Rh systém Rh systém Geny

Rh systém
Rh systém
• Nejkomplexnější a nejvíce polymorfní
• Rh antigeny patří k nejvíce imunogenním
Mgr. HanaTereza Bolcková
RH lokus - 1.chromozóm
Geny
• 2 Geny geny kódující Rh proteiny vysoce
homologní – na 1.chromozómu (1p34-36)
– RHCE gen - Rh CcEe protein
– RHD gen - Rh D protein
• Příbuzný gen (cca 40% sekvenční homologie)
RHAG – na 6.chromozómu (6p11-21)
– Rh glykoprotein
Počet exonů: RHD 10, RHCE 10, RHAG 10
1
Rh protein family
Rh protein family
• RhAG protein – předek Rh proteinů
– 40% sekvenční homologie s Rh proteiny
• RhCcEe protein – antigeny C c E e Cw
• RhD protein – antigen D
Neil.D.Avent, Marion E.Reid: The Rh blood group systém, Blood 2000, 95,2
Rh komplex
– Rh proteiny (RhD protein, RhCcEc protein) – všechny
Rh antigeny
– Rh glykoprotein (RhAG)
– 2 Rh proteiny (RhD, RhCcEe) +2 Rh glykoproteiny
(RhAG) uspořádány v tetramerickou strukturu
+Rh související proteiny:
– LW-glykoprotein-adhezivní molekula ICAM4,ligand pro
integrin LFA-1
– Integrin asociovaný protein (IAP-CD47)
– Glykophorin B – nesoucí antigeny S,s,U (u Rhnull
redukována hlavně exprese U antigenu)
– Fy glykoprotein – pouze částečná souvislost, z Duffy
antigenů u Rhnull chybí pouze Fy5
– Bílkovina pásu 3 (Band 3; anion exchanger,AE1 –
nesoucí antigeny systému Diego – pouze částečná
souvislost (vzájemné ovlivnění optimální exprese obou
systémů)
2
Exprese struktur Rh systému
během erytropoezy
Exprese struktur Rh systému
Rozpustná forma: ne
Tkáně: erytroidně specifické
• Rh antigeny se objevují již v rané erytropoeze
• Anti-D se váže na asi 3% BFU-E, 68% CFU-E a na
všechna pozdější vývojová stádia
• síla vazby postupně zesiluje – 25%
proerytroblasty, 50-60% erytroblasty, 75%
normoblasty, 100% maturované erytrocyty
• Na fetálních buňkách jsou Rh antigeny
prokazovány od šestého gestačního týdne.
Rh antigeny
Antigeny Rh systému
• Jsou lokalizovány na proteinech RhD a
RhCcEe
• Frekvence výskytu se někdy liší podle dané
populace
Počet antigenů: 45
D, C, E, c, e, Cw
f, Ce, G, CG, CE, c-like, cE, Ce-like
HFA: Hr0, Hr, hrS, Rh29, hrB, HrB, C-like, Nou,
Sec, Dav,
• LFA: V, Cx, Ew, VS, hrH,Rh35, Bea, Rh42Thornton, Crawford, JAL, STEM, MAR,
• LFA u variantních D: Dw, Goa, Rh32, Har,
Evans, Tar, Riv, FPTT, BARC
•
•
•
•
3
Rh antigeny
• Počty antigenů na erytrocyt:
– u normální exprese D 10 000-30 000; C/c a E/e cca 40
000
– Jsou závislé na geno-a fenotypovém uspořádání (např.
při C v trans pozici je exprese D slabší, než při C v cis
pozici; CcEe antigeny jsou exprimovány ve větším
počtu u D- než u D+)
– A dále na homo- nebo heterozygocii pro daný antigen
(tzv. efekt dávky)
– Zvýšené počty D antigenu jsou nalézány na krvinkách s
chyběním některých nebo všech C/c a E/e antigenů (D-/ D-- 100 000 – 200 000)
– Snížené počty (v řádů tisíců až stovek) jsou u slabých D
antigenů a u některých typů D variant
Slabé a variantní RhD antigeny a
monoklonální protilátky
Rozšíření poznatků o membránovém
uspořádání RhD proteinu a stále dochází
(s produkcí nových monoklonálních
protilátek) k upřesňování klasifikace RhD
variant
D antigen
• soubor epitopů na povrchu extramembranózní části
Rh D proteinu.
• Epitopem je určité seskupení několika aminokyselin
polypeptidového řetězce, konformačně závislé na
prostorovém uspořádání celého proteinu
• Monoklonálními protilátkami je v současné době
rozeznáváno více než.30 různých epitopů
D antigen
Ostatní erytrocytové antigeny většiny proteinových
systémů
• výskyt v alelických párech
• rozdílem většinou jediná aminokyselina
• podstatně nižší imunogenicita antigen pozitivních
krvinek pro antigen-negativní jedince
4
D antigen
Výskyt v populacích:
Kavkazská 85%
Černošská 92%
Asijská
99%
Am.indiáni 99%
Počet molekul na erytrocytu:
Běžné D fenotypy 10 000 – 33 000
Slabé D fenotypy 200 – 10 000
Zesílené D fenotypy 75 000 – 200 000
D antigen – efekt enzymů
Ficin/Papain
Trypsin
α-Chymotrypsin
Pronáza
Sialidáza
DTT 200 mM
Cloroquine (RT)
Kyselé prostředí
D antigen
Resistentní (↑ ↑ )
Resistentní (↑ )
Resistentní (↑ )
Resistentní (↑ ↑ )
Resistentní (↑ )
Resistentní
Resistentní
Resistentní
D antigen
Klinický význam aloprotilátek:
Transfuzní reakce: mírné až těžké/akutní
nebo pozdní
HON: mírné až těžké
5
D antigen
D antigen
In vitro charakteristika aloprotilátek:
Autoprotilátky
Třída Ig: většina IgG, některá IgM (IgA
vzácně)
Optimální technika: NAT, enzymy
Vazba komplementu: velmi vzácně
Ano, mohou působit jako mimikující
aloprotilátky
Rh D gen
Více než 200 RhD alel
• variantní D
• slabé D
• DEL
• D negativní
• nefunkční alely
Variantní D antigeny
• Změny RHD genu, které se promítají do
extramembranózní části RhD proteinu
– Lineární změna D epitopů
– Změna 3-dimezionální konformace smyčky
6
Variantní D antigeny
– Chybí některé epitopy (proti kterým mohou
jedinci s D variantou vytvářet protilátky)
– Dochází k novému tvaru RhD proteinu, který
někdy bývá rozeznáván imunitním systémem
jedinců s normálními antigeny jako nový
antigen (LFA)
Variantní D antigeny
• Definovány variantní D II až VII
příčina
• substituce jedné extracelulární
aminokyseliny
– DII a DVII (DMH, DFW, DHR, DMHI, DNU, DNB)
• hybridní RHD-CE-D alely
– DIII, IV, V, VI
– každá obsahuje několik subtypů
Variantní D antigeny
Síla exprese D variant je velice rozdílná
Od téměř normálních počtů kopií
RhD(var)proteinu (DNB,DIII,DVItypIII)
Až po značnou redukci (DVItypI)
• v závislosti na tom, zda daná změna
proteinu ovlivní jeho zabudování do
membránového tetrameru s RhAG či nikoliv
Variantní D antigeny
Osoby s variantním D proteinem mohou
tvořit alloanti-D
Nejčastější a zřejmě klinicky nejvýznamnější
(popsány potransfuzní reakce i těžké HON)
je varianta DVI.
7
Variantní D antigeny
Variantní D antigeny
Mapování RhD epitopů
Mapování RhD epitopů
• Dříve byly variantní antigeny identifikovány
testováním erytrocytů dobře
charakterizovanými polyklonálními anti-D
tvořené osobami s variantním D
• A také testováním anti-D pacienta proti
erytrocytům se známým variantním
antigenem
Nyní
• Lidské monoklonální protilátky se používají
ke klasifikaci variantních D antigenů podle
exprimovaných epitopů
• Původní model – 8 a 9 epitopů rozšířen na
16, 30, 37 epitopů
• Většina epitopů konformačně závislých
Slabé a variantní RhD antigeny a
monoklonální protilátky
Slabé a variantní RhD antigeny a
monoklonální protilátky
Na povrchu RhD proteinu se nachází velké množství
D epitopů – vazebných míst pro jednotlivé
monoklonální protilátky
Velikost jednoho epitopu může odpovídat cca 5
aminokyselinám
Epitopy určeny jednak sekvencí aminokyselin
(primární strukturou), ale také vzájemným
prostorovým uspořádáním
extramembranózních smyček RhD proteinu
(sekundární a terciální strukturou)
Monoklonální protilátky – reagují pouze s
jedním epitopem
- pokud je u D varianty bodová mutace ve
vazebném místě monoklonální protilátky
– negativní reakce
8
D antigen
• Imunologická jedinečnost a velmi silná
imunogenicita D antigenu
– u D-jedinců chybí celý RhD protein
– mají pouze RhCcEeproteiny, které se liší od
RhD 30-35 aminokyselinami.
– jejich imunitní systém dobře rozpoznává D+
erytrocyty (které mají „navíc“RhDprotein)
– cca D-80% jedinců po kontaktu s D+erytrocyty
vytváří anti-D protilátky.
Variantní D antigeny
Variantní D antigeny
• téměř u všech D variant již byl definován
monoklonálními protilátkami příslušný
„epitopový deficit“ (chybění reakce)
• pouze varianta DIII může prozatím být
serologicky detekována pouze na základě
nereaktivity s polyklonální protilátkou antiD produkovanou jedincem s variantou DIII.
Variantní D
D varianty
• zpočátku rozpoznávány na základě anti-D
aloimunizace
• v poslední době jsou častěji zjišťovány při
zjištění slabých a diskrepantních nálezů při
stanovování Rh(D) a následném testování
panelem monoklonálních protilátek ve
specializovaných laboratořích
9
Charakteristika variantních D fenotypů
Fenotyp
II
IIIa
IIIb
IIIc
IVa
IVb (heterogenní)
Asociovaný D epitopy
haplotyp
Ce
epD1,(2),3,5
,6/7,8
Ce G+
epD1-9
Ce GepD1-9
Ce
epD1-9
ce
epD4,5,6/7,
8
Ce,cE
epD5,6/7,8
Etnický původ
Kavkazský
Černošský
Černošský
Kavkazský
Černošský
Kavkazský,
Japonský
Charakteristika variantních D fenotypů
Fenoty
p
VII
DFR
DBT
R0Har
Asociovaný D epitopy
haplotyp
Ce
epD1,2,3,4,5.6/7,9
Ce>cE
epD(1),(2),3,4,(5),6
/7,9
Ce>(C)(e)
epD (6/7),8
a ce
c(e)
epD(5),(6/7)
Charakteristika variantních D fenotypů
Fenotyp
Asociovaný D epitopy
Etnický
haplotyp
původ
Va
ce, Ce,cE
epD2,3,4,6/7,8,9 Kavkazský,
Černošský,
Japonský
Vb
Cwe
Neznámo
VI type I cE
epD3,4,9
Kavkazský
VI type II Ce
epD3,4,9
Kavkazský,
Japonský
VII
Ce
epD1,2,3,4,5.6/7 Kavkazský
,9
Slabé a variantní D antigeny
Etnický původ
Kavkazský
Kavkazský
Kavkazský
Černošský
Japonský
Kavkazský
Frekvence výskytu abnormálních D antigenů:
• 1% všech D+
• z toho 10% představují D varianty
10
Slabé D antigeny
• Změny RHD genu, které se promítají do
transmembránové a intracelulární části
RhD proteinu
Slabé D antigeny
• Původně popsáno 16 typů Dweak
• V současnosti počet Dweak typů včetně
subtypů: 80
– exprese sníženého množství D antigenů
(obvykle méně než 5000 D antigenů na
erytrocyt)
– D antigen nezměněn
Slabé D antigeny
• Nejčastější D weak v evropské a kavkazské
populaci
– D weak typ 1, 2, 3, 4.0/4.1
– 95% všech typů D weak
Slabé D antigeny
• Jedinci se slabými D antigeny se
neimunizují normálním D antigenem
• Výjimky: D weak typ 15, D weak typ 4.2
(DAR), D weak typ 7
• Nebyla zaznamenána aloimunizace u
Dweak typ 1 až 4.1
• Pozorovány nízkotitrové autoprotilátky
11
DEL
• Velmi slabě exprimovaný D antigen – 200
nebo méně kopií D antigenu na RBC
• Vzácné v evropské populaci
• Až 30% D-negativních ve východoasijské
populaci
Vzácné delece fenotypů
Dc• Chybí E e
D-• chybí C,c,E,e
– u fenotypu D--/D-- je tak vysoký počet D
antigenů, že dochází k aglutinaci těchto
krvinek i účinkem inkompletních (IgG)
anti-D protilátek
D negativní
• Nejběžnější D negativní haplotyp ve všech
populacích je způsoben delecí RDH genu
– v kavkazské populaci téměř výhradně
• Existují i jiné D negativní haplotypy:
– nefunkční RhD alely – částé v Afrických
populacích
Zvláštní formy Rh fenotypů
Rhnull
• Na membráně ery chybí RhD i RhCE protein
Příčina:
• 2 nefunkční RHCE alely spolu s RHD
deletovaným haplotypem – amorfní typ
• Defekt v RHAG alelách - regulátorový typ
– exprese Rh proteinů vyžaduje přítomnost
RhAG proteinu
12
Zvláštní formy Rh fenotypů
Rhmod
• Rh antigeny jsou velmi zeslabené a
prokazatelné jen nejcitlivějšími metodami
(Rhmod)
Polymorfismus RhC/c a RhE/e
alelické páry antigenů - mají podklad ve změnách
nukleotidů RHCE genu
Substituce nukleotidů v RHCE:
E/e – 6 substitucí – změna 4 aminokyselin
C/c - 1 substituce – změna 1 aminokyseliny
Variantní E antigeny: I, II, III, Dv type III
Neil.D.Avent, Marion E.Reid: The Rh blood group systém, Blood 2000, 95,2
C/c a E/e antigeny
G antigen
pravděpodobný mechanismus vzniku genů je
rozdílný
• RHCE (Ce)gen vznikl zřejmě rekombinací s
nahrazením prvních dvou exonů RHCE(ce) exony z
RHD
• RHCE(cE) gen vznikl.bodovou mutací (ce) genu
• RhD a RhC proteiny nesou G antigen, který
souvisí s částí na druhé extracelulární
smyčce kódované exonem 2
• Konformačně závislý
• Klinický význam:
– Transfuzní reakce: žádné až těžké
– HON: žádné až těžké
13
f antigen
• složený antigen
• exprimovaný na ery majících „c“ a „e“ ve stejném
haplotypu (cis) např. R1r (DCe/dce), R0R0 Dce/Dce
• není exprimován pokud „c“ a „e“ se vyskytují na
oddělených haplotypech (trans) např. R1R2
(DCe/DcE)
• anti-f je častou součástí anti-c nebo anti-e sér
• Klinický význam:
Rh u pacientů s myeolidní leukémií
• Pacienti s akutní nebo chronickou
myeloidní leukemií, myeloidní metaplasií,
polycytémií nebo myelofibrózou
– Příležitostně mají 2 populace ery s různým Rh
– Transfuzní reakce: mírné/pozdní/hemoglobinurie
– HON: mírné
Ostatní Rh antigeny
• Většinou buď antigeny o vysoké frekvenci
výskytu (HFA-high frequency antigen)
• Nebo antigeny o nízké frekvenci výskytu (LFA-low
frequency antigen)
• Některé z nich jsou závislé na určité kombinaci
jiných antigenů RhCcEe proteinu, což svědčí o
jejich konformační povaze
• Některé jsou společné všem Rh antigenům (chybí
pouze u Rhnull), jsou tedy lokalizovány na
identických aminokyselinových sekvencích RhD a
RhCcEe proteinů.
Detekce RhD antigenů
antigenů
14
Slabé a variantní RhD antigeny vyšetřování
Detekce slabých a variantních RhD antigenů
• je velmi závislá na použitých
diagnostických sérech
• a vzhledem k množství možných reakcí u
variantních antigenů nemůže být v
každém případě stoprocentně
informativní
• Kompromis mezi možnostmi diagnostiky,
rutinní proveditelností testu a klinickou
významností výsledků
Detekce RhD antigenů
Dárce krve:
• Detekce pokud možno všech typů RhD antigenu
– normální, variantní i slabé antigeny
–
–
–
Dvojí určení aglutinačním testem (2 různá séra,
monoklonální diagnostika- proti různým epitopům)
Určení slabých D pomocí IgG protilátek a NAT
Pokud jsou používány monoklonální IgG protilátky,
mělo by být užito více klonů a kombinace
antiepitopových specifit použitých IgG a IgM by měla
pokrýt celé spektrum RhD variant)
Detekce RhD antigenů
Současná doporučení požadují při určování
RhD zohlednit účel, pro který je
prováděno, zda je o:
• dárce krve
• novorozence
• příjemce transfuze
• těhotnou ženu
Guide to the preparation, use and
quality assurance of blood
components
14th edition 2008
Chapter: Blood group serology
Směrnice pro přípravu, použití a
kontrolu kvality krevních produktů
Kapitola: serologie krevních skupin
15
2. Kontrola kvality pro stanovení krevních
skupin
Kontrolovaný parametr: 3.
Imunohematologická vyšetření v
těhotenství a po porodu
stanovení RhD
Minimální požadavky pro testování
• Dvojí testování s použitím dvou anti-D reagentů
různých klonů nebo šarží
• použití NAT pro potvrzení D weak (slabé D) u
dárců, kde to je požadováno.
• Musí být zajištěno, že systém rozeznává
nejdůležitější D varianty (zejména D varianty
kategorie DVI) jako Rh (D) positivní ♣
♣ pokud ABO a RhD je již známo, je dostatečný
jeden test
Doporučení Společnosti pro transfuzní lékařství ČLS
JEP š. STL2010_06 ze dne 1.3.2010 verze 3 (2010_06)
Pracovní skupina STL: Dušková D., Kubánková H.,
Masopust J., Pejchalová A., Písačka M.
Zpracování pro účely této přednášky
Mgr. Hana Tereza Bolcková
4.1.3 Vyšetření plodu
Detekce RhD antigenů
Novorozenec:
Test
Metoda a diagnostika
(min. požadavky)
ABO Aglutinogeny 2x.
2 různé klony pro každé dg.
Sérum.
D
Dw
2 monoklonální dg. séra anti-D
třídy IgM s různými klony, která
nedetekují variantu DVI.
Není vhodné dg. sérum antiCDE.
Komentář
Jen v případě kordocentézy
prováděné u susp. anémie
způsobené HON a před IUT.
Jen v případě kordocentézy
prováděné u susp. anémie
způsobené HON a před IUT
Nevyšetřuje se
16
Detekce RhD antigenů
Příjemce transfuze, těhotná
• Možnost imunizace D- i D variant
• Ideálně
–
–
–
zachytit všechny varianty jako D- nebo na základě
diskrepantních reakcí dvou diagnostik
Detekovat všechny osoby s Dweak (bez rizika
imunizace) jako D positivní
Není možno zajistit vzhledem k velké heterogenitě
reakcí slabých a variantních RhD antigenů
2.2 Stanovení krevní skupiny AB0 a antigenu D
(AB0, RhD) dle doporučení STL2011_07.
2 Antigen D (RhD) – u příjemce
transfuze
• Každý vzorek se vyšetřuje dvojmo různými
monoklonálními diagnostickými séry anti-D třídy IgM,
která by neměly detekovat variantu DVI. Pro určení
antigenu D se nepoužívá antiglobulinový test.
Detekce RhD antigenů
Příjemce transfuze, těhotná
• Požadavek
– Prevence imunizace u varianty nejčastější
současně nejvíce disponované k tvorbě
protilátek – DVI
•
•
použití takových aglutinačních diagnostik, která
nereagují s variantou DVI
u negativních výsledků aglutinačních anti-D
diagnostik se u příjemců a těhotných již
nepokračuje testem na určení slabých D
Doporuč
Doporučení
ení STL
Imunohematologická vyšetřování
v těhotenství a po porodu
Vstupní vyšetření
• 12. týden
AB0 (AG+AGI; opak. AG)
D (2x IgM,
IgM, ne antianti-DVI, ne Dw)
(diskrepance → ref.
ref. laboratoř
laboratoř)
Screening Ab (LISS(dg. ery)
(LISS-NAT)
ery)
Identifikace Ab (dg. ery)
ery) [fenotyp]
fenotyp]
17
2.2 Stanovení krevní skupiny AB0 a antigenu
D (AB0, RhD) dle doporučení STL2011_07.
2.2 Stanovení krevní skupiny AB0 a antigenu D
(AB0, RhD) dle doporučení STL2011_07.
2 Antigen D (RhD)
2 Antigen D (RhD)
Při vyšetření antigenu D rozlišujeme 3 kategorie výsledků:
RhD pozitivní = jasně pozitivní reakce se všemi použitými
diagnostickými séry anti-D
RhD negativní = jasně negativní reakce se všemi použitými
diagnostickými séry anti-D
Dw/v (slabý antigen D/varianta antigenu D)
Dw/v (slabý antigen D/varianta antigenu D) = na slabý
antigen D či variantu antigenu D je vhodné myslet u:
Transfuzní význam D variant a slabých D
antigenů
• Příjemcům s D variantami – by měly být podávány Dsubstituce (prevence anti-D imunizace)
• Není možné z důvodu značné heterogenity D variant
použít při rutinním testování takový postup, který by
zaručil detekci všech typů – prevence vyhrazena pro
variantu DVI – (výběr takových anti-D aglutinačních
diagnostik – IgM, která s touto variantou nereagují)
• D varianty se silnou expresí a minimální změnou epitopů
však budou i nadále určovány jako D+ a budou v riziku
aloimunizace (například DNB)
• Rodinná studie, preventivní opatření u dosud
neimunizovaných osob, zejména mladých žen
• Slabě exprimované varianty jsou chráněny před rizikem
podání D+ tím, že u příjemců není indikováno stanovení
slabých antigenů antiglobulinovým testem
slabší reakce všech použitých diagnostických sér anti-D
zcela diskrepantních reakcí použitých diagnostických sér
(pozitivní x negativní)
rozdílu v síle reakcí použitých diagnostických sér anti-D
nečekaného nálezu anti-D imunizace bez autoreakce u osoby se
zdánlivě normálním antigenem D
diskrepance mezi anamnestickým údajem a současným
vyšetřením
diskrepance mezi výsledky vyšetření jedince postupy
doporučenými pro dárce a příjemce krve.
Transfuzní význam D variant a slabých
D antigenů
• Příjemci se slabými D antigeny – imunizace nehrozí,
protože však rutinní diagnostika dosud nedovoluje
jednoznačné rozlišení obou kategorií, měli by též dostávat
D- substituce (zejména pokud jde o mladé osoby ženského
pohlaví a není-li akutní nedostatek D- transuzních
přípravků)
• Pro těhotné ženy s D variantami jsou doporučována
stejná opatření jako pro D- matky
• Pro dárce krve a novorozence platí, že určení přítomnosti
D antigenu (slabého či variantního) má být co nejcitlivější
a jedince takto určené je třeba považovat za D+
18
Určení Rh genotypu erytrocytů
pacienta
•
CE certifikované diagnostické molekulárněgenotypovací postupy (diagnostické soupravy
PCR-SSP, microarray BloodChip)
ID-karta „Typizace Rh D varianty“
ID-karta „Typizace Rh D
varianty“
Obsahuje:
• ID-Karty
• ID-Anti-D 1-6
Děkuji za pozornost
19
Použitá literatura
Marion E. Reid, Christine Lomas-Francis: THE BLOOD
GROUP ANTIGEN, Academic Press 1997
Avent.N.D., Reid, M.E.: The Rhe blood group
systém: a review. Blood, 2000,č,95,s375-387
Písačka M: Současné pozantky o Rh systému,
Transfuze dnes 6, 78-87
Flegel W.A.: Molecular genetics and clinical
applications for RH. Transfus Apher Sci. 2011
February; 44(1): 81-91
20