery 0.5 µM každý (MWG Biotech), Taq DNA
polymeráza (Gibco) 2.5 U/100 µl. PCR reakce probíhala za následujících
podmínek: počáteční denaturace na 94°C 1 min, následovaná : 94°C 15 sec,
annealing 60°C 30 sec, elongace na 72°C 1 min, závěrečná extenze 72°C 5 min.
PCR mix zpočátku obsahoval pouze primery pro Plk, primery pro GAPDH byly
přidány během reakce po proběhnutí 5 cyklu. Tak bylo možno použít multiplex
reakci i přes velký nadbytek GAPDH. Celkový počet cyklů byl 27 (5+22).
Kontrolní reakce ke každému experimentu byly: jedna zkumavka bez cDNA, a
jedna pouze s totální RNA. PCR amplikony byly separovány na 1,5%
agarózových gelech v prostředí TBE a ethidium bromidu. Výsledek byl
zaznamenán pomocí CCD kamery a vyhodnocen denzitometricky. Kvantita
signálu byla vyhodnocena pomocí Image Master 1D Elite V3.
43
Ribonuclease Protection Assay (RPA): Plasmidy obsahující prasečí GAPDH a
Plk cDNA inzerty byly použity na přípravu značených RNA sond. Před reakcí
byly plazmidy linearizovány digescí restriktázami Bgl II (Plk) a Not I
(GAPDH). Po štěpení byly plazmidy přečištěny na gelu. Délka chráněných
fragmentů byla 224bp pro GAPDH a 458bp pro Plk. MAXIscript™ SP6/T7 Kit
(Ambion) byl použit k syntéze sond značených [α-32P] (800 Ci/mmol, 20
mCi/ml) UTP (Amersham) v in vitro transkripci. Po syntéze byly sondy
vyčištěny na polyakrylamidovém gelu. K hybridizaci v roztoku byl použit 1µg
celkové RNA izolované z každého intervalu. K hybridizaci bylo použito takové
množství sondy, aby v každém intervalu byla v nadbytku nad stanovovanou
RNA. Reakce byla uskutečněna za použití chemikálií z RPA II™ kitu (Ambion).
Hybridizace byla ponechána přes noc na 42°C. Po digesci RNasou A + T1 byly
chráněné fragmenty separovány na 5% polyakrylamidovém gelu. Signál z gelu
byl následně detekován autoradiograficky. Exponované filmy byly po vyvolání
skenovány CCD kamerou a signál byl analyzován pomocí Image Master 1D
Elite V3. Gely byly také obarveny stříbrem za účelem detekce polohy RNA
hmotnostních markerů.
3.4. Kultivace prasečích oocytů: Oocyty prasat byly získány z cyklujících
prasniček na místních jatkách. Po poražení, paření a vykolení prasat byly
vaječníky odděleny a aspirací buď přímo na jatkách nebo následně v laboratoři
byly získány GV oocyty s plně vyvinutým kumulem. Kultivovány byly v M199
Hepes modifikovaném médiu z 10% FCS a 1,5 IU/ml FSH v kapkách na
hodinovém sklíčku po dobu nutnou k dosažení konkrétního stádia meiotické
maturace v termostatu v atmosféře 5% CO2 a 38,5ºC pod parafínovým olejem.
3.5. Příprava antisér a monoklonálních protilátek: K imunizaci králíků a
myší za účelem přípravy monoklonálních i polyklonálních protilátek byly
44
použity jako antigen fúzní proteiny připravené v E. coli. Inzerty z plazmidů
pGEX 4Z reprezentujících prasečí fragmenty Plk, Fnk a SNK byly
překlonovány do expersních vektorů pET 30 a,b,c s přihlédnutím ke čtecímu
rámci. Získané rekombinantní plazmidy byly použity k transfekci buněk E. coli
kmene BL 21(DE3)Lys S. Indukce exprese byly provedena pomocí IPTG
v koncentraci 0,5µM přes noc v teplotě 20ºC. Fúzní protein byl izolován
pomocí S a His Tag komerčním kitem His Trap (Pharmacia Amersham).
Vyčištěným fúzním proteinem byli imunizováni outbrední králíci plemene
Novozélandský bílý podle individuálních imunizačních schémat. Po vykrvení
králíků bylo sérum získáno standardním postupem (1 hodinu při laboratorní
teplotě, přes noc při 4ºC v ledničce a následná centrifugace na odstranění
krevního koláče). Sérum bylo dále uchováno v alikvotech při - 20. Sérum bylo
použíto buď přímo, nebo se z něj izolují imunoglobuliny dvoustupňovou
metodou:
I. Srážení hrubé frakce imunoglobulinů 50% nasycením síranem amonným
1. centrifugace séra 3000 g, 30 min
2. za míchání při laboratorní teplotě přidáváme nasycený roztok síranu
amonného do 50% nasycení séra
3. necháme reagovat při 4º C přes noc
4. centrifugujeme 3000g /30 min, pelety obsahují hrubou imunoglobulinovou
frakci séra
5. rozpustíme sraženinu v PBS a odstraníme přebytek síranu, buď dialýzou proti
PBS, nebo rychleji na koloně Sephadexu G-25 fine
II. Izolace čistých imunoglobulinů na koloně Proteinu A:
1. ekvilibrujeme kolonu Proteinu A navázaného na Sepharose CL-4B ve
vazebném pufru (100 mM Tris, pH 8)
2. k roztoku protilátek přidáme 1/10 objemu 1,0 M Tris, pH 8,0
3. zavedeme roztok protilátek na kolonu, pak propláchneme kolonu 10 objemy
100mM Tris, pH 8,0, poté 10 objemy 10 mM Tris, pH 8,0
45
4. eluujeme čisté protilátky z kolony 100mM glycinem pH 3.0. Eluce probíhá po
krocích, 500 µl na jeden alikvot
5. eluáty jímáme do zkumavek Ependorf, do kterých byl předem napipetován
roztok 1 M Tris pH 8,0, 50 µl na 500µl eluátu, aby nedošlo k poškození
imunoglobulinů kyselým glycinovým pufrem
6. definujeme čistotu produktu na SDS PAGE a aktivitu protilátek v imunoblotu
Monoklonální protilátka byla získaná ve spolupráci s Laboratoří molekulární
embryologie na Mendlově zemědělské univerzitě v Brně. Příprava této
monoklonální protátky se dá stručně popsat v těchto bodech :
1. imunizace mladých samic inbredního kmene BALB/c (Anlab) 200 µg
rekombinantního proteinu, který byl použit pro přípravu antiséra, do břišní
dutiny, opakovaná imunizace za 14 dní, po 7 dnech byla slezina vyjmuta,
v IDMEM za pomoci skalpelu a skleněné stříkačky rozmělněna. Po dekantaci
větších kousků byly buňky propláchnuty 3x IDMEM bez FCS a buňky byly
naředěny na požadovanou koncentraci.
2. 12 až 6 dní (podle životnosti buněk) před plánovanou fůzí byly rozmraženy
buňky myelomové linie kmene BALB/c. Tato linie je selektována na enzymový
defekt v HGPRT a TK. Před fúzí byly mechanicky uvolněny z tkáňových lahví,
centrifugovány v IDMEM bez FCS 2x, spočítány a naředěny.
3. Fůze: obě buněčné populace byly smíchány poměru 1:10 ve prospěch
slezinných buněk. Společně centrifugovány v IMDM bez FCS. Po slití do sucha
byl přidán PEG 1500 37 °C teplý v určeném množství a buňky byly opatrně
promíchávány po dobu jedné minuty. Po uplynutí této doby bylo přidáno
IDMEM předehřáté na 37°C k zastavení reakce. Médium bylo přidáváno po
kapkách během 1,5 minuty. Centrifugujeme 2x v DMEM, poté v DMEM s 5%
FCS, nakonec jsou po poslední centrifugaci buňky resuspendovány v DMEM s
20% FCS + 5x HAT (hypoxantin, amonopterin, thymidin) + 1x Hybridoma
enhancing factor.
46
4. Kultivace hybridomů probíhala na 96 jamkových ELISA destičkách s rovným
dnem. Od 3 dne po fůzi byla prováděna kontrola v inverzním mikroskopu na
rostoucí kolonie.
5. kultivační médium z jamek s rostoucími koloniemi bylo testováno na
přítomnost specifických imunoglobulinů v ELISA, kde antigenem byl fúzní
protein.
6. touto metodou byly připraveny 2 hybridomy (PL12 a P1) které tvoří
protilátky rozpoznávající Plk. Po klonování těchto hybridomů metodou
hraničního ředění byly vybrány nejproduktivnější klony na výrobu protilátek.
3.6. Imunobloting : Připravujeme diskontinuální polyakrylamidový gel podle
receptury uváděné firmou BioRad, o potřebné koncentraci (7,5 a 10 procentní).
Vzorky buněk byly lyzovány ve vzorkovém pufru (Tris-HCl pH 7,6,
mercaptoethanol, SDS bromphenol blue) v poměru 1:1 a denaturovány ve 100°C
po dobu 3 minut. Poté byly nanášeny na horní zaostřovací gel. Dělení probíhalo
na elektroforéze firmy BioRad, přenos na membránu byl proveden polosuchým
způsobem (Fast Blot Biometra). Membrána byla ihned poté inkubována v TTBS
s blokovacím agens (5% roztok želatiny nebo odtučněného mléka, nebo 2%
roztok albuminu) podle potřeby, zpravidla 1-3 hodiny při laboratorní teplotě,
nebo v lednici přes noc. Primární protilátky byly aplikovány na membránu v
blokovacím roztoku v ředění, které je v rozsahu 1:100 až 1:5000, inkubace s
protilátkou probíhaly většinou v chladu přes noc, v některých případech 1
hodinu za pokojové teploty.
Sekundární protilátky byly používány různé provenience a potřebné specifity
značené HRP, detekce se prováděla ECL.
3.7. Imunoprecipitace: se provádí z buněčného materiálu z tkáňových kultur
nebo z izolovaných buněk, případně oocytů:
1. Médium bylo odstraněno a buňky opláchnuty teplým PBS bez Mg2+ a Ca2+.
47
2. Buňky byly lyzovány v RIPA lyzovacím pufru (150 mM NaCl, 50 mM Tris
pH 8.0, 0.5% deoxycholát sodný, 0.1% SDS, 0.1 mM Na VO, 1% NP4O,
aprotinin -zásobní roztok 1 mg/ml, z tohoto roztoku dáme 1µ/l ml RIPA, trypsin
inhibitor - zásobní roztok 10 mg/ml, z tohoto roztoku dáme 1µl/lml RIPA. Lýza
se provádí na ledu, pufr je předem vychlazen.
3. Lyzát byl centrifugován při 4°C 10 000 g, 5 min
4. Předčištění lyzátu pomocí proteinu G 5µl na 150 µl lyzátu (Sigma P-4691),
60 min za stálého míchání, 4°C.
5. Centrifugace při 10 000 g 4°C, 5 min na odstranění proteinu G.
6. Přidání protilátek do předčištěného lyzátu, 1µl antiséra na 300 µl lyzátu.
Inkubace v lednici 2 hodiny za stálého míchání.
7.Centrifugace při 4°C, 10 000 g , 5 min.
8.Protein G 5µl na 150 µl lyzátu, ponecháno v chladničce přes noc za stálého
míchání.
9. Centrifugace při 4°C, 10 000 g 5 min 5X.
10. Po poslední centrifugaci byl přidán příslušný objem 2x koncentrovaného
vzorkového pufru, podle potřeby redukujícího nebo neredukujícího, proteiny
byly denaturovány 100°C na 3 min, alikvoty byly zamraženy, na detekci byl
použit imunobloting
48
4. Výsledky:
4.1.
Sekvence publikované v GenBank: Plk-p (AF339021), Fnk-p
(AF348425), Snk-p (AF348424). Jsou přiloženy specifikace
jednotlivých sekvencí tak, jak jsou prezentovány v GenBank.
4.2.
Publikace zaměřené na synchronizaci prasečích fetálních fibroblastů a
expresi Plk v těchto buňkách:
Kues WA, Anger M, Carnwath JW, Paul D, Motlik J, Niemann H.
Cell cycle synchronization of porcine fetal fibroblasts: effects of serum
deprivation and reversible cell cycle inhibitors. Biol Reprod. 2000
Feb;62(2):412-9.
Martin Anger, Wilfried A. Kues, Jiri Klima, Manfred Mielenz, Jan Motlik,
Joseph W. Carnwath and Heiner Niemann
EXPRESSION OF POLO-LIKE KINASE IN CELL CYCLE
SYNCHRONIZED PORCINE FETAL FIBROBLASTS
přiložen manuskript
4.3. Předběžné výsledky analýzy exprese Plk na úrovni mRNA a proteinů
v prasečích oocytech v průběhu zrání in vitro.
49
Předběžné výsledky analýzy exprese Plk na úrovni mRNA a proteinů
v prasečích oocytech v průběhu zrání in vitro.
Měření exprese Plk mRNA v průběhu meiotické maturace prasečích oocytů.
Denzitometrická měření prokázala, že hladina Plk mRNA je prakticky
konstantní v průběhu zrání in vitro. Do každé RT-PCR reakce byla použita
RNA izolovaná z 5 oocytů.
50
Měření exprese proteinů ukázalo, že celkové množství Plk proteinu je
konstantní v průběhu zrání prasečích oocytů in vitro. V tomto experimentu
byla srovnána exprese Plk v oocytech v normálním zracím médiu M199 (viz
metodika) a v médiu M199 obsahujícím 100µM Butyrolacton I.
Získané králičí polyklonální antisérum detekuje dvě formy Plk proteinu lišící
se pohyblivostí na SDS gelu, což pravděpodobně koresponduje
s fosforylačními změnami spojenými s aktivací Plk. Na každý interval bylo
použito 50 oocytů.
51
Srovnávací studie získané králičí polyklonální protilátky a monoklonální
protilátky, při přípravě obou byl použit stejný antigen. Ze srovnání obou
vyplývá, že monoklonální protilátka na rozdíl od polyklonální zviditelňuje
pouze jednu formu Plk. Každý interval představuje 50 prasečích oocytů
v indikovaných stádiích meiotickho zrání.
52
Na membránu bylo přeneseno 100 prasečích GV oocytů rozdělených v SDS
PAGE. Membrána s rozdělenými proteiny byla podélně rozříznuta a každá část
membrány byla inkubována v jiné protilátce (srovnání polyklonální a
monoklonální protilátky). Tento experiment potvrzuje, že monoklonální
protilátka detekuje formu na SDS PAGE migrující rychleji, tedy pravděpodobně
defosforylovanou, zatímco polyklonální detekuje obě formy Plk proteinu.
53
5. Závěr
Na izolaci prasečích fetálních fibroblastů byly použity féty získané
z prasnice 25 dne březosti. Buňky byly izolovány dle postupu uvedeného
v metodice individuálně z každého plodu. Při následném pasážování byly patrné
poměrně značné rozdíly v proliferační aktivitě buněk izolovaných z různých
jedinců. Vzhledem k tomu, že jsme tento fenomén nepodrobili bližšímu
zkoumání, lze se jen domnívat, že by tyto rozdíly mohly být
vyjádřením individuálních genetických rozdílů mezi féty, případně vyjádřením
pohlavních rozdílů. Fibroblasty byly pasážovány až do dvacáté pasáže, se
vzrůstajícím počtem pasáží jsme pozorovali sníženou schopnost proliferace.
Toto snížení proliferační schopnosti lze pozorovat i v případě dosažení
konfluence.
Redukcí fetálního séra v kultivačním médiu byly fibroblasty
synchronizovány převážně v G0/G1 fázi buněčného cyklu. Experimentálně bylo
dále zjištěno, že snížení koncentrace FCS v médiu na 0,2% po dobu 48 hodin je
dostačující k dosažení žádoucího efektu synchronizace (Kues et al. 2000). I
když v některých experimentech zaměřených na přenos jader byly používány
buňky kultivované v nízké hladině fetálního séra po dobu delší než 48 hodin
(Wilmut a Cambell 1998), v našem případě, pro prasečí fetální fibroblasty bylo
zjištěno, že prodloužení doby kultivace v médiu se sníženou koncentrací
fetálního séra vede k poruchám proliferace, fragmentaci DNA a masivnímu
nástupu apoptózy u buněk (Kues et al.2000). Otázkou ovšem je, jestli právě
tento efekt navozený dlouhodobou kultivací, není žádoucí pro úspěšný přenos
jader. Je potřeba také ozřejmit, že v těchto studiích byly pro dlouhodobé
kultivace v nízkých koncentracích séra využívány především buňky izolované
z tkání a orgánů dospělých jedinců a že u takto terminálně diferencovaných
buněk může být rekce na sníženou koncentraci séra odlišná ve srovnání s
54
buňkami získanými z proliferačně vysoce aktivních tkání embrya.
Prasečí fibroblasty synchronizované v G0/G1 byly stimulovány zvýšením
koncentrace FCS (10%) k proliferaci a k zahájení buněčného cyklu. U vzorků
buněk získaných v různých časových intervalech po stimulaci byl zjišťován
obsah DNA průtokovou cytometrií. Bylo zjištěno, že u buněk stimulovaných 14
hodin můžeme pozorovat signifikantní změny v profilu buněčného cyklu (viz
přiložený manuskript), objevuje se značné procento (38.0 ± 9.8) buněk v S fázi.
Tato výrazná změna ve složení populace nenastala, pokud byly buňky
kultivovány po stejnou dobu (14 hodin) v médiu s Aphidicolinem. Můžeme říci,
že profil buněčného cyklu u buněk synchronizovaných Aphidicolinem na
začátku S fáze byl prakticky totožný s profilem buněk synchronizovaných v
G0/G1 snížením hladiny FCS. Z našich pozorování je však zřejmé, že tyto
populace, i když obsahem DNA prakticky totožné se odlišují biochemicky. Jak
bylo zjištěno, Aphidicolin je plně reverzibilní a synchronizované buňky po jeho
odstranění nejeví žádné známky poruch proliferace, ani nevykazují zvýšenou
fragmentaci DNA, popřípadě vyšší množství buněk v apoptóze (Kues et al.
2000). Po odstranění Aphidicolinu z kultivačního média byly prasečí fetální
fibroblasty schopny dosáhnout S fáze už v průběhu tří hodin, na rozdíl od
hladověných buněk v G0/G1, které na dosažení S fáze potřebují 14 hodin
stimulace. Lze tedy říci, že jsme prokázali, že prasečí fetální fibroblasty mohou
být synchronizovány Aphidicolinem, že tento postup nám umožňuje získat až
80% buněk s množstvím DNA typickým pro G0/G1 fázi, a že z hlediska
biochemie buněčného cyklu se tyto buňky nachází už na počátku S fáze.
Buňky synchronizované Aphidicolinem byly také následně použity jako
výchozí populace pro synchronizace buněk v G2/M fázi. Po odmytí
Aphidicolinu byly buňky stimulovány 3 hodiny kompletním médiem s 10%
FCS a následně synchronizovány v Butyrolactonu I. Stimulace FCS je po bloku
na začátku S fáze nutná k zahájení replikace DNA. Jakmile je tento proces
započat a na FACS se objeví větší množství buněk v S fázi, je možno přidat
55
Butyrolacton I, který jako selektivní inhibitor CDK synchronizuje buňky
v G2/M fázi, neboť pro vstup do M fáze je aktivita CDK nutná. Redukcí hladiny
fetálního séra v kultivačním médiu a dále chemickou synchronizací za použití
Aphidicolinu a Butyrolactonu I jsme připravili vzorky buněk v G0/G1, na
počátku S a v G2/M fázi buněčného cyklu. Další obohacení buněčné populace
tak, aby byly buňky plně vitální a použitelné pro další kultivace, je možné jen za
použití separačních metod, například sortování buněk na průtokovém cytometru.
Klonovací postup za použití mezidruhových primerů v PCR nám umožnil
v poměrně krátké době získat cDNA fragmenty prasečího Plk, Fnk a Snk bez
nutnosti manipulace s cDNA knihovnami, jejichž komerční dostupnost u prasete
je malá a navíc ty, které lze získat, nejsou pro naše účely vhodné. Získané
sekvence, publikované v GenBank, byly porovnávány se sekvencemi
jednotlivých molekul z rodiny Plk u různých druhů a byla zjištěna vysoká
homologie prasečích sekvencí zejména se sekvencemi humánními.
Kvantifikací Plk mRNA jsme získali údaje o expresi této molekuly
v průběhu buněčného cyklu v synchronizovaných prasečích fetálních
fibroblastech. Bylo zjištěno, že Plk mRNA je velmi málo zastoupena v celkové
RNA z buněk v G0/G1 synchronizovaných hladověním a dále u buněk
stimulovaných sérem až do 14 hodin, kde dochází k posunu buněk z G0/G1
směrem k S fázi. Nejvyšší hladina Plk byla detekovaná u buněk 23 hodin
stimulovaných sérem, kde se nachází už více než 30% buněk v G2/M fázi. I
když jsme pomocí vícestupňové synchronizace Aphidicolinem a
Butyrolactonem I dosáhli vyššího počtu buněk v G2/M (přes 40%) ve vzorku,
exprese Plk mRNA nedosahovala takové úrovně jako u buněk stimulovaných 23
hodin. Tento fakt lze vysvětlit tím, že buňky stimulované sérem 23 hodin mají
G2/M populaci rozprostřenou v celém rozsahu M fáze, kde je exprese nejvyšší,
kdežto buňky chemicky synchronizované se nachází na přechodu G2/M. Námi
zjištěné údaje o expresi Plk mRNA v průběhu buněčného cyklu u
synchronizovaných prasečích fetálních fibroblastů se shodují s literárními údaji
56
o expresi této molekuly v průběhu buněčného cyklu u myších a lidských
buněčných linií kultivovaných in vitro.
Námi připravené protilátky, ať už monoklonální, či polyklonální
rozpoznávají v imunoblotu molekulu o hmotnosti přibližně 68 kDa, což je
molekulární hmotnost Plk proteinu u myši i u člověka. Zdá se, že polyklonální
protilátka detekuje dvě různé formy Plk molekuly lišící se mobilitou na SDS
PAGE a monoklonální pouze jednu. Mohlo by se jednat o dva fosforylační stavy
Plk. Tento předpoklad je však nutno podrobit dalšímu zkoumání za použití
fosfatáz.
Bylo zjištěno, že množství Plk mRNA ani proteinu nekolísá v průběhu
meiotického zrání prasečích oocytů a i proporce mezi oběma formami lišícími se
pohyblivostí na SDS PAGE zůstávají zachovány. Tento poměr se pouze mírně
změní ve prospěch pomaleji migrující formy za použití Butyrolactonu I ve
zracím médiu pro GV oocyty po dobu 48 hodin. Tyto předběžné výsledky na
prasečích oocytech je nutno ještě ověřit dalšími experimenty, ve kterých se
zaměříme na vliv Butyrolactonu I na množství Plk mRNA a proteinu. Je dále
nutno vyvinout specifickou kinázovou esej a konfrontovat výsledky získané na
imunoblotu z kinázovou aktivitou Plk v průběhu meiotického zrání prasečích
oocytů.
57
1. Abrieu, A., Dorée, M., Picard, A., (1997). Mitogen Activated Protein
Kinase Activation Downregulates a Mechanism that Inactivates Cyclin Bcdc2 Kinase in G2-arrested Oocytes. Molecular Biology of the Cell 8,
249-261.
2. Abrieu A, Brassac T, Galas S, Fisher D, Labbe JC, Doree M (1998). The
Polo-like kinase Plx1 is a component of the MPF amplification loop at the
G2/M-phase transition of the cell cycle in Xenopus eggs. J Cell Sci 1998
Jun;111 ( Pt 12):1751-7
3. Alberts B., Bray D., Lewis J., Raff M., Roberts K., Watson J.D. (1994)
Molecular biology of the cell. Garland Publishing, Inc. third edition 1994.
4. Andersen, G., Busso, D., Poterszman, A., Hwang, J.R., Wurtz, J.M., Ripp,
R., Thierry, J.C., Egly, J.M., Moras, D. (1997) The structure of cyclin H“
common mode of kinase activation and specific features. The EMBO
Journal 16, 958-967.
5. Arnaud L, Pines J, Nigg EA. (1998) GFP tagging reveals human Polo-like
kinase 1 at the kinetochore/centromere region of mitotic chromosomes.
Chromosoma 1998 Dec;107(6/7):424-429
6. Boulikas, T. (1996) Nuclear Import of Protein Kinases and Cyclins.
Journal of cellular Biochemistry 60, 61-82.
7. Brauninger, A., Strebhardt, K., Rubsamen-Waigmann, H. (1995)
Identification and functional charakterization of the human and murine
polo-like kinase (Plk) promoter. Oncogene, 11, 1793-1800.
58
8. Brandeis, M., Hunt, T. (1996) The proteolysis of mitotic cyclins in
mamalian cells persist from the end of motosis until the onset of s phase.
The EMBO Journal 15, 5280-5289.
9. Brassac T, Castro A, Lorca T, Le Peuch C, Doree M, Labbe JC, Galas S.
The polo-like kinase Plx1 prevents premature inactivation of the
APC(Fizzy)-dependent pathway in the early Xenopus cell cycle.
Oncogene. 2000 Aug 3;19(33):3782-90
10. Carmena M, Riparbelli MG, Minestrini G, Tavares AM, Adams R,
Callaini G, Glover DM. Drosophila polo kinase is required for
cytokinesis. J Cell Biol. 1998 Nov 2;143(3):659-71.
11. Chase D, Feng Y, Hanshew B, Winkles JA, Longo DL, Ferris DK.
Expression and phosphorylation of fibroblast-growth-factor-inducible
kinase (Fnk) during cell-cycle progression. Biochem J. 1998 Aug 1;333 (
Pt 3):655-60.
12. Clay, F.J., McEwen, S.J., Bertoncello, I., Wilks, Dunn, A.R. (1993)
Identification and cloning of a protein kinase-encoding mouse gene, Plk,
related to the polo gene of Drosophila. Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90, 48824886.
13. Clay FJ, Ernst MR, Trueman JW, Flegg R, Dunn AR (1997). The mouse
Plk gene: structural characterization, chromosomal localization and
identification of a processed Plk pseudogene. Gene 1997 Oct
1;198(1-2):329-39
59
14. De Souza, P.C.C., Ellem, K.A.O., Gabrielli, B.G. (2000) Centrosomal and
Cytoplasmatic Cdc2/Cyclin B1 Activation Precedes Nuclear Mitotic
Events. Experimental Cell Research 257, 11-21.
15. Derua, R., Stevens, I., Waelkens, E., Fernandez, A., Lamb, N., Merlevede,
W., Goris, J. (1997) Chrakterization and Physiological Importance of a
Novel Cell Cycle Regulated Protein Kinase in Xenopus laevis Oocytes
That phsphorylates Cyclin B2. Experimental Cell research 230, 310-324.
16. Descombes P, Nigg EA (1998). The polo-like kinase Plx1 is required for
M phase exit and destruction of mitotic regulators in Xenopus egg
extracts. EMBO J 1998 Mar 2;17(5):1328-35
17. De Vantéry, C., Gavin, J.D., Vassali, J.D., Schorderet-Slatkine, S. (1996)
An Accumulation of 34cdc2 at the End of Mouse Oocyte Growth
Correlates with the Acuisition of Meiotic Competence. Developmental
Biology 174, 335-334.
18. Donohue, P.J., Alberts G.F., Guo, Y., Winkles, J.A. (1995) Identification
by Target Differential Display of an Immediate Early Gene Encoding a
putative Serine/threonine Kinase. The Journal of Biological Chemistry
270, 10351-10357.
19. Elez R, Piiper A, Giannini CD, Brendel M, Zeuzem S. Polo-like kinase1,
a new target for antisense tumor therapy. Biochem Biophys Res Commun.
2000 Mar 16;269(2):352-6.
60
20. Errede, B., Cade, R.M., Yashar, B.M., Kamada, Y., Levin, D.E., Iriie, K.,
Matsumoto, K., (1995) Dynamics and Organization of MAP Kinase
Signal Pathways. Molecular Reproduction and Development 42, 477-485.
21. Fenton B, Glover DM (1993). A conserved mitotic kinase active at late
anaphase-telophase in syncytial Drosophila embryos. Nature 1993 Jun
17;363(6430):637-40
22. Ferris DK, Maloid SC, Li CC. (1998). Ubiquitination and proteasome
mediated degradation of polo-like kinase. Biochem Biophys Res Commun
1998 Nov 18;252(2):340-4
23. Fode, C., Motro, B., Yousefi, S., Heffernan, M., Dennis, J.W. (1994) Sak,
a murine -serine/threonine kinase that is related to the Drosophila polo
kinase and involved in cell proliferation. Proc.Natl.Acad.Sci.USA 91,
6388-6392.
24. Fode, C., Binkert, Ch., Dennis, J.W. (1996) Constitutive Expression of
Murine Sak-a Supresses Cell Growth and Induces Multinucleation.
Molecular and Celular Biology, Sept. 1996, 4665-4672.
25. Furuno, N., Ogawa, Y., Iwashita, J., Nakajo, N., Segata, N. (1997)
Meiotic cell cycle in Xenopus oocytes is independent of cdk2 kinase. The
EMBO Journal 16, 3860-3865.
26. Gabrielli, B.G., Roy, L.M., Maller, J.L. (1993) Requirement for Cdk2 in
cytostatic factor-mediated metaphase II arrest. Science 259, 1766-1769.
61
27. Gavin, A.C., Cavadore, J.C., Schrordet-Slatkine, S., (1994) Histone H1
kinase aktivity, germinal vesicle breakdown and M phase entry in mouse
oocytes. Journal of Cell Science 107, 275-283.
28. Gebauer, F., Richter, J.D. (1997) Synthesis and function of Mos: the
control switch of vertebrate oocyte meiosis. BioEssay 19, 19-23.
29. Georgescu, S.P., Komuro, I., Hiroi. Y., Mizuno, T., Kudoh, S., Yamazaki,
T., Yazaki, Y. (1997) Downregulatio of Polo-like Kinase Correlates with
loss of Proliferative Ability of Cardiac Myocytes. Journal of Molecular
Cardiology 29, 929-937.
30. Glover DM, Ohkura H, Tavares A (1996). Polo kinase: the choreographer
of the mitotic stage? J Cell Biol 1996 Dec;135(6 Pt 2):1681-4.
31. Glover DM, Hagan IM, Tavares AA. (1998). Polo-like kinases: a team
that plays throughout mitosis. Genes Dev 1998 Dec 15;12(24):3777-87
32. Golsteyn, R.M., Schultz, S.H., Bartek, J., Ziemiecki, A., Ried, T., Nigg,
E.A. (1994) Cell cycle analysis and chromosomal localization of human
PLK 1, a putative homologue of the mitotic knases Drosophila polo and
Sacharomyces cerevisiae Cdc5. Journal of Cell Sciences 107, 150915017.
33. Golsteyn, R.M., Mundt, K.E., Fry, A.M., Nigg, E.A. (1995) Cell Cycle
Regulation of the Activity and Subcellular Localization of PLK 1, a
Human Protein Kinase Implicated in Mitotic Spindle Function. The
Journal of Cell Biology 129, 1617-1628.
62
34. Golsteyn RM, Lane HA, Mundt KE, Arnaud L, Nigg EA (1998). The
family of polo-like kinases. Prog Cell Cycle Res 1996;2:107-14
35. Grana, G., Reddy, E.P. (1995) Cell cycle control in mammalian cells: role
of cyclins, cyclin dependent kinases (CDKs(, growth supressor genes and
cyclin-dependent kinase inhibitors (CKIs). Oncogene 11, 211-219.
36. Hamanaka, R., Smith, M.R., O Connor, P.M., Maloid, S., Mihalic, K.,
Spivak, J.L., Longo, D.L., Ferris, D.K. (1995) polo-like-kinase Is a Cell
Cycle-regulated Kinase Activated during Mitosis. The Journal of
Biochemistry 270, 21086-21091.
37. Hampl, A., Eppig,J. (1995) Analysis of the mechanisms of metaphase I
arrest in maturing mouse oocytes. Development 1995.
38. Hirao, Y., Tsuji, Y., Miyano, T., Okano, A., Miyake, M., Kato, S., Moor,
R.M. (1995) Association between p34cdc2 levels and meiotic arrest in pig
oocytes during early growth. Zygote 3, 325-332.
39. Hirao, Y., Eppig,J.J. (1997) Analysis of the mechanisms of metaphase I
arrest in strain LT mouse oocytes: participation of MOS. Development
124, 5107-5113.
40. Holtrich, U., Wolf, G., Braunninger, A., Karn, T., Bohme, B., RubsamenWaigmann, H., Strebhardt, K. (1994) Induction and down regulation of
PLK, a human serine/threonine kinase expressed in proliferating cells and
tumors. Proc.Natl.Acad.Sci.USA 91, 1736-1740.
63
41. Huang, S., Ingber, D.E. (1999) The structural and mechanical complexity
of cell-growth control. Nature Cell Biology 1, Sep. 1999, E 131-E 138.
42. Hunter, T., Pines, J. (1994) Cyclins and Cancer II: Cyclin D and CDK
Inhibitors Come of Age. Cell 79, 573-582.
43. Hunter, T. (1995) Protein Kinases and Phosphatases: The Yin and Yang
of Protein Phosphorylation and Signaling. Cell 80, 225-236.
44. Jones, C., Smythe, C. (1996) Activation of the Xenopus cyclin
degradation machinery by full-lenght cyclin A. Journal of Cell Science
109, 1071-1079.
45. Kalab, P., Kubiak, J.Z., Verlhac, M.H., Colledge, W.H., Maro, B., (1996)
Activation of p90rsk during meiotic maturation and first mitosis in mouse
oocytes and eggs: MAP kinase-independent and -dependent activation.
Development 122, 1957-1964.
46. Karaiskou A, Cayla X, Haccard O, Jessus C, Ozon R. (1998). MPF
amplification in Xenopus oocyte extracts depends on a two-step activation
of cdc25phosphatase. Exp Cell Res 1998 Nov 1;244(2):491-500.
47. Karaiskou A, Jessus C, Brassac T, Ozon R. Phosphatase 2A and polo
kinase, two antagonistic regulators of cdc25 activation and MPF autoamplification. J Cell Sci. 1999 Nov;112 ( Pt 21):3747-56.
48. Kauselmann G, Weiler M, Wulff P, Jessberger S, Konietzko U, Scafidi J,
Staubli U, Bereiter-Hahn J, Strebhardt K, Kuhl D. The polo-like protein
kinases Fnk and Snk associate with a Ca(2+)- and integrin-binding protein
64
and are regulated dynamically with synaptic plasticity. EMBO J. 1999 Oct
15;18(20):5528-39.
49. Kotani S, Tugendreich S, Fujii M, Jorgensen PM, Watanabe N, Hoog C,
Hieter P, Todokoro K (1998). PKA and MPF-activated polo-like kinase
regulate anaphase-promoting complex activity and mitosis progression.
Mol Cell 1998 Feb;1(3):371-80
50. Kumagai, A., Dunphy, W.G. (1996) Purificatio and Molecular Cloning of
Plx1, a Cdc25-Regulatory Kinase from Xenopus Egg Extracts. Science
273, 1377-1379.
51. Lake, R.J., Jelinek, W.R. (1993) Cell Cycle -and terminal DifferentiationAssociated Regulation of the Mouse mRNA Encoding a Conserved
Mitotic Protein Kinase. Molecular and cellular biology, 7793-7801.
52. Lane H.A., Nigg, E.A. (1996) Antibody Microijection Reveals an
Essential Role for Human Polo-like Kinase 1 (Plk 1) in the functional
maturation of Mitotic Chromosomes. The Journal of Cell Biology, 135,
1701-1713.
53. Lane H.A., Nigg, E.A. (1997) Cell-cycle control: POLO-like kinases join
the outer circle. Trends in Cell Biology 7, 63-68.
54. Lee, K.S., Yuan, Y.O., Kuriyama, R., Erikson, R.I. (1995) Plk is an MPhase-Specific Protein Kinase and Interacts with a Kinesin-Like Protein,
CHO1/MKLP-1. Mollecular and Cellular biology, 7143-7151.
65
55. Lee KS, Grenfell TZ, Yarm FR, Erikson RL (1998). Mutation of the
polo-box disrupts localization and mitotic functions of the mammalian
polo kinase Plk. Proc Natl Acad Sci U S A 1998 Aug 4;95(16):9301-6
56. Li, B., Ouyang, B., Pan, H., Reissmann, P.T., Slamon, D.J., Arceci, R.,
Lu, L., Dai, W., (1996) prk, a Cytokine-inducible Human Protein
serine/threonine Kinase whose Expression Appears to be Down-regulated
in Lung Carcinomas. The Journal of Biological Chemistry 271, 1940219408.
57. Logarinho E, Sunkel CE (1998). The Drosophila POLO kinase localises
to multiple compartments of the mitotic apparatus and is required for the
phosphorylation of MPM2 reactive epitopes. J Cell Sci 1998 Oct;111 ( Pt
19):2897-909
58. Martinez, A.M., Afshar, F.M., Cavadore, J.C., Labbé, J.C., Doréé, M.
(1997) Dual phosphorylation of the T-loop in cdk7: its role in controlling
cyclin H binding and CAK activity. EMBO journal 16, 343-353.
59. Matsubara, N., Yanagishawa, M., Nishimune, Y., Obinata, M., Matsui, Y.
(1995) Murine Polo Like Kinase 1 Gene is Expressed in Meiotic
Testicular Germ Cells and Oocytes. Molecular Reproduction and
development 41, 407-415.
60. Masui, Y. (1992) Towards understanding the control of the division cycle
in animal cells. Biochemistry and Cell Biology 70, 920-945.
61. Mitra, J., Schultz, R.M. (1996) Regulation of the acquisition of meiotic
competence in the mouse: changes in the subcellular localization of cdc2,
66
cyclin B1, cdc25C and wee1, and in the concentration of these proteins
and their transcripts. Journal of Cell Science 109, 2407-2415.
62. More, G.D., Ayabe T., Kopf, G.S., Schulz, R.M. (1996) Temporal
Patterns of gene Expression of G1_s Cyclins and Cdks during the First
and Second Mitotic Cell Cycles in Mouse Embryos. Molecular
Reproduction and Development 45, 264-275.
63. Moos, J., Visconti, P.E., Moore, G.D., Schultz R.M., Kopf, G.S. (1995)
Potential Role of Mitogen-Activated Protein Kinase in Pronuclear
Envelope Assembly and Disassembly Following Fertilization of Mouse
Eggs. Biology of reproduction 53, 692-699.
64. Moos, J., Kopf, G.S., Schultz, R.M., (1996) Cycloheximide-induced
activation of mouse eggs: effect on cdc2/cyclin B and MAP kinase
activities. Journal of cell science 109, 739-748.
65. Mordret, G. MAP kinase kinase: A node connecting multiple pathways.
Biol.Cell. 79, 193-207.
66. Motlík, J., Kubelka, M. (1990) Cell-Cycle Aspect of Growth and
Maturation of Mammalian Oocytes. Molecular Reproduction and
Development 27, 366-375.
67. Motlík J., Šutovský, P., Kalous, J., Kubelka, M., Moos, J., Schultz, R.M.
(1996) Co culture with pig membrana granulosa cells modulates the
activity of cdc2 and MAP kinase in maturing cattle oocytes. Zygote, 247256.
67
68. Mundt KE, Golsteyn RM, Lane HA, Nigg EA. On the regulation and
function of human polo-like kinase 1 (PLK1): effects of overexpression
on cell cycle progression. Biochem Biophys Res Commun. 1997 Oct
20;239(2):377-85.
69. Murray, A.W. (1994) Cyclin dependent kinases: regulators of the cell
cycle nad more. Current Biology 1, 191-195.
70. Naito, K., Hawkins, C., Yamashita, M., Nagahama, Y., Aoki, F.,
Kohmoto, K., Toyoda, Y., Moor, R.M. Association of 34cdc2 and Cyclin
B1 during Meiotic Maturation in Porcine Oocytes. Developmental
Biology 168, 627-634.
71. Nigg, E.A. (1995) Cyclin-dependent protein kinases: key regulators of the
eukaryotic cell cycle. BioEssays 17, 471-480.
72. Nigg EA. (1998) Polo-like kinases: positive regulators of cell division
from start to finish. Curr Opin Cell Biol 1998 Dec;10(6):776-83
73. Nurse, P. (1994) Ordering S Phase and M Phase in the Cell Cycle. Cell
79, 547-550.
74. Ouyang B, Pan H, Lu L, Li J, Stambrook P, Li B, Dai W. Human Prk is a
conserved protein serine/threonine kinase involved in regulating M phase
functions. J Biol Chem. 1997 Nov 7;272(45):28646-51.
75. Pines, J., Hunter, T. (1994) The diferential localization of human cyclins
A and B is due to a cytoplasmic retention signal in cyclin B. The EMBO
Journal 13, 3772-3781.
68
76. Planas-Silva MD, Weinberg RA. The restriction point and control of cell
proliferation. Curr Opin Cell Biol. 1997 Dec;9(6):768-72. Review.
77. Pahlavan G, Polanski Z, Kalab P, Golsteyn R, Nigg EA, Maro
B.Characterization of polo-like kinase 1 during meiotic maturation of the
mouse oocyte. Dev Biol. 2000 Apr 15;220(2):392-400.
78. Poon, Y.C.R., Yamashita, K., Howell, M., Ershler, M.A., Belyavsky, A.,
Hunt, T. (1994) Cell cycle regulation of the p34CDC2 / p33CDK2 - activating
kinase p40MO15. Journal of Cell science 107, 2789-2799.
79. Qian YW, Erikson E, Maller JL. (1998). Purification and cloning of a
protein kinase that phosphorylates and activates the polo-like kinase Plx1.
Science 1998 Nov 27;282(5394):1701-4
80. Qian YW, Erikson E, Li C, Maller JL (1998). Activated polo-like kinase
Plx1 is required at multiple points during mitosis in Xenopus laevis. Mol
Cell Biol 1998 Jul;18(7):4262-71.
81. Qian YW, Erikson E, Maller JL. Mitotic effects of a constitutively active
mutant of the Xenopus polo-like kinase Plx1. Mol Cell Biol. 1999
Dec;19(12):8625-32.
82. Ravnik, S.T., Wolgemuth, D.J. (1996) The Developmentally restricted
Pattern of Expression in the Male Germ Line of a Murine Cyclin A,
Cyclin A2, suggested Roles in Both Mitotic nad Meiotic Cell Cycles.
Developmental biology 173, 69-78.
69
83. Sagata, N. (1996) What does Mos do in oocytes and somatic cells?
BioEssays 19, 13-21.
84. Simmons, D.I., Neel B.G., Stevens, R., Evett, G., Erikson, R.I. (1992)
Identification of an Early-Response Gene Encoding a Novel Putative
Protein Kinase. Molecular and Cellular Biology, Sept. 1992, 4164-4169.
85. Simizu S, Osada H.Mutations in the Plk gene lead to instability of Plk
protein in human tumour cell lines. Nat Cell Biol. 2000 Nov;2(11):852854.
86. Smith MR, Wilson ML, Hamanaka R, Chase D, Kung H, Longo DL,
Ferris DK. Malignant transformation of mammalian cells initiated by
constitutive expression of the polo-like kinase. Biochem Biophys Res
Commun. 1997 May 19;234(2):397-405.
87. Smits VA, Klompmaker R, Arnaud L, Rijksen G, Nigg EA, Medema RH.
Polo-like kinase-1 is a target of the DNA damage checkpoint. Nat Cell
Biol. 2000 Sep;2(9):672-676.
88. Soucek, T., Push, O., Hengstaschlager-Ottand, E., Adams, P.D.,
Hengstschlager, M. (1997) Deregulated expression of E2F-1 induces
cyclin A-and E-associated kinase activitae independently from cell cycle
position. Oncogene 1997, 2251-2257.
89. Strausfeld, U.P., Howell, M., Descombes, P., Chevalier, S., Rempel, R.E.,
Adamczewski, J., Maller, J.J., Hunt, T., Blow, J.J. (1996) Both cyclin A
70
and cyclin E have S-phase promoting (SPF) activity in Xenopus egg
extracts. Journal of Cell Science 109, 1555-1563.
90. Su, T.T., Vidwans, S.J. (2000) DNA defects target the centrosome. Nature
Cell Biol Vol 2, E28-E29.
91. Sunkel CE, Glover DM. polo, a mitotic mutant of Drosophila displaying
abnormal spindle poles. J Cell Sci. 1988 Jan;89 ( Pt 1):25-38.
92. Taieb F., Thiebier, C., Jessus, C. (1997) On Cyclins, Oocytes and Eggs.
Molecular Reproduction and Development 48, 397-411.
93. Tavares, A.A.M., GloverD.M., Sunkel, C.E. (1996) The conserved mitotic
kinase is regulated by phosphorylation and has preferred microtubuleassociated substrates in Drosophila embryo extracts. The EMBO Journal
15, 4873-4883.
94. Uchiumi T, Longo DL, Ferris DK. 1997. Cell cycle regulation of the
human polo-like kinase PLK promoter. J Biol Chem 27214:9166-74.
95. Verhlac, M.H., Kubiak, J.Z., Weber, M., Géraud, G., Colledge, W.H.,
Evans, M.J., Maro, B. (1996). Mos is required for MAP kinase activation
and is involved in microtubule organization during meiotic maturation in
the mouse. Development 122, 815-822
96. Wianny F, Tavares A, Evans MJ, Glover DM, Zernicka-Goetz M. (1998).
Mouse polo-like kinase 1 associates with the acentriolar spindle poles,
meiotic chromosomes and spindle midzone during oocyte maturation.
Chromosoma 1998 Dec;107(6/7):430-439
71
97. Wickramasinghe, D., Becker, S., Ernst, M.K., Resnick, J.L., Centanni,
J.M., Tessarollo, L., Grabel, L.B., Donovan, P.J. (1995) Two CDC25
homologues are differentially expressed during mouse development.
Development 121, 2047-2056.
98. Wilmut I, Campbell KH. Quiescence in nuclear transfer. Science. 1998
Sep 11;281(5383):1611.
99. Wolf, G., Elez, R., Doermer, A., Holtrich, U., Ackermann, H., Stutte,
H.J., Altmannsberger, H.M., Rubsamen-Waigmann, H., Strebhardt, K.
(1997) Prognostic significance of polo-like kinase (PLK) expression in
non-small cell lung cancer. Oncogene 14, 543-549.
100.
Yuan, J., Horlin, A., Hock, B., Stutte, H.J., Rubsamen-Waigmann,
H., Strebhardt, K. (1997) Polo-Like Kinase, a Novel Marker For Cellular
Proliferation. American Journal of Pathology 150, 1165-1172.