5. Biosensory

BIOSENSORY
DEFINICE BIOSENSORU:
Biosensor je analytický přístroj, který
obsahuje citlivý prvek biologického původu,
který je součástí nebo v těsném kontaktu
s fyzikálně-chemickým převodníkem
převodník
(transducer)
elektronická
výstupní signál
jednotka
biorekogni ční vrstva
analyt
= látka, která se stanovuje
BIOREKOGNIKAČNÍ VRSTVA
Biokatalytická (enzym)
purifikovaný enzym, extrakt, tkáň, orgán,
organismus
Bioafinitní (afinitní vazba)
lektin, protilátka, nukleová kyselina, receptor
FYZIKÁLNĚ CHEMICKÉ PŘEVODNÍKY
Elektrochemické
potenciometrické, amperometrické,
voltametrické, konduktometrické
Optické
fotometrické, luminometrické, fluorometrické
nelineární optika
Piezoelektrické a akustické
Kalorimetrické
PODMÍNKY PRO MĚŘENÍ
přídavky
vzorků
S
Měření v nádobce
Měření v nádobce
Průtočný systém
- neředěný vzorek
- ředěný vzorek
(flow injection analysis
FIA)
průtočná cela
s biosensorem
čas
A
S
čas
IN
OUT
Průtočné měření s biosensory
B
BIOKATALYTICKÉ BIOSENSORY
ELEKTROCHEMICKÉ: amperometrické
potenciometrické
konduktometrické
Základem je elektrochemický měřící systém:
 referentní elektroda
 pracovní elektroda
pracovní elektroda pokrytá biorekognikační vrstvou
ENZYMOVÁ ELEKTRODA
Referentní elektrody:
Slouží jako srovnávací bod k měření nebo
nastavení potenciálu pracovní elektrody. Jejich
potenciál je přesně definovaný a stálý.
 argentchloridová Ag/AgCl/KCl
 kalomelová Hg/Hg2Cl2/KCl
 merkurosulfátová Hg/HgSO4/K2O4
Pracovní elektrody:
vyrobeny
z ušlechtilých kovů (Au, Pt, Ir)
grafit
vodivé polymery
organické vodivé soli
Potenciometrické biosensory
-
-
-
-
A A A A
+
K
Základem potenciometrie je
změna potenciálu na rozhraní
elektrody s roztokem
+
K
Převodníkem je iontově selektivní elektroda
v kombinaci s enzymovou vrstvou (ISE)
Typy ISE:
 skleněná elektroda
 pevné ISE: tenká vrstva iontového vodiče
monokrystalu nebo směs
krystalů, precipitát
Sb/Sb2O3 – citlivá na O2
 membránové tvořené membránou, která
odděluje dva roztoky
membrána i roztoky obsahují
určitý ion, který se účastní
výměnné reakce
 pevná membrána
 kapalná membrána
 speciální propustné membrány
Typické příklady:
Typ převodníku
stanovovaná látka enzym
pH
penicilin
acetylcholin
glukosa
esterasy,
nukleové kyseliny
močovina
aminokyseliny
NH3/NH4
CO2
nitrát a nitrit
močovina
aminokyseliny
laktát
penicilinasa
cholinesterasa
glukosaoxidasa
nukleasy
ureasa
glutamátdehydrogenasa
oxidasa L-/D-AK
bakterie
ureasa
lysindekarboxylasa
tyrosindekarboxylasa
laktátmonoxidasa
dekarboxylující oxidasa
Amperometrické biosensory
jsou založeny na heterogenním přenosu
elektronů mezi elektrodou a redoxním
párem molekul
poskytují jako signál proud, který je
úměrný koncentraci analytu.
Proud I se obvykle měří při konstantním
napětí (potenciál E) pracovní elektrody
eXred
Xox
Amperometrické biosensory
 kyslíková elektroda
 peroxidová elektroda
Kyslíková elektroda
potenciál pro redukci kyslíku:
-650 mV vzhledem
k Ag/AgCl referentní elektrodě
Elektroda má předřazenu
membránu propustnou pouze
pro O2, což zaručuje prakticky
absolutní specifitu (rušivé látky
neprojdou přes membránu)
MĚŘENÍ KYSLÍKU
Au (Pt) elektroda
zatavená ve skle
Ag/AgCl elektroda
elektrolyt
membrána
propustná pro O2
Elektrodová redukce kyslíku je čtyřelektronový proces:
O2 + 2 H2O + 2 eH2O2 + 2 e-
H2O2 + 2 OH2 OH-
MĚŘENÍ PEROXIDU VODÍKU
+600 mV
Není předřazena membrána
Elektrodová anodická oxidace peroxidu vodíku při 600 mV:
H2O2
O2 + 2 e- + 2H+
ENZYMOVÉ ELEKTRODY S OXIDASAMI
Spojením peroxidové nebo kyslíkové elektrody
s oxidasami jako biorekognikační vrstvou vznikají
enzymové elektrody.
Enzymy oxidují molekulu substrátu (analytu)
za přítomnosti kyslíku, přičemž vzniká
peroxid vodíku nebo voda:
Substrát + O2
Produkt + H2O2
Substrát + O2
Produkt + H2O
Přehled
oxidas
Substrát oxidasy
Alkohol
L-Aminokyseliny
D-Aminokyseliny
Askorbát
Bilirubin
Diaminy
Fenol (Tyrosinasa)
Galaktosa
Glukosa
L-Glutamát
Choiln
Cholesterol
p-difenoly (Lakasa)
L-Laktát
L-Laktát (dekarb.)
L-Lyzin
Monoaminy
NADH
Oxalát
Pyruvát
Sulfit
Urát(Urikasa)
Xanthin
koenzym
FAD
FAD
FAD
Cu
MAO
EC číslo
1.1.3.13
1.4.3.2
1.4.3.3
1.10.3.3
1.3.3.5
1.4.3.6
1.14.18.1
1.1.3.9
1.1.3.4
1.4.3.11
1.1.3.17
1.1.3.6
1.10.3.2
1.1.3.2
1.13.12.4
1.4.3.14
1.4.3.4
XOD
1.2.3.4
1.2.3.3
1.8.3.1
1.7.3.3
1.1.3.22
Fp
FAD
Mo
Cu
Mo
Zkratka
AOD
BRO
DAO
GOD
COD
LOD
LMO
Cu
Cu
Cu
FAD
FAD
FAD
FAD
Cu
FAD
FMN
FAD
H2 O2
ano
ano
ano
ne
ne
ano
ne
ano
ano
ano
ano
ano
ne
ano
ne
ano
ano
ano
ano
ano
ano
ano
ano
Enzymové elektrody s dehydrogenasami
největší skupinou oxidoreduktas jsou
dehydrogenasy
(existuje přes 250 NAD+ a 150 NADP+
dependentních enzymů) katalyzující redoxní
reakce s účastí
NAD(P)+ / NAD(P)H:
Substrát + NAD(P)+ + 2 e- + H+
Produkt + NAD(P)H
Reakce má rovnovážný průběh, oxidace obvykle
probíhá v slabě alkalickém prostředí.
Přehled dehydrogenas
Substrát
Alkohol
Aldehyd
Alanin
Formiát
Galaktosa
Glycerol
Glukosa
Glukosa-6-fosfát
Glutamát
Zkratka
ADH
AlDH
Ala-DH
FDH
Gal-DH
Gly-DH
GDH
G6P-DH
GlDH
EC číslo
1.1.1.1
1.2.1.5
1.4.1.1
1.2.1.2
1.1.1.48
1.1.1.6
1.1.1.47
1.1.1.49
1.4.1.3
3-Hydroxybutyrát
3-Hydroxysteroid
Isocitrát
Inositol
L-Laktát
D-Laktát
L-Leucin
L-Malát
Sorbitol
3-HBDH
3-HSDH
ICDH
IDH
L-LDH
D-LDH
L-LeDH
L-MDH
SDH
1.1.1.30
1.1.1.50
1.1.1.42
1.1.1.18
1.1.1.27
1.1.1.28
1.4.1.9
1.1.1.37
1.1.1.14
Detekce NAD(P)H
N
PMS
Fenazin methosulfát
+
N
CH3
CH3OSO3
R: methyl Meldola Blue
N
H2N
O
H3C
N
XHN
S
X: H
+
N R2
R: ethyl Nile Blue
N+Me2
Toluidine Blue O
X: naphthoyl
Naphthoyltoluidine Blue O
Elektrochemická detekce NADH
pomocí reoxidace vznikajícího
NADH
E0 = -560 mV/SCE
reakce je heterogenní
Přímá oxidace vyžaduje vysoký
potenciál (přes 1 V na uhlíku)
(zároveň nastává dimerizace a
adsorpce produktů na povrch
elektrody odezvy jsou nestabilní.
Reoxidace pomocí modifikujících
látek (E0 = -200 až -50 mV)
vázaných na povrchu elektrody:
modifikující látky
 substituované fenaziny, fenoxaziny,
fenothiaziny
oxidace kolem 0 V/SCE
 hexakyanoželezitan
 TTF.TCNQ
 reakce je homogenní
Mox + NADH
CT
Mred
H+
CT
Mred + NAD+
Mox + 2 e- + n H
nejprve vzniká CT
(tranfer komplex),
po rozpadu je reoxidován
mediátor
lze pracovat při mnohem
nižším potenciálu
Přímý přenos elektronů z biomolekul na elektrodu
Přímý reverzibilní přenos elektronů z biomolekuly (bílkovina,
nukleová kyselina) je ztížen:
redoxní skupiny (disulfidické můstky, flaviny,
hem, ionty kovů, Fe-S skupiny), ale uvnitř molekuly.
kontakt s povrchem elektrody je možný jen
při určité orientaci molekuly = snižuje proudové odezvy.
substrát
Eox
e-
produkt
Ered
 velká molekula= pomalá difúze
 adsorbce na povrchu elektrody
 denaturace biomolekul
 přímý přenos elektronů zřídka
 výjimka. malé redoxní molekuly:
-cytochrom c, cytochrom b, azurin, ferredoxin
-lakasa, peroxidasa
 používají se uhlíkové nebo kovové elektrody
modifikované pomocnými látkami
které brání adsorbci biomolekul
a napomáhají jejich orientaci
 mediátory, které umožňují přenos elektronů
mezi biomolekulou a elektrodou
(urychlují přenos nebo jej vůbec umožňují)
Požadavky na mediátory
reaguje s biokomponentou a elektrodou
dostatečně rychlý přenos elektronů (měla by být známa
stechiometrie a počet přenášených elektronů)
stabilní formy (redukované i oxidované) za podmínek použití
neúčastní se postraních reakcí (např. s O2)
vhodný redoxní potenciál (větší rozdíl redoxních
potenciálů E0mezi enzymem a mediátorem sice zvětší
proud, ale také naroste šum, nebezpečí interferencí
a doba ustavování pozadí,
(přiměřený rozdíl asi 100 mV)
bez vlivu pH na průběh redoxní reakce
netoxický (např. pro aplikace in vivo)
vhodný k imobilizaci (nejlépe rozpustný nebo snadno
adsorbovatelný např. na grafitu)
Mediátory
Název
tris-(2,2’-bipyridyl)ruthenium(III)
tris-(2,2’-bipyridyl)osmium(III)
ferrocen-1,1’-dikarboxylová kyselina
ferrocenylmethyltrimethylamonium
1,1’-bis(hydroxymethylferrocen]
4
4ferrokyanid K [Fe(CN)6]
hydroxyethylferrocen
N,N‘-dimethyl-p-fenylendiamin
ferrocenoctová kyselina
p-benzochinon
N,N,N‘,N‘-tetramethyl-p-fenylendiamin
2,6-dichlorfenolindofenol (DCIP)
1,2-naftochinon
fenazin methosulfát (PMS)
methylenová modř
tetramethyl-p-benzochinon (durochinon)
2-hydroxy-1,4-naftochinon
fenosafranin
E° (V)
1.031
0.603
0.403
0.388
0.224
0.190
0.161
0.139
0.124
0.039
0.029
-0.016
-0.090
-0.161
-0.230
-0.191
-0.378
-0.493
Fe
ferrocen Fc
S
S
S
S
tetrathiafulvalen
TTF
NC
CN
NC
CN
tetrakyanochinodimethan TCNQ
k ideálnímu mediátoru se blíží ferrocen
Jak začlenit mediátor do systému bioelektrody?
 mediátor volně rozpustný v roztoku nebo
uvnitř micel
 kompozitní směsi
(grafit+ mediátor+acetylcelulosa jako pojivo)
 na povrch kovových elektrod se kovalentně váže
 prostorové polymerní struktury obsahující
mediátor mohou být použity k navázání enzymů
na povrch elektrody
 navázat mediátor na povrch enzymu
BIOKATALYTICKÉ SENSORY rekognikační prvek
je enzym = bílkovina, která biokatalyticky přemění
určitý specifický substrát na produkt.
V nejjednodušším případě lze popsat schématem:
Enzym + Substrát
k1
Enzym-Substrát
k2
Enzym + Produkt
k-1
Rychlost vzniku produktu podle rovnice Michaelise-Mentenové:
V max  S 
v=
Km  S 
Vmax je maximální rychlost
při saturaci substrátem:
Km = (k-1+ k2)/k1
Pro enzymové sensory platí upravená rovnice
Michaelise-Mentenové:
 Rychlost v ní vystupuje jako měřený signál
 Snaha udržet koncentraci substrátu mnohem
nižší než je Km, protože pak závisí odezva
lineárně na koncentraci substrátu,
pro [S] < < Km a [S] v jmenovateli zanedbat
 Při imobilizaci enzymů v biosensorech dochází
obvykle ke změně Km, takže se dá určit jen
zdánlivá hodnota.
Typ biorekognikační vrstvy
 purifikovaný enzym
 biologický materiál (buňky, tkáňové řezy)
 jeden enzym nebo dva i více, které spolu
kooperují-katalyzují následné reakce
nebo recyklační procesy
stanovení substrátů
stanovení inhibitorů
stanovení aktivity enzymů
Stanovení substrátů
ANALYT
substrát imobilizovaného enzymu
PŘEVODNÍK
elektroda nebo optický systém
Příklady stanovení látek jako substrátů
 sacharidy
 alkoholy a fenoly
 kyseliny
 aminokyseliny
 dusíkaté látky
 purinové báze
 estery a amidy
 triglyceridy
 fosfolipidy
 penicilin
GLUKOSA
Biorekognikační vrstva
 glukosaoxidasa EC 1.1.3.4. Aspergillus niger
Penicillinum notatum
 glukosodehydrogenasa EC 1.1.99.17, PQQ
Acinetobacter calcoaceticus
 pyranosaoxidasa = glukosa-2-oxidasa
nevýhoda: reaguje s dalšími sacharidy
b-D-glukosa + O2
 D-glukonolakton
glukosaoxidasa
+ H 2O 2
GALAKTOSA
klinická biochemie
Biorekognikační vrstva:
galaktosoxidasa EC 1.1.3.9
H2O2
SACHAROSA
glukosa + fruktosa
Biorekognikační vrstva:
je třeba imobilizovat několik enzymů:
INVERTASA (EC 3.2.1.26) hydrolýza
sacharosy na a-glukosu a fruktosu
MUTAROTASA (EC 5.1.3.3) urychluje
ustavení rovnováhy mezi oběma anomery
glukosy (spontálně – pomalu)
GLUKOSAOXIDASA (EC 1.1.3.4.)
oxiduje b-anomer glukosy za vzniku H2O2
LAKTOSA
Biorekognikační vrstva:
b-galaktosidasa (EC 3.2.1.23)
poskytuje monosacharidy glukosa a galaktosa
galaktosoxidasa (EC 1.1.3.9)
glukosaoxidasa (EC 1.1.3.4)
MALTOSA
Biorekognikační vrstva
a-glukosidasa (EC 3.2.1.20)
mutarotasa (EC 5.1.3.3)
přeměna a-glukosy na b-glukosu
glukosaoxidasa (EC 1.1.3.4)
VITAMIN C kyselina askorbová
Biorekognikační vrstva:
askorbátoxidasa (EC 1.10.3.3)
nevzniká peroxid, ale jen voda –kyslíková elektroda
H
O
HO
H
O
OH
HO
OH
O
HO
+ ½ O2 askorbátOD

O
OH
O
+ H2 O
O
AMINY A POLYAMINY
Význam:
Enzymy:
kadaverin a putrescin = diaminy, které vznikají
působením mikroorganismů na potraviny
bílkovinného složení (sýry, maso, ovoce, sojová
omáčka, pivo, víno), indikátor čerstvosti
potravin
klinická biochemie –histamin (alergická reakce)
polyaminy (spermin a spermidin) indikátory
některých karcinomů
aminoxidasa (EC 1.4.3.6), AO
polyaminy(EC 1.5.3.11), PAO
RCH2NH2 + O2
AO, PAO
RCHO + H2O2 + NH3
MOČOVINA
Význam:
Enzym:
klinická biochemie
indikátor funkce ledvin norma: 3,6 až 9 mM
zemědělství: stanovení krmné dávky
na základě znalosti koncentrace močoviny
v kravském mléku
ureasa (EC 3.5.1.5) absolutně specifická
katalyzuje:
H2N-CO-NH2 + H2O +
2H+
ureasa
CO2 + 2NH4+
PENICILIN
Enzymy:
b-laktamasa (Penicilinasa) (EC 3.5.2.6)
penicilinamidasa (EC 3.5.1.11)
Stanovení penicilinu
S
RCONH
N
O
CH 3
CH 3
Typ penicilinu:
(R=):
G…C6H5CH2V..CHOCH-
laktamasa
CH 3
CH 3
N
COOH
O
COOH
penicilin
S
RCO N
penicilinamidasa
H 2N
S
N
O
6-APS
CH 3
CH 3
COOH
Peniciloinová
kyselina
+
R-COOH
Stanovení inhibitorů
Stanovení inhibitorů
Reakce inhibitor + enzym = snížení aktivity
imobilizovaného indikačního enzymu.
Měření inhibitorů je velmi citlivé:
molekula analytu zablokuje molekulu enzymu.
Stanovení inhibitorů:
 reverzibilní
 irreverzibilní
Stanovení reverzibilních inhibitorů
 Výchozí signál Y0 biosensoru se substrátem
 Do reakční směsi přidá vzorek s inhibitorem
= pokles signálu DY, který je přímo úměrný
koncentraci inhibitoru.
Změna signálu je obvykle rychlá a brzy dosáhne
ustáleného stavu.
 Po promytí je možné celý proces opakovat,
přitom výchozí signál se substrátem je beze změny,
nedošlo k poklesu aktivity v biorekognikační vrstvě.
S substrát
I inhibitor
DY signál
Stanovení irreverzibilních inhibitorů
 Stanoví výchozí signál
 Následuje inkubace s inhibitorem
 Stanoví se zbytkový signál DY
Kinetické měření
Inhibitor se přidá přímo do směsi se substrátem a
sleduje se časový pokles signálu dY/dt
Nevýhoda:
opakované použití biosensoru není neomezené,
aktivita postupně klesá, až dojde k úplnému
poklesu signálu.
Možnosti měření s cholinesterazovými sensory:
acetylcholin + H2O
ChE
cholin + 2 H2O + O2
kyselina octová + cholin
ChOD
betain + 2 H2O2
amperometricky
octan + H3O+
kyselina octová + H2O
inhibice organofosfáty a karbamáty
RO
R´
z
P
X
organofosfáty
O
R
N
R´
pH-sensory
X karbamáty
Stanovení enzymových aktivit
Měření enzymových aktivit
Produkt měřeného enzymu slouží jako substrát
indikačního enzymu imobilizovaného v biokatalytické
vrstvě.
Výhoda: nevadí zákal
Příklady stanovení:
laktátdehydrogenasa
a-amylasa
transaminasy
arginasa
Laktátdehydrogenasa
Význam: klinická praxe
normální hodnoty: muži: 63 až 155 U/l
ženy: 62 až 131 U/l
vzrůstá při hepatitidě nebo infarktu
Měření: substrátem je laktát a měří se produkce
pyruvátu pomocí sensoru
s pyruvátoxidasou
laktát + NAD+
pyruvát
+ fosfát +
pyruvát + NADH
kyslík
acetylfosfát
+
CO2
+
H2O2
BIOSENSOR PRO GLUKOSU
Enzymová elektroda
na jedno použití
Stanovení glukosy u diabetiků
Diabetes mellitus (cukrovka)
hyperglykemie
metabolická acidóza
glykosurie
Diabetes mellitus je chronické endokrinní a metabolické
onemocnění, vznikající v důsledku nedostatečného
působení insulinu.
Denní průběh hladin krevní glukosy
snídaně oběd
večeře spánek
snídaně
Osobní elektrochemické biosensory pro měření glukosy
První osobní glukometr fa MediSense na bázi výměnného
elektrochemického biosensoru.
Exac Tech velikost psacího pera a zasunovaly se do něj
měřící pásky na jedno použití.
Companion formát karty
Dnes MediSense patří do skupiny Abbott Laboratories
a současný glukometr má název Precision QID.
Oproti předcházejícím typům potřebuje pro analýzu
5ml krve, takže pacient je méně zatěžován.
Osobní glukometr fy MediSense
Exac Tech – velikost pera
další verze – velikost karty
OSOBNÍ GLUKOMETR V PRAXI
Jak postupovat?
Výsledek a jak jej řešit………
LABORATORNÍ ANALYZÁTORY
S BIOSENSORY
První měřil pouze glukosu, dnes měří celou řadu klinicky
významných analytů.
BIOSENSOROVÝ ANALYZÁTOR
na katedře biochemie
KOMPLIKACE PŘI MĚŘENÍ
S AMPEROMETRICKÝMI BIOSENSORY
Eliminace interferencí
 elektroaktivní látky
 produkt = látka, která je už v analyzovaném
roztoku
 nánosy organických látek na elektrodě
Výsledek
 zvýšení signálu
 snížení signálu
eliminací
by se měly veškeré interferující látky
odrušit nebo převést na nerušící produkty
Tohoto efektu se dosáhne přeřazením vhodného
eliminačního systému před vlastní biosensor.
převodník
biorekognikační
vrstva
antiinterferenční
vrstva
analyt
rušivé látky
Eliminace kyseliny askorbové
Ruší při stanovení metabolitů v krevním séru, kde
je konečnou fází amperometrická detekce peroxidu vodíku.
Eliminace:
 předřazení membrány s askorbátoxidasou
(neprodukuje peroxid vodíku)
 použití ferrikyanidu ve spojení s lakasou
(bez lakasy by vadil vzniklý ferrokyanid)
 předřadit antiinterferenční vrstvu vlastnímu
převodníku (negativně nabitá membrána
velmi hustá acetylcelulosa
 provedení elektrooxidace askorbátu ještě
před příchodem do biokatalytické vrstvy
(přeřazení platinové síťky nebo trubičky)
BIOAFINITNÍ BIOSENSORY
jeden z afinitních partnerů imobilizován
na povrchu převodníku; podle generování signálu
se pak rozlišují:
1. přímé sledování vzniku biokomplexu v čase
2. nepřímé jeden z afinitních partnerů je
vhodně označen, na konci interakce
se pak stanoví množství značky
navázané na povrchu sensoru
1. PŘÍMÉ
Přímé sledování bioafinitních interakcí probíhá v reálném
čase, bez nutnosti značení a separačních kroků.
Jeden reakční partner je imobilizován na povrchu
převodníku, druhý je volně v roztoku, průběžně se
sleduje vazba na citlivém povrchu.
Měřený signál odráží pouze změny na povrchu sensoru
a v jeho těsné blízkosti.
 OPTICKÉ (nelineární optika)
 PIEZOELEKTRICKÉ (rezonanční frekvence)
 IMPEDIMETRICKÁ ZAŘÍZENÍ
Optická vlákna
kritická mez
Šíření paprsku ve světlovodu
jádro (core) - index lomu n1
plášť (cladding) - n2, n2<n1
mechanický obal
úhel dopadu větší
než kritická mez
- paprsek se šíří
úhel dopadu menší
než kritická mez
- paprsek se tlumí
numerická apertura - úhel dopadu menší než kritická mez
JÁDRO VLÁKNA:
PLÁŠŤ:
OBAL:
PRŮMĚR VLÁKNA:
sklo
křemen (UV)
plast (levné)
silikonový
plast (polykarbonát)
stovky mm
MĚŘÍCÍ KONFIGURACE PRO OPTICKÁ
VLÁKNA
D
S
dual fibre
D
beam splitter
S
S
bifurcated
vzorek
přímé ozařování extrinsic sensing
interakce se uskutečňují na konci vlákna
nepřímé ozařování intrinsic sensing
Optický vodič neslouží pouze k pasivnímu
vedení světla, ale chemické změny
v těsném okolí světlovodu se sledují
na základě vyvolaných změněných podmínek
pro vedení světla uvnitř světlovodu.
Při vedení světla uvnitř
světlovodu dochází k interferenci
mezi dopadajícím a odraženým
2
světelným paprskem a tím vzniká
elektromagnetické stojaté vlnění.
tlumená (zhášivá) vlna
(evanescent wave).
1.Velmi tenký světlovod (tloušťka asi vlnová délka světla),
světlo se šíří v určitých diskrétních modech
(více odrazů na jednotku délky)
2. Silný světlovod
1
z
Exponenciální vlna
mod:
0
E
1
2
Na vnějším povrchu interakce s látkami
elektromagnetická vlna se šíří do okolí mimo světlovod,
přitom její intenzita klesá exponenciálně se vzdáleností
od rozhraní („exponenciální vlna“)
na vnějším povrchu světlovodu může docházet k interakcím
s přítomnými látkami
energetické profily exponenciální vlny jsou pro tři základní
mody ukázány na obrázku
pro vyšší mody narůstá podíl „vnější energie“ a zvětšuje se
penetrační hloubka
OPTICKÉ PŘEVODNÍKY
n2 opticky řidší
n1 opticky hustší
α
Vznik exponenciální vlny
Princip:Základem interakce je
interakce exponenciální vlny
s okolím sensoru.
Při dopadu paprsku šířeného
v opticky hustším prostředí
na rozhraní s řidším prostředí
pod úhlem větším než kritický (sina > n2/n1), dochází
k totálnímu vnitřnímu odrazu světla.
přitom vzniká v opticky řidším prostředí elektromagnetická
vlna vyvolaná interakcí dopadajícího a odraženého světla,
jejíž intenzita klesá exponenciálně se vzdáleností
od povrchu.
DVA TYPY OPTICKÝCH SYSTÉMŮ:
Planární světlovod ISO (integrated optical sensor)
Rozhraní kov/dielektrikum SPR surface plasmon rezonance
(rezonance elektromagnetické vlny šířené povrchovou
vrstvou kovu)
Interakcí exponenciální vlny s blízkým okolím sensoru,
dochází ke změně podmínek pro šíření světla v optickém
systému, které se kvantifikují podle změn intenzity
nebo fázového posuvu vedeného světla.
Měřený signál
změna indexu lomu
okolního roztoku
C
F (M)
x
z
C
F’
F (M)
adsorbovaná
vrstva F’
dF
Na změnu efektivního indexu
lomu DN vedeného světla mají
vliv dva procesy:
1) homogenní změna indexu
lomu DnC celého okolního
prostředí C (roztoky pufrů
nC = 1,33), systém tedy
funguje jako refraktometr
to je z hlediska sensoru
nežádoucí.
2) tvorba homogenní adsorbované
vrstvy F´je vlastní děj, má
index lomu nF´a tloušťku dF´
např. pro vrstvu bílkovin je
index lomu nF´ 1,45 – 1,55 a
tloušťka vrstvy dF 4 – 10 nm
SPR
C vzorek
M kov
S podklad
hranol
α
DAD
LED, laser
 Pro zavedení světla se používá vstupní hranol, povrchová
vlna se exituje na rozhraní mezi kovem M a dielektrickou
vrstvou C (vzorek).
 Místo hranolu lze použít i vstupní mřížku
 Jako detektor slouží řada fotodiod (DAD, diode array
detector), což umožňuje určit závislost intenzity
na úhlu odrazu
SPR signál
Vazebná reakce
=>
změna resonančních podmínek
Intensita odraž.
paprsku
úhel odrazu α


resonanční úhel odpovídající minimu intensity odraženého
paprsku je kontinuálně vyhodnocován,
jeho poloha je úměrná změnám povrchové hmotnosti
vyvolaným adsorpcí biomolekul
SPR BIOSENSOR
čip systému
BIACORE
Rozměry:
9 x 2,5 x 0,1 cm
Modifikace povrchu:
CM5 karboxymethyl-dextran, HPA hydrofobní,
SA streptavidinový, NTA komplexace kovů
firma Pharmacia
PIEZOELEKTRICKÉ BIOSENSORY
1890 Objev piezoeletrického efektu
bratři Curieové
V některých anizotropních krystalech (křemen, turmalín,
Rochellova sůl) se při mechanickém namáhání generují
orientované dipóly a vznik elektrické napětí.
Tento efekt se uplatňuje i v obráceném smyslu:
Pokud se na krystal přivede střídavé napětí o vhodné
rezonanční frekvenci, začne krystal se stejnou frekvencí
vibrovat,přitom se převážná část energie (105 : 1)
uchová v oscilujícím systému a nerozptyluje se do okolí.
Piezosensory - chemické mikrovážky
kovové elektrody
Au nebo Pt
na protilehkých stran
objemová akustická vlna schéma tloušťkové
střihové vibrace
kontakty
základní stav / amplituda
držák
destička
z křemene
AT-řez
5 až 20 MHz
Piezoelektrický krystal
Hmotnostní citlivost:
QCM - quartz crystal
microbalance
-2f
Df =
2
0 Dm
A r m
q
Rezonanční frekvenci f0 určují fyzikální vlastnosti
křemene a tloušťka destičky (čím je tenčí, tím
rychlejší vibrace a vyšší f0)
U typu QCM bývá f0 od 5 do 20 MHz, pokud by
krystal byl ještě tenčí, lámal by se.
Když dojde k navázání látky na povrch elektrod,
dojde ke změně rezonanční frekvence f0.
Změní se hmotnost celého systému a vibrace se
zpomalí – frekvence poklesne.
Pokud krystal osciluje v přítomnosti kapaliny, dojde
k dalším změnám f0 v důsledku tlumení oscilací
(viskozita prostředí)
Měření s PZ krystaly se dá provádět dvěma
způsoby:
AKTIVNÍ METODA PZ krystal je součástí
širokopásmového oscilačního obvodu, jehož
frekvence se řídí vlastnostmi krystalu aktuální
frekvence se stanoví pomocí čítače, rozlišení je
0,1 až 1 Hz při základní frekvenci 10 až 20 MHz
citlivost kolem 3 ng/Hz a mez detekce 10 ng/cm2
PASIVNÍ METODA na PZ krystal se zvenčí přivádí
střídavé napětí o známé proměnné frekvenci a
v okolí rezonance se proměří impedanční
charakteristika, závislost velikosti /Z/ a fázového
úhlu f na frekvenci. Nákladná aparatura,
impedanční analyzátor několik milionů korun,
ale odliší hmotnostní a viskózní změny.
Měřící uspořádání
počítač
pumpa
čítač (měřič
frekvence)
vzorek
odpad
oscilační
obvod
průtočná cela s krystalem
Schéma měření
Y
Y
Y Y
YY Y
Y
Y Y Y
Y
Y
Y
Y
2. asociace
se vzorkem
1. imobilizace ligandu
4. regenerace
Y
Y
Y
Y
Y
Y
Y
Y
Y
3. pufr
disociace
Y
Y
Y
Y
Y
UKÁZKA KINETICKÉ ANALÝZY
pufr
5 ug/ml
10
0.0008
15
0.0006
MAb
kobs
-1
25
(s )
0.0004
kobs = kd + ka*[Ab]
500 Hz
-1
0.0002
kd = (0.0000297 +/- 0.000017) s
-1 -1
ka = (2460 +/- 98) l mols
10 min
50
0.0000
0
100
200
[MAb] (nmol/l)
Studium interakce protilátky s imobilizovaným
haptenem pomocí píezoelektrického biosensoru
300
UKÁZKA MĚŘÍCÍHO ZAŘÍZENÍ
Biochemická laboratoř MU Brno, PřF, katedra biochemie
APLIKACE PIEZOELEKTRICKÝCH BIOSENSORŮ
Pro plynou fázi: základem je imobilizovaný afinitní ligand
reakce se vzorkem probíhala v roztoku, následovalo
promytí, vysušení a stanovení nové rezonanční frekvence
opět v suchém stavu.
Výhoda: snadná interpretace, naměřená data reprezentují
změnu hmotnosti.
Nevýhoda: těžkopádné provedení
Měření přímo v roztoku umožňuje sledovat afinitní
interakce v reálném čase. Třeba rozlišit změny
hmotnosti a viskozity, i když u běžně používaných
koncentrací biomolekul je viskozita jejich roztoků
málo odlišná od základního pufru.
Piezoelektrická metoda je rychlejší a citlivější než
klasické postupy.