textová verze přednášky

Ústav experimentální medicíny AVČR, v.v.i.
Centrum buněčné terapie a tkáňových náhrad a Ústav neurověd, Universita
Karlova, 2. lékařská fakulta, Praha
Prof. MUDr. Eva Syková, DrSc.
Adresa:
Ústav experimentální medicíny AVČR, v.v.i.
Vídeňská 1083
142 20 Praha 4
Telefon:
241062230
Fax:
241062782
Email:
[email protected]
2
Kmenové buňky jsou nediferencované buňky (nespecializované), které se mohou neustále
obnovovat
a
dávají
vzniknout
jednomu
nebo
více
druhům
vysoce
diferencovaných
(specializovaných) buněčných populací. Přestože většina buněk organismu je specializovaná
k provádění specifických funkcí, kmenová buňka je a zůstává nediferencovaná dokud neobdrží
signál k diferenciaci do specializované buňky.
Kmenové buňky se liší svým vývojovým potenciálem. Za skutečně totipotentní buňku může
být považována pouze zygota. Zygota vytváří všechny buňky organismu, včetně např. buněk
placenty, které nejsou součástí embrya. Ve vývojovém stádiu blastocysty (časné lidské embryo,
staré 4 až 5 dní) se buňky dělí na trofoektoderm, který dává vzniknout extra-embryonálním tkáním,
placentě a pupečníku, a na embryoblast. Embryoblast je tvořen primitivním ektodermem a
primitivním endodermem zajišťujícím výživu embrya. Buňky primitivního ektodermu izolované
z vnitřní buněčné masy jsou ex vivo označovány jako
. Tyto buňky
se označují jako pluripotentní, neboť z nich mohou vzniknout buňky odvozené ze všech 3
embryonálních zárodečných vrstev, tj. mesodermu, ektodermu a endodermu, včetně zárodečné linie.
Tyto zárodečné vrstvy jsou embryonálním zdrojem všech somatických buněk, kterých je více než
200 různých typů (Obr. 1). Dalším zdrojem pluripotentních buněk je fetální tkáň, ze které se později
vyvinou gonády. Tyto buňky izolované z primordiálních zárodečných tkání fétů (lidské féty staré 5
až 10 týdnů) se nazývají
.
Většina orgánů obsahuje kromě heterogenní populace specializovaných buněk, které
zajišťují vlastní funkci orgánu či tkáně, ještě početně omezenou buněčnou populaci zajišťující
náhradu „opotřebovaných“ buněk v konečných stádiích diferenciace a tím trvalou regeneraci celých
funkčních jednotek. Tyto
se mohou obnovovat po celou dobu života
jedince. Jsou označované jako multipotentní, neboť dávají vzniknout specializovaným buněčným
typům tkáně, ze které pocházejí. Navíc přinejmenším některé z nich se mohou přizpůsobovat
prostředí, do kterého jsou vloženy, a zásadně měnit svůj původní směr vývoje. Tato vlastnost,
označovaná jako plasticita, nebo také transdiferenciace, byla poprvé odhalena pokusy s nervovými
kmenovými buňkami, které se po vnesení do krve vlivem okolního prostředí diferencovaly do
krevních buněk (Bjornson a spol. 1999). Pravdou ovšem zůstává, že okolo transdiferenciace se
vedou stále spory a její mechanismy rozhodně ještě nejsou objasněny.
3
Embryonální kmenové buňky jsou linie pluripotentních buněk odvozených přímo z časného
embrya (blastocysty) bez předchozí imortalizace a bez použití transformujících agens. Mohou být
bez omezení množeny jako homogenní nediferencovaná kultura kmenových buněk, a i po
dlouhodobé manipulaci in vitro si zachovávají stabilní karyotyp a pluripotenci.
Izolace prvních myších embryonálních kmenových buněk z embryoblastu blastocysty
(Evans a Kaufman 1981, Martin 1981) byla významnou událostí především pro vývojové biology.
Savčí embryo se vyvíjí v těle matky a je velmi obtížně přístupné jakémukoliv zkoumání.
Pluripotentní myší embryonální kmenové buňky se proto staly modelem mnoha vývojových
procesů a v podmínkách in vitro byly diferencovány do většiny buněčných typů.
Pro neomezené množení myších embryonálních kmenových buněk in vitro bez ztráty
pluripotence je zcela zásadní přítomnost cytokinu LIF (leukemický inhibiční faktor), který stimuluje
specifické receptory na buněčné membráně. Signál je přenášen do jádra, kde řídí aktivitu
transkripčních faktorů zodpovědných za udržení pluripotentního stavu. LIF může být embryonálním
4
kmenovým buňkám dodáván ve dvou formách. První z nich je LIF produkovaný primárními
fibroblasty izolovanými z 11-ti až 13-ti denních myších zárodků, které se používají jako kultivační
podložka (feeder) embryonálních buněk z vnitřní buněčné masy. Fetální fibroblasty zároveň
usnadňují adhezi a stimulují růst buněk vnitřní buněčné masy. Druhou formou je rekombinantně
připravený LIF přidávaný ve vysokých koncentracích do kultivačního média. To umožňuje
kultivaci embryonálních kmenových buněk i bez použití kultivační podložky z myších
embryonálních fibroblastů.
V roce 1998, 17 let po izolaci prvních myších linií embryonálních kmenových buněk, James
Thomson a jeho kolegové z University of Wisconsin poprvé úspěšně získali linie lidských
embryonálních kmenových buněk (hESC linie) z embryoblastu přebytečných blastocyst
vytvořených na klinikách asistované reprodukce za účelem umělého oplodnění a darovaných pro
vědecké účely (Thomson a spol. 1998). Ve stejném roce skupina Johna Gearharta z John Hopkins
Hospital (Baltimore) publikovala odvození linie lidských embryonálních zárodečných buněk
z primordiálních buněk zárodečné rýhy lidských fétů získaných Při abortech (Shamblott a spol.
1998).
Linie lidských embryonálních kmenových buněk se odvozují z blastocyst, které jsou
získávány na klinikách asistované reprodukce. Pětidenní lidská blastocysta se skládá z 200 až 250
buněk, z
nichž většina tvoří trofoektoderm. Trofoektoderm musí být nejprve odstraněn,
mikrochirurgicky nebo imunochirurgicky, čímž se odhalí embryoblast. Ten obsahuje v tomto stádiu
vývoje pouze 30 až 34 buněk (Obr. 2).
Normální blastocysta se skládá z
trofoektodermu (modré šipky) a embryoblastu (bílé šipky).
Po odstranění zony pellucidy je
embryoblast zřetelnější. ( Autor: A.. Hampl, UEM AVČR).
5
V květnu roku 2003 byla na mezinárodní konferenci International Stem Cell Forum (společnost
zabývající se výzkumem kmenových buněk) ustanovena International Stem Cell Initiative (ISCI,
aktivita cílená na vzájemné srovnávání hESC linií), jejímž koordinátorem je britská banka
kmenových buněk (UK Stem Cell Bank). Cílem bylo získat co nejvíce hESC linií
charakterizovaných přesně stanovenými standardními testy za definovaných podmínek k dalšímu
výzkumu. Laboratoře vyzvané členy společnosti k účasti v ISCI musí prokázat, že jejich hESC linie
byly odvozeny podle obecně přijímaných etických pravidel. Sedmnáct laboratoří souhlasilo s účastí
a celkem přispívají 59 liniemi lidských embryonálních kmenových buněk do studie ISCI (Obr. 3).
Studie zahrnuje analýzu 17 povrchových antigenů průtokovou cytometrií, kvantitativní RT-PCR
analýzu transkripčních úrovní více než 100 genů a změny exprese těchto genů během diferenciace,
mikrobiologické analýzy, DNA fingerprinting, analýzu karyotypu, histologické hodnocení
vytvořených teratomů a další. Většina testů je prováděna v centrálních referenčních laboratořích
(Adewumi a spol, 2007).
Čísla představují počet hESC linií,
jimiž jednotlivé státy přispívají do této mezinárodní aktivity. Česká republika má v ISCI 3 linie
hECS. (ature Biotech, 2005)
6
Linie lidských embryonálních kmenových buněk si udržují schopnost neustále se obnovovat
se zachováním normálního karyotypu. Základním faktorem udržujícím kmenové buňky
v nediferencovaném stavu není LIF, ale faktor zvaný FGF (fibroblast growth factor). Během
dlouhodobé kultivace si buňky zachovávají svůj pluripotentní potenciál. Potvrzení jejich
pluripotentního potenciálu in vivo se provádí pomocí xenotransplantace lidských embryonálních
kmenových buněk imunodeficientním myším, kde tyto buňky generují teratomy obsahující mnoho
buněčných typů odvozených ze všech 3 zárodečných vrstev, například střevní epitel (odvozený z
endodermu), chrupavku (odvozenou z mesodermu), či neuroepitel (odvozený z ektodermu).
Pomocí exogenních diferenciačních faktorů je možné diferencovat lidské embryonální
kmenové buňky in vitro cíleně do specifických derivátů: přidání retinové kyseliny (RA) a
nervového růstového faktoru (NGF) do kultivačního média nasměruje diferenciaci do neuronálních
typů, fibroblastového růstového faktoru (FGF) a destičkového růstového faktoru (PDGF) do
gliálních prekurzorů, butyrátu sodného do hepatocytů, 5-aza-2’-deoxycytidinu do kardiomyocytů, a
přídavek mnoha různých cytokinů nasměruje diferenciaci do hematopoetických buněk. Pěstují-li se
lidské embryonální kmenové buňky v neurobazálním médiu s přídavkem fibroblastového růstového
faktoru (FGF) a epidermálního růstového faktoru (EGF), vznikne jednotná populace lidských
neurálních prekurzorů.
Implantujeme-li se neurální prekurzory připravené z lidských embryonálních kmenových
buněk do vyvíjejícího se mozku potkana či myši, dojde k jejich začlenění do mozku příjemce,
migraci podél příslušné migrační dráhy, diferenciaci do neuronů a tvorbě synaptických kontaktů.
Z některých implantovaných prekurzorů vzniknou také astrocyty a ostatní typy gliových buněk.
Somatické kmenové buňky jsou nediferencované (nespecializované) buňky, které se
nacházejí ve tkáních. Jsou schopny diferencovat se do všech specializovaných buněčných typů
tkáně, ze které pocházejí. Mohou vytvářet vlastní identické kopie po dobu života organismu. Při
dělení generují progenitorové (prekurzorové) buňky, které se dále vyvíjejí ve zralé buněčné typy
s charakteristickými tvary a specializovanými funkcemi, jako jsou například kontrakce svalových
buněk in vitro či přenos vzruchů nervovými buňkami. Somatické kmenové buňky se vyskytují
v organismu v relativně malém množství, jsou rozptýleny ve tkáních a chovají se různě v závislosti
na svém lokálním prostředí (niche). Jejich hlavní úlohou je udržování integrity a funkčnosti tkání
tím, že nahrazují poškozené buňky, které umírají v důsledku poranění či nemoci. Můžeme je najít
7
v kostní dřeni, periferní krvi, cévách, rohovce a sítnici oka, mozku, míše, kosterních svalech, zubní
dřeni, játrech, pankreatu, vlasovém váčku a epitelu kůže a trávicího systému. Zatím nebyla
izolována žádná populace somatických kmenových buněk schopná vytvářet všechny buněčné typy
organismu.
Progenitorové buňky se nacházejí ve fetálních a dospělých tkáních a jsou to již buňky
částečně specializované. Na rozdíl od somatických kmenových buněk, které se dělí pomalu,
asymetricky a při dělení vždy generují alespoň jednu kmenovou buňku schopnou se opět
obnovovat, progenitorové buňky se dělí rychle a při dělení tvoří dvě progenitorové nebo dvě
specializované buňky, které však už nejsou schopny sebeobnovy. Progenitorové buňky jsou
považovány za buňky předurčené k diferenciaci podél jednotlivých vývojových drah, i když tato
charakteristika nemusí být úplně definitivní.
Některé somatické kmenové buňky se zřejmě mohou diferencovat i do buněk jiných tkání
než pouze do těch, ze kterých pocházejí, dokonce i do tkání pocházejících z jiné embryonální
zárodečné vrstvy (Obr. 4). Tento jev se nazývá či transdiferenciace. Příkladem jsou například
hematopoietické kmenové buňky (odvozené od mesodermu), které se diferencovaly jak do buněk
kosterního svalstva (také odvozených od mesodermu), tak do třech hlavních typů mozkových
buněk, tedy neuronů, astrocytů a oligodendrocytů (odvozených od ektodermu). Dalším příkladem
plasticity jsou stromální buňky kostní dřeně, které jsou odvozené od mesodermu a mohou se
diferencovat do dalších tkání odvozených od mesodermu, jako jsou buňky kosterního svalstva,
srdečního svalstva či jaterní buňky, avšak mohou se diferencovat i do neurálních tkání, které jsou
odvozené od ektodermu. Podobně neurální kmenové buňky izolované z dospělého mozku se mohou
diferencovat do hematopoietických buněk, myogenních elementů, či dokonce mohou generovat
mnoho různých buněčných typů v chimérickém embryu. Naopak jaterní kmenové buňky se mohou
diferencovat do neurálních buněk. Plasticita somatických kmenových buněk je předmětem
intenzivního výzkumu, stále se objevují důkazy podporující tuto schopnost, ale i práce, které tuto
vlastnost vyvracejí.
8
(podle Kirschstein a
Skirboll, 2001)
Kmenové buňky nervového systému
Před více než 40 lety Altman a Das prokázali, že dvě oblasti postnatálního mozku potkana,
hipocampus a bulbus olfactorius, obsahují dělící se buňky, ze kterých vznikají neurony (Altman a
Das 1965, Altman 1969). Přesto v té době převládal názor, že se nervové buňky v dospělém mozku
nedělí, a že tedy po narození v mozku již nové buňky nevznikají. Až v posledním desetiletí série
9
prací ukázala, že se v dospělém savčím mozku opravdu nacházejí kmenové buňky, a že tyto buňky
mohou dát vznik všem hlavním buněčným typům mozku, neuronům, astrocytům a
oligodendrocytům.
Kmenové buňky se v dospělém mozku nacházejí v subventrikulární zóně (SVZ) postranních
komor a v subgranulární zóně (SGZ) gyrus dentatus v hipocampu. SVZ je vrstva dělících se buněk
pod vrstvou ependymálních buněk, tvořících výstelku komor. Obsahuje tři různé buněčné populace:
pomalu se dělící SVZ astrocyty, které generují rychle se dělící přechodné oválné buňky. Ty se dělí
za vzniku neuroblastů migrujících rostrálním migračním proudem do čichového bulbu. SVZ
astrocyty mají vlastnosti kmenových buněk, neboť se dělí asymetricky za vzniku další oválné buňky
a neuroblastu (Doetsch 2003). Obdobně SGZ astrocyty v gyrus dentatus mají vlatnosti kmenových
buněk. Při asymetrickém dělení se samy obnovují a zároveň dávají vzniknout granulárním
neuronům hipocampu. Pokud dojde v mozku k poranění, nově vznikající buňky nemigrují pouze do
čichového bulbu, ale i do místa léze.
Kmenové buňky kostní dřeně
Nejvíce studované jsou somatické kmenové buňky kostní dřeně. Poznatek, že kostní
dřeň obsahuje kmenové buňky, není nový. Hematopoietické kmenové buňky, zodpovědné za tvorbu
všech typů krevních buněk v těle (erytrocytů, leukocytů a trombocytů), byly rozpoznány před více
než 40 lety (Till a McCullough 1961, Becker a spol. 1963). Stromální buňky kostní dřeně,
heterogenní buněčná populace generující kostní, chrupavčitou, tukovou, vazivovou tkáň a
retikulární síť podporující krvetvorbu, byly popsány krátce po objevu hematopoietických
kmenových buněk. Tato populace buněk se často označuje jako mesenchymální kmenové buňky.
Asi před deseti lety byla z cirkulující krve izolována populace progenitorových buněk
diferencujících se do cévních endotelových buněk. Zároveň bylo zjištěno, že tato populace pochází
z kostní dřeně.
Mesenchymální kmenové buňky kostní dřeně jsou vřetenovité buňky morfologicky podobné
fibroblastům, které při počátečním růstu in vitro tvoří před první trypsinizací kolonie. Na svém
povrchu neexprimují hematopoietické povrchové markery CD34, CD45, CD14, CD31, CD133,
naopak exprimují CD90, CD73, CD105, CD166, CD54, CD55, CD13 a CD44. In vitro se
diferencují do mesodermálních buněčných typů: osteocytů, adipocytů a chondrocytů, ale také do
linií nemesodermálních, například buněk neuronálního typu.
V současné době existuje více metod izolace mesenchymálních kmenových buněk. Jsou
založeny buď na jejich biologických vlastnostech, jako je selektivní adheze k plastu - tyto kultury
10
jsou však heterogenní, kontaminované hematopoetickými buňkami - nebo na základě jejich
povrchových markerů, jako je například izolace pomocí monoklonální protiláky Stro-1.
Mesenchymální kmenové buňky se stejnými biologickými vlastnostmi byly vedle kostní
dřeně izolovány i z jiných orgánů: z periferní krve, synoviálních membrán, tukové tkáně, svalů,
pupečníkové krve, či zubní dřeně dočasných zubů. Zřejmě v těle existuje rozsáhlá síť, která je
průběžně doplňována z kostní dřeně. Podle poslední hypotézy mesenchymální kmenové buňky
normálně cirkulují v periferní krvi, při stresu či po poranění se začnou množit a jsou
chemoatrahovány do kostní dřeně a do léze pomocí vazby mezi receptorem CXCR4,
exprimovaným somatickými kmenovými buňkami, a jeho ligandem SDF-1, sekretovaným
poraněnou tkání a různými orgány. Osa SDF-1-CXCR4 hraje roli při osídlování nejen kostní dřeně,
ale také svalů, jater a nervových tkání, přednostně však kostní dřeně kmenovými buňkami.
Cirkulující kmenové buňky tedy mezi sebou soutěží o obsazení SDF-1 pozitivních útočišť ve
tkáních. Tato kompetice zřejmě vysvětluje lépe než plasticita kmenových buněk, proč kmenové
buňky kostní dřeně byly nalezeny ve svalech, nebo naopak proč svalové satelitní buňky či jaterní
kmenové buňky byly izolovány z kostní dřeně.
Mesenchymální kmenové buňky produkují různé hematopoetické i nehematopoetické
růstové faktory, interleukiny a chemokiny. Některé konstitutivně, jako IL-6, IL-7, IL-8, IL-11, IL12, IL-14, IL-15, LIF, M-CSF (macrofage colony stimulating faktor), Flt-3 ligand, či SCF, jiné po
stimulaci zánětlivými molekulami, jako IL-1, G-CSF, či GM-CSF. Zároveň exprimují receptory
těchto látek, jako receptor pro IL-1, IL-3, IL-4, IL-6, IL-7, LIF, SCF, G-CSF, IFNγ, TNFI + II,
TGFβI + II, bFGF, PDGF, či EGF. Dále produkují množství molekul extracelulární matrix,
například fibronektin, laminin, kolagen, hyaluronan, proteoglykany, a adhesivní molekuly, jako jsou
integriny, ICAM, VCAM, ALCAM, LFA-3, L-selectin, endoglin, CD44, či lektiny, například
galectin-1. Významně tak přispívají k vytváření a funkci mikroprostředí kostní dřeně.
Kmenové buňky kosterního svalstva
Satelitní buňky kosterního svalstva byly identifikovány před více než 40 lety u žab, později
pak i u savců. Nacházejí se na povrchu bazální laminy zralých svalových buněk a zprostředkovávají
růst svalů. Za normálních podmínek se satelitní buňky nedělí, avšak poranění či zátěžová cvičení
mohou spustit jejich proliferaci. Satelitní buňky pak generují myogenní progenitorové buňky
diferencující se do myofibril.
Existuje však ještě jiný druh kmenových buněk schopných regenerovat kosterní svalstvo.
Jedná se o tzv. postranní populaci buněk, která se nachází ve svalech i kostní dřeni a může být
separována pomocí FACS (Fluorescence-activated cell-sorting) analýzy.
11
Kmenové buňky kůže a trávicího systému
Epitelové buňky kůže a trávicího systému jsou neustále obnovovány. Savčí kůže obsahuje
minimálně tři populace epitelových buněk: epidermální buňky, buňky vlasového váčku a žlázové
epitelové buňky (například buňky tvořící potní žlázy). Ve všech těchto populacích byly nalezeny
kmenové buňky. Například kmenové buňky vlasového váčku tvoří progenitory, které dávají
vzniknout všem sedmi různým buněčným typům vlasového váčku. Zároveň však mohou kmenové
buňky vlasového váčku tvořit kožní epidermis. Další populace kožních kmenových buněk se
nachází v bazální vrstvě epidermis. Tyto buňky proliferují v bazální oblasti a během migrace
k vnějšímu povrchu kůže se postupně diferencují. Keratinocyty tvořící nejpovrchovější vrstvu kůže
již nemají jádra a tvoří ochrannou bariéru.
Kmenové buňky obnovující epitel tenkého střeva jsou fyzicky oddělené od zralých
buněčných typů, které jsou z nich generovány. Nacházejí se ve střevních kryptách, hlubokých
vchlípeninách ve střevním lumen, kde tvoří organizované shluky buněk nazývané strukturálněproliferační jednotky.
Významným důvodem pro výzkum kmenových buněk je možnost jejich použití pro
buněčnou terapii. Pro mnoho závažných onemocnění neexistuje kauzální léčba, je uplatňována
pouze léčba symptomatická. Současná medicína využívá k náhradě nevratně poškozených tkání a
orgánů. I přes velké pokroky v transplantacích celých orgánů, pro nedostatek dárců tato strategie
nestačí pokrývat rostoucí požadavky na život zachraňující orgány. V některých tkáních jako je
CNS, transplantace orgánů vůbec nepřichází v úvahu. Kmenové buňky by mohly nahradit tkáně
poškozené při mnoha devastujících onemocněních, například při Parkinsonově chorobě,
Alzheimerově chorobě, amiotrofické laterální skleróze, roztroušené skleróze, iktu, míšním poranění,
infarktu myokardu, diabetu, selhání ledvin či jater, rozsáhlých popáleninách a náhradě kostí a
chrupavek.
Kmenové buňky také mohou být díky svým migračním schopnostem využity jako nosiče
pro dopravování různých genů, růstových a trofických faktorů, chemokinů či cytokinů do
poškozených tkání v těle a působit tak antiapoptoticky a proregeneračně. Terapie založené na
kmenových buňkách jsou dnes také hlavním směrem zkoumání ve výzkumu maligních nádorových
12
onemocnění. V medicíně se již buněčná terapie s velkým úspěchem používá pro léčbu nádorů
krevní řady, v ostatních oblastech probíhají četné klinické zkoušky.
Embryonální kmenové buňky představují důležitý směr ve výzkumu buněčné terapie, neboť
mají široký diferenciační potenciál. Na druhou stranu je s jejich výzkumem a použitím spojeno
mnoho metodických a etických problémů. Lidské embryonální kmenové buňky se dnes standardně
kultivují v médiích obsahujících zvířecí séra a na myších embryonálních fibroblastech sloužících
jako kultivační podložka (feeder). Tento způsob kultivace však vede k zabudování zbytků Nglykolyl-neuraminové kyseliny do plasmatické membrány embryonálních kmenových buněk. Nglykolyl-neuraminová kyselina je přítomna na povrchu většiny savčích buněk, chybí však u lidí.
Většina lidí má proti této látce vytvořené cirkulující protilátky. Případná implantace lidských
embryonálních kmenových buněk, které přišly během kultivace do kontaktu se zvířecím
materiálem, by proto mohla mít za následek zvýšení pravděpodobnosti odhojení štěpu. Navíc se
takto zvyšuje nebezpečí přenosu virových a prionových onemocnění při jakékoliv klinické aplikaci.
Proto se mnoho laboratoří pokouší kultivovat lidské embryonální kmenové buňky
v bezfeederových systémech, či s použitím feederových buněk lidského původu (v současnosti se
nejčastěji používají fibroblasty izolované z předkožky). Nedávno byla odvozena nová linie lidských
embryonálních kmenových buněk zcela bez použití feederových buněk i zvířecího séra.
Dalším problémem spojeným s použitím lidských embryonálních kmenových buněk pro
buněčnou terapii je potenciální
po implantaci. Aby se předešlo nebezpečí vzniku
nádorů, je nutno částečně diferencovat embryonální kmenové buňky in vitro do požadované linie a
zajistit odstranění všech nediferencovaných buněk z buněčného štěpu před implantací. Jednou
z možných strategií vedoucích k odstranění nediferencovaných buněk je sortování buněk na základě
fluorescenčně značených povrchových markerů. Tento přístup již byl úspěšně testován v pokusném
uspořádání.
Linie lidských embryonálních kmenových buněk jsou z hlediska transplantačních strategií
, neboť jsou odvozené z blastocyst. Aby se zamezilo nebezpečí odhojení štěpu kmenových
buněk po transplantaci, bude nutné zajistit genetickou shodu příjemce a štěpu. Vytváření bank linií
lidských embryonálních kmenových buněk je velice nákladné a spojené s mnoha etickými a
politickými problémy. Alternativou by mohlo být vytváření
metodou
somatických buněk (SCNT=somatic cell nuclear transfer). Jedná se o přenos jádra
izolovaného ze somatické buňky (například fibroblastu) budoucího příjemce do oocytu dárce
13
předem zbaveného jádra. Cytoplazma oocytu přeprogramuje dosud neznámým mechanismem
chromozómy v jádře somatické buňky. Klonovaná buňka se vyvíjí v blastocystu, z níž může být
odvozena linie embryonálních kmenových buněk nesoucí set chromozómů identických
s chromozómy budoucího příjemce.
Rozvoj metody přenosu jader je svázán etickými a zákonnými omezeními týkajícími se
použití lidských embryí pro výzkum. Nedávno byly proto navrženy nové možnosti odvození linií
lidských embryonálních kmenových buněk bez zničení embryí. Jednou z technik je
. Jedná se o extrakci jediné buňky z blastomery, což je osmibuněčné stádium
vývoje embrya. Stejná technika je používána na klinikách asistované reprodukce, kde je odebraná
buňka použita pro preimplantační genetickou diagnostiku, aniž by se tím narušil další vývoj embrya
nebo došlo k jeho zániku. I z takto odebrané buňky je možno odvodit linii embryonálních
kmenových buněk.
Další technikou odvození linií lidských embryonálních kmenových buněk bez zničení
embryí je alternativa
, a sice pozměněný přenos jader. Jedná se o přenos somatického jádra
s inaktivovaným genem Cdx2, který je zodpovědný za vývoj trofoektodermu. Vzniklé embryo tedy
není schopné implantace do dělohy, je však možné z něj odvodit linii embryonálních kmenových
buněk. Ovšem ani tato technika není úplně bezpečná, neboť k inaktivaci genu je nutno použít
lentivirus, který může nepříznivě ovlivnit odvozenou buněčnou linii.
V roce 2007 byl poprvé popsán způsob přeprogramovaní kožní buňky na pluripotentní
buňku vnesením 4 vybraných genů do jádra. Takto vzniklé buňky měly vlastnosti embryonálních
kmenových buněk. Jelikož ale dva z těchto genů můžou způsobit vznik nádorů, není tato metoda
v blízké budoucnosti aplikovatelná v humánní medicíně.
Využití somatických kmenových buněk v buněčné terapii skýtá určité výhody ve srovnání
s použitím embryonálních kmenových buněk. Somatické kmenové buňky jsou vhodné pro
, neboť je lze získat přímo od pacienta samotného. Zabrání se tak
pozdějším imunitním reakcím proti implantátu. V případě implantace somatických kmenových
buněk rovněž nevzniká nebezpečí vzniku nádorů, a v neposlední řadě odpadají četné etické
problémy spojené s izolací embryonálních buněk.
Mnoho světových laboratoří proto v posledním desetiletí zkoumá možnosti použití
somatických kmenových buněk pro buněčnou terapii. Mezi výsledky jednotlivých skupin jsou však
velké rozdíly, které jsou nejspíš způsobeny četnými technickými problémy spojenými s výzkumem.
14
Překvapivě obtížným problémem je nalezení vhodného buněčného markeru, který by byl dostatečně
citlivý a zůstal stabilní po implantaci buněk do rozličných tkání. Dále je velice obtížné dobře
definovat časový interval po poranění, ve kterém je vhodné provést implantaci. Pozorované
odlišnosti jsou také způsobeny jemnými ale rozhodujícími rozdíly použitých kmenových buněk
mezi jednotlivými skupinami. Například i různý myší kmen použitý pro izolaci buněk či dokonce
fáze buněčného cyklu implantovaných buněk mohou významně ovlivňovat výsledky.
Zřejmě nejvhodnějším, nejprostudovanějším a nejsnáze přístupným zdrojem somatických
kmenových buněk je
a
. Již v polovině 19-tého století patolog Cohnheim
navrhl hypotézu, že všechny buňky těla pocházejí z krevního řečiště, tedy z kostní dřeně. Stárnutí a
degenerativní onemocnění mohou být částečně způsobena právě postupným úbytkem cirkulujících
kmenových buněk a jejich funkčních vlastností.
Až počátkem nového tisíciletí potvrdily nové studie Cohnheimovu hypotézu a naznačily, že
kmenové buňky nacházející se v mnoha tkáních jsou doplňovány nehematopoietickými kmenovými
buňkami z krevního řečiště a kostní dřeně během různých procesů tkáňových oprav.
Nejpřesvědčivější důkazy pocházejí překvapivě ze vzorků tkání pacientů, kteří podstoupili
transplantaci orgánů či kostní dřeně. U pacientek, které získaly kostní dřeň od mužských dárců,
byly nalezeny buňky s mužskými chromozómy: v játrech jako hepatocyty a cholangiocyty,
v ledvinách jako tubulární epitelové buňky, v plicích jako epitelové a endotelové buňky, v srdci
jako kardiomyocyty, a v mozku jako neurony i Purkyňovy buňky.
V periferní krvi cirkulují vedle hematopoietických také mesenchymální kmenové buňky a
endothelové progenitory. V současné době se množí různé názvy a definice cirkulujících
kmenových buněk, shodují se však některé jejich povrchové markery. Společnou charakteristikou
cirkulujících buněk jsou markery CD133, CD34 a CD14, a dále exprese kmenového transkripčního
faktoru Oct-4. In vitro kultivace těchto buněk generuje mesenchymální kmenové buňky, což je
spojeno s potlačením exprese povrchových markerů cirkulujících buněk a naopak s indukcí exprese
mesenchymálních povrchových markerů.
se již více než 30 let používají při transplantačních
terapiích mnoha krevních onemocnění. Děti trpící SCID (severe combined immune deficiency) jsou
úspěšně léčeny transplantací kostní dřeně od roku 1968. Pacienti s leukémií nejprve podstoupí
chemoterapii vedoucí ke zničení jejich vlastní kostní dřeně a poté transplantaci zdravé kostní dřeně
od donorů se shodnými HLA antigeny. Stejné schéma se zkouší u pacientů s pokročilou
roztroušenou sklerózou.
mají terapeutický účinek při ischémiích. Intravenózní podání
+
lidských CD34 buněk potkanům s infarktem myokardu vedlo k výrazné angiogenezi, snížení
15
apoptózy myocytů, a obnově srdeční funkce; implantované CD34+ buňky daly vzniknout
kardiomyocytům, buňkám hladkého svalstva cév a endothelovým buňkám. Alternativou je exogenní
mobilizace endothelových progenitorů z kostní dřeně podáním různých cytokinů pacientům. Podání
statinů podporuje angiogenezi v ischemické tkáni; podání G-CSF (granulocyte-colony stimulating
factor) a SCF (stem cell factor) regeneruje poškozený myokard, obnovuje srdeční funkci a tak
snižuje mortalitu po infarktech.
se mohou podílet na buněčné terapii dvěma hlavními
mechanismy: mohou samy přispívat k obnově poškozených tkání (tzv. replacement), nebo mohou
působit antiapoptoticky a vytvářet faktory podporující regeneraci endogenních buněk (tzv. rescue
efect). Předmětem zkoumání jsou čtyři hlavní oblasti jejich potenciálního klinického využití: mohou
být podávány pacientům lokálně (do místa poškození) nebo systémově do krevního řečiště (Obr 5),
nebo v kombinaci s umělými biomateriály ve tkáňovém inženýrství a nebo v kombinaci s genovou
terapií.
Z kostní
krve je možné izolovat celou buněčnou frakci, nebo jednotlivé subpopulace buněk. Ty je možné ex
vivo expandovat, případně geneticky upravit a podat pacientům systémově, nebo lokálně.
defektů,
zlomenin
mesenchymálních kmenových buněk je velice účinný při léčbě kostních
dlouhých
kostí,
či
defektů
chrupavek.
Směs
mesenchymálních
a
hematopoietických buněk byla lokálně zkoušena u pacientů s ischémií myokardu, onemocněními
koronárních tepen, či s nezhojenými chronickými kožními poraněními. Studie na potkanech
16
s míšním poraněním ukázaly, že lokální podání mesenchymálních kmenových buněk může zlepšit
neurologický obraz. V těchto studiích bylo nalezeno velice málo implantovaných buněk
exprimujících neurální markery, efekt je zřejmě spojen s výše zmíněnou produkcí trofických
faktorů těmito buňkami.
mesenchymálních kmenových buněk bylo testováno u dětí
s osteogenesis imperfecta. Transplantované buňky produkovaly normální kolagen, což zlepšilo
klinický obraz onemocnění. Další klinické testy s pozorovaným zlepšením proběhly u pacientů s
Hurlerovým syndromem a idiopatickou aplastickou anémií. Kombinovaná transplantace
hematopoietických
a
mesenchymálních
hematopoietických
buněk
usídlit
se
kmenových
v kostní
buněk
dřeni.
výrazně
zvyšuje
schopnost
buňky
poskytují
Mesenchymální
hematopoietickým stromální podporu urychlující jejich zotavení po transplantaci a snižují díky
svým imunomodulačním schopnostem imunitní reakci stěpu vůči hostiteli. Studie na potkanech
s traumatickým poškozením mozku či s poraněním míchy předpokládají terapeutický efekt
systémově podaných mesenchymálních kmenových buněk i v centrálním nervovém systému. Tyto
studie vedly ke klinické studii u pacientů s transverzální míšní lézí, kde bylo pozorováno po podání
do 30-ti dnůpo poranění částečné zlepšení (Syková a spol. 2006).
představuje alternativní možnost zisku tkání a orgánů potřebných pro
transplantaci. Předpokládá, že vlastní buňky pacienta budou hustě umístěny na trojrozměrnou
biodegradující kostru a kultivovány v bioreaktorech, což umožní tvorbu konkrétní tkáně či orgánu,
například jater, srdce, chrupavky, či ledvin. V mozku a míše často dochází ke vzniku rozsáhlých
kavit, které brání regeneraci. Umělé biomateriály zde hrají úlohu v přemostění defektů před
implantací kmenových buněk (Obr. 6). Mesenchymální kmenové buňky jsou vhodným kandidátem
pro tkáňové inženýrství díky jednoduché in vitro kultivaci a velkému proliferačnímu a
diferenciačnímu potenciálu. Úspěšné pokusy na zvířatech potvrdily tento přístup pro léčbu defektů
dlouhých kostí, i pro náhradu chrupavek v kloubech, nose, uchu nebo průdušnici.
17
Polymérní
makroporézní hydrogel na bázi hydroxyetylmetakrylátu (HEMA) má vysoký obsah vody a svými
fyzikálními a mechanickými vlastnostmi napodobuje vlastnosti nervové tkáně. Je biokompatibilní a
poskytuje mechanickou podporu buňkám a axonům i umožňuje difúzi růstových faktorů.
Schéma přemostění hemisekce míchy blokem hydrogelu.
Detail operované míchy potkana, do které je vložen blok hydrogelu.
Po jednom měsíci vroste
implantovaný hydrogel (ohraničený tečkovanou čarou) do tkáně míchy laboratorního potkana.
(Autoři: E. Syková, A. Hejčl, UEM AVČR)
kmenových buněk je lákavý úkol pro genovou terapii, neboť
kmenové buňky mají vyšší proliferační kapacitu a dlouhodobé přežívání ve srovnání s jinými
somatickými buňkami. Mesenchymální kmenové buňky po úspěšné transfekci exprimovaly
exogenní proteiny (například IL-3) a uchovaly si tuto schopnost i po transplantaci in vivo.
Modifikace mesenchymálních kmenových buněk vedoucí k expresi růstových faktorů typu BMP
(bone morphogenic protein) vedla k velice účinné osteogenezi a chondrogenezi. Další velice
nadějnou strategií je použití geneticky modifikovaných mesenchymálních kmenových buněk jako
18
nosičů pro chemoterapii nádorů. Myší model prokázal, že buňky produkující interferon-β podané
systémově se specificky usídlily v nádoru, jenž začal následně ustupovat.
mají obrovský potenciál pro buněčnou terapii
neurologických onemocnění. Mohou být izolovány z fetálního nebo dospělého mozku, což
v případě lidských buněk s sebou nese etické problémy spojené s použitím lidské tkáně mozku
z legálních abortů. U pacientů trpících Parkinsonovou chorobou zajistila implantace fetálních
dopaminergních neuroblastů do striata dlouhodobou obnovu funkčních schopností, i když zatím
přežívá pouze 10 % implantovaných buněk. Pozitivních výsledků bylo dosaženo také po implantaci
neurálních kmenových buněk v případě Huntingtonovy choroby a zvířecích modelů iktu. Neurální
kmenové buňky jsou velice účinné pro léčbu roztroušené sklerózy, kde způsobují remyelinizaci
axonů a snižují astrogliózu, a to po lokálním stejně jako systémovém podání. Díky své pozoruhodné
schopnosti migrovat tkáněmi celého těla a usídlovat se v různých typech nádorů, ať už neurálního
nebo jiného původu, mohou být neurální kmenové buňky s výhodou využity jako nosiče
chemoterapeutik pro léčbu nádorů.
Výzkum možností buněčné terapie je založen na transplantaci buněk do organismu a
následném sledování jejich migrace, usídlení v cílové tkáni, diferenciace a vlivu na okolní tkáně. Je
tedy nezbytné implantované buňky odlišit od buněk příjemce.
Implantované buňky lze detekovat v hostitelském organismu ex vivo, tedy po vyjmutí cílové
tkáně a jejím histologickém zpracováni, či in vivo, tedy během života organismu, což umožňuje
sledování dynamických změn a je použitelné i v klinické praxi.
ex vivo
Možnosti detekce buněk v hostitelské tkáni ex vivo lze rozdělit na několik typů: a) detekce
endogenních značek, b) štěpů z transgenních zvířat, c) exogenních značek, či d) geneticky
upravených štěpů.
Detekce endogenních markerů
Jedná se o detekci buněčného štěpu z jiného jedince (allotransplantát) či druhu
(xenotransplantát) organismu než je organismus příjemce. Je založena na specifických rozdílech
19
mezi štěpem a příjemcem. U allotransplantátů se jedná o detekci specifické alely odlišné od alely
příjemce, například buňky z myšího kmene C3H je možno odlišit v hostitelské tkáni divokého
kmene myší pomocí monoklonální protilátky rozeznávající C3H-specifický alloantigen. Podobný
přístup je možno použít i k detekci xenotransplantátů, například lidské buňky implantované do
potkaních či myších modelů lze odlišit pomocí monoklonální protilátky HuNu (human nuclei)
specificky rozeznávající jádra lidských buněk. Další možností odlišení allotransplantátů je detekce
chromozómu Y v případě implantace samčích
buněk do samičího příjemce metodou in situ
hybridizace specifických DNA sond rozeznávajících sekvence přítomné pouze na chromozómu Y.
Tyto endogenní značky jsou stabilní, ale imunologické aspekty spojené s allo- či xenotransplantací vedou k odmítnutí štěpu hostitelem. Imunosupresivní terapie mohou prodloužit přežití
štěpu, ale zavádí další těžko definovatelné faktory do pokusů. Řešením je také použití
imunodeficientních kmenů myší a potkanů jako příjemců.
Detekce štěpů z transgenních zvířat
Buňky izolované z vhodných transgenních zvířat nesou transgenní značku, kterou je možno
použít k detekci těchto buněk po implantaci příjemci, který tuto značku nenese. Transgenní značka
může být v dárcovském organismu připojena k obecnému promotoru, pak je exprimována většinou
buněk, nebo může být připojena ke specifickému promotoru, a exprimována pouze buňkami, které
během své diferenciace aktivovaly tento promotor. Například promotor GFAP (glial fibrillary acidic
protein) je aktivován pouze v astrocytech, promotor neuron-specifické enolázy (NSE) pouze
v neuronech.
Transgenní značky vhodné k detekci implantovaných buněk jsou například gen pro βgalaktozidázu (lac Z) izolovaný z E.Coli, který je možné prokázat histochemicky, nebo pomocí
specifické monoklonální protilátky. Výsledkem histochemického barvení jsou modře zbarvené
buňky, monoklonální protilátku je možné prokázat pomocí peroxidázy nebo fluorescenčně. Další
široce používanou transgenní značkou je gen pro zelený bioluminiscentní protein GFP (green
fluorescent protein) izolovaný z medúzy Aequorea Victoria. Protein GFP je přímo detekovatelný
pomocí fluorescenčního mikroskopu (Obr. 7).
20
µ
Tyto buňky byly izolované z kostní dřeně EGFP transgenní linie “zelených potkanů”
TgN
(acro/act-EGFP)4Osb, která exprimuje EGFP (enhanced GFP) pod kontrolou kuřecího promotoru
pro ß-actin a cytomegalovirového enhanceru. Výsledkem jsou „zeleně svítící“ buňky všech tkání,
kde se ß-actin exprimuje. (Autoři: P. Jendelová, K. Růžičková, UEM AVČR)
Detekce exogenních značek
Exogenní značky jsou do buněk zaváděny před implantací příjemci. Na rozdíl od výše
uvedených typů detekce mohou být použity i při autologních transplantacích. Dělí se na
cytoplazmatické, membránové a jaderné.
Většina cytoplazmatických značek se do buněk dostává endocytózou. Množství značky
v buňce závisí na její extracelulární koncentraci a také na buněčném typu. Po endocytóze do
cytoplazmatických váčků a lysozómů mohou být značky degradovány či transformovány, čímž se
omezuje použití tohoto typu značení na spíše krátkodobé studie. Navíc exogenní značky mohou být
z implantovaných buněk přeneseny na buňky příjemce a tím způsobit chybnou interpretaci
výsledků. Částečně se tomu dá zabránit použitím novějších fluorescenčních typů značek, které
pronikají do buněk membránami, ale jakmile jsou v cytoplazmě, jsou modifikovány za vzniku
produktů neschopných zpětného prostupu membránou. Jedná se například o thiol-reaktivní sondy
nebo diacetáty látek jako je FITC (fluorescein isothiocyanate) či carboxyfluorescein succinimidyl
ester (CFSE). Zabudování těchto značek do fagocytických buněk příjemce, například makrofágů, se
zabránit ale nedá. Navíc tyto fluorescenční značky rychle pohasínají. Nový typ značky,
21
QuantumDots, nepohasíná po velice dlouhou dobu, ale problém ředění cytoplazmatických značek
při každém buněčném dělení zůstává.
Membránové exogenní značky mají tu výhodu, že umožňují vizualizaci tvaru buňky včetně
všech buněčných výběžků. Na druhou stranu díky rychlému obratu a přestavbě membrán mohou být
značky snadno přerozděleny na sousedící buňky a způsobit falešnou pozitivitu buněk příjemce.
Navíc nebezpečí přenosu na fagocytické buňky v případě smrti implantované buňky je společné pro
všechny exogenní značky. Příkladem jsou karbocyaniny, například DiI, jež se váží na lipidové
buněčné membrány. Dalším fluorescenčním lipofilním chromoforem vážícím se na buněčné
membrány je PKH26.
Příkladem jaderných exogenních značek je bisbenzimid (Hoechst 33342). Váže se na DNA,
barví tedy pouze buněčné jádro. Dalším příkladem jaderných značek je radioaktivně značený
thymidin (3H-thymidin), či bromdeoxyuridin (BrdU). Tyto značky jsou stabilně zabudovány do
DNA dělících se buněk. 3H-thymidin lze detekovat radiograficky, BrdU pomocí specifických
protilátek. Pokud se takto označené buňky dělí i po implantaci příjemci, značky se rychle ředí,
avšak pokud se dělit přestanou, značky zůstanou dlouhodobě stabilní a nemohou být přeneseny do
jader nedělících se buněk příjemce. Mohou však být přeneseny na makrofágy, ovšem v nich jsou
lokalizovány v cytoplazmatických váčcích a lze je tedy morfologicky rozeznat od původní
implantované buňky.
Detekce geneticky upravených štěpů
Tento způsob detekce je založen na transfekci buněk DNA sekvencemi kódujícími protein,
který bude po implantaci buňkami produkován a umožní tak jejich detekci v příjemci. Vhodnými
sekvencemi jsou stejně jako v případě izolace buněk z transgenních zvířat geny pro lacZ či GFP.
Použití GFP skýtá mnoho výhod: zelený fluorescenční protein představuje relativně malou cDNA,
jež může být snadno zabudována do virových vektorů, může být detekován v živých i fixovaných
buňkách, a navíc GFP-označené buňky mohou být sortovány pomocí přístroje FACS. Buňky je
možno transfekovat s použitím virových vektorů či bez nich.
Nejefektivnějším způsobem transfekce kmenových buněk je použití vektorů odvozených od
lentivirů. Lentivirové vektory jsou na rozdíl od jiných (adenovirové, retrovirové) schopny
transfekovat i nedělící se buňky, aniž by ovlivnily jejich diferenciační potenciál.
Použití virových vektorů je velice účinné, je však spojeno s vysokými nároky na dodržování
bezpečnostních předpisů. Moderní alternativní metody zahrnují transfekci buněk pomocí
molekulárních vibrací indukovaných elektrickým polem, tento způsob je velice účinný a
nepoškozuje buňky. Klasický elektroporační přístup byl nedávno optimalizován pro stabilní vysoce
22
účinnou transfekci mesenchymálních kmenových buněk, a nukleofekci, tedy dopravu DNA přímo
do jádra. Dalším přístupem je transfekce založená na lipozómech, či použití savčích umělých
chromozómů. Všechny tyto vysoce moderní metody neovlivňují viabilitu buněk ani jejich
diferenciační potenciál.
In vivo
Klinické využití terapeutického potenciálu kmenových a progenitorových buněk závisí na
lepším porozumění osudu implantovaných buněk in vivo, především jejich přežívání, migraci,
integraci a diferenciaci v organismu příjemce, bez ohledu na to zda jsou buňky používány jako
nosiče růstových faktorů, k mobilizaci endogenních kmenových buněk či zda zajišťují náhradu
buněk. Sledování implantovaných buněk in vivo zobrazováním magnetickou rezonancí je vhodným
nástrojem pro dynamické studie monitorující rychlost a specifitu migrace buněk v poškozené tkáni,
dobu přežití buněk v lézi či optimální časové okno, během kterého je implantace buněk nejúčinnější
pro dosažení terapeutického účinku.
Detekce buněk magnetickou rezonancí je možná pokud jsou implantované buňky označeny
kontrastními látkami a odlišeny tak od okolních buněk. V současné době se jako kontrastní látky
nejvíce používají tzv. SPIO částice na bázi superparamagnetických oxidů železa, jež byly poprvé
použity pro buněčné značení krátce po použití chalátů gadolinia. Superparamagnetické částice
výrazně zkracují T2 a T2* relaxační časy vody ve svém okolí a tím mění kontrast MR obrazů.
Takto označené buňky jsou pak velice dobře detekovatelné na zobrazeních T2 nebo T2* vážených
sekvencí jako hypointensní body. Navíc obsahují železo, které je biokompatibilní a může být v
buňkách odbouráváno pomocí normálních biochemických drah metabolismu železa, modifikace
jejich povrchu umožňuje navázání funkčních skupin a ligandů, a jsou i snadno detekovatelné
pomocí elektronové mikroskopie.
Pro použití SPIO částic pro značení buněk je klíčová stabilizace povrchu pro zabránění
agregace, navíc jejich vnější vrstva musí indukovat buněčnou fagocytózu pro snadný vstup do
cytoplazmy. Nejčastěji se povrch potahuje dextranem. Mezi dextranem potažené SPIO částice
(DCSPIO) patří komerční produkty Feridex®, Endorem®, Combidex® a Sinerem®. Záporně nabitý
povrch indukuje fagocytózu třikrát silněji než běžně používaný kladně nabitý dextran, ale takové
částice zatím nejsou komerčně schválené pro klinické užití. K usnadněnému vstupu nanočástic do
buňky se používá kombinace DCSPIO a běžných transfekčních činidel, jako je SuperfectTM, poly-Llysin (PLL), Lipofectamin, FugeneTM či protamin sulfát. Tato činidla ovšem mohou být pro buňky
toxická. Částce se mohou do buněk dostávat i specificky, přes navázanou monoklonální protilátku
23
namířenou proti určitému buněčnému receptoru. Ovšem stejně jako u ostatních exogenních značek,
i v případě SPIO částic dochází k ředění značky během buněčného dělení, a navíc může dojít
k přenosu značky na fagocytické buňky hostitele v případě smrti implantované buňky.
Výsledky prvních studií používajících SPIO částice pro označení a následnou in vivo detekci
buněk po transplantaci do potkaního mozku jsou známy od roku 1992 (Norman a spol. 1992).
Mnoho dalších studií ukazujících migraci magneticky značených implantovaných buněk v potkaním
mozku či míše rychle následovalo (souhrn viz Syková a Jendelová 2007). Implantované buňky
značené SPIO částicemi byly sledovány pomocí magnetické rezonance také na modelech infarktu
myokardu, implantace Langerhansových ostrůvků či svalové degenerace.
Cílem základního výzkumu kmenových buněk i preklinických studií je plně
charakterizovat
kmenové
buňky,
objasnit
mechanismy,
které
jim
umožňují
expanzi
v nediferencovaném stavu, pochopit jednotlivé diferenciační dráhy in vitro a jejich funkci pak
otestovat v experimentálních modelech různých onemocnění. V buněčných bankách bude třeba
vypěstovat vhodné buňky v dostatečném množství, ideálně „na míru“ pro jednotlivý typ
onemocnění. Navíc je třeba ověřit ideální „dopravu“ buněk na místo účinku. Kmenové i
progenitorové buňky mohou být implantovány lokálně i systémově, či nakultivované na
trojrozměrných biodegradabilních polymerních nosičích, které umožní překlenout rozsáhlejší
defekty ve tkáních. V neposlední řadě je třeba vysledovat vhodné terapeutické okno pro každý typ
onemocnění, tj. dobu, ve které bude mít podání buněk účinek. Každé onemocnění či poranění se
mění v čase a produkce různých cykokinů, chemokinů i růstových faktorů, stejně tak jako proces
jizvení, může významně ovlivnit migraci i homing implantovaných buněk a tím i úspěšnost léčby.
Využití kmenových buněk v klinické medicíně nebude možné, pokud nebudeme mít jistotu, že
podané buňky nebudou v těle příjemce tvořit nádory. Implantované buňky by mohly být pod
kontrolou in vivo užítím značení a zobrazovacích metod. Přes všechna úskalí, která stojí buněčné
terapii v cestě, klinických studií typu I a II, využívajících hlavně somatické kmenové buňky
přibývá a lze předpokládat, že v budoucnosti dojde k využití buněčné terapie k léčbě pacientů s
onemocněními, která dnes neumíme vyléčit.
24
1. The International Stem Cell Initiative*, Adewumi O, Aflatoonian B, Ahrlund-Richter L, a
spol. Characterization of human embryonic stem cell lines by the International Stem Cell
Initiative. Nat Biotechnol. 2007 Jun 17; [Epub ahead of print]
2. Altman J, Das GD. Autoradiographic and histological evidence of postnatal hippocampal
neurogenesis in rats. J Comp Neurol 1965;124:319-335.
3. Altman J. Autoradiographic and histological studies of postnatal neurogenesis. IV. Cell
proliferation and migration in the anterior forebrain, with special reference to persisting
neurogenesis in the olfactory bulb. J Comp neurol 1969;137:433-457.
4. Andrews PW, Benvenisty N, McKay R, Pera MF, Rossant J, Semb H, Stachy GN. The
International Stem Cell Initiative: toward benchmarks for human embryonic stem cell
research. Nature Biotech 2005;23:795 – 797.
5. Becker AJ, McCullough EA, Till JE. Cytological demonstration of the clonal nature of
spleen colonies derived from transplanted mouse marrow cells. Nature 1963;197:452-454.
6. Bjornson CR, Rietze RL, Reynolds BA, Magli MC, Vescovi AL. Turning brain into
blood: a hematopoietic fate adopted by neural stem cells in vivo. Science 1999;283:534537.
7. Doetsch F. The glial identity of neural stem cells. Nat Neurosci 2003;6:1127-1134.
8. Evans MJ, Kaufman MH. Establishment in culture of pluripotential cells from mouse
embryos. Nature 1981;292:154-156.
9. Kirschstein R , Skirboll LR. Stem cells: Scientific progress and future research directions.
NIH 2001;1-42.
10. Martin GR. Isolation of a pluripotent cell line from early mouse embryos cultured in
medium conditioned by teratocarcinoma stem cells. Proc Natl Acad Sci USA
1981;78:7634-7636.
11. Shamblott MJ, Axelman J, Wang S, Bugg EM, Littlefield JW, Donovan PJ, Blumenthal
PD, Huggins GR, Gearhart JD. Derivation of pluripotent stem cells from cultured human
primordial germ cells. Proc Natl Acad Sci USA 1998;95:13726-13731.
12. Syková E, Homola A, Mazanec R, Lachmann H, Langkramer-Konradová S, Kobylka P,
Pádr R, Neuwirth J, Komrska V, Vávra V, Štulík J, Bojar M. Autologous bone marrow
transplantation in patients with subacute and chronic spinal cord injury. Cell
Transplantation 2006 15:675-687
13. Syková E. a Jendelová P. Migration, fate and in vivo imaging of adult stem cells in the
CNS. Cell Death Differ. 2007 Jul;14(7):1336-1342.
25
14. Thomson JA, Itskovitz-Eldor J, Shapiro SS, Waknitz MA, Swiergiel JJ, Marshall VS,
Jones JM. Embryonic stem cell lines derived from human blastocysts. Science
1998;282:1145-1147.
15. Till JE, McCullough EA. A direct measurement of the radiation sensitivity of normal
mouse bone marrow cells. Radiat Res 1961;14:213-222.
26