11. Genové terapie - farmaceuticka

Genové terapie
11. Genové terapie
11.1. Úvod
Genové terapie jsou léčebné postupy nebo postupy zmírňující projevy genetické poruchy pomocí
nukleových kyselin nebo geneticky modifikovaných buněk pacienta s terapeutickým přínosem
pro pacienta. Jestliže můžeme říci, že symptomatická léčba geneticky podmíněných chorob neléčí
podstatu, ačkoli je známa příčina onemocnění, pak genové terapie léčí právě příčinu onemocnění.
Symptomatická léčba je založena na následujících procedurách








Dodání chybějícího enzymu u enzymopatií
Dodání jiných chybějících látek (substrátů, proteinů, aj.)
Vyvarování se substrátu, který nelze správně metabolizovat (speciální diety)
Chirurgické zákroky
Farmakologické ovlivnění narušených fyziologických procesů
Farmakologické zlepšení kvality života
Jiné ovlivnění fyziologických procesů nebo kvality života (přístroje, pomůcky)
Transplantace chorobou poškozeného orgánu
Genové terapie jsou naproti tomu založeny na jakékoliv proceduře, která je určena k léčení
nemoci genetickou modifikací buněk pacienta. Při genových terapiích se do buněk transferují geny
nebo jejich části, případě jen oligonukleotidy.
Základní strategií genové exprese je kompenzace abnormální genové exprese. Medicína
založená na genové terapii může rekonstituovat postižený orgán buďto
 zajištěním regenerace specifické tkáně prostřednictvím exprese embryonálních genů, které
navodí růst buněk a jejich vývoj příslušným směrem, nebo
 terapií pomocí buněk a to buď získaných od vhodného zdravého dárce, nebo geneticky
modifikovaných kmenových buněk
Počátky genových terapií sahají do roku 1990, kdy byly provedeny první klinické studie při léčbě
deficience adenosin-deaminázy (adenosine deaminase deficiency, ADA). V této studii byly
transformovány lymfocyty periferní krve ADA deficientních pacientů retrovirovým vektorem, který
exprimoval funkční adenosin-deaminázu. Ještě 10 let po tomto zásahu lymfocyty jednoho pacienta
exprimovaly funkční enzym, což znamená, že genová terapie může mít dlouhodobý účinek. U jiného
pacienta se vyvinula imunitní reakce k transportnímu systému, a proto se u něj terapeutický gen
neexprimoval, což už tehdy poukázalo na problémy, které jsou s genovou terapií spojeny.
1
Genové terapie
Otázka, kterou je nutno si při použití genových terapií zodpovědět zní: Kdy můžeme genovou
terapii použít? Toto rozhodnutí je závislé na následujících faktorech:
1) Musíme znát přesnou příčinu genetické choroby, tzn. gen, jeho umístění, povahu produktu a
hlavně mechanizmus patologického účinku genového produktu
2) Musíme mít správně vytvořenou strategii genové terapie
3) Součástí léčebné strategie je i volba vhodného vektoru a vytipování cílových buněk genové
terapie
4) S ohledem na jistou kontroverznost této terapie je třeba provádět genovou terapii, pouze
pokud je úspěšně otestována a schválena k použití
Kromě toho musíme vyřešit řadu dalších otázek spojených s výběrem vektoru, cílových buněk a
techniky provedení, např.
 Je cílem genové terapie opravit dědičnou genetickou poruchu nebo vnést do recipientních
buněk novou funkci? Pokud půjde např. o léčbu cystické fibrózy, pak se jedná o nápravu defektního
stavu. Naopak v případě léčby AIDS se můžeme pokusit o transformaci buněk genem s novou funkcí;
např. genem, jehož produkt bude interferovat s replikací viru HIV.
 Má být terapeutický gen fungovat po dlouhou nebo krátkou dobu? Většinou půjde
o požadavek, aby gen fungoval dlouhou dobu, ale v případě léčby nádorového bujení nebo požadavku
vnesení DNA vakcíny může jít i o účinek relativně krátkodobý.
 U většiny aplikací je zapotřebí kontinuální exprese terapeutického genu. V některých
případech je zapotřebí expresi regulovat, například při léčbě diabetes mellitus.
 Dalším důležitým faktorem je výběr cílových buněk. V některých situacích je to dáno
charakterem postižení; například v případě familiární hypercholesterolémie je zapotřebí vnést
do hepatocytů gen kódující receptor pro LDL. V jiných případech, například při saturaci nízkých hladin
srážecích faktorů (což vede k hemofilii), je třeba zacílit specifickou populaci buněk; v tomto
konkrétním případě je třeba vnést gen produkující uvedené srážecí faktory do takových buněk, které
je budou schopny přivést do místa účinku, tedy do krevního řečiště. V případě faktoru IX se povedla
transformace myoblastů, které tento srážecí faktor secernovaly v krvi. Výběr cílových buněk je také
závislý na dostupných technikách manipulace s konkrétními buňkami.
Vlastní provedení genové terapie zahrnuje
1) Vytvoření genetické informace (metodami rekombinantní DNA), která je určená pro transport
do buněk
2) Vytipování buněk, do kterých bude upravená genetická informace vnesena
3) Výběr vhodného vektoru
4) Po provedení genové terapie je třeba pacientův stav pečlivě monitorovat a všímat si jak
zlepšování zdravotního stavu, tak i nástupu případných komplikací
2
Genové terapie
S ohledem na historii zavádění technik genové terapie můžeme hovořit o genových terapiích
klasického typu, jejichž cílem je dopravit geny do vhodných cílových buněk tak, aby bylo dosaženo
optimální exprese vnesených genů a zajistit produkci látky, která chybí, případně aktivovat buňky
imunitního systému ve snaze pomoci odstranit nemocné buňky. Klasickými genovými terapiemi tak
můžeme zajistit především optimální expresi vloženého genu, umožnit tvorbu chybějícího produktu
nebo přímo likvidovat nemocné buňky či aktivovat imunitní systém.
Genové terapie „neklasické“ jsou novější a jsou zaměřeny především na inhibici exprese genů
asociovaných s patogenezí, případně na korekce genetického defektu a obnovení normální genové
exprese. Toho lze dosáhnout například inhibicí exprese patogenního genu, restaurací normálních
hladin exprese nebo využitím interferujících RNAi.
Základní schéma genové terapie je uvedeno na obr. 11.1:
Obr. 11.1: Obecné schéma genové terapie
jádro
vektor
a)
transformovaný
gen
DNA cílové
buňky
b)
intracelulární efekt
c)
extracelulární efekt
Genetický materiál s genem, který má být transformován, je nejprve vložen do vektoru, kterým
je gen přenesen do cílové buňky. Proces genové terapie pak zahrnuje následující kroky:
a) Vstup terapeutické nukleové kyseliny spojené s vektorem do cytoplasmy cílové buňky.
b) Přenos nukleové kyseliny do jádra recipientní buňky. To je často, ne však vždy, doprovázeno
integrací cizího genetického materiálu do buněčné DNA.
c) Cizorodý gen, ať už integrovaný nebo ne, je exprimován. Důsledkem je produkce proteinu.
Regulační elementy na transformované nukleové kyselině mohou být nastaveny tak, že zajišťují
expresi proteinu do buňky nebo jeho expresi z buňky ven.
3
Genové terapie
Na obr. 11.2 je uveden příklad genové terapie kmenových buněk. Důsledkem vnesení genu
do kmenové buňky bude jeho přítomnost ve všech z nich diferencovaných buněk, v našem případě
lymfocytů, makrofágů i ostatních krevních buněk.
Obr. 11.2: Obecné schéma důsledku genové terapie kmenových buněk
nový gen
implantace
transfekce
kmenová
buňka
diferenciace
B-lymfocyt
makrofág
eozinofil
T-lymfocyt
bazofil
neutrofil
Podle typu buněk, můžeme genové terapie dělit na
 Genovou terapii somatických buněk
 Genovou terapii zárodečných buněk
Genová terapie somatických buněk se používá k manipulaci s takovými buňkami, které lze z těla
jedince s defektem odebrat, transformovat opravenou kopií genu a vrátit zpět do těla. V současnosti
je nejvíce rozvinuta technika vnášení genů do kmenových buněk kostní dřeně. Jako vektory slouží viry,
a to nejčastěji retroviry nebo adenoviry. Technika je nadějná pro léčbu dědičných onemocnění
krevních buněk.
Genová terapie zárodečných buněk se provádí tak, že se do oplodněného vajíčka dodá kopie
správné verze příslušného genu a vajíčko se implantuje zpět do těla matky. Implantace se provádí
mikroinjekcí DNA do vajíčka. Opravená verze genu je v tomto případě zpravidla přítomna ve všech
buňkách nového jedince. Tato technika je teoreticky použitelná k léčení jakékoli dědičné choroby.
S ohledem na etické problémy s potenciální terapií zárodečných mutací je tento typ genových
terapií v současné době ve většině zemí světa zakázán!
4
Genové terapie
11.2. Genová terapie ex vivo a in vivo
Prvním krokem při genové terapii je rozpoznání genu, jehož funkce chybí nebo je nedostatečná a
v důsledku čehož dochází k rozvoji patologického procesu. Takový gen je pak nutno klonovat v jeho
„zdravé“, funkční kopii. Kromě toho je ale naprosto nezbytné dobře porozumět procesům, které se
odehrávají v nemocném organismu a poznat strukturu genového produktu, aby bylo možné správně
zacílit terapeutický produkt do správných buněk nebo tkání. Volbu terapeutické struktury ovlivní také
rozhodnutí, jak zajistit dlouhodobý účinek terapie, případně její časovou souhru s dalšími biologickými
procesy. Cílová buňka, tkáň nebo orgán musí být pro terapeutický gen nebo jeho produkt snadno
dostupný, musí být definován měřitelný cílový stav, kterého má být genovou terapií dosaženo.
Podle způsobu provedení rozlišujeme
 Genové terapie in vivo, kdy dochází k transferu DNA přímo do buněk pacienta
 Genové terapie ex vivo, kdy se vlastní úprava DNA a transformace pacientových buněk
provádí mimo organismus a modifikované buňky se poté vracejí do organismu
Genová terapie in vivo je přímá injekce vektoru s terapeutickým genem do krevního oběhu.
Tento postup je ale charakteristický nízkou hladinou exprese terapeutického proteinu; úspěch
nezaručí ani extrémní dávky rekombinantní DNA vpravované do krve. Kromě toho může vést
distribuce DNA i do oblastí, které nejsou cílovými místy terapie, k rozvoji řady nežádoucích vedlejších
účinků. Rovněž je nesnadné dopravit tímto způsobem terapeutickou DNA do takových tkání, které
mají omezený dosah ke krevnímu řečišti, např. svalů nebo nádorů. K dalším použitelným postupům
patří injekce intratumorální, intraperitoneální, subkutánní, intraarteriální a intramuskulární. Jsou to
metody hrubé, invazivní a v některých případech vyžadující specializované chirurgické dovednosti.
Při genové terapii in vivo musí být vektory upraveny tak, aby byly schopny rozpoznat cílové buňky,
do kterých vnesou terapeutický gen. Na povrch vektorů jsou např. umísťovány protilátky, které se
specificky váží na povrchové antigeny cílových buněk. Jinou možností je administrace hormonu
na povrch vektoru, který pak vyhledá v těle pacienta ty buňky, které nesou receptor pro tento
hormon. Proveditelnost této techniky byla demonstrována na příkladu retrovirových vektorů, které
na svém povrchu nesou EPO.
Modifikací genové terapie in vivo je terapie in situ, která znamená přímou injekci vektoru do těla
jedince přímo nebo do blízkosti buněk, které mají být „opraveny“. Technika byla použita pro přímou
injekci vektorů do nádorů nebo pro administraci vektorů ve formě aerosolu do buněk epitelu
respiračního traktu při léčbě cystické fibrózy. Aplikace in situ je méně komplikovaná než in vivo, ale
není vždy proveditelná. To v případě, kdy cílové místo terapeutického zásahu není lokalizováno
v jednom místě, např. u krevních buněk.
Genová terapie ex vivo vyžaduje izolaci a kultivaci cílových buněk. Transfer terapeutických genů
do těchto buněk se provádí pomocí vektorů na bázi plasmidů nebo virů. Cílové buňky jsou nejprve
odebrány z těla jedince, pak jsou inkubovány s DNA funkčního genu naklonovaného do vektoru.
Po začlenění tohoto genu do genomu cílové buňky je tato pomnožena a vnesena zpět do těla jedince.
Po provedeném zásahu se studuje charakter transgenních buněk, měří se exprese terapeutických
5
Genové terapie
genů a teprve ověřené zdravé buňky jsou přeneseny zpět do těla pacienta. Aby byl proces úspěšný,
musí být cílové buňky relativně snadné buňky z těla pacienta odebírat a naopak zase vnášet.
V počátcích genových terapií se tohoto způsobu používalo jen u těch buněk, které bylo možno
z pacienta snadno izolovat, upravit a poté vrátit (např. buňky kostní dřeně nebo hepatocyty). Dnes
dokážeme buňky vnášet lokální nebo systémovou injekcí, přenášet v enkapsulované podobě nebo
jako tkáně tvořené buňkami osídlujícími nějaké podpůrné lešení. Genová terapie ex vivo je pro
pacienta zpravidla bezpečnější, protože nevzniká imunita proti vektorové DNA a rovněž množství
toxických látek spojených s transformací je sníženo. V současnosti se jedná o nejčastější způsob
provádění genové terapie. Byl aplikován na řadu různých typů buněk, včetně krevních a kmenových
buněk, buněk epitelu, svalů a hepatocytů.
Základní rozdíl mezi in vivo a ex vivo genovou terapií je znázorněn na obr. 11.3.
Obr. 11.3: Genová terapie in vivo a ex vivo
Ex vivo
In vivo
klonovaný gen X
+
selekce a
namnožení
buněk X+
transfer
genu
odběr
buněk
buňky
pacienta X-
některé
buňky X+
buňky X+
návrat geneticky
modifikovaných buněk
pacientovi
6
Genové terapie
11.3. Cíle genové terapie
Genovými terapiemi je možno léčit následující typy onemocnění
 Vrozené poruchy spojené s genetickou deficiencí genového produktu nebo nepřiměřenou
expresí genu
 Nádorová onemocnění, především poruchy biologické funkce protoonkogenů nebo
nádorových supresorových, apoptotických a reparačních genů
 Nemoci imunitního systému jako jsou alergie, záněty a autoimunní choroby
 Infekční nemoci například způsobené virovým nebo bakteriálním patogenem
V současné době probíhají klinické zkoušky genových terapií u následujících onemocnění. Tento
výčet ale není úplný, informace o dalších aplikacích se objevují v odborném i populárním tisku
prakticky denně.












různé typy zhoubných nádorů
cystická fibróza
familiární hypercholesterolémie
Gaucherova choroba
deficiente fosforylázy purininových nukleozidů
revmatoidní artritida
AIDS
hemofilie
vážná kombinovaná imunodeficience (SCID)
deficience α1 antitrypsinu
CGD
onemocnění periferních cév
Ve světě probíhá již více než 1 500 různých klinických testů genové terapie. Většinu z nich tvoří
aplikace protinádorové; monogenní onemocnění, kterými genové terapie začínaly, tvoří jen asi 8%
testů. Přehled o typech genových terapií prováděných v roce 2006 podává Tabulka 11. 1. Převážná
většina klinických testů se provádí v USA, Velké Británii a Německu. Geografická distribuce genových
terapií v roce 2006 je uvedena v Tabulce 11. 2.
7
Genové terapie
Tabulka 11. 1: Genové terapie ve fázi klinických testů v roce 2006.
Klinické testy na bázi genových terapií
Onemocnění
Počet
Procento
Nádorová onemocnění
842
67,0
Kardiovaskulární onemocnění
113
9,0
Monogenní nemoci
104
8,6
Infekční nemoci
81
6,4
Označování genů
50
4,2
Zdraví dobrovolníci
21
1,7
Ostatní
47
3,7
Tabulka 11. 2: Genové terapie ve fázi klinických testů v jednotlivých zemích, stav v roce 2006.
Klinické testy na bázi genových terapií
Onemocnění
Počet
Procento
USA
815
65,0
Velká Británie
150
12,0
Německo
74
5,9
Švýcarsko
42
3,3
Francie
20
1,6
Belgie
19
1,5
Austrálie
17
1,3
Japonsko
16
1,3
Kanada
17
1,3
Itálie
15
1,2
Ostatní státy (včetně ČR)
75
5,9
8
Genové terapie
11.3.1. Genová terapie nádorů
Strategií genové terapie nádorů je zničit nádorové buňky a současně chránit buňky zdravé. Toho
lze dosáhnout




korekcí genetických mutací spojených s nádorovým fenotypem
stimulací protinádorové odpovědi T lymfocytů (imunoterapie)
onkolytickými viry, které se replikují v nádorových buňkách a ničí je (viroterapie)
využitím systémů enzymatických pro-léčiv, které ničí nádorové buňky po konverzi netoxické
sloučeniny na cytotoxický metabolit (tato technologie je popsána v kapitole 12.5. Úloha
metabolismu léčiv v genové terapii)
Oprava genetických mutací nachází uplatnění jen v malém počtu případů, protože vývoj nádoru
je komplexní proces. Tato strategie se uplatňuje v klinických zkouškách, ve kterých se sleduje
nadprodukce tumor supresorových genů p53, MDA-7 a ARF. Byl to právě gen p53, pro který byl v roce
2003 schválen první klinicky celosvětově použitelný lék na bázi genové terapie. Jedná se o přípravek
Gencidin, který byl schválen v Číně. Gencidin je rekombinantní retrovirus, který exprimuje standardní
formu p53 a používá se k léčbě pacientů, u kterých tento gen nefunguje správně. Genová terapie
nádorů se jevila jako velmi slibná, nicméně se ukázalo, že transport terapeutického genu hluboko
do nádorové tkáně je proces velmi komplikovaný. Terapie je málo účinná především tam, kde je
zapotřebí kontinuální exprese transgenu. Přesto byl přístup využívající oprav genů úspěšně aplikován
na nádory prostaty, plic a pankreatu.
Imunoterapie spočívající v indukci imunitního systému, jeho zacílení na nádorové buňky a jejich
destrukci nebyla příliš úspěšná; exprese je zpravidla nízká, cytotoxické lymfocyty málo avidní
k příslušnému antigenu asociovanému s nádorem a nádorové buňky ze své podstaty unikají
pozornosti imunitního systému. Klinicky byly testovány systémy exprimující buďto pro-zánětlivé
cytokiny (interleukiny IL-2, IL-4 a IL-12), ko-stimulační molekuly (HLA-B7 a antigen LFA-3 – lymphocyte
function-associated antigen 3) nebo tumor-specifické antigeny jako je mucin-1 a lidský karcinoembryonální antigen. Vektor exprimující transgen, který má stimulovat imunitní odpověď a zajistit
dlouhodobou imunitní ochranu, je často injikován přímo do nádoru (obr. 11.4 A). Indukci exprese
jednoho nebo více imunostimulačních genů je možné také zajistit ex vivo v izolovaných nádorových
buňkách nebo nádorové buněčné linii (obr. 11.4 B). Testují se také možnosti kultivace T lymfocytů
nebo buněk kostní dřeně pacienta v přítomnosti nádorového antigenu nebo po jejich transformaci
stimulačním genem; tím může dojít k vytvoření klonu buněk, který rozpozná a odstraní nádor poté, co
jsou tyto buňky zaneseny do organismu (obr. 11.4 C).
Onkolytické viry navozují smrt nádorových buněk replikací, expresí cytotoxických proteinů a lyzí;
ostatní buňky těla nechávají nepovšimnuté. K této tzv. viroterapii se nejčastěji používají upravené viry
vakcínie, herpes simplex virus I, reovirus, virus Newcastelské nemoci, poliovirus a adenovirus, protože
přirozeně atakují nádory a snadno se s nimi manipuluje. Problémem této strategie je skutečnost, že
mnoho lidí má přirozené protilátky proti těmto virům, a proto jsou z těla rychle odstraněny, ještě než
se začnou úspěšně replikovat. Protože se jedná o lidské viry, je třeba při práci s nimi dodržovat zvláště
přísné bezpečnostní předpisy, což výrazně prodražuje klinické testování. Přesto bylo i touto technikou
dosaženo určitých úspěchů.
9
Genové terapie
Obr. 11.4: Imunoterapie nádoru založená na genové expresi. A) Přímá injekce vektoru, který
exprimuje imunostimulační molekuly nebo nádorově-specifické antigeny přímo v nádoru. Po uvolnění
transgenního produktu jsou aktivovány makrofágy, dendritické buňky, zabíječské buňky a T lymfocyty,
které pak putují k nádoru, kde destruují buňky exprimující transgen. B) Buňky izolované z pacienta
nebo nádorových buněčných linií jsou kultivovány s vektorem, zabity ozářením a vloženy zpět
do pacienta. Buněčné epitopy pobídnou imunitní systém k útoku a odstranění nádorových buněk.
C) T lymfocyty a buňky kostní dřeně pacienta jsou kultivovány s vektorem nebo nádorovými antigeny.
Zpět do těla pacienta jsou pak přemístěny živé buňky, které napadají nádorové buňky a odstraňují je.
A)
vektory
nádorová
tkáň
aktivace imunitního
systému
destrukce nádoru
aktivace imunitního
systému
destrukce nádoru
B)
vektory
nádorové
buňky
zabité
buňky
C)
vektory
aktivace imunitního
systému
imunitní
buňky
živé
buňky
10
destrukce nádoru
Genové terapie
11.3.2. Genová terapie kardiovaskulárních onemocnění
Většina klinických testů kardiovaskulárních onemocnění se zabývá léčbou koronární a periferiální
ischemie. Efektivním nástrojem léčby ischemií se zdá být nadprodukce pro-angiogenních faktorů jako
je vaskulární endoteliální růstový faktor (VEGF), růstový faktor fibroblastů (FGF) a růstový faktor
hepatocytů (HGF). Četnost selhání bypasů koronárních arterií v důsledku restenózy a aterosklerózy lze
snížit nadprodukcí endoteliální a indukovatelné syntázy oxidu dusnatého. Nadprodukce genů, které
snižují hladinu cholesterolu (apoproteiny ApoA-1 a ApoE, receptory pro LDL a VLDL) byla vyzkoušena
při léčbě onemocnění metabolismu lipidů, např. familiární homozygotické hypercholesterolémie nebo
deficience ApoE. Žádný z uvedených přístupů ale neměl výrazně lepší efekt v terapii oproti stávajícím
metodám léčby.
11.3.3. Genová terapie monogenních chorob
Od genové terapie se očekává, že bude schopna nahradit nefunkční kopii genu funkční variantou
a tak zajistit permanentní zvrat patologických procesů. Doposud se to však v žádných klinických
zkouškách nepodařilo. Více než třetina probíhajících klinických zkoušek je zaměřena na léčbu cystické
fibrózy. K dalším onemocněním, která se testují pro léčbu genovou terapií, patří Hurlerův syndrom,
Hunterův syndrom, Huntingtonova chorea, Gaucherova choroba, Wiskott-Aldrichův syndrom, vážná
kombinovaná imunodeficience (SCID), Duchenneova muskulární dystrofie, chronická granulomatóza,
familiární hypocholesterolémie, deficience adherence leukocytů, hemofilie A a B, mukopolysacharidóza typu IV, deficience lipoprotein-lipázy, aj.
Jediná skupina onemocnění, kde bylo dosaženo významného terapeutického úspěchu, jsou vážné
kombinované imunodeficience. Příčiny dosavadních neúspěchů spočívají v následujících faktorech:
 nemáme k dispozici vhodnou techniku pro přenos terapeutických genů
 mezi hostitelským organismem a vektorem terapeutického genu dochází k nepříznivým
interakcím
 biologie a patologie monogenních onemocnění a cílových orgánů je složitá
 nejsou k dispozici nástroje umožňující relevantní měření klinické účinnosti genové terapie
Největší výzvou při léčbě monogenních onemocnění zůstává indukce genové exprese, která by
byla dostačující pro korekci klinického fenotypu, zároveň by nevedla k neuváženým reakcím
imunitního systému a minimalizovala by rizika inzerční mutageneze integrativních vektorů
v transformované buňce.
11.3.4. Genová terapie infekčních chorob
V současnosti probíhá již více než 100 klinických testů genových terapií infekčních chorob. Velký
zájem se soustředí na léčbu AIDS. Většinou se jedná o ex vivo transfer genetického materiálu
do autologních T lymfocytů prostřednictvím murine lukemia viru nebo lentiviru. Úspěšné byly
laboratorní pokusy, při kterých byly nadprodukovány proteiny, které interferují s replikací viru HIV.
K témuž cíli se zaměřují postupy využívající ribozymy, RNA klamné cíle a antimediátorové
oligonukleotidy, které se vážou k repetitivním sekvencím genomu HIV.
11
Genové terapie
11.3.5. První genová terapie schválená v EU
Apolipogene tiparvovec (Glybera®)
Jedná se o první aplikaci genové terapie schválenou Evropskou lékovou agenturou k použití
ve všech zemích EU. Ke schválení došlo v červenci 2012, Evropskou komisí to bylo schváleno
v listopadu 2012.
Přípravek určený k léčbě familiárního deficitu lipoprotein lipázy (lipoprotein lipase deficiency,
LPLD). Toto onemocnění se projevuje zvýšenými hladinami chilomikronů, částic (komplexů proteinlipid) přenášejících v krvi některé tuky. Je způsobeno defekty v genu pro lipoprotein lipázu (LPL). LPL
zpracovává tuky z potravy. Pokud tohoto enzymu není v těle dost, nebo když nepracuje správně,
dochází k dramatickému zvýšení hladin tuku v krvi.
Glybera vnáší do těla nemocného funkční kopii genu pro LPL, ze kterého vzniká normálně
fungující LPL. Gen je přenášen vektorem na bázi adeno-asociovaného viru serotypu 1, který se váže na
receptory svalových buněk. V normálním stavu jsou to právě svalové buňky, které jsou pro distribuci
LPL nejdůležitější. Glybera je aplikována jednorázovou sérií intramuskulárních injekcí do nohy – viz
obr. 11.5.
Jak uvádí příbalová informace: „Vektor sestává z proteinového obalu odvozeného ze sérotypu 1
adeno-asociovaného viru (AAV1), cytomegalovirového (CMV) promotoru, posttranskripčního
regulačního elementu viru hepatitidy sviště lesního a obrácených terminálních repetic odvozených z
AAV2. Alipogen tiparvovek je produkován za použití hmyzích buněk a technologie rekombinantních
bakulovirů.“
Obr. 11.5: Aplikace přípravku Glybera
FFA = free fatty acids
Jednorázová
aplikace do
svalu nohy
Přípravek Glybera byl testován ve třech klinických studiích v Holandsku a Kanadě na celkem 27
pacientech. Z dat získaných v těchto studiích vyplývá, že se koncentrace tuků v krvi po podání Glybery
snižuje po 3-12 týdnech po aplikaci. Už jediná dávka má dlouhotrvající účinky. Účinkem LDL
exprimované z transgenu dochází k odstraňování chylomikronů.
LPLD je dědičné onemocnění, proto je u suspektních jedinců vhodná diagnostika. Protože
12
Genové terapie
existuje přes 100 různých polymorfismů v genu LPL, které vedou k LPLD, je vhodné celou kódující
oblast genu sekvenovat. Protože se jedná o recesívní znak, jsou nemocní pouze jedinci se dvěma
nefunkčními alelami. Jedinci s jednou nefunkční alelou jsou přenašeči. Rodiče a děti jedince s LPLD
jsou zpravidla přenašeči, kteří nemají syndromy onemocnění. Sourozenci jedince s LPLD mají 25%
„šanci“, že taky onemocní a 50% „šanci“, že jsou přenašeči. S 25% pravděpodobností ale nesou
nepoškozené varianty genu.
Více si můžete přečíst na
http://www.uniqure.com/products/glybera/
Příbalová informace SÚKL
11.4. Vektory pro genovou terapii
Funkční kopie genu, která má nahradit gen v organismu nefungující, musí být naklonována
do vektoru, který je schopen jen transformovat do recipientních buněk bezpečným způsobem.
Vektory pro genovou terapii jsou obecně koloidní suspenze sestávající ze složitých molekul
s průměrným hydrodynamickým průměrem od 40 do 1 000 nm. Takové částice jsou ochotně
přijímány orgány retikuloendoteliálního systému – játry, slezinou, kostní dření a nadledvinkami. Jsou
také snadno opsonizovány, tedy obalovány sérovými proteiny jako je komplement a pohlcovány
makrofágy v játrech a slezině; to v řádu minut po intravenózní aplikaci.
Po aplikaci vektoru musí tento ještě překonat určité bariéry v epitelu. Buňky, které jsou umístěny
na povrchu orgánu, jsou často pokryty tlustou mukózní vrstvou, která fyzicky brání kontaktu
s buněčnými cíli a obsahuje enzymy, které dokáží vektor rychle degradovat. Buňky pod touto vrstvou
jsou často obrvené a vytvářejí pevné spoje, které brání vstupu čehokoli dovnitř. Mnoho vektorů nese
na svém povrchu negativní náboj a to taky znesnadňuje interakce s negativně nabitými buňkami.
Genový transfer může být usnadněn tím, že je transportní systém pokryt pozitivně nabitými ionty, že
použijeme mukolytické reagencie a hypotonické roztoky, které rozbijí pevné spoje a zesílí penetraci
buněk vektorem.
Poté, co vektor vstoupí do buňky, musí uniknout prostředí endozómů a lysozómů. Některé
vektory jsou injikovány s komponentami, které v kyselém endosomálním prostředí nabobtnají a
ochrání tak genetický materiál před významnou změnou pH, před rozštěpením enzymy a chrání
vektor před předčasným uvolněním. Jiné postupy využívají inaktivovaných virů nebo složek bakterií,
živých virů a toxinů. Jakmile je vektor v cytoplasmě, musí se dostat do jádra, kde využije endogenní
transkripční aparát k expresi terapeutického transgenu.
11.4.1. Obecné vlastnosti transgenů
Typický transgen sestává z tzv. expresní kazety, což je cDNA ohraničená na 5´-konci promotorem
a na 3´-konci terminátorem transkripce a polyadenylačním signálem (obr. 11.6 A). Transgen je
začleněn do plasmidové DNA nebo rekombinantního viru (přehled v Tabulce č. 11.3 a 11.4). Geny,
které souvisí s patogenitou virových vektorů, jsou odstraněny a nahrazeny expresní kazetou;
13
Genové terapie
reprodukce viru je omezena. U mnoha vektorů zbývají z celého genomu jen dlouhé koncové repetice
(LTR), oblasti na 5´- a 3´- konci, které kontrolují transkripci RNA virů nebo převrácené koncové
repetice (ITR) řídící replikaci a stabilizaci genomu DNA virů. Sbalovací signál (Ψ) zodpovědný
za sbalování viru je rovněž intaktní. Geny pro replikaci poskytuje buněčná linie (obr. 11.6 B). Způsob,
jakým budou produkovány rekombinantní viriony je dán biologií výchozího viru. Produkční buňky
musí být připraveny tak, aby se sekvence genů zprostředkujících replikaci nebo patogenezi viru
nepřekrývaly a nedoplňovaly se sekvencemi genů na virovém genomu. Mohlo by totiž docházet
k rekombinaci a vytváření virů, které by byly schopny samostatné replikace. Proto je vhodné testovat
nově připravenou várku virionů na přítomnost tzv. replikačně kompetentních virů (RCV), které jsou
samozřejmě nežádoucí příměsí. Poté, co jsou viry izolovány z buněčné linie, jsou dále purifikovány,
kvantifikovány anebo titrovány. Původně se virové částice separovaly od buněčných proteinů
ultracentrifugací v hustotním gradientu. Tato metoda je ale pracná, nesnadno se provádí ve velkých
objemech a snižuje efektivní titr virionů, protože dochází k rozbíjení jejich struktur. V současnosti je
vhodnější použít k purifikaci chromatografie, která umožňuje získat velká množství vysoce
koncentrovaných virových částic, které jsou vhodné k humánní terapii.
Tabulka 11. 3: Vektory, které se využívají v klinických zkouškách genové terapie.
Klinické zkoušky genové terapie (stav v roce 2006)
Vektor
Počet
Podíl (%)
Adenovirus
322
26
Retrovirus
293
23
Plasmidová DNA
230
18
Lipofekce
99
7,9
Virus vakcínie
88
7,0
Poxvirus
85
6,8
Adeno-asociovaný virus
46
3,7
Herpes simplex virus
43
3,4
RNA transfer
16
1,3
Další způsoby
31
2,4
Neznámá metoda
36
2,9
14
Genové terapie
Obr. 11.6: Obecné schéma transgenu a jeho přenosu
A) Expresní kazeta transgenu. Je ohraničena promotorem a polyadenylačním signálem. Může být
klonována přímo do plasmidu a přímo použita pro transfer genu nebo může být klonována
do plasmidu, který obsahuje virové elementy, které zajišťují produkci rekombinantních virů
v produkční/sbalovací buněčné linii.
B) Produkční/sbalovací buněčná linie. Buněčná linie je vytvořena stabilní transfekcí buněk plasmidem,
který obsahuje geny nezbytné pro replikaci viru. Konstrukt pak často obsahuje pouze tzv. sbalovací
signál Ψ a expresní kazetu ohraničenou virovými sekvencemi ITR/LTR. Geny odpovědné za virovou
infekci jsou z konstruktu odstraněny. Po transfekci je v buňce produkováno velké množství genomů
vektoru. Ty jsou exportovány z jádra do cytoplasmy, kde interagují s virovými proteiny vyrobenými
buňkou. Sbalovací signál zahájí sbalování virových částic. Kompletní virové částice se pak uvolní
z buňky v závislosti na mechanismu, který je řízen vektorem.
A
intron
polyadenylační místo
3´
5´
promotor
transgen
B
ITR/LTR
Ψ
ITR/LTR
Kompletní virový genom
replikace
patogenita
replikační konstrukt
Ψ
konstrukt s vektorem
produkční/sbalovací buňka
jádro
virové genomy
virové kapsidy
15
Genové terapie
I vzhledem k široké plejádě onemocnění, která jsou potenciálně léčitelná genovou terapií,
neexistuje jediný univerzální vektor použitelný pro všechny potenciální aplikace. Při výběru vhodného
vektoru je třeba sledovat následující parametry
 velikost transgenních kazet
 efektivitu přenosu do terapeutického cíle (schopnost infikovat dělící se nebo nedělící se
buňky, vhodné receptory na cílových buňkách)
 délku trvání genové exprese (dlouhodobá versus přechodná, vektory integrativní versus
neintegrativní)
 má-li jít o indukovatelnou nebo konstitutivní expresi
 maximální úroveň imunitní odpovědi vyvolané vektorem a úroveň toxicity akceptovatelné
hostitelem
 požadavky na purifikaci vektoru a dostupnost produkce ve velkých objemech
 způsob a jednoduchost podávání terapie
 schopnost vektoru chránit genetický materiál
 robustnost a stabilita vektorového systému
Tabulka 11. 4: Charakteristické vlastnosti vektorů pro genové terapie.
Genetický
materiál
Velikost
genomu
Klonovací
kapacita
Forma
genomu
Průměr (Nm)
Tropismus
Exprese
virových
proteinů
Retrovirus
Lentivirus
Adenovirus
Adeno-asociovaný
virus
RNA
RNA
dsDNA
ssDNA
7-11 kb
8 kb
36 kb
4,7 kb
8 kb
8 kb
7 kb*, 35kb**
< 5 kb
Integrovaná
Integrovaná
Episomální
Stabilní/episomální
100-145
80-120
80-100
20-22
Jen dělící se buňky
Široký, dělící se i
nedělící se
buňky
Široký, dělící se i
nedělící se buňky
Široký, nevhodný
pro
hematopoetické
buňky
NE
ANO/NE
ANO*/NE**
NE
16
Genové terapie
Tabulka 11. 4: pokračování
Adenovirus
Adeno-asociovaný
virus
Pomalá,
konstitutivní
Rychlá, přechodná
Průměrná,
konstitutivní,
přechodná
Jednoduchá
Složitá
Jednoduchá*/složitá**
Průměrná
Ex vivo
Ex vivo
Ex/in vivo
Ex/in vivo
< 108
< 107
< 1014
< 1013
Nepravděpodobná
Pravděpodobná,
po vstupu
ANO
ANO
Imunogennost
Nízká
Nízká
Vysoká
Průměrná
Potenciální
patogenicita
Nízká
Vysoká
Nízká
Žádná
Bezpečnost
Inzerční
mutageneze
Inzerční
mutageneze
Potenciálně zánětlivá
reakce
Krátkodobě ne,
dlouhodobě není
známo
Slabá
Slabá
Značná
Vysoká
Retrovirus
Lentivirus
Exprese
transgenu
Pomalá,
konstitutivní
Produkce ve
velkých
objemech
Metoda
transformace
Typický
výtěžek
(virus/ml)
Pre-existující
imunita
Fyzikální
stabilita
* první generace, replikačně deficientní viry
** adenoviry závislé na pomocném viru
17
Genové terapie
11.4.2. Vektory na bázi virů
Virové vektory jsou v současnosti nejefektivnější transportní systémy, protože přirozenou cestou
vstupují do buňky a překonávají buněčnou obranu. Používají se v přibližně 70% klinických testů
(Tab. 11. 3). Nejvíce se používají vektory na bázi retrovirů, adenovirů a adeno-asociovaného viru
(Tab. 11. 4).
Výroba virového vektoru pro účely genové terapie obecně sestává z těchto kroků:
1) Propagace viru ve vhodné buněčné linii savčích buněk
2) Izolace viru, jeho zkoncentrování a purifikace
3) Charakterizace výsledného virového izolátu
Na obr. 11.7 je uvedena příprava vektoru na bázi adenoviru, u dalších typů vektorů je schéma
podobné.
Obr. 11.7: Velkoobjemová příprava vektoru na bázi adenoviru
Příprava buněčné kultury
(bioreaktor pro živočišné buňky)
infekce
vektorem
Propagace vektoru
Lyze buněk
(homogenizace)
Sběr infikovaných buněk
(filtrace/centrifugace)
Čištění virionů
(filtrace)
Štěpení DNA
Koncentrace
(ultrafiltrace)
Inaktivace potenciálních
kontaminujících virů
(rozpouštědlo/detergent)
Chromatografická purifikace
(iontoměničová chromatografie a
gelová filtrace)
Charakterizace a plnění
18
Genové terapie
K propagaci virionů v živočišných buňkách se používají bioreaktory pro kultivaci živočišných
buněk o objemu do 100 litrů. Purifikované vektory lze uchovávat v chladu nebo zmrazené po dobu
minimálně 2 roky.
Vektory na bázi retrovirů
Retroviry mají průměr 80-100 nm a obsahují dvě kopie jednořetězcové ssRNA o délce přibližně
7-11 kb. Uvnitř kapsidu jsou tyto ssRNA asociovány se zpětnou transkriptázou, integrázou a
proteázou. Vše je obaleno proteiny nukleokapsidu a uzavřeno v kapsidové matrix, která tvoří jádro
retrovirových částic. Vnější obal tvoří membrána pocházející z hostitelské buňky; sestává z proteinů a
lipidů. Uvnitř této lipidové dvojvrstvy jsou trans-membránové a povrchové glykolipidy (obr. 11.8).
Obr. 11.8: Struktura retroviru
proteáza
ssRNA
zpětná transkriptáza
integráza
nukleokapsid
transmembránové
glykolipidy
kapsidová matrix
povrchové
glykolipidy
membrána
Retroviry můžeme v zásadě rozdělit podle stupně složitosti na dvě skupiny. Jednoduché retroviry
obsahují tři hlavní geny – gag (kóduje protein virového kapsidu), pol (kóduje zpětnou transkriptázu) a
env (kóduje virový obalový protein). Složité retroviry, jako je např. lentivirus obsahují geny
pro replikaci a překonání imunitního systému hostitelské buňky (obr. 11.9). Na obou koncích
retrovirového genomu jsou LTR sekvence. Součástí LTR sekvence je promotor, zesilovač transkripce a
sekvence zodpovědné za integraci DNA do hostitelského genomu. Bezprostředně u 5´ LTR sekvence
leží sekvence ψ, která je zodpovědná za sbalování RNA do virového kapsidu.
Po vstupu do hostitelské buňky je virová RNA přepsána do dsDNA a v této podobě je integrována
do genomu hostitelské buňky. Ve formě proviru pak retroviry setrvávají i několik let. Nicméně i geny
retroviru integrované do hostitelského genomu jsou transkribovány a jejich translací vznikají proteiny,
které tvoří nové kapsidy. Do kapsidů jsou v cytoplasmě integrovány replikované molekuly virové
ssRNA. Nově vzniklé virové částice vystupují přes membránu (a přitom se jí obalí) do vnějšího
prostředí a napadají další buňky.
19
Genové terapie
Obr. 11.9: Struktura genomu retrovirů a genomu retrovirového vektoru
Genom jednoduchého retroviru
gag
LTR
pol
ψ
LTR
env
Genom složitého retroviru
nef
gag
env
LTR
pol
vpu
ψ
vpr
LTR
vif
tat
rev
Genom retrovirového vektoru
terapeutický gen
LTR
ψ
LTR
Retroviry mají řadu vlastností, pro které jsou vhodné k uskutečnění přenosu terapeutických genů
(Tab. 11. 4). Jejich klonovací kapacita je kolem 8 kbp. Při konstrukci vektorů na bázi retrovirů jsou
nahrazovány endogenní virové geny zodpovědné za normální replikaci viru za exogenní terapeutické
geny (Obr. 11.9). Tato náhrada způsobí, že se výsledný vektor nemůže replikovat. Zralé virové částice
jsou produkovány v tzv. „sbalovacích buňkách“ (producing/packing cells). Tyto rekombinantní buňky
obsahují strukturní geny gag, pol a env, a proto v nich mohou vznikat kompletní virové částice, které
nesou terapeutický gen, ale nejsou schopny se replikovat.
Retrovirové vektory jsou různým způsobem upravovány. Některé nesou gen gag, což vede
k produkci defektních částic, kterých ale vzniká mnohem více než standardních virionů. Jinou
modifikací je vnesení silných promotorů před terapeutický gen. Většina retrovirových vektorů je
založena na viru MoMuLV (Moloney murine leukaemia virus).
Exprese terapeutického genu, který byl přenesen retroviry, jsou stabilní a dlouhodobé. Je to dáno
tím, že se retroviry integrují do hostitelského genomu. Retrovirové vektory je možné podrobit procesu
tzv. „pseudotypizace“, což je situace, kdy jsou povrchové glykoproteiny nahrazeny jinými
pocházejícími z nepříbuzných virů (např. viru vezikulární stomatitidy, viru Ebola) a tím je změněno
20
Genové terapie
spektrum buněk, které retrovirový vektor napadá. Někdy to taky vede ke stabilizaci retrovirových
partikulí.
Nevýhodou retrovirových vektorů je to, že nemohou transdukovat nedělící se buňky. I samotná
skutečnost, že se retrovirus integruje, ale může vést k závažným komplikacím, když se začlení
do transkripčně aktivních oblastí genomu a rozvrátí metabolismus buňky.
Retrovirové vektory se připravují v nízkém titru, asi 1x105 až 1x107 aktivních virionů/ml. Viriony
jsou nestabilní, musí se jich aplikovat objemově velká množství, což je rovněž nevýhodné. Kromě toho
jsou retroviry z těla rychle odstraňovány, kvůli tomu, že nesou na svém povrchu antigenní struktury
pro tělo cizorodých buněk (membrány hostitelských buněk, ve kterých viriony vznikly).
Vlastnosti retrovirů, které ovlivňují jejich použití jako vektorů pro genové terapie, lze shrnout
do následujícího přehledu
 retroviry jako skupina jsou podrobně prostudovány a jejich biochemie a molekulární biologie
je podrobně popsána
 většina retrovirů integruje svoji provirovou DNA jen do aktivně se replikujících buněk
 vektory transdukují hostitelské buňky s až 100% účinností
 geny integrované DNA jsou dlouhodobě exprimovány ve vysokých hladinách
 provirová DNA se integruje do chromozómů hostitelských buněk nahodile
 retroviry jsou „promiskuitní“, infikují široké spektrum typů buněk
 provirová DNA je přenášena do dceřiných buněk kompletní
 lze snadno produkovat replikačně-deficientní retrovirové částice o vysokém titru
 na řadě retrovirových vektorů byly provedeny studie týkající se bezpečnosti jejich použití
Za rozhodující vlastnosti retrovirů, které je činí vhodným materiálem pro přípravu vektorů, je
možné považovat především dobrou znalost jejich biochemie a molekulární biologie, 100% účinnost
transdukce a skutečnost, že geny integrované DNA jsou dlouhodobě exprimovány ve vysokých
hladinách.
Naopak k omezujícím vlastnostem patří především
 Relativní nestálost vektorů založených na retrovirech. Znamená to, že virové částice retrovirů
lze sice snadno namnožit v hostitelských buňkách, ale tyto jsou poté výrazně poškozeny
v průběhu purifikace a zakoncentrování před vlastní klinickou aplikací.
 Retrovirové vektory infikují pouze dělící se buňky a kromě toho musí mít takové buňky
specifický receptor, jehož povaha není doposud u většiny buněčných typů známa. Z tohoto
důvodu je těžké vytvořit přesný protokol genové terapie pro tento typ vektorů; není totiž
jisté, jaké buňky budou v dané situaci infikovány.
 K fyziologickým komplikacím může docházet také po integraci a expresi exogenního genu
v jiných než cílových buňkách.
 Přenesený terapeutický gen se může v cílové buňce integrovat do víceméně jakéhokoli místa.
Tím může být například narušena funkce pro život buňky esenciálního genu, a to nevratně.
Naprosto fatální následky má integrace do tumor supresorového genu, což vede
k neoplastické transformaci nebo začlenění proviru do blízkosti protoonkogenu, čímž dojde
k jeho aktivaci a stejným důsledkům.
V posledním bodě popsané nežádoucí účinky genové terapie zprostředkované retroviry se
bohužel staly medicínskou realitou v roce 2002. Dva roky předtím byly touto technikou léčeny dvě
21
Genové terapie
děti trpící vzácnou na X vázanou vážnou kombinovanou imunodeficiencí (SCID-X1). Retrovirové
vektory s funkční kopií genu pro podjednotku receptoru cytokinu γ od zdravých dárců byly přeneseny
technikou ex vivo do buněk kostní dřeně. Celkem bylo touto technikou ošetřeno 10 pacientů, u 9
došlo k pozitivní klinické odpovědi. Došlo k rekonstituci imunitního systému a pacienti už nemuseli žít
v izolaci ve sterilním prostředí. U dvou nejmladších pacientů ale došlo po dvou letech
k nekontrolovatelné proliferaci T-lymfocytů a úmrtí. Následně bylo prokázáno, že leukémie byla
spuštěna integrací proviru do blízkosti promotoru protoonkogenu LMO2 a jeho následné aktivaci.
Tento případ vedl k zákazu další genové terapie na bázi retrovirových vektorů v některých zemích a
obecně k postupnému poklesu pre-klinických zkoušek na této technologii založených.
První klinicky využitý retrovirus byl MoMLV, který byl aplikován při léčbě ADA-ASID (ADA severe
combined immunodeficiency), imunodeficientního onemocnění spojeného s abnormálním
katabolismem purinů, který brání expanzi lymfocytů. MoMULV byl upraven tak, že exprimoval
rekombinantní ADA a byl transdukován do T lymfocytů ex vivo. I po 10 letech byly buňky funkční a
nebyly pozorovány žádné vážné vedlejší účinky této terapie.
Lentiviry jsou pomalu transformující retroviry a patří k nim i virus HIV. Mohou infikovat i nedělící
se buňky jako jsou neurony, hepatocyty nebo makrofágy. Jsou vhodné i k transdukci
hematopoetických zárodečných buněk. Ačkoli se mohou integrovat do genomu hostitelských buněk,
jejich místa inzerce jsou více konzervativní, než je tomu u ostatních retrovirů. Proto je u lentivirů nižší
riziko inzerční mutageneze. Jsou ale bohužel schopny rekombinace a mohou tedy vytvářet replikačně
kompetentní viriony. Delece v oblasti 3´ LTR zabraňuje transkripci sbalovacího signálu a to snižuje
schopnost viru vytvořit funkční viriony – takto upravené vektory jsou tedy velmi bezpečné.
Do roku 2003 nebyly s lentiviry provedeny žádné genové terapie. Nyní se nejvíce využívají k léčbě
HIV u pozitivních pacientů. Lentivirus je transdukován do autologních mononukleárů periferní krve
ex vivo. Efektivita transdukce je ale nízká, proto je nutné připravovat virové vektory o vysokém titru.
Replikačně deficientní retroviry jsou propagovány v geneticky upravených sbalovacích buňkách
vytvořených transfekcí plasmidu, který nese geny gag a pol. Tyto buňky jsou transformovány druhým
plasmidem, který obsahuje virové LTR sekvence, sbalovací sekvence a transgenní kazetu. Při strategii
tzv. „pseudotypizace“ nejsou geny env pro obalové proteiny exprimovány ve sbalovacích buňkách.
Využívá se sekvencí povrchových proteinů nepříbuzných virů, které jsou klonovány do samostatného
plasmidu, který zase nemá geny gag a pol. V buňkách transformovaných takovým plasmidem dochází
k produkci různých vektorů s odlišnými tkáňovými specificitami. Linie sbalovacích buněk jsou
odvozeny buďto z myších fibroblastů linie NIH-3T3 nebo ledvinových buněk 293T lidského embrya.
Použití jiné než lidské buněčné linie vede k aktivaci imunitního systému proti buněčným
komponentám zabudovaným ve vnějším obalu viru. Proto se hledají další lidské buněčné linie, např.
AM12, Ψ-CRIM, PG13, aj. Za optimálních podmínek lze udržet buněčnou linii v aktivním stavu
po dobu přibližně 4 týdnů.
Rutinní produkce retrovirových vektorů probíhá v adherujících buňkách rostoucích jako
monovrstvy ve standardních lahvích nebo ve válcovitých nádobkách pro buněčné kultury. Kultivační
médium obsahující virové částice je přímo inkubováno s buňkami v podmínkách ex vivo. Množství
aktivních virionů produkovaných takovým způsobem je nízké, pro klinické zkoušky je pak zapotřebí asi
22
Genové terapie
200 až 800 ml supernatantu na pacienta. Retrovirové částice jsou nestabilní při teplotě 37°C (t 1/2 je
kolem 5 až 8 hodin). Účinnost transdukce snižují také volné buněčné glykoproteiny. Kvalita
retrovirových preparátů se ale zlepšuje, když se používá kontinuální kultivace s pravidelným odběrem
supernatantu, čímž se snižuje množství toxických látek v růstovém médiu. K odstranění buněčných
zbytků se používá centrifugace nebo mikrofiltrace. Zbytky solí, séra a nízkomolekulárních
kontaminant, které se při centrifugaci nebo mikrofiltraci dostanou do virové frakce, lze odstranit
iontoměničovou nebo afinitní chromatografií nebo gelovou filtrací.
Retrovirové preparáty se skladují při -80°C ve formě supernatantů. Protože jsou virové částice
fragilní, musí být zvýšená pozornost věnována složení skladovacího pufru a vůbec skladovacím
podmínkám. Je rovněž třeba zajistit stabilitu virionů ve všech fázích purifikačního procesu. Na stabilitu
virionů mají vliv nejen teplota, pH a koncentrace solí, ale taky typ sbalovacích buněk, obsah
cholesterolu ve vnějším obalu viru a proteiny vybrané pro pseudotypizaci. Málo je známo o vlivu
aditiv na stabilitu virových částic.
Vektory na bázi adenovirů
Adenoviry jsou relativně velké viry bez vnějšího obalu. Kapsid tvoří ikosaedr. Jejich genetický
materiál je tvořen dvouřetězcovou lineární DNA o velikosti přibližně 35 kb. Genom má transkripční
jednotky pro časně a pozdně přepisované geny, což odpovídá kinetice virové infekce. Transkripční
jednotky pro časně exprimované geny nesou označení E1A, E1B, E2, E3 a E4, transkripční jednotky pro
pozdně exprimované geny se značí Iva2, IX, VA1 a VAII. Geny v transkripční jednotce E1A aktivují další
časně přepisované transkripční jednotky, které iniciují přechod napadené buňky do S fáze buněčného
cyklu, což je fáze vhodná pro replikaci viru. Proteiny z genů transkripční jednotky E1B brání apoptóze.
Geny transkripční jednotky E2A kódují DNA polymerázu, preterminální proteiny a proteiny vázající se
na ssDNA, komponenty nezbytné pro replikaci viru. Transkripční jednotka E3 je zodpovědná za to, že
virus unikne odpovědi imunitního systému, produkty transkripční jednotky E4 ovlivňují buněčný
cyklus a transformaci buňky. Geny pozdních transkripčních jednotek jsou přepisovány jako jeden
dlouhý transkript, který je upraven do pěti molekul mRNA (L1 až L5), které kódují strukturní proteiny
kapsidu.
Vektory na bázi adenovirů mají pozměněnou jen malou část DNA. U prvních adenovirů to byla
oblast E1, dnes expresní kazeta nahrazuje oblast E3. Virová DNA vstupuje až do jádra hostitelské
buňky, ale neintegruje se do jejího genomu. Infekce těmito viry způsobuje u člověka přinejhorším
mírné klinické symptomy.
Adenovirové částice mají rozměr přibližně 70 až 90 nm (obr. 11.10). Proteinový kapsid sestává
z 252 podjednotek, 240 z nich je trimerický tzv. hexon protein. Na každém ze 12 vrcholů kapsidu se
nachází 5 kopií tzv. penton proteinu, ve kterém je ukotven vláknitý protein. Tento vláknitý protein je
asymetrický, sestává z tenkého proteinu, na jehož vrcholku je globulární hlavice. Uvnitř kapsidu jsou
další proteiny, které se vážou k penton proteinu. Terminální proteiny se připojují ke koncům molekul
dsDNA, slouží jako primery pro replikaci a zprostředkují připojení virového genomu k proteinové
matrix.
Infekce adenovirem začíná vazbou domény na zmíněné hlavici vláknitého proteinu k příslušnému
buněčnému receptoru (obr. 11.11). Adenovirus se může vázat taky k doméně α2 na molekule hlavního
histokompatibilního komplexu (MHC I) nebo k heparan sulfát glykózaminoglykanu (HS GAG). Po tomto
primárním kontaktu dochází k interakci motivu Arg-Gly-Asp pentonové báze k integrinovým
23
Genové terapie
receptorům αVβ3 a αVβ5. Připojením integrinů je aktivována série signalizačních buněčných procesů
spojených s virovou infekcí, která vede k internalizaci adenovirových částic, viriony se vyhnou
endosómům a putují k buněčnému jádru. Adenoviriony vstoupí do jádra do 30 minut po iniciálním
kontaktu s buňkou. Asi po jedné hodině po vazbě virionů k receptorům se objeví časná mRNA a virové
proteiny. Replikace vidové DNA a sbalování virových částic v jádře začíná 8 hodin po infekci a
kulminuje ve 30. až 40. hodině po infekci uvolněním asi 104 až 105 zralých virových částic; buňka
lyzuje.
Obr. 11.10: Struktura adenoviru. Virus sestává z dsDNA obalené ikosaedrickým proteinovým
kapsidem.
terminální protein
s hexonem asociovaný protein
hexon
protein vnitřní části kapsidu
penton
virová DNA
vláknitý protein
s pentonem asociovaný protein
Adenoviry mají několik vlastností, které je předurčují pro genové terapie (Tab. 11. 4). Biologii virů
dobře rozumíme, a proto dokážeme relativně snadno zkonstruovat adenovirové vektory, které lze
připravit do vysokých titrů až 1013 virionů/ml. Exprese transgenu z takových vektorů je rychlá a
robustní a je možno ji ještě zesílit silnými heterologními promotory. Adenoviry jsou stabilní a dokáží
přežít i ve vysoce stringentních podmínkách provázejících purifikaci; jsou stabilní i při dlouhodobém
skladování. Adenoviry infikují široké spektrum buněk, dělících se i nedělících se. Adenoviry se
neintegrují do hostitelského genomu. To sice snižuje riziko inzerční mutageneze, ale na druhé straně
představuje nevýhodu, protože exprese terapeutického genu je jen přechodná a takovou genovou
terapií nelze dosáhnout dlouhodobé korekce genetického defektu.
24
Genové terapie
Stručný přehled výhod a nevýhod vektorů na bázi adenovirů je uveden zde:
Výhody
Nevýhody
Adenoviry mohou přenášet geny i do buněk,
Adenoviry jsou pro člověka vysoce imunogenní
které se nedělí
Snadno se množí do vysokých titrů
Stálost exprese transformovaného
variabilní a zpravidla přechodná
genu
je
Obvykle dochází k vysokým hladinám exprese Infekce permisívních buněk divokým typem
transformovaných genů
adenoviru vede většinou k lyzi buněk
Jedná se o relativně stabilní viry
Adenoviry jsou vůči infikovaným typům buněk
široce selektivní
Je to především nestabilita vektorů na bázi adenovirů daná skutečností, že se geny neintegrují
do genomu hostitelských buněk; a to omezuje použití této terapie na ty případy, kdy stačí jen
krátkodobá exprese terapeutického genu. To lze zdánlivě překonat opakovanými dávkami virů, ovšem
v takových případech dochází k silné imunologické reakci vůči těmto pro člověka vysoce imunogenním
virům. Preklinické testování tohoto typu genové terapie vedlo v roce 1999 k úmrtí, které bylo
vyvoláno vážnou a neočekávanou reakcí na zánět způsobený adenovirovým vektorem.
Protože lze do genomu adenoviru začlenit i velké transgenní kazety, byly zkonstruovány hybridní
vektory adenovirus-adeno-asociovaný virus, a ty jsou schopny místně specifické integrace
do chromozómu a exprimují transgen dlouhodobě.
Stinnou stránkou použití rekombinantních adenovirů je to, že vyvolávají silnou imunitní odpověď.
Odpověď hostitele probíhá ve třech fázích. První fáze nastává hodinu po systémové administraci, trvá
4 dny a je charakterizována trombocytopenií a uvolňováním jaterních enzymů; tato reakce je závislá
na virové dávce. Druhá fáze nastává 5-7 dnů po administraci, projevuje se odstraněním
transdukujících buněk aktivovanými lymfocyty. V cílové tkáni a lokalizovaným zánětem. Během třetí
fáze se vyvíjí humorální imunita T lymfocytů typu CD4+; neutralizující protilátky odstraňují viriony
z cirkulace a brání elektivní readministraci. Úspěšná readministrace adenovirových vektorů je obtížná,
protože 50 až 90% světové populace má vysoké hladiny protilátek proti adenovirům sérotypu 5.
Význam imunitní odpovědi vyvolané adenovirovými vektory byl potvrzen i klinicky v roce 2002.
Součástí léčby s cílem opravit deficienci ornitin karbamylázy byla administrace adenovirových vektorů
s terapeutickým genem přímo do jater. To mělo ale za následek středně silnou imunitní odpověď a
následné rychlé odstranění vektoru a transgenu z těla pacientů. Jeden z pacientů, u kterých byla
použita největší dávka virionů (6x1011 částic/kg) prošel syndromem vážné imunitní reakce, který byl
spojen s multiorgánovým selháním a sepsí; zemřel záhy po aplikaci genové terapie. Bylo to první
úmrtí spojené s genovou terapií. Podobně tomu bylo s léčbou hemofílie A po intravaskulárním
přenosu adenovirového vektoru. Genová terapie zde byla zastavena, protože u pacientů se objevila
přechodná trombocytopenie a došlo k aktivaci transaminázy. Výsledkem těchto neúspěšných aplikací
bylo poznání, že relativně bezpečný způsob aplikace rekombinantních adenovirů je administrace
přímo do cílových orgánů v dávkách do 1x1011 virionů.
25
Genové terapie
Obr. 11.11: Infekční cyklus adenoviru. Infekce začíná připojením vláknitých proteinů k buněčným
receptorům. Vazba kapsidového pentonu k integrinu na receptorech zahájí proces pohlcení virových
částic. Jakmile virus vstoupí do endozómu, sníží se ve vezikulu pH, dojde k degradaci kapsidových
proteinů a uvolnění virové DNA do cytoplasmy. Virová DNA je transportována do jádra, kde je
přepsána do RNA. Mediátorová RNA pak putuje do cytoplasmy, kde je použita k produkci
terapeutického proteinu. Tento proces je dokončen během 2 hodin.
2. Pohlcení
virionu
3. Lyze kapsidu
αν receptor
4. Transkripce
Ad receptor
1. Připojení viru
k receptoru
jádro
5. Translace
protein
Odvrátit imunitní reakci organismu na adenovirus se zkoušelo současnou aplikací
imunosupresívních látek jako je cyklofosfamid, FK506 a cyklosporin A. Tímto způsobem byla
prodloužena exprese terapeutického transgenu, ale zastavit produkci neutralizujících protilátek se
nepodařilo. Druhou možností, která se zkouší, je změna genomu viru. Vektory druhé generace
s atenuovanými oblastmi E1-E4 vyvolávají slabší zánětlivou reakci (obr. 11.12). Toxicita a exprese
transgenů byla zlepšena u adenovirových vektorů závislých na pomocném viru (helper dependent
vectors). Takové adenoviry mají odstraněné všechny časné a pozdní geny. Avšak i takové vektory
vyvolávají neutralizační imunitní reakci.
Preexistující imunitu k adenovirům sérotypu 5 se genové terapie snaží obejít použitím adenovirů
takových sérotypů, které se u lidí nevyskytují vůbec nebo jen velmi zřídka. Takovými jsou adenoviry
sérotypu 35 nebo 11. Protože jsou protilátky primárně zaměřeny vůči hexonu, je možné využít také
hybridních virionů, které tento protein nemají. Jenže jejich produkce je velmi obtížná. Zkouší se také
obalit virové částice polyethylenglykolem nebo je zabudovat do jiných polymerů.
26
Genové terapie
Obr. 11.12: Struktura genomů a složení rekombinantních adenovirových genomů. Šipkami je
znázorněna orientace transkripce a translace časných (E, early) a pozdních (L, late) genů u divoké
formy viru. Úseky virového genomu, které byly nahrazeny nevirovými sekvencemi, jsou znázorněny
tenkou linkou. ITR = koncová převrácená repetice (inverted terminal repeat), Ψ = sbalovací signál.
L1-L5
Ψ
divoký virus
E2
E4
ITR
Transgenní kazeta
Ψ
vektor první
generace
E3
E1
ITR
kapacita ~ 8,2 kbp ̴
ITR
+/- E3
E1
ITR
Ψ
vektor druhé
generace
ITR
E1
+/- E2
+/- E3
+/- E4 ITR
kapacita ~ 14 kbp ̴
Ψ
vektor druhé
generace
ITR
kapacita ~ 36 kbp ̴
ITR
Využití adenovirů v medicíně započalo už v 50. letech 20. století. V USA byly využity adenoviry
sérotypů 4 a 7 jako orální vakcína proti akutnímu respiračnímu onemocnění u vojáků. Tato vakcína se
používala bez pozorovatelných vedlejších účinků po dobu 25 let, a proto byly zkušenosti s ní použity
pro vývoj vektorů pro genové terapie. V současnosti jsou to nejpoužívanější vektory (Tab. 11. 3), které
se používají především v klinických testech pro léčbu kardiovaskulárních chorob. V roce 2003 byl
použit Gencidin (SiBiono, Shenzen, Čína), replikačně deficientní adenovirus sérotypu 5 k expresi
transgenu p53, k léčbě nádoru a byl schválen k celosvětovému použití pro léčbu kožního
spinocelulárního karcinomu (head and neck squamous cell carcinoma). Zkouší se spolu s dalším
doposud neschváleným lékem Advexinem k léčbě gliomu, jednoho typu plicního nádoru a nádoru
vaječníků; léčba se provádí samostatně nebo v kombinaci s chemoterapií a ozařováním.
Protože adenoviry vyvolávají rychlou a silnou imunitní odpověď, používají se také jako adjuvans
pro vyvolání silné imunitní odpovědi proti exprimovanému antigenu při vakcinaci. Úspěšné bylo
27
Genové terapie
využití takových virů, které kódovaly produkty takových patogenů jako je antrax, mor, hepatitida B,
vzteklina a SARS.
Produkce a příprava rekombinantních adenovirů. Tradičně se rekombinantní adenoviry vyrábějí
transfekcí lidských buněčných linií, které komplementují E1, tedy linie 293, 911, PER.C6 nebo N52.E6.
Transfekce se provádí
a) Binárním plasmidem, který obsahuje levou ITR a sbalovací doménu za kterou následuje
transgenní kazeta v oblasti E1, a
b) Templátem, který sestává z většiny genomu adenoviru včetně pravé ITR a úseku DNA
vloženého do binárního plasmidu
Na sekvencích, které obsahují obě molekuly, dochází k homologní rekombinaci a vzniká
adenovirus, který má kompletně deletovanou oblast E1. K rekombinaci se používají savčí buňky,
alternativně pro zjednodušení a urychlení procesu kvasinky nebo bakterie. Poté, co se vytvoří
rekombinantní genom a dojde k replikaci a sbalení, lze adenovirové vektory snadno produkovat
ve velkých množstvích v E1-komplementujících buňkách.
K produkci helper-dependentních virů, které obsahují pouze virové ITR a sbalovací signál je
zapotřebí systému, který exprimuje celý genom adenoviru tzv. in trans. Takový systém ale ještě nebyl
vytvořen. Nejefektivnější systém pro produkci helper-dependentních virů využívá první generace
vektorů s deletovanou oblastí E1; takové vektory zajistí amplifikaci DNA i její sbalení do virových
kapsidů. Buňky linie 293 exprimují rekombinázu Cre a pomocný virus, který má sbalovací elementy
ohraničeny místy loxP. Po infekci těchto buněk dojde k efektivnímu odstranění sbalovacích elementů
tím, že dojde k rekombinaci těchto sekvencí loxP rekombinázou Cre. Na obr. 11.13 je znázorněna
jedna z metod výroby helper-dependentních adenovirů.
Poté, co jsou adenoviry vyprodukovány, purifikují se centrifugací v gradientu CsCl. Ještě lepší
metodou je iontoměničová chromatografie. Virus lze izolovat v koncentracích 0,5 až 5,0 x 1012
virionů/ml aniontové pryskyřice tvořící náplň chromatografické kolony. Toto množství odpovídá 0,14
až 1,4 mg viru/ml pryskyřice. Další purifikaci virových částic lze provést gelovou filtrací nebo afinitní
chromatografií na imobilizovaných kovových částicích.
Pro účely dlouhodobého skladování virionů je vhodné je vysušit a skladovat při -20°C až -80°C.
Když použijeme neiontových detergentů (např. polysorbát 80), které brání absorpci virionů na
skleněné povrchy, kryoprotektantů (např. sacharóza), které brání rozpadu virových částic během
opakovaného zmrazování a rozmrazování a inhibitorů volných radikálů (např. histidin, etanol nebo
EDTA), můžeme skladovat viriony až po dobu 2 let při teplotě 4°C. Stabilitu virionů ovlivňují i další
faktory a to koncentrace a čistota virionů, dvojmocné ionty a pH.
Jednou z největších výzev produktů na bázi adenovirů představuje v současné době to, že
nemáme sofistikované techniky pro jejich konečnou charakterizaci. Nejméně stabilní součástí virionů
je pentonová báze a protein IIIa. Proto se výzkum zaměřuje na studium kinetiky rozpadu právě těchto
struktur a hledání způsobů, jak je stabilizovat.
28
Genové terapie
Obr. 11.13: Metoda produkce helper-dependentních adenovirů (HD-Ad). Genom HD-Ad je uvolněn
z plasmidu restrikční endonukleázou. Genom linearizovaného viru je transfekcí vnesen do buněk
exprimujících jak rekombinázu Cre, tak i protein E1 adenoviru. Replikace konstruktu na bázi HD-Ad
vyžaduje také současnou infekci buněk pomocným („helper“) adenovirem. Sbalovací signál takového
viru je ohraničen místy loxP. Po infekci buněk obsahujících rekombinázu Cre jsou sbalovací sekvence
touto rekombinázou vystřiženy, a proto se nemohou tvořit intaktní částice pomocného viru. Proteiny
kapsidu se ale vytvářejí ze sekvencí pomocného viru; mohou tak vznikat intaktní částice HD-Ad.
Pomocný virus je propagován jen v takových buňkách, které exprimují adenovirový E1 (zajišťuje
replikaci), ale které neexprimují rekombinázu Cre, která zajišťuje sbalování virionů.
ITR
Ψ
plasmid obsahující genom HD-Ad
ohraničený restrikčními místy
loxP
Ψ
ITR
loxP
ITR
Ψ
štěpení restriktázou
pomocný virus amplifikovaný
v cre negativních buňkách
Ψ
genom HD-Ad
infekce
transfekce
rekombináza Cre
Ψ
Ψ
replikace
exprese časných genů
Ψ
Ψ
exprese pozdních genů
strukturální proteiny
helper-dependentní adenovirus
29
Genové terapie
Vektory na bázi adeno-asociovaného viru
Perspektivní variantou pro přípravu vektorů vhodných ke genovým terapiím je adeno-asociovaný
virus. První lidský adeno-asociovaný virus byl objeven v roce 1965 a to jako kontaminující složka
v adenovirových preparátech. Adeno-asociovaný virus je velmi malý neobalený parvovirus nesoucí
lineární ssDNA o velikosti 4,7 kb. Jeho genom sestává jen ze dvou otevřených čtecích rámců, rep a
cap, které kódují čtyři replikační a tři kapsidové proteiny (Obr. 11.14). Obrácené koncové repetice
na koncích genomu jsou signálními místy pro replikaci, sbalování a integraci virového genomu
do hostitelského chromozómu.
Kapsid adeno-asociovaného viru je ikosaedrický a je tvořen pouze 60 kopiemi proteinů VP1, VP2
a VP3 v poměru 1:1:8. Protein VP3 rozpoznává buněčné receptory a je zodpovědný za tkáňovou
specificitu viru. Protein VP1 obsahuje na N-konci fosfolipázovou doménu, která je nezbytná
pro virovou infekci. Úloha VP2 není doposud objasněna, není nezbytně nutný k tvorbě
životaschopných virionů. Je známo 9 různých sérotypů adeno-asociovaného viru a přes 100 variant.
Žádný nezpůsobuje onemocnění člověka. Kromě lidí se vyskytuje i u primátů. Nejlépe prostudovaný je
sérotyp 2.
Obr. 11.14: Struktura genomu adeno-asociovaného viru. Sekvence rep a cap jsou ohraničeny
obrácenými koncovými repeticemi ITR. Promotor p5 iniciuje transkripci genů, které kódují proteiny
Rep78 a Rep68. Promotor p19 řídí expresi proteinů Rep52 a Rep40. Promotor p40 pak exprimuje
proteiny virového kapsidu. Proteiny VP2 a VP3 vznikají ze stejné transkripční jednotky (stejné mRNA).
Nepřerušované čáry vyznačují molekuly mRNA, smyčky vyznačují místa sestřihu (introny).
rep
rep
Rep 78 (4,2 kb)
Vp1 (87 kDa),
2,3 kb
Rep 68 (3,9 kb)
Vp2 Vp3
Vp2, Vp3 (73,
62 kDa), 2,3 kb
Rep 52 (3,6 kb)
Rep 40 (3,3 kb)
Viriony adeno-asociovaného viru sérotypu 2 využívají jako receptory heparan sulfát
proteoglykany. Tyto receptory se vyskytují v buňkách kosterního svalstva, játrech, mozku a oční sítnici.
K internalizaci viru dochází s pomocí integrinů ανβ5, receptoru typu 1 pro růstový faktor fibroblastů
(fibroblast growth factor receptor type 1, FGF-1) a receptoru pro růstový faktor hepatocytů
(hepatocyte growth factor receptor, c-Met). Virus vstupuje do buňky endocytózou a je transportován
do jádra (obr. 11.15). V jádře musí být ssDNA převedena na dsDNA. Jako počátek replikace jsou
využity sekvence ITR. Replikace je zahájena vazbou proteinů Rep 68 a Rep 78 k ITR. Virus není
30
Genové terapie
schopen autonomní replikace a svůj životní cyklus je schopen dokončit jen v přítomnosti jiného viru,
nejčastěji adenoviru nebo taky herpesvirus nebo viru vakcínie. Tyto pomocné viry exprimují proteiny,
které se podílejí jak na replikaci, tak i transkripci a expresi genů adeno-asociovaného viru. Není-li
pomocný virus k dispozici, zůstává adeno-asociovaný virus v latentním stavu. Může se integrovat
do jedinečného lokusu na lidském chromozómu č. 19 (AAVS1) nebo přetrvávat jako stabilní
epizomální komplex. Po infekci pomocným virem započne replikace. Probuzení z latentního stavu
mohou navodit také chemické karcinogeny nebo UV světlo.
Co se exprese terapeutických genů exprimovaných z vektorů na bázi adeno-asociovaného viru
týče, od počátku „infekce“ dochází k pomalému růstu hladiny transgenu po dobu několika týdnů
od administrace až je dosaženo stabilního plató.
Obr. 11.15: Infekční cyklus adeno-asociovaného viru (AAV). Virus vstupuje do buňky po vazbě
na receptor endocytózou. Jakmile se dostane do buněčného jádra, vydá se jednou ze dvou
zaměnitelných drah. Není-li k dispozici pomocný virus, vstupuje do latentní fáze, při níž se integruje
do hostitelského genomu prostřednictvím ITR sekvencí. Je-li přítomný pomocný virus, pak je
aktivována exprese genů adeno-asociovaného viru a virový genom se uvolní z hostitelského
chromozómu. Spustí se replikace a sbalování virionů. Viriony se z buňky uvolní lyzí, kterou opět
indukuje pomocný virus. K aktivaci viru může dojít také látkami, které poškozují DNA; pomocného viru
není v tomto případě zapotřebí.
AAV
produktivní infekce
latentní infekce
lyze buňky
aktivace viru
integrace do
hostitelského
genomu
adenovirus
herpesvirus
31
Genové terapie
Vhodnost adeno-asociovaného viru pro genový transfer
Vektory na bázi adeno-asociovaného viru mohou přenášet pouze menší kusy DNA, ale dokáží
infikovat i buňky, které se nedělí. Zajišťují také dlouhotrvající genovou expresi přeneseného materiálu,
protože se jejich DNA integruje do hostitelského genomu. Nejsou patogenní a zajišťují dlouhodobou
expresi transgenu (Tab. 11. 4).
Genom adeno-asociovaného viru je kromě toho jednoduchý a snadno manipulovatelný. Virus je
odolný vůči řadě fyzikálních i chemických faktorů, proto je odolný k procesům nezbytným k purifikaci
virových částic a je dlouhodobě skladovatelný.
Rekombinantní vektory na bázi adeno-asociovaného viru nevyvolávají imunitní odpověď.
Primární odpověď hostitele se zaměřuje na tvorbu neutralizujících protilátek proti kapsidovým
proteinům. Kromě toho je přibližně 80% populace séropozitivní na protilátky proti sérotypu 2.
Buněčná a protilátková odpověď byla zaznamenána taky proti produktu transgenního genu. Odpověď
závisí na povaze transgenu, použitém promotoru, způsobu a místě administrace vektoru, dávce
vektoru a genetické predispozici hostitele. Imunitní reakci lze utlumit podáváním protilátek proti
anti-CD4 a anti-CD40 ligandům spolu s první dávkou vektoru. Používají se i jiné látky, mění se sérotyp
virového vektoru po každé dávce nebo se vytváří pseudotypované vektory.
Výše uvedenou nízkou klonovací kapacitu vektorů na bázi adeno-asociovaného viru lze částečně
nahradit použitím dvou vektorů, protože se díky sekvencím ITR mohou rekombinovat oba jejich
genomy, ovšem s nižší účinností.
V současnosti probíhají desítky klinických testů, při kterých se využívají vektory na bázi adenoasociovaného viru – Tab. 12. 3. Poprvé byl takový vektor použit k přenosu cDNA pro regulátor
transmembránové vodivosti u cystické fibrózy do respiračního epitelu v roce 1996. Těmito zkouškami
se dokázalo, že genovým transferem lze pozitivně ovlivnit funkci plic. Bezpečného a efektivního
přenosu genů do mozku prostřednictvím vektorů na bázi adeno-asociovaného viru bylo dosaženo
v klinických zkouškách léčby Canavanovy, Parkinsonovy a Alzheimerovy choroby. Zkouší se léčba
metastáz nádoru prostaty odolného vůči hormonální léčbě.
Produkce a příprava rekombinantních vektorů na bázi adeno-asociovaného viru. Vektory
tohoto typu jsou konstruovány tak, že se nahradí geny rep a cap promotorem a terapeutickým genem
a celé je to ohraničeno sekvencemi ITR. Genom rekombinantního viru je naklonován do plasmidu,
který je ko-transformován do buněk linie 293 spolu s dalším plasmidem, který obsahuje geny rep a
cap bez sekvencí ITR; to zabraňuje sbalování DNA sekvencí s těmito geny do virových kapsidů. Protože
je k replikaci viru zapotřebí pomocného viru, jsou transformované buňky ještě infikovány adenovirem
v nízké koncentraci (obr. 11.16 A). Původní purifikační protokoly využívaly k oddělení těchto dvou virů
rozdíly v jejich termostabilitě a hustotě. Adenovirus bylo možné inaktivovat umístěním preparátu
na 30 minut do lázně s teplotou 56°C; následně byly viriony separovány ultracentrifugací v hustotním
gradientu. Čistoty zásobních virových partikulí bylo zase dosaženo klonováním sekvencí E1a, E2a, E4 a
VA1 (zajišťují funkce pomocného viru) do třetího plasmidu (obr. 11.16 B). Kvůli relativně nízké
efektivitě trojnásobné transformace byly v průběhu velkoobjemové produkce selektovány buněčné
linie, které obsahovaly integrované sekvence genů rep a cap (obr. 11.16 C).
32
Genové terapie
Obr. 11.16: Obecné schéma přípravy rekombinantních vektorů na bázi adeno-asociovaného viru
A) Metoda, při které se využívá dvou plasmidů. Buňky jsou transformovány jedním plasmidem, který
obsahuje transgenní kazetu adeno-asociovaného viru ohraničenou ITR sekvencemi (cis) a druhým
plasmidem, který obsahuje sekvence rep a cap bez virových ITR (trans). Je přidán rovněž replikačně
deficientní pomocný virus, který podpoří replikaci adeno-asociovaného viru a jeho sbalování. Jakmile
buňky začnou lyzovat, jsou sklizeny. K odstranění pomocného viru je zapotřebí využít rozsáhlých
purifikačních postupů.
B) Metoda, při které se využívá tří plasmidů. Plasmidy cis a trans z předchozí strategie jsou
ko-transformovány se třetím plasmidem, který nese adenovirové pomocné sekvence. Buňky jsou
sklízeny po 48-72hodinách po transformaci. Touto metodou vznikají pouze rekombinantní viriony.
C) Metoda využívající jen jednoho plasmidu. Do buněk je vpraven jen jediný plasmid, který nese geny
rep, cap, selektovatelný znak a transgenní kazetu ohraničenou ITR sekvencemi. Transformované
buňky obsahují integrovaný plasmid a jsou množeny v kultuře se selekčním médiem. Pomocné funkce
musí být v tomto systému dodány pomocným virem. Jako v případě postupu A) je k oddělení adenoasociovaného viru od viru pomocného zapotřebí složitých purifikačních postupů.
A)
B)
cis
trans
cis
nebo
herpesvirus nebo adenovirus
lyze buňky
mechanická
lyze
nebo
33
trans
pomocný
virus
Genové terapie
C)
plasmid
rep cap
SM
ITR ITR
lyze buňky
Toxicita genů rep a cap a nutnost infekce pomocným virem jsou přetrvávající faktory, které
komplikují produkci adeno-asociovaného viru.
Purifikace virových částic je komplikována toxicitou CsCl, agregací virionů a skutečností, že
v gradientu chloridu cesného není možné kompletně viriony adeno-asociovaného viru odstranit. Tyto
problémy lze obejít použitím gradientu iodixanolu. Jinou možností je nanesení virových partikulí
na afinitní kolonu s heparinem nebo monoklonálními protilátkami proti AAV2. Nejvhodnější metodou
je použití iontoměničové chromatografie. U této metody je ale potřeba specificky nastavit hodnoty
pH pufru, koncentraci detergentu a složení média v kolonce pro každý sérotyp viru. Čistota a
infekčnost získaných virionů je srovnatelná s afinitní chromatografií a metoda trvá asi 3 hodiny.
Částice adeno-asociovaného viru jsou stabilnější než viriony jiných rekombinantních virů.
Ve fosfátovém pufru vydrží při 4°C přes 4 měsíce. Podobně je tomu při teplotě skladování při 25°C.
Přidáním kryoprotektantů, např. sorbitolu a polysorbátu 80, se životnost při 4°C prodlouží až na 1 rok.
Lyofilizovaný preparát vydrží rok i při skladování při 25°C. Podobně jako adenovirus ztrácí adenoasociovaný virus infekčnost po zamrazení na teploty -80°C nebo -20°C.
Virové partikule adeno-asociovaného viru mají tendenci tvořit agregáty. Na rozdíl
od ultracentrifugace v gradientu CsCl nejsme chromatografickými metodami schopni odlišit viriony,
které obsahují DNA od těch prázdných. To lze zlepšit zvýšením iontové síly pufrů během purifikace.
34
Genové terapie
Vektory na bázi dalších virových vektorů
Herpex simplex virus je neurotrofní virus, může být využit pro transport genů do neuronů
periferního i centrálního nervového systému. Po infekci zůstává herpesvirus v nedělících se neuronech
v latentním stavu; jeho genom zůstává neintegrovaný. Vektory na bázi tohoto viru ještě nebyly
připraveny.
Sindbis virus je zástupce alfavirů, ssRNA virů, které infikují hmyzí buňky i buňky obratlovců. Zralé
virové částice obsahují ssRNA a kapsidový protein C. Vnější obal virionů tvoří lipidová dvouvrstva,
ve které jsou zabudovány dva virové proteiny, E1 a E2. Vazbu virionů k povrchovým receptorům
hostitelských buněk zprostředkuje protein E2. Savčí receptory tohoto viru jsou vysoce konzervativní a
patří mezi lamininové receptory. Sindbis virus je jednoduchý, robustní, je schopen infikovat nedělící se
buňky a umožňuje expresi terapeutických genů ve vysokých hladinách genového produktu. Infikuje
ale široké spektrum hostitelských buněk, není tedy specifický. Genovou manipulací vektorů na bázi
tohoto viru se ale podařilo změnit specifičnost hostitelských buněk. Do genu pro protein E2 byla
zabudována sekvence kódující vazebnou doménu IgG pro bakterii Staphylococcus aureus. Přerušený
protein E2 se nedokáže vázat na laminin buněčných receptorů, což poškozuje tropismus viru. Část
chimérického proteinu, tzv. doména A, se ale může ještě vázat k monoklonálním protilátkám. Takto
změněný virus může být použit jako tzv. generický neboli „null“ vektor, který se může vázat
prostřednictvím monoklonální protilátky k vybranému typu buněk, obr. 11.17.
Obr. 11.17: Konstrukce vektoru na bázi Sindbis viru
a) Zjednodušené schéma výchozího Sindbis viru, který na svém povrchu vystavuje protein E2
b) Rekombinantní vektor s proteinem E2 s naklonovanou vazebnou doménou pro IgG proteinu A
c) Inkubace rekombinantního vektoru s monoklonální protilátkou, která se imobilizuje na povrchu
virových částic. Takové částice jsou pak monoklonální protilátkou zacíleny do buněk specifického typu.
a)
b)
c)
35
Genové terapie
11.4.3. Nevirové transportní systémy
Nevirové vektory představují v současné době minoritní techniky využívané v genových terapiích.
Jejich nezpochybnitelnými výhodami oproti virovým systémům jsou:
1) Nízká nebo žádná imunogennost
2) Skutečnost, že se terapeutické geny takto přenášené neintegrují do hostitelského genomu,
což znemožňuje případnou aktivaci hostitelských onkogenů nebo inaktivaci genů nezbytných
k přežití hostitelských buněk
3) Další výhody a nevýhody jsou shrnuty v Tabulce 11. 5
Technika byla použita už v roce 1990 pro přenos „nahé“ plasmidové DNA. Gen pro
β-galaktozidázu, kterou tento plasmid nesl, byl po intramuskulární aplikaci exprimován ve svalových
buňkách myší. Účinnost transfekce byla ale nízká, k expresi došlo jen u 1-2% svalových buněk, DNA se
neintegrovala do genomu. DNA zachycená na povrchu mikroskopických zlatých kuliček byla také
nastřelena do epidermis metodou genového děla „gene gun“ a následně úspěšně exprimována.
Tímto způsobem byla přenesena DNA kódující antigeny viru lidské chřipky, což mělo za následek
efektivní imunizaci zvířat proti tomuto viru.
Původně se s těmito systémy pro genové terapie moc nepočítalo, jejich „znovuzrození“ nastalo
poté, co se objevily závažné komplikace při práci s virovými vektory. Nevirové systémy mají
neomezenou klonovací kapacitu, což významně rozšiřuje spektrum použitelných terapeutických genů
a expresních kazet. Mají omezenou kapacitu, co se týče inzerční mutageneze a nevytvářejí tak snadno
nechtěné vedlejší produkty homologickou rekombinací. S rekombinantními plasmidy určenými pro
genovou terapii lze také snadno manipulovat standardními postupy genového inženýrství. Produkovat
velká množství plasmidů, k tomu není zapotřebí žádných specifických dovedností. Produkce plasmidu
je mnohem levnější než produkce virů. Na druhou stranu je klinické využití plasmidových konstruktů
omezeno nízkou efektivitou transformace, která pramení z nespecifického příjmu vektoru buňkou a
nedostatečného přenosu do terapeutického cíle. Plasmidy také nedokáží dostatečně překonat
mechanismy buněk, které uspávají expresi genů, a z toho důvodu nemůže být dosaženo dostatečné
genové exprese.
Pro zajištění efektivní replikace musí plasmid obsahovat počátek replikace ori. Počet kopií
plasmidu v buňce reguluje gen rop, který udržuje počet na maximálně 20 až 40 kopiích/buňku.
Vektory na bázi plasmidu pUC tento gen nemají a proto se mohou v buňce vyskytovat v počtu až 500
kopií. Většina vektorů pro nevirovou genovou terapii je založena právě na plasmidech pUC. Jako
selekční znak bývá ponechán zpravidla ten, který nese příslušný plasmid. Podle nařízení FDA (USA)
však musí vektory pro terapii lidí splňovat následující:
a) Selekční znaky musí mít co nejmenší vliv na lidské zdraví a nesmí přenášet rezistenci
k antibiotikům na symbiotické bakterie
b) Selekce na bázi penicilinů by mohla vyvolávat nežádoucí reakce u jedinců, kteří jsou na tato
antibiotika alergičtí, proto nesmí purifikované plasmidy obsahovat rezidua penicilínů
c) Gen TN903, který nese rezistenci ke kanamycinu, který se v terapii často používá,
je použitelný v plasmidových konstruktech určených ke genové terapii
Co se týče požadavků na genovou expresi, platí, že je možné využívat prvků vektorů na bázi virů,
zejména co se týče udržování plasmidu v jádře a jejich replikace. Místně specifické rekombinace lze
dosáhnout použitím virové rekombinázy SSR. Mitotické stability plasmidových vektorů je dosaženo
36
Genové terapie
použitím sekvence genu pro scaffold/matrix připojovací oblast (S/MAR). Plasmid s touto sekvencí se
může udržet v buňkách CHO a HeLa až po 100 dělení. Je možné použít také lidské umělé chromozómy
(human artificial chromosomes), které není možné sbalovat do virových kapsidů, zatím to ale moc
nefunguje.
První fyzikální metodou transformace terapeutických genů byla mikroinjekce DNA nebo RNA
do cytoplasmy nebo jádra buňky. Je to nejjednodušší a nejefektivnější metoda transformace, zajišťuje
přenos 100% genetického materiálu do recipientní buňky. Vyžaduje ale vysoce specializované
dovednosti a nástroje. Pro buňku je tato metoda velmi hrubá, protože při ní dochází k mechanickému
poškození cytoplasmatické a jaderné membrány; používá se k transformaci kultivovaných buněk nebo
embryonálních buněk ex vivo.
Tzv. „genové dělo“ využívá techniku bombardování buněk pevnými částicemi. Metoda byla
vyvinuta pro rostlinné buňky a později adaptována i na buňky živočišné a tkáně. Částice jsou ze zlata a
DNA je uchycena na jejich povrchu. Nastřelování částic do buňky se děje buďto elektrickými pulsy
nebo výboji hélia. Efektivita transformace závisí na velikosti částic, době přenosu a rychlosti částic.
Při této metodě je dosahováno vysokých expresí i při malém množství nastřelované DNA. Využití této
metody omezuje kapacita částic a hloubka jejich penetrace do buňky. Ačkoli se metoda jeví
z klinického pohledu jako bezpečná, jsou buňky, do kterých proniknou částice, zpravidla těžce
poškozeny.
Elektroporace je metoda, při které je buněčná membrána vystavena expozici pulsů o vysokém
napětí. Tím dochází k dočasné destabilizaci membrány a zvýší se její propustnost pro DNA.
Elektroporací byly úspěšně transformovány buňky svalů, kůže, jater i solidních nádorů. Elektroporaci
ovlivňují jak technické parametry zařízení, elektroporátoru, tedy především délka pulsu a síla
elektrického pole, tak i parametry biologické, jako je koncentrace transformující DNA, její konformace
a velikost. Tyto parametry musí být pro každý typ buňky vždy znovu a znovu optimalizovány. Hlavním
omezujícím faktorem pro elektroporaci je to, že je DNA transportována neočekávaně do různých
buněk elektroporované tkáně, což samozřejmě může vést k expresi transgenu v nechtěných místech.
Sonoporace zvyšuje permeabilitu buněčné membrány akustickou kavitací pomocí ultrazvuku.
Ultrazvukové vlny způsobují, že bubliny, které se v buňce nebo jejím okolí vytvářejí (nebo jsou zde
uměle vytvářeny), prasknou a rozbijí membrány ve svém okolí. Technika sonoporace byla testována
jak v podmínkách in vitro, tak i in vivo. Efektivita přenosu genů závisí na frekvenci ultrazvuku,
akustickém tlaku, délce pulsů a době expozice. Podstatný je taky charakter vznikajících bublin.
Modifikace buněčné membrány lze dosáhnout i laserovými paprsky. Princip účinku spočívá
v zahřátí buněk laserem, což má za následek vytvoření rozdílu mezi osmotickým tlakem mezi
cytoplasmou a okolním prostředím. Permeabilizace membrány je přechodná a velmi rychlá, buňky
nejsou působením laseru významně poškozeny. Účinnost této techniky je 100% a neovlivňuje růst ani
dělící schopnosti buňky. Přesto se laser využívá jen málo, protože zdroje záření jsou drahé a zařízení
příliš rozměrná, nemluvě o nutnosti složitého zaškolování obsluhy takového zařízení.
37
Genové terapie
Tabulka 11. 5: Výhody a nevýhody nevirových transportních systémů pro genové terapie
Výhody
„Nahá“ DNA
Nevýhody
Není zapotřebí žádných
specifických dovedností
Snadná výroba
Nízká efektivita transformace
Přechodná exprese
Při injekci do jádra až 100%
účinnost
Vyžaduje vysoce specializované
dovednosti
Omezené možnosti dodávání ex vivo
Malá prostupnost do tkání
Fyzikální metody
Mikroinjekce
Genové dělo
Snadné provedení
Efektivní imunizace už malým
množstvím DNA
Vysoká efektivita transformace
Elektroporace
Sonoporace
Ozáření laserem
Magnetofekce
Metoda dobře tolerovatelná
dalšími aplikacemi
Může být 100% účinná
Bezpečná metoda zavedená
v klinické praxi
Přechodná exprese
Toxicita, poškození tkání
Vysoce invazívní
Přechodná exprese
Toxicita ještě neproměřena
Nutné speciální dovednosti a drahé
vybavení
Nízká efektivita s „nahou“ DNA
Chemické metody
Lipozómy
Kationtové polymery
Snadná výroba
Fúzní lipozómy zlepšují efektivitu
transformace
Snadno manipulovatelné pro
účely správné zacílení
Přechodná exprese
Toxicita, mírná imunogennost
Přechodná exprese
Toxicita, mírná imunogennost
Magnetofekce využívá magnetických nanočástic, což jsou polymerem obalené molekuly oxidu
železa. Nanočástice se vážou k DNA nebo virovým vektorům a jsou v cílových buňkách koncentrovány
externím magnetickým polem, které je protlačuje skrz plasmatickou membránu do cytoplasmy. Tato
metoda byla použita a byla vysoce účinná při transformaci buněk gastrointestinálního traktu a
krevních cév. Efektivitu transformace ovlivňuje v tomto případě typ vektoru (virový versus nevirový),
dávka, kompozice a doba inkubace. Zařízení, které se k magnetofekci používá je jednoduché a levné.
Metoda je bezpečná a v klinické praxi se používá při chemoterapii. Samotná technika není toxická,
toxické jsou pouze specifické transformační reagencie. Hlavní výhodou magnetotransfekce je zvýšení
biodostupnosti rekombinantní DNA a snížení jejího množství, které je zapotřebí k efektivnímu
přenosu genů.
Hydroporace neboli hydrodynamický přenos genů je metoda, při které jsou do cirkulace
zaváděny velké objemy roztoků, tím dojde k překonání bariér jako je endothelium, tak vlastní
buněčné membrány. Metoda byla poprvé použita pro přenos genů v roce 1999, kdy byl do jater myši
napumpován roztok DNA odpovídající 8-10% celkové hmotnosti těla. Od té doby bylo hydroporace
38
Genové terapie
použito k přenosu genů do svalů a do ledvin. Technika je jednoduchá, je k ní zapotřebí pouze injekční
stříkačka a jehla. Jako pufry se používají roztok soli, Ringerův roztok nebo fosfátem pufrovaný roztok
soli. Dávka DNA se pohybuje mezi 0,1 až 10 mg/kg hmotnosti. Při hydroporaci nedochází k žádnému
zjevnému poškození tkání, ale zvyšuje se krevní tlak a snižuje se srdeční činnost. Přechodně se také
zvyšují tkáňově specifické parametry, jako je hladina sérových transamináz po administraci do jater a
kreatinin kinázy po injekci do svalů. Hydroporace byla zatím odzkoušena pouze na malých zvířatech,
pro větší zvířata chybí odpovídající katétry, na lidech se tedy zatím nezkoušela.
Co se chemických metod přenosu genů týče, používají se především lipozómy a kationtové
polymery. Kationtové lipozómy jsou první nevirové systémy, kterých bylo použito v klinických testech.
Kationtové lipozómy vytváření po kontaktu s negativně nabitou kostrou rekombinantní DNA
organizované struktury, které chrání genetický materiál před degradací. Povrch těchto struktur je
nabitý kladně a to umožňuje jejich interakce s buněčnou membránou a endocytózu.
Interakce lipozómů s DNA závisí na pH, náboji a struktuře lipozómů. Kationtové lipidy sestávají
ze čtyř funkčně odlišných domén (obr. 11.18):
A.
B.
C.
D.
pozitivně nabité „hlavice“
mezerníku různé délky
spojovací části
hydrofobní kotvy
Obr. 11.18: Obecná struktura kationtového lipidu. Označení jednotlivých části v textu. Každou
z domén je možno modifikovat a zlepšit tím podmínky pro přenos genů.
O
CH3
C
O
+
N
H3C
CH3
A
O
C
O
B
C
D
Efektivitu transformace lze zvýšit použitím neutrálních „pomocných“ lipidů, jako je např.
dioleoylfosfatidylethanolamin a cholesterol, které komplexy stabilizují a napomáhají rozrušení
buněčných membrán. Kromě toho se přidávají další látky zesilující interakce DNA-lipid, látky
permeabilizující membrány, a přirozené ligandy pro zacílení komplexů lipozóm-DNA, např. transferin,
folát, asialofetuin nebo protilátky k povrchovým buněčným strukturám. To vše zvyšuje tkáňovou
specifičnost a efektivitu transformace.
39
Genové terapie
Fúzní lipozómy neboli virozómy byly vyvinuty proto, aby zvýšily stabilitu vektoru v endozómu a
cytoplasmě a umožnily transport DNA do jádra. První z těchto hybridů virus/nevirový vektor, tzv.
„lipozóm HVJ“ (Hemagglutinating Virus of Japan) byl připraven v roce 1999 z částic viru HVJ
inaktivovaných UV zářením a lipozómů, které obsahovaly DNA komplexy s proteinem skupiny HMG-1
(high mobility group-1 protein), obr. 11.19.
Obr. 11.19: Lipozóm HVJ. Sestává z rekombinantní DNA obalené proteinem HMG-1 uzavřené
do lipozómu připraveného ze 3 lipidů. V lipidové vrstvě jsou roztroušeny molekuly hemaglutinin
neuramidázy (HN) a fúzních glykoproteinů, které obojí pocházejí z HVJ. Tyto vektory mají vysokou
transformační účinnost a nízkou toxicitu. Byly použity v několika aplikacích in vitro a in vivo.
protein HN
fúzní protein
rekombinantní DNA
protein HMG-1
Úspěšná transformace je zajištěna hemaglutin neuramidázou a fúzními glykoproteiny, které
usnadňují interakci se zbytky kyseliny sialové na buněčných površích a fúzi s buněčnou membránou.
Protein HMG-1 stabilizuje terapeutický gen v jádře. Ačkoli se proti HVJ v těle tvoří protilátky, nebyla
pozorována ani toxicita vektoru ani žádná zánětlivá reakce.
Další virozómy byly připraveny na bázi membránového fúzního proteinu s hemaglutininem
z influenza viru. Kationtové lipidy pak s využitím G glykoproteinu z obalu viru vezikulární stomatitidy.
Kationtové polymery umožňují kondenzaci DNA tím, že neutralizují náboj kostry DNA a zajišťují
kontakt s buňkou prostřednictvím iontových interakcí. Nejvíce využívanými kationtovými polymery
jsou polylysin (PLL) a polyethylenimin (PEI). Použití další látek je omezeno kvůli jejich toxicitě.
Polymery usnadňují tkáňově-specifický přenos genů prostřednictvím kovalentního spojení látek se
specifickými buněčnými povrchovými strukturami. Uhlovodíky, např. laktóza a galaktóza pomáhají při
transportu DNA do hepatocytů tím, že se připojují k sialoglykoproteinům. Konjugáty s peptidem, který
se váže na stěny artérií, pomáhají transportu do endoteliálních buněk. Když se ke komplexům DNAkationtový polymer připojí protilátky k povrchovým buněčným molekulám, je možné navodit tkáňověspecifickou genovou expresi a snížit toxicitu komplexů. K používaným biodegradovatelným
40
Genové terapie
polymerům patří poly(α-[4-amino-butyl]-L-glykolová kyselina (PAGA), poly(β-amino ester), poly(2aminoethyl propylén fosfát) PPE-EA a poly(D,L-laktid-ko-4-hydroxyl-L-prolin), PHLP.
Reakce imunitního systému na nevirové vektory závisí na dávce a způsobu administrace
nevirových vektorů. Nízké dávky mají na funkce orgánů a histologii tkání malý vliv. Vyšší dávky
především co se týče kationtových lipozómů už ale vyvolávají akutní zánět a vážná poškození tkání.
V důsledku agregace komplexů vznikají v krevní cirkulaci velké částice a ty jsou snadno rozpoznávány
retikuloendoteliálním systémem. Nejvážnější vedlejší účinky má intravenózní a intrapulmonární
aplikace. Strategie, kterými je možno omezit zánětlivou reakci a toxicitu nevirových vektorů, spočívají
v odstranění motivů CpG z plasmidové DNA, minimalizaci interakcí mezi komplexem nevirového
vektoru a imunitním systémem a použití imunosuprimujících látek v komplexech.
Motivy CpG lze odstranit tím, že množíme plasmidy v bakteriích, které exprimují Sss I metylázu.
Ta metyluje zbytky cytosinu. Jinou možností je použít plasmidů bez motivů CpG a nebo tyto motivy
odstranit místně specifickou rekombinací. V neposlední řadě je možno odstranit zbytné prokaryotické
sekvence místně specifickou rekombinací a vytvořit tzv. „minimální“ plasmidy. Tyto zásahy sníží riziko
imunitní reakce proti vektoru, ale ponechají plasmidům schopnost transformace. Kovalentní pegylace
DNA komplexů zvyšuje jejich toxicitu, ale zvýší efektivitu transformace, protože pegylované struktury
neagregují a nejsou eliminovány v retikuloendoteliálním systému. Pegylované molekuly jsou také
stabilnější a jejich polyethylenglykolová část usnadňuje připojení cílových molekul a protilátek.
Produkci cytokinů je možno redukovat injektážemi lipidů před přidáním vlastní rekombinantní DNA;
redukce může dosáhnout až 80%. Snížení zánětlivé reakce a toxicity je možno dosáhnout také
vytvořením tzv. „safeplexes, tj. lipoplexů a polyplexů, které obsahují molekuly suprimující zánět;
přitom transformační schopnost zůstává zachována. Řadu zmíněných faktorů je možno kombinovat.
Klinicky byly nevirové vektory otestovány například při intramuskulární aplikaci plasmidů
exprimujících antigenní epitopy řady patogenů, včetně viru HIV-1 a viru Ebola. Z genetických
onemocnění byly testovány hemofilie A, cystická fibróza, deficience α-1-antitrypsinu a Canavanova
choroba.
Při vytváření a produkci nevirových vektorů se využívá standardních technik pro plasmidy.
Protože pro jednu dávku je zapotřebí přibližně jeden miligram DNA, je hlavním problémem, se kterým
se musí výroba vypořádat, velkoobjemová produkce. Velkoobjemová produkce plasmidu zahrnuje 5
základních kroků:
1) Fermentace, při které musí bakteriální kultura narůst tak, aby buňky obsahovaly co největší
množství plasmidů. Nejčastěji využívaným producentem je Escherichia coli rostoucí v bohatém
médiu.
2) Sklízení buněk, které probíhá centrifugací nebo filtrací. Při dodržování podmínek „Správné výrobní
praxe“ (Good Manufacturing Practice, GMP) je filtrace levnější. Filtrací je kromě toho jednodušší
odstranit většinu „kontaminujících“ složek, tj. vedlejších produktů metabolismu, mimobuněčných
zbytků a dalších nečistot, před zahájením vlastní purifikace
3) Lyze, při které se rekombinantní plasmidy uvolní z buněčné biomasy. Tento krok je kritickým pro
celý proces, protože je rozhodující pro optimalizaci výtěžku CCC forem plasmidů, kterými se
transformuje. OC a L formy nejsou pro genovou terapii tak účinné. Nejpoužívanější metodou je
lyze alkáliemi a precipitace buněčných zbytků acetátem. Součástí preparátu plasmidové DNA jsou
ale při tomto způsobu izolace zbytky detergentů, se kterými se ve velkých objemech nesnadno
41
Genové terapie
pracuje. Proto se přechází na lyzi buněk prostřednictvím zvýšené teploty.
4) Izolace a purifikace slouží k odstranění dalších zbytků po lyzi. Používá se precipitace detergenty,
polyethylen glykolem nebo solemi klasickým postupem podle Birnboima a Doly z roku 1979. Tyto
látky se pak odstraňují různými chromatografickými postupy, kterými se zároveň odstraní RNA,
oddělí jiné formy plasmidů a endotoxiny
5) Objemová příprava. Po purifikaci se plasmid převede do vhodného pufru filtrací přes membránový
filtr o velikosti pórů 50 až 100 kDa. Plasmidy, které jsou určeny pro klinické aplikace, musí být
velmi dobře charakterizovány a otestovány. Parametry pro tyto plasmidy byly schváleny FDA a
WHO a jsou zjednodušeně popsány v Tab. 11. 6.
Tabulka 11. 6: Kvalitativní parametry a „akceptovatelné“ hodnoty nečistot pro plasmidy určené ke
klinickým zkouškám
Typ zkoušek
Parametr
Způsob stanovení
Akceptovatelné
množství v konečném
produktu
Identita
Křížová kontaminace
dalšími produkty
Restrikční
štěpení/gelová
elektroforéza
Neposuzuje se
Čistota
Rezidua bakteriální
chromozomální DNA
Real-time PCR
< 2 μg/mg pDNA
Rezidua RNA
Analytická HPLC
< 0,2 μg/mg pDNA
Rezidua bakteriálních
proteinů
Test BCA
< 3 μg/mg pDNA
Endotoxin
Test LAL
< 10 E.U./mg pDNA
Sterilita (bakterie nebo
houby)
Metoda popsaná v CFR
21 610.12
Žádný růst
Vzhled
Vizuální posouzení
Čirý roztok bez částic
pH
pH metr
Fyziologické hodnoty
(7,0-7,4), ale může být
produktově specifická
Konformace plasmidu
(CCC versus OC)
HPLC nebo CGE
> 97% CCC
Značená dávka
ELISA, FACS, RT-PCR,
absorpce A260
Transgenní/plasmidově
specifický
Aktivita
42
Genové terapie
11.5. Úloha metabolismu léčiv v genové terapii
Důležitým aspektem pre-klinického vývoje je vyhodnocení, jak nová látka ovlivní lékmetabolizující enzymy. Např. infekce a zánět významně redukují expresi a funkci enzymů metabolismu
cytochromu P450 (CYP), což bylo prokázáno v testech in vitro, in vivo i v klinických zkouškách. Proto se
sleduje také vliv virových i nevirových vektorů na expresi právě těchto enzymů. Už jediná dávka
rekombinantního adenoviru suprimuje krysí CYP3A2 po dobu 14 dnů. CYP3A2 je homologem lidského
CYP3A4, který je zodpovědný za metabolismus přibližně 50% prodávaných medikamentů.
11.5.1. Geneticky řízená terapie proléčiva
Jedním z primárních cílů nádorové terapie je transport vysoce aktivních, cytotoxických látek
k nádorům a metastázám takovým způsobem, aby byla omezena expozice normální tkáně. Geneticky
řízená proléčiva představují jednu z možností, jak toho dosáhnout. Terapeutický transgen, jehož
produkt přeměňuje dané proléčivo, je transformován přímo do nádorových buněk, poté se aplikuje
proléčivo a to je konvertováno na léčivo pouze v místě exprese terapeutického transgenu. Tento efekt
lze ještě zesílit tím, že je transgen pod nádorově specifickým promotorem, tedy promotorem, který je
aktivován transkripčními faktory, které vznikají jen v mikroprostředí nádoru; příkladem může být
hypoxii indukující faktor.
Některé strategie geneticky řízené terapie proléčiva využívají tzv. „efekt okolostojícího diváka“.
V takových případech jsou cytotoxické látky produkovány transformovanými buňkami, které jsou
rozptýleny mezi buňky obklopující nádor. Už toto zastaví růst nádoru a způsobí jeho regresi. Při tomto
způsobu „léčby“ není zapotřebí transformovat všechny buňky (obr. 11.20). V klinických studiích je
několik desítek terapií založených na tomto způsobu genové terapie, některé už dosáhly fáze III.
Klinickým standardem geneticky řízené terapie proléčiva je nadprodukce thymidin kinázy viru
herpex simplex (HSV-tk)ve spojení s gancyklovirem. Jedná se o selektivní systém, protože gancyklovir
je slabým substrátem lidské monofosfát kinázy. HSV-tk gancyklovir rychle konvertuje na trifosfátovou
formu po fosforylaci v buňkách exprimujících HSV-tk. Trifosfát kompetuje s deoxy-GTP během
replikace DNA a jakmile se začlení do narůstajícího řetězce, blokuje DNA polymerázu a indukuje
jednořetězcové zlomy.
Klinické využití 5-fluorouracilu je omezeno tím, že pro terapeutický účinek musí být podáván
ve velkých množstvích. Pokud ale v buňkách navodíme nadprodukci bakteriální cytosin deaminázy a
použijeme jako proléčivo 5-fluorocytosin, vytváří se v buňkách lokálně 5-fluorouracil, který je
následně konvertován buněčnými kinázami na 5-fluorouridin-5-trifosfát, jenž brání syntéze rRNA a
mRNA. Této terapie se dá využít při léčbě nádorů s minimálními vedlejšími účinky. Látka 5-aziridinyl2,4-dinitrobenzamid může být přeměněna na aktivní metabolit, 5-aziridinyl-4-hydroxylamino-2nitrobenzamid, která vytváří křížová spojení ve struktuře DNA. K tomu je zapotřebí dodat
nitroreduktázu z Escherichia coli.
43
Genové terapie
Obr. 11.20: Efekt okolostojícího diváka. Do pacienta je zanesen rekombinantní vektor s genem, který
exprimuje terapeutický enzym. Vektor indukuje expresi jen v některých buňkách sledovaného cíle.
Když je pacientům aplikováno proléčivo metabolizované oním enzymem, začnou je takové buňky
konvertovat na vysoce toxické molekuly. Tyto molekuly se začnou v buňkách hromadit, eventuálně je i
zabijí a uvolní se do okolí, kde zlikvidují okolní buňky.
vektor s terapeutickým genem
terapeutický gen
infekce
infekce
proléčivo
cytotoxický metabolit
11.5.2. Systémy farmakologické regulace genové exprese
Pro úspěšnou implementaci genové terapie v klinické praxi bude nezbytné zajistit striktní regulaci
genové exprese v závislosti na místě účinku a fyziologickém stavu buněk, které mají být genovou
terapií upraveny. Expresní systémy, které jsou v současné době vyvíjeny, obsahují chimérické
promotory, které obsahují specifický operátor (Op)a vedle něj zabudovaný minimální promotor (Pmin),
obr. 11.21. Chimérický promotor je aktivován vazbou komplexu aktivátoru (TA) na operátor Op.
Komplex TA sestává z DNA vazebné domény (DB) a ligand vázající domény (LB); LB je schopna
interakce s orálně aktivní substancí. Tato substance umožňuje tvorbu komplexu TA a spouští nebo
reprimuje genovou expresi. Onou aktivní substancí mohou být antibiotika, steroidy, imunosupresanty
a jejich deriváty a jiná léčiva. V optimálně regulovaném systému musí být všechny komponenty
neimunogenní, bezpečné a tolerovatelné. Exprese transgenu musí být v reprimovaném stavu
nedetekovatelná a po indukci co nejvyšší. Induktor se musí efektivně inkorporovat do systémů pro
přenos genů. Regulující složka musí být netoxická, schopna distribuce do cílové tkáně a mít poločas
života několik hodin, aby bylo možno genovou expresi rychle změnit. Tyto požadavky nejsou v rozporu
se standardními požadavky na farmaceutické produkty.
44
Genové terapie
Obr. 11.21: Obecný koncept farmakologické regulace genové exprese. Pacient dostane jednu dávku
rekombinantního vektoru s regulačními elementy a transgenní kazetou. Regulátorový gen obsahuje
sekvence pro vazbu molekuly ligandu (LB) a vazebné místo pro molekulu DNA (DB). Obě molekuly
mají schopnost interakce s orálně aktivní substancí, která zajišťuje tvorbu transaktivačního komplexu
(TA). Pokud tato substance není k dispozici, pak se komplex nevytváří. Po vytvoření transaktivačního
komplexu se tento váže ke specifickému operátoru Op nebo minimálnímu promotoru (Op/Pmin), který
se nachází na počátku kazety s terapeutickým genem. K expresi transgenu dochází, jen když se
k sekvencím Op/Pmin váže transaktivační komplex, nikoli jen samotný protein vázající se na DNA.
orálně aktivní léčivo
LB
DB
vektor
TA
regulační
gen
TA
Op/Pmin
terapeutický
transgen
terapeutický
protein
Nejrozšířenějšími testovanými systémy jsou dimerické systémy TET-ON/TET-OFF a
Rapamycin/Rapalog (Obr. 11.22). Připraveny byly primárně na bázi rekombinantních adenovirů,
adenoasociovaného viru a retrovirových vektorů.
Většina farmakologicky regulovaných expresních systémů byla testována na zvířecích modelech
nádorových a hormonálních onemocnění. Jednou z možností, jak atakovat nádory, je transfer
T lymfocytů. Ty ale napadají jak buňky nádoru, tak i buňky zdravé tkáně. Jinými modely, na kterých
byly tyto systémy testovány, je artritida, hemofilie B, chronická hepatitida B a tuberkulóza.
Pokusy se provádějí i na primátech. Do 16 zvířat byly intramuskulární injekcí transformovány dva
viry na bázi adenoasociovaného viru (v jedné dávce, která obsahovala 3,9 x 1012 a 11,5 x 1012
genomů/kg). Jeden z virů exprimoval transkripční faktory rapamycinového systému, druhý
erytropoetin pod minimálním promotorem, který obsahoval vazebná místa pro tyto regulované
transkripční faktory. V odpovědi na rapamycin a jeho deriváty zvířata exprimovala erytropoetin, a to
v závislosti na dávce induktoru. Jedno ze zvířat bylo studováno po dobu 6 let.
45
Genové terapie
Obr. 11.22: Příklady farmakologicky regulovaných systémů genové exprese
A) Tetracyklin dependentní regulační systém. Tento systém sestává ze dvou konstruktů. První
konstrukt obsahuje sekvence pro transaktivační protein (TA). V systému TET-OFF vyvolává interakce
tetracyklinu nebo jeho derivátu (např. doxycilinu) s TA změnu konformace a TA se nemůže vázat
k TET-Op (Tet O). To brání aktivaci promotoru a následné expresi genu. Není-li doxycilin přítomen, pak
se TA váže k sekvenci Tet O a dojde k zahájení exprese. Interakce doxycilinu s TA systému TET-ON
iniciuje konformační změnu, která vyvolává vazbu TA komplexu k Tet O, který řídí genovou expresi.
V tomto systému dochází k expresi genu pouze v přítomnosti doxycylinu.
Kazeta pro regulační přesmyk
transaktivátory
transaktivátor
promotor
polyA
+ doxycilin
TET-OFF
žádná aktivace genu
polyA
transgen
CMV Pmn
Tet, Tet, Tet, Tet
aktivace genu
- doxycilin
polyA
transgen
CMV Pmn
Tet, Tet, Tet, Tet
+ doxycilin
TET-ON
aktivace genu
polyA
transgen
CMV Pmn
Tet, Tet, Tet, Tet
žádná aktivace genu
polyA
transgen
CMV Pmn
Tet, Tet, Tet, Tet
46
- doxycilin
Genové terapie
B) Rapamycin dependentní regulační systém. Rapamycin je léčivo, které může současně interagovat
se dvěma buněčnými polypeptidy, FKBP12 a FRAP. V tomto systému kóduje transaktivační kazeta
vazebnou doménu proteinu FRAP pro rapamycin (FRB), která má aktivační doménu z podjednotku
p65 lidského nukleárního faktoru kappa B. Druhá aktivační doména kóduje 3 kopie FKBP fúzovaného
k jedinečné vazebné doméně pro DNA, ZFHD-1. Sekvence obou transaktivačních proteinů obsahují
jaderný lokalizační signál (N). Transgenní kazeta obsahuje 12 kopií rozpoznávacího místa pro ZFHD-1,
které je umístěno proti směru transkripce minimálního promotoru pro interleukin-2. Tento promotor
iniciuje expresi a produkci terapeutického transgenu jen tehdy, když se k regionu ZFDH-1 váže 12 kopií
kompletního transaktivačního komplexu. Transaktivační komplex se tvoří jen v přítomnosti
rapamycinu.
konstitutivní
promotor
transaktivátor
N
FRB
DNA vazebná doména
p65
N
ZFHD1
FKBP FKBP FKBP
rapamycin
rapamycinem
Indukovaná
exprese
vazebná místa pro 12 ZF
IL2 Pmin
47
terapeutický gen
T
Genové terapie
11.6. Regulace a dohled nad genovými terapiemi
Kroky, které je třeba podstoupit, aby producent terapeutického genu získal povolení ke klinickým
zkouškám je sumarizován na obr. 11.23. Platí pro USA. Centrum CBER (Center for Biologics Evaluation
and Research) patřící pod FDA (Food and Drug Administration) provede revizi návrhu aplikace genové
terapie od IND (Investigational New Drug) předloženou výzkumníkem nebo sponzorem záměru. NIH
(National Institutes of Health) ustanoví pravidla pro genetický výzkum a implementační politiku
prostřednictvím OBA (Office of Biotechnology Activities). OBA spravuje RAC (Recombinant DNA
Advisory Committee), což je multidisciplinární skupina v NIH, která byla založena na základě zájmu
vědecké komunity a veřejnosti o etické, vědecké a bezpečnostní aspekty genetického výzkumu.
Vědecké a etické posouzení výboru RAC je pro klinické pokusy prováděné ve společnostech, které
obdržely finanční podporu od NIH na provádění výzkumu rekombinantní DNA, povinné. Ostatní
zájemci mohou podstoupit proces posouzení v RAC dobrovolně. Za monitorování a implementační
shodu je zodpovědný OHRP (Office for Human Research Protections), stejně tak i za podporu
vzdělávacích materiálů, které chrání osoby, které se klinických testů účastí jako pacienti. V každém
místě, kde probíhají klinické zkoušky v genových terapiích, posuzují a schvalují postupy a schvalovací
formuláře také IBC (Institutional Biosafety Committee) a IRB (Institutional Review Board). Přihlašování
pacientů ke klinickým zkouškám začíná až poté, co skončí posuzování IND a RAC a schvalovací proces
v IBC a IRB.
Obr. 11.23: Proces získávání povolení pro klinického testování nových terapeutických genů. Proces
začíná vytvořením původního konceptu na vědeckém pracovišti. Nápad je testován in vitro a in vivo
v mnoha preklinických studiích. Jsou-li výsledky slibné, sumarizuje výzkumník postup a preklinická
data v aplikaci IDN, která je postoupena oddělení CBER (Center for Biologics Evaluation and Research)
ve FDA (Food and Drug Administration). Výzkumník také podstoupí návrh klinické zkoušky se všemi
detaily k posouzení RAC, které je pod kontrolou OBA v NIH. Stejný protokol (s revizemi doporučenými
RAC) je postoupen IRB všude tam, kde jsou v průběhu klinické zkoušky testováni pacienti. Protokol
musí být posouzen v IBC každého pracoviště. Jen když z každého místa přijde souhlasné stanovisko,
může být ke klinické zkoušce připuštěn první pacient.
idea
OBA/RAC (NIH)
IRB
(výzkumné
pracoviště)
preklinické studie
výzkumník
IND
CBER (FDA)
IRB
(výzkumné
pracoviště)
pacient
48
Genové terapie
Vektory určené pro klinické zkoušky se vyrábějí podle pravidel správné laboratorní praxe (Good
Laboratory Practice, GLP) a správné výrobní praxe (Good Manufacturing Practice, GMP). Obecné
požadavky pro výrobu buněčných produktů a produktů pro genové terapie je možné najít v části
„Points to Consider“ nebo „Guidance“ na www.fda.gov. Standardy vektorů lze zajistit u ATCC
(American Type Culture Collection).
49