Dibenzocyklooktadienové lignany- látky se schopností

Dibenzocyklooktadienové lignany- látky se
schopností překonat mnohočetnou lékovou
resistenci
Gabriela Páchniková
Department of biology
Masaryk University, Faculty of medicine
2
MDR – „MultiDrug Resistance“
rakovinové bunky
chemoterapia
citlivá bunka
rezistentná
bunka
vznik rezistentného
tumoru
rezistencia
3
ABC (ATP Binding Cassette) proteínová
rodina
• 7 podrodín, cca 50 transportných
proteínov
• Pgp (MDR1) – ABCB podrodina – prvý
popísaný transportér asociovaný s MDR
u buniek
• 1280aa/170kDa proteín
• ABC transportér – 2 ATP viažuce
domény + 2 transmembránové domény
efflux
ATP
viaž.
doména
c
matrix
b.
membrána
cytosol
vonkajšia
strana
membrána
vnútorná
strana
b.
membrána
4
Aktívny efflux
Extracelulárny
priestor
Ligand
sekretovaný
ATP
hydrolýza
väzba
ligandu
dimér otvorený
Pi, ADP
uvoľnen
é
dimér zatvorený
dimér otvorený
Linton K J Physiology 2007;22:122-130
črevo
apikálna str.
črevo
•Aktívny transport xenobiotík
väzbou a štiepením ATP
•Transport biologicky
aktívnych látok (cholesterol)
intest.
lumen
pečeň
bazolaterálna
str.
pečeň
hepatocyty
krv
intest. epitel.
bunky
„blood-brain
barrier“
obličky bunky prox. tubulu
suprarenálne žľazy
cieva
endot. bunka
lumen tubulu
5
Schisandra chinensis (Turcz.) Bail,
Schisandraceae
http://kylenorton.healthblogs.org/2012/01/26/t
he-world-most-popular-herbs-schizandrahealth-benefits-and-side-effects/
„wu-wei-zi“ – „sweet, sour, bitter, hot, salty“
http://www.superfoods-scientificresearch.com/medicinal-herbs/schizandrabenefits.html
Obsahuje širokú škálu biologicky aktívnych látok
Výskyt – sever/severovýchod Číny, oblasti Ruska a Kórei
Typické efekty:
•Imunomodulačný efekt
•Antioxidačná aktivita
•Antivírusová aktivita
•Protirakovinový účinok
http://www.sciencephoto.com/media/
27358/enlarge#
•Kardio/hepato protektívny účinok
•Pomoc pri nespavosti, chrípke, prechladnutiu, fyzickom vyčerpaní
6
Dibenzo[a,c]cyklooktadiénové lignany
• 2005/2006 Pan et al.
• Slaninová et al., TIV, 23,
2009
• Efekt na akumuláciu
látok - vinblastin,
daunorubicin,
doxorubicin
• Lignany, blokovaním
transportérov =
akumulácia liečiv vo
vnútri MDR buniek –
potenciálny inhibítor Pgp
rezistentná bunka,
pumpujúca látky von
cieva,
transportujúca
liečivo
vylučované liečivo
vonkajšia strana
vonkajšia strana
b. membrána
transp. kanál pre
príjem látok
transmembránová
transportná pumpa,
vylučujúca látky
vnútorná strana
chemoterapeutikum,
akumulované vnútri
bunky pri blokácii
kanálu
inhibičná
látka,
blokujúca Pgp
pumpu
(MDR1 )
7
Vplyv lignanov na rezistentné nádorové bunky
(Slaninová et al., 2009, TIV, 23)
• Bunky: COR-L23/R
rezistentné na doxorubicín,
prítomnosť mrp1 (ABCC1)
• Testované zlúčeniny: 10
lignanov S. chinensis,
verapamil
• Akumulácia doxorubicínu:
preinkubácia s lignanmi (25
µM) - 15 min
• inkubácia s doxorubicínom
60 min
• prietoková cytometria
COR-L23/R
COR-L23
8
COR-L23/R
Lignany zvyšujú akumuláciu
rezistentných bunkách
a
podporujú
účinok
DOXO
v
R-(+)-deoxyschizandrin a R,S-(±)-γ-schizandrin v relatívne
netoxických
koncentráciách
obnovujú
cytotoxický
efekt
doxorubicinu na rezistentných bb COR-L23/R.
Všeobecným štruktúrnym znakom obidvoch najaktívnejších
lignanov je R-biaryl konfigurácia a absencia hydroxy skupiny na C-8.
9
Bunky HL60/MDR
HL60 MDR (prof. Sarkadi,
Maďarsko) – „MDR fenotyp“
Detekcia MDR génu (RT-PCR) v HL60 a HL60/MDR: β-actin = kontrola,
mdr1 gén (P-gp gén) detekovaný len pri MDR fenotype
 Bunky promyeloidnej
leukémie
 MDR fenotyp –
prítomnosť génu mdr1
IC50 hodnoty
HL60
HL60/MDR
Doxorubicin
0,01
0,9
5
15
(+)-Deoxyschizandrin
20
30
Gomisin N
10
30
Verapamil
IC50 hodnoty pre vybrané látky : Verapamil (μM) a lignany a DOXO
(μM): 10μg/ml (lign.) = 25μM, 20μg/ml = 50μM, 30μg/ml = 75 μM
10
Výsledky:
Akumulačná esej
150,00%
100,00%
167,37%
163,25%
108,08%
100,00%
50,00%
GOA
25μM
SCH
25μM
TGP
25μM
(+) DEO
25μM
0,00%
WUC
25μM
TGP 25uM
DSH-DIA 25uM
WUC 25uM
SCH 25uM
GOA 25uM
VERA 20uM
DMSO
0,00%
200,00%
DSH-DIA
25μM
50,00%
259,52%
234,50%
250,00%
VERA
20μM
129,57%
116,97%
100,00%
297,59%
255,63%
300,00%
148,19%
GON
25μM
173,10%
150,00%
351,20%
350,00%
DMSO
200,00%
100,00%
400,00%
213,55%205,68%
% of control
% of control
250,00%
Testované lignany Gomisin A, Schizandrin, Wuweizisu C, DSH-DIA, Tigloyl gomisin P,
Gomisin N, (+) Deoxyschizandrin,
11
Akumulácia enantioméry
350,00%
288,49%
250,00%
**
187,64%
150,00%
100,00%
*
*
206,30%
143,31%
119,36%
100,00%
137,95%
144,56%
50,00%
GON 25 μM
(-) DEO 25
μM
(+) DEO 25
μM
(-) ySCH 25
μM
(+)ySCH 25
μM
(+-)ySCH 25
μM
VERA 10 μM
0,00%
DMSO
% of control
200,00%
229,32%
(-) GOJ 25
μM
256,61%
(+) GOJ 25
μM
300,00%
Testované lignany – () -Schizandrin, (-) -Schizandrin, (+) -Schizandrin, (-)
Deoxyschizandrin, (+) Deoxyschizandrin, (-) Gomisin J, (+) Gomisin J, Gomisin N
12
Toxicita lignanov a ich komb. s DX
látka
HL60/MDR
DX
0.9
VERA
15
DEO
30
(-) DEO
35
GON
30
GOA
30
GOG
55
(+) GOJ
55
(-) GOJ
35
Compund (% of control)
SCH
35
SCHT
15
(±) γSCH
30
(+) γSCH
15
(-) γSCH
30
WUC
30
Doxorubicin (μg/ml)
0
0,01
0,1
0,3
DMSO 0,25 μl/ml
110,6 ± 6,37
−
−
−
(±)-γ-Schizandrin
92,8 ± 12,1
85,1 ± 31,8
56,4 ± 24,4
40,0 ±13,0**
(+)-γ-Schizandrin
130,7 ± 2,5
93,6 ± 27,4
94,1 ± 13,1
35,1 ± 12,3**
(-)-γ-Schizandrin
111,4 ± 9,9
100,0 ± 16,3
104,9 ± 13,2
81,5 ± 14,1
(+)-Deoxyschizandrin
96,0 ± 9,9
91,4 ± 22,6
51,6 ± 4,0**
41,8 ± 1,1**
(-)-Deoxyschizandrin
114,8 ± 5,6
114,8 ± 5,6
45,3 ± 3,4**
37,2 ± 3,6**
(+)-Gomisin J
98,1 ± 20,5
98,1 ± 20,5
99,9 ± 16,7
72,8 ± 2,1*
(-)-Gomisin J
94,8 ± 25,3
94,8 ± 25,3
60,6 ± 13,5*
37,5 ± 12,0**
Gomisin N
113,4 ± 11,2
113,4 ± 11,2
47,7 ± 12,3**
39,7 ± 10,4**
Verapamil
97,5 ± 13,0
56,5 ± 10,5**
36,2 ± 1,4**
5,9 ± 4,6**
AGH
90
24,17%
DX 0,01 µg/ml + VERA
25 µM
31,83%
DX 0,03 µg/ml + VERA
25 µM
DX 0,1 µg/ml + VERA
25 µM
20,60%
DX 0,01 µg/ml + GON
10 µg/ml
17,15%
DX 0,03 µg/ml + GON
10 µg/ml
28,55%
DX 0,1 µg/ml + GON 10
µg/ml
10,03%
DX 0,01 µg/ml + DEO
10 µg/ml
DX 0,03 µg/ml + DEO
10 µg/ml
DX 0,1 µg/ml + DEO 10
µg/ml
5,53% 7,07%
GON 10 µg/ml
8,23%
DEO 10 µg/ml
4,70%
DX 0,01 µg/ml
10,53%
DX 0,03 µg/ml
DX 0,1 µg/ml
3,10% 2,87%
VERA 25 µM
DMSO
40,00%
35,00%
30,00%
25,00%
20,00%
15,00%
10,00%
5,00%
0,00%
PK
% mŕtvych buniek
13
Viabilita buniek 48h
36,60%
27,93%
15,03%
8,27%
14
Bunkový cyklus
NK
DEO 25μM
DMSO
GON 25μM
DOXO 0,1μg/ml
DEO 25μM + DOXO 0,01μg/ml
DOXO 0,01μg/ml
GON 25μM + DOXO 0,01μg/ml
15
Záver
Lignany:
 Zvyšujú akumuláciu liečiva v rezistentných bunkách nadexprimujúcich
P-gp
 Toxicita testovaných lignanov je približne rovnaká pre bunky rezistentné
na doxorubicínu ako pre bunky citlivé – nie sú teda substrátom ABC
transportérov
 V kombinácii s Doxorubicínom v sub-toxických dávkach zvyšujú %
mŕtvych buniek
 Napriek tomu, že sami bunkový cyklus neovplyvňujú, indukujú v
kombinácii s Doxorubicínom v sub-toxických konc. zástavu b. cyklus v
G2/M fáze (efekt Doxorubicínu)
 Kombinovaný účinok zvyšuje citlivosť buniek HL60/MDR
 Potvrdili sme výraznejší účinok (+) -SCH
 Lignany by mohli byť látky perspektívne pre terapiu rezistentných
nádorov
16
Ďakujem
Doc. MUDr. Iva Slaninová, Ph.D.,
Mgr. Ludmila Koubíková
Mgr. Jiří Slanina, Ph.D., Ing.
Martina Čarnecká, Ph. D.,
Biochemický ústav LF MUNI
Kolektív laboratória:
Mgr. Stjepan Uldrijan, Ph. D.
Mgr. J. Hammerová
Mgr. Katka Cetkovská
M.Sc. Amandine Verlande
Zuzana Prokopová
Image: Graham Johnson (http://www.newscientist.com/gallery/the-celldance-festival/2)
(+) Deoxyschizandrin, Gomisin N – (1ug, 2ug,
5ug, 10ug, 15ug, 20ug, 25ug, 30ug)/ml
18
2
3
ggggggggggggggg
ggggggggggggggg
ggggggggggggggg
ggggggggggggggg
ggggggggggggggg
ggggggggg
19
4
Chemical structures of six lignans 1.
schisandrin; 2. schisandrol B; 3. schisantherin
A; 4. deoxyschisandrin; 5. γ-schisandrin and 6.
schisandrin C (5)
1
20
21
22