CD34 QuantiFlowEx® Kit

Transkript

Lysing Solution contains 10X concentrated ammonium chloride
based solution for red blood cell lysis. Solution is fixative-free.
3. Storage and shelf life after first opening
CD34 QuantiFlowEx® Kit is stable until expiration date printed on
the product label when stored at 2-8°C.
Shelf life after first opening is not different from shelf life given on
the product label.
Do not freeze the CD34 QuantiFlowEx® Kit or any of its
components.
Do not expose the CD34 QuantiFlowEx® Kit or any of its
components to direct light during manipulation when staining
cells.
Do not use the kit after expiration date stated on primary
package label.
Avoid prolonged exposure to light. Avoid contamination of any of
the kit components.
Evidence of deterioration
In case of components deterioration seen as a visible
precipitation of the component content or a discoloration of the
component content or if data obtained show any performance
alteration, please contact manufacturer using following e-mail
address: [email protected]
Flow cytometry assay for enumeration of
viable CD34+ stem cells as a percentage of
all viable leukocytes.
h
ED7080
V
M
50 tests
C
EXBIO Praha, a.s.
Nad Safinou II 341
252 42 Vestec, Czech Republic
Tel: +420 261 090 666
Fax: +420 261 090 660
E-mail: [email protected]
www.exbio.cz
4. Warnings and precautions
Staining Reagent (ED7080-1) contains sodium azide as a
preservative. However, the concentration of sodium azide
(15mM) in the reagent is not considered as hazardous.
7-AAD (ED7080-2) contains 7-Aminoactinomycin D viability dye
which is considered a potential carcinogen. However, the
concentration of 7-AAD in the reagent is not considered as
hazardous.
Refer to the Safety Data Sheet (SDS) for a complete list of
warnings and precautions.
1. Intended use
CD34 QuantiFlowEx® Kit is intended for identification and
percentage enumeration of total viable CD34+ stem cells from
total viable leucocytes in specimens with determined white blood
cell (WBC) count.
The following specimens can be analyzed using the CD34
QuantiFlowEx® Kit: normal and mobilized peripheral blood, fresh
and thawed leukapheresis products, fresh and thawed bone
marrow, and fresh and thawed cord blood.
The kit is intended for in vitro diagnostic (IVD) use in combination
with a flow cytometer equipped with appropriate light scatter and
fluorescence detectors and appropriate software for data
acquisition and analysis.
5. Principles of the examination method
This method is based on specific binding of monoclonal antibody
to the target antigen expressed on the cell surface. Specific
monoclonal antibody bound to an antigen is covalently
conjugated with a fluorescent probe, which is excited by
corresponding laser beam from the appropriately equipped flow
cytometer. Subsequent emission of light from the particular
fluorescent probe is collected and analyzed by a flow cytometer
in a dedicated fluorescence detector. Differences in cell
fluorescence intensity enable separation of cell subsets based on
the expression of the analyzed antigen.
Staining of cells expressing the target antigen is accomplished by
incubating suspension of cells with the monoclonal antibody
reagent followed by a lysis of red blood cells. Stained cells are
subjected to analysis by a flow cytometer.
2. Components
CD34 QuantiFlowEx® Kit, sufficient for 50 tests, is provided with
the following reagents:
Cat. No.
ED7080-1
ED7080-2
ED7080-3
Component Name
Staining Reagent
7-AAD
Lysing Solution
Size
1 ml
1 ml
15 ml
Qty
1 pc
1 pc
1 pc
Staining Reagent contains pre-mixed cocktail of anti-CD45
FITC, clone MEM-28, and anti-CD34 PE, clone 4H11(APG),
monoclonal antibodies. Labeled antibodies are diluted and
cocktailed at optimum concentration in stabilizing phosphate
buffered saline (PBS) solution containing 15mM sodium azide.
7-AAD contains pre-diluted 7-Aminoactinomycin D (7-AAD) cell
viability dye in stabilizing phosphate buffered saline (PBS)
solution containing 15mM sodium azide.
6. Additional required equipment
Materials required but not supplied
Disposable 12 × 75 mm test tubes for specimen staining
BD Trucount™ Tubes (5 ml) containing fluorescent cell count
standard for use with Becton Dickinson cytometers (Optional)
1/8
ED7080_EN_160422
Automatic pipettes with disposable tips
Vortex mixer
Beckman Coulter Flow-Count™ Fluorospheres - fluorescent cell
count standard for Becman Coulter cytometers (Optional)
Hematology analyzer capable of exact leukocyte counting
CD34 control, e.g. CD-Chex CD34®, CD34 control – 3 levels
(Streck, cat. # 213337, 213347, 213383)
Instrument requirement
A flow cytometer equipped with a suitable excitation source and
detectors for light scatter and appropriate fluorescence. The
cytometer must be equipped with appropriate software for data
acquisition and analysis.
Laser alignment and regular cytometer calibration using
fluorescent particles is strongly advised in order to achieve the
optimum sensitivity, reproducibility and precision.
9. Examination procedure
Specimen Staining – Single Platform method
For the examination of one blood specimen, one test tube is
sufficient.
For a Becton Dickinson cytometers, BD Trucount™ Tube may be
used as a test tube for absolute CD34 stem cell counting.
1. Add 20 µl of ED7080-1 Staining Reagent to a test tube.
2. Add 20 µl of ED7080-2 7-AAD to a test tube.
3. Add 100 µl of blood specimen to the tube using reverse
pipetting technique.
Note 1: For CD34+ stem cell percentage enumeration pippeting
accuracy is critical. Therefore reverse pipetting technique using
automatic air displacement pipette is highly advised.
For reverse pipetting sample aspiration, depress pipette knob to
its 2nd stop and aspirate sample. Then place the pipette tip
containing blood sample near the tube bottom and depress
pipette knob to its 1st stop for sample dispensing.
Note 2: Avoid sample smears from pipette tips on the tube walls.
Sample smears will not be stained by the ED7080-1 Staining
reagent and will be resuspended by the pre-diluted ED7080-3
Lysing solution (see step 6) upon vortexing. Such cells from
blood smears may negatively influence live CD34+ stem cell
percentage enumeration.
4. Vortex gently.
5. Incubate for 20-30 minutes at room temperature in the dark.
6. Add 2 ml of pre-diluted ED7080-3 Lysing Solution (for
preparation of the diluted reagent, refer to Section 7 Reagent
preparation).
7. Incubate for 10 minutes at room temperature in the dark.
8. Vortex gently
9. For use with Beckman Coulter® cytometer Flow-Count™
Fluorospheres may be used for absolute CD34 stem cell
counting:
Add 100 µl of Flow-Count™ Fluorospheres using reverse
pipetting technique (refer to step 3). For further instructions refer
to Flow-Count™ manufacturer’s instructions.
10. Vortex tube to reduce aggregation prior to flow cytometry
analysis.
7. Reagent preparation
Kit component ED7080-1 Staining reagent is ready to use.
Kit component ED7080-2 7-AAD is ready to use.
Kit component ED7080-3 Lysing Solution must be diluted prior to
the use. Prepare lysing solution for red blood cell lysis by mixing
1 part of ED7080-3 Lysing solution with 9 parts of deionized
water (e.g. mix 1 ml of ED7080-3 Lysing solution with 9 ml of
deionized water).
8. Specimen
Sample intended for examination must be collected into a
suitable container specific for the type of specimen. Presence of
anticoagulant in the container, e.g. EDTA, citrate or heparin is
required for collection of blood material.
Storage and handling conditions for different specimen types
may differ and should be considered prior to collection and
analysis.
Sample vitality decreases with time after collection and
manipulation with the specimen, e.g. freezing / thawing may
directly influence results due to possible loss of specific cell
subsets.
Samples with low cell viability promote non-specific binding of
reagents to dead cells.
Analyze all samples within 24 hours. Prolonged storage of a
sample decreases cell viability.
Do not use previously fixed and stored specimens. Reject
haemolyzed, clotted, or clumped specimens.
If the WBC count of a sample is greater than 40 x 103 cells/µL,
dilute the specimen according to standard laboratory procedures,
using PBS with 0.5% bovine serum albumin (BSA) (not part of
CD34 QuantiFlowEx® Kit). Use reverse pipetting to dilute the
sample. Record and enter the dilution factor for the calculation of
the final CD34 result, refer to Section 11 Calculation of
examination results.
Specimen Staining – Dual Platform method
Prior to flow cytometry run blood sample intended for analysis on
a hematology analyzer in order to define exact white blood cell
count per µl of blood material. Refer to hematology analyzer
manufacturer’s instructions for exact procedure.
For the examination of one blood specimen, one test tube is
sufficient.
1. Add 20 µl of ED7080-1 Staining Reagent to a test tube.
2. Add 20 µl of ED7080-2 7-AAD to a test tube.
3. Add 100 µl of blood specimen to the tube using reverse
pipetting technique.
Note 1: For CD34+ stem cell percentage enumeration pipetting
accuracy is critical. Therefore reverse pipetting technique using
automatic air displacement pipette is highly advised.
For reverse pipetting sample aspiration depress pipette knob to
its 2nd stop and aspirate sample. Then place the pipette tip
containing blood sample near the tube bottom and depress
pipette knob to its 1st stop for sample dispensing.
WARNING All biological specimens and material coming in
contact with them are considered biohazards and should be
handled as if capable of transmitting infection. Appropriate safety
precautions and handling procedures must be applied in
accordance with applicable laws and regulations.
2/8
ED7080_EN_160422
(Perpendicular) Light Scatter (both Signal Area and Signal
Height).
Measure sample and acquire listmode data using software
intended for sample analysis supplied with cytometer.
Note 2: Avoid sample smears from pipette tips on the tube walls.
Sample smears will not be stained by the ED7080-1 Staining
reagent and will be resuspended by the pre-diluted ED7080-3
Lysing solution (see step 6) upon vortexing. Such cells from
blood smears may negatively influence live CD34+ stem cell
4. Incubate for 20-30 minutes at room temperature in the dark.
5. Add 2 ml of pre-diluted ED7080-3 Lysing Solution (for
preparation of the diluted reagent, refer to Section 7 Reagent
preparation).
6. Incubate for 10 minutes at room temperature in the dark.
7. Vortex tube to reduce aggregation prior to flow cytometry
analysis.
Data Analysis
Emission spectra of FITC, PE and 7-AAD overlap. Compensation
of measured data is required prior to analysis. Non-compensated
CD45 FITC fluorescence increases background in PE detector,
decreasing sensitivity of CD34 PE. Non-compensated CD34 PE
fluorescence increases background in 7-AAD detector, and viceversa.
It is highly advised to prepare controls for compensation
purposes.
Note: Samples with expected low cell viability should be used for
preparation of 7-AAD compensation control. Samples with high
cell viability provide low number of dead cells. Low dead cell
count may negatively influence mean dead cell 7-AAD
fluorescence intensity and may produce inadequate
compensation.
Flow Cytometry analysis
Analyze stained samples using flow cytometer. Refer to
Section 6 Instrument requirements.
1. Single Platform method
Set threshold on fluorescence in FITC detector rather than event
size for data collection. Threshold on Forward Scatter (event
size) may exclude microparticle events from count standard from
analysis which would negatively influence CD34+ stem cell
Depending on the sample specimen, acquire at least 300,000 –
1,000,000 events per tube.
Always acquire cell light scatter parameters: Forward Angle Light
Scatter (both Signal Area and Signal Height) and Side
(Perpendicular) Light Scatter (both Signal Area and Signal
Height).
Measure sample and acquire listmode data using software
intended for sample analysis supplied with cytometer.
2. Dual Platform method
Set threshold on Forward Scatter.
Depending on the sample specimen acquire at least 300,000 –
1,000,000 events per tube.
Always acquire cell light scatter parameters: Forward Angle Light
Scatter (both Signal Area and Signal Height) and Side
Analyze measured and compensated data using appropriate
software. For enumeration of percentage of live CD34+ stem cells
a protocol according to International Society for Hematotherapy
and Graft Engineering, so called ISHAGE1 protocol, must be
applied.
Using 5 parameters: 2 light scatter parameters and 3 fluorescent
parameters CD34+ hematopoietic stem cells are identified by a
combination of sequential and Boolean gating according to their
properties.
True CD34+ stem cells express CD34 and CD45 antigen,
however CD45 expression is similar to that of blast cells. Staining
intensity is detectable but lower than in e.g. lymphocytes.
True CD34+ stem cells also provide forward angle light scatter
signal similar to blast cells or lymphocytes and exhibit low
rectangular light scatter properties (side scatter).
3/8
ED7080_EN_160422
Figures 1-5 show sequence of logical gating ensuring accurate identification of live CD34+ stem cells for accurate percentage
enumeration.
Fig.1: Image in the left represents all gated events from Regions A, B,
C, G (derived from Region F) and I.
First, place a gate around live cells on a Side Scatter Signal Area
(SSC-A) vs. 7-AAD viability staining dot-plot as shown as Region A.
Note: When using stabilized blood control as e.g. Streck CD-Chex
CD34® it is strongly advised to check viability Region A and reposition
the region if necessary as stabilized blood contains formaldehyde which
causes cell membrane permeability to a 7-AAD viability dye making all
the cells 7-AAD positive.
Fig. 3: Place regions around fluorescent microparticle count standard as
depicted above. Region I delineates microparticles from BD TruCount™
standard acquired on BD FACSCanto™ cytometer and Region J
delineates microparticles from Beckman Coulter’s Flow-Count™
microparticles acquired on a Beckman Coulter Navios cytometer.
Fig. 2: Visualize cells from Region A in a SSC-A vs. CD45 FITC dot-plot
and place gate around leukocytes represented as Region B and a gate
around lymphocytes represented as Region C.
Bring cells from Region B to a SSC-A vs. CD34 PE dot-plot and place
gate around CD34 positive events as shown in Region D.
Image on the right shows events from fluorescent microparticles from
Region I depicted in Regionu E.
Region E indicates optical and fluorescent properties of fluorescent
microparticle count standard present in the BD TruCount™ Tube.
Fig. 4: Clarify CD34 positive events from Region D by placing a Region
F around dim CD45 positive cell cluster in a SSC-A vs CD45 FITC dotplot with events from Region D as shown in the pictue on the left..
Display events from Region C in a SSC-A vs Forward Scatter Signal
Height (FSC-H) dot-plot. Place new gate around lymphocytes from
Region C as shown as a Region G.
4/8
ED7080_EN_160422
Live CD34+ stem cell percentage enumeration from all live
leukocytes:
%
34
34
100
CD34 Abs live CD34+ stem cell absolute count per 1 µl of
WBCAbs
%CD34
Fig. 5: Copy Region G delineating lymphocytes to events from Region
F visualized in a SSC-A vs FSC-H dot-plot in order to differentiate the
cluster of CD34+ stem cells from smaller events like debris. Region G
depicts True CD34+ stem cells.
Bring events from Region I or Region J to a CD45 FITC vs Time dot-plot
a place a gate Region H around singlet counting beads as shown in the
picture on the right.
Note 1: Counting bead size and fluorescence properties may differ
between different manufacturers. Fig. 3 represents size and fluorescent
properties of beads present in BD TruCount™ Tube or Beckman Coulter
Flow-Count™ Fluorospheres.
Note 2: Any non-homogeneity or non-linearity of event acquisition
(disturbance in acquisition, decrease in fluorescence) in Region H
should be considered for a review. Such non-homogenous acquisition of
events or acquisition that is not perpendicular to CD45 FITC axis
indicates problems with fluidics of a flow cytometer.
RegionB
RegionG
RegionH
PM
DF
blood material
live leukocyte absolute count per 1 µl of blood
material
percentage of live CD34+ stem cells from all live
leukocytes
number of events in Region B (leukocytes)
number of events in Region G (stem cells)
number of events in Region H (microparticles)
microparticle count per 1 µl of evaluated
specimen indicated by microparticle’s
manufacturer
dilution factor (dilution of blood material before
staining); DF = 2 means that 1 part of blood
material (100 µl) was diluted using 1 part of PBS
containing 0,5% BSA (100 µl)
Dual platform analysis
Use hemotology analyzer for to define leukocyte count per µl of
sample. Refer to hematology analyzer manufacturer’s
instructions.
Use equations below for percentage and absolute count
enumeration of live CD34+ stem cells from all live leukocytes.
10. Control procedure
Set voltage on fluorescence detectors of interest using a normal
sample. Voltage on a PMT should be set high enough so that
minimum of negatively stained events interfere with 0th channel
fluorescence axis.
Run a CD34 control, e.g. Streck CD-Chex CD34® prior to sample
analysis.
Refer to manufacturer’s cytometer specifications for fluorescence
detectors in which emission of fluorescence of antibody stained
CD45+, CD34+ and 7-AAD+ events is collected according to the
emission characteristics of fluorochrome.
Live CD34+ stem cell absolute count enumeration per 1 µl of
blood material:
34
Live CD34+ stem cell percentage enumeration from all live
leukocytes:
%
11. Calculation of results from examination
34
100
Single platform analysis
Use equations below for percentage and absolute count
enumeration of live CD34+ stem cells from all live leukocytes.
CD34 Abs live CD34+ stem cell absolute count per 1 µl of
Live CD34+ stem cell absolute count enumeration per 1 µl of
blood material:
34
%CD34
Live leukocyte absolute count enumeration per 1 µl of blood
material:
DF
WBCAbs
RegionB
RegionG
5/8
blood material
live leukocyte absolute count per 1 µl of blood
material defined using hematology analyzer
percentage of live CD34+ stem cells from all live
leukocytes
number of events in Region B (leukocytes)
number of events in Region G (stem cells)
dilution factor (dilution of blood material before
staining); DF = 2 means that 1 part of blood
material (100 µl) was diluted using 1 part of PBS
containing 0,5% BSA (100 µl)
ED7080_EN_160422
12. Performance characteristics
CD-Chex
replicates
Specificity
Monoclonal antibody MEM-28 reacts 2 with all alternative forms of
human CD45 antigen (Leukocyte Common Antigen), a 180-220
kDa single chain type I transmembrane protein expressed at high
level on all cells of hematopoietic origin, except erythrocytes and
platelets.
Monoclonal antibody 4H11[APG] reacts 3 with Class III epitope of
human CD34 antigen (Mucosialin), a 110-115 kDa monomeric
transmembrane phosphoglycoprotein expressed on
hematopoietic progenitors cells and on the most pluripotential
stem cells; it is gradually lost on progenitor cells.
(n = 5)
Expected
range
Expected
mean value
[%]
Mean value
obtained
[%]
SD
CV
[%]
95% of
values Range
Level 1
0,02 – 0,12
0,07
0,087
0,006
7,13
0,075 - 0,099
Level 2
0,41 – 0,63
0,52
0,544
0,023
4,23
0,498 - 0,590
Level 3
1,38 – 1,98
1,68
1,610
0,03
1,86
1,55 - 1,67
3. Degree of agreement between 4 different methods of obtaining
CD34+ and CD45+ absolute count and CD34%.
CD34 QuantiFlowEx® kit was used for CD34+ absolute count
and CD34 % enumeration together with two other commercially
available parallel products intended for CD34+ stem cell
percentage and absolute count enumeration in combination with
Single and Dual Platform Method.
4 different patient specimens were analyzed in (n = 3) replicates
for CD34+ absolute count and CD34 % enumeration using Single
platform method on a BD FACSCanto™ cytometer and Beckman
Coulter Navios cytometer. For CD34+ absolute count and CD34
% enumeration using Dual platform method BD FACSCanto™
cytometer, Beckman Coulter Navios cytometer and a Sysmex
XN-1000™ hematology analyzer were used. Data is shown in the
table below.
Accuracy of method
Accuracy of method was established by 3 different experiments
carried out on different sites and on different number of
specimens.
1. Degree of agreement between expected results obtained by
accredited method using other commercially available reagent
and CD34 QuantiFlowEx® kit
Specimens of different origin (bone marrow, peripheral blood and
peripheral blood apheresis product from Hematology and
Oncology (n = 23) were collected and analyzed using both
accredited method and using CD34 QuantiFlowEx® kit.
Dual platform method involving hematology analyzer and a BD
FACSCato™ II cytometer was used as a method of choice for
obtaining data. Results were analyzed in terms of linear
regression.
Live CD34+ stem cell percentage enumeration from all live leukocytes [%]
BD FACSCanto™ cytometer
Beckman Coulter Navios cytometer
Commercial parallel
No. 1, Single Platform
analysis
CD34 QuantiFlowEx kit,
Dual Platform analysis
Commercial parallel
analysis
0,088
0,086
0,111
0,117
0,680
0,765
0,747
0,703
0,944
1,000
1,210
1,320
0,363
0,345
0,359
0,375
2,50
Live CD34+ stem cell percentage enumeration using BD
FACSCanto™ cytometer
y = 0,9921x + 0,01
R² = 0,9873
2,00
1,200
1,50
Dual Platform method [%]
Data obtained using CD34 QuantiFlowEx®kit [%]
Accuracy of method in CD34 percentage enumeration
1,00
0,50
0,00
0,00
0,50
1,00
1,50
2,00
2,50
y = 1,0987x - 0,0212
R² = 0,994
1,000
0,800
0,600
0,400
0,200
0,000
0,000
Data obtained by accredited method [%]
0,200
0,400
0,600
0,800
1,000
1,200
Single Platform method [%]
2. Degree of agreement between expected results using CD34
standard and CD34 QuantiFlowEx® kit
Live CD34+ stem cell percentage enumeration using
CD34 standard from Streck CD-Chex® CD34 was used in three
different levels of CD34+ cells present in stabilized blood sample.
Replicate analyses (n = 5) were evaluated whether the acquired
results of CD34 % fall within expected range specified in Streck
CD-Chex® CD34 product datasheet.
Dual Platform method [%]
1,400
Dual platform method involving hematology analyzer and a BD
FACSCato™ cytometer was used as a method of choice for
obtaining data shown in the table below.
y = 1,0778x - 0,0256
R² = 0,9898
1,200
1,000
0,800
0,600
0,400
0,200
0,000
0,000
0,200
0,400
0,600
0,800
1,000
1,200
1,400
Single Platform method [%]
6/8
ED7080_EN_160422
Precision
Intralaboratory precision of method was established on one site
by two operators using one flow cytometer in two different days.
CD34 standard from Streck CD-Chex® CD34 was stained and
analyzed in two different levels of CD34+ cell concentration in
replicate analysis (n = 5 and n = 6). Percentage of CD34+ cells
present in CD34 standard (stabilized blood sample) within a 0 –
200 cells / µl dynamic range was calculated and evaluated.
Below pooled mean, pooled SD and pooled CV (%) of CD34 %
obtained by two operators is presented.
Live CD34+ stem cell absolute count enumeration from all live leukocytes [cell count / µl]
Commercial parallel
analysis
28,2
32,1
Commercial parallel
analysis
26,2
772,2
1051,8
724,6
1073,0
3817,2
4349,7
3673,2
4780,3
18,8
17,9
18,2
18,6
31,3
Dual Platform method [cells / µl]
Live CD34+ stem cell absolute count enumeration using
5000,0
4500,0
4000,0
3500,0
3000,0
2500,0
2000,0
1500,0
1000,0
500,0
0,0
y = 1,1331x + 49,489
R² = 0,9982
Operator 1
n
Level 1
Mean
Level 1
SD
Level 1
CV (%)
Level 3
Mean
Level 3
SD
Level 3
CV (%)
5
0,07
0,006
8,73
1,52
0,032
2,08
Operator 2
6
0,05
0,004
9,52
1,32
0,013
0,96
Pooled
11
0,06
0,011
20,26
1,41
0,107
7,56
13. Biological reference intervals
0,0
Biological reference interval was calculated from specimens
acquired from patients (n = 19) before mobilization of CD34+
stem cells and from those undergoing mobilization of CD34+
stem cells.
500,0 1000,0 1500,0 2000,0 2500,0 3000,0 3500,0 4000,0 4500,0
Single Platform method [cells / µl]
Live CD34+ stem cell absolute count enumeration using
Min
Dual Platform method [cells / µl]
Absolute
6000,0
y = 1,2968x + 35,668
R² = 0,9991
5000,0
* 10^3 / µl
Absolute CD34+ / µl
CD34 %
n = 19
Max
Mean
SD
1,5
41,6
17,7
14,6
1,38
158,08
50,8
43,2
0,02
2,23
0,6
0,6
4000,0
14. Limitations
3000,0
2000,0
Product labelled as CE IVD is intended for In Vitro Diagnostic
use in laboratories outside the USA and Canada.
Prepared (stained and lysed) samples must be analyzed within
2 hours after sample preparation.
Samples that are not to be analyzed immediately after sample
preparation must be placed in a refrigerator or placed on a wet
ice.
Do not dilute or freeze the reagents of the CD34 QuantiFlowEx®
kit. Do not pipette reagent volumes other than specified in
Section 9 Examination procedure.
Non-accurate results may be obtained if Regions are improperly
set.
1000,0
0,0
0,0
500,0
1000,0
1500,0
2000,0
2500,0
3000,0
3500,0
4000,0
Single Platform method [cells / µl]
Linearity
11 serial dilutions each in replicate measurements for CD34+
absolute count (n = 3) were carried out using peripheral whole
blood spiked with CD34+ cells. Samples were stained using
CD34 QuantiFlowEx® kit and analyzed on a BD FACSCanto™
cytometer. Linear regression was used for evaluation of expected
value against mean recovered value at each dilution.
Recovered absolute CD34+ count [cells / µl]
CD45+
15. References
Linearity range of method
3000
1. Sutherland et. al. Journal of Hematotherapy 5:213-226, 1996
2. HLDA III Workshop Oxford 1987; WS Code NL 833a
3. HLDA VI Workshop Kobe 1996; WS Code M MA58
y = 1,0648x + 4,8404
R² = 1
2500
2000
1500
16. Trademarks
1000
FlowEx® is a registered trademark of EXBIO Praha, a.s.
FACSCanto™ is a registered trademark of BD Biosciences, San
Jose
TruCount™ is a registered trademark of BD Biosciences, San
Jose
Flow-Count™ is a registered trademark of Beckman Coulter® 500
0
0
500
1000
1500
2000
2500
3000
Expected absolute CD34+ count [cells / µl]
7/8
ED7080_EN_160422
17. Symbols
V
h
g
M
i
l
H
X
In Vitro Diagnostics Medical Device
Catalog Number
Batch Code
Manufacturer
Consult instructions for use
Store within temperature limits
Use by
Sufficient for <n> tests
8/8
ED7080_EN_160422
Komponenta 7-AAD obsahuje naředěný 7-Aminoactinomycin D
(7-AAD), vitální barvičku v optimální koncentraci ve stabilizačním
fosfátovém roztoku (PBS) obsahujícím 15mM azid sodný.
Komponenta Lysing Solution obsahuje 10X koncentrovaný
roztok na bázi chloridu amonného určený k lyzi červených
krvinek. Roztok neobsahuje fixativum.
3. Skladování a doba použitelnosti po prvním
otevření
Cytometrická souprava pro určení počtu
živých CD34+ kmenových buněk vyjádřených
jako procento ze všech živých leukocytů.
h
ED7080
V
M
Souprava CD34 QuantiFlowEx® Kit si zachová funkční
charakteristiky skladováním při teplotě 2-8°C do data exspirace
vytištěné na produktové etiketě.
Doba použitelnosti produktu se po prvním otevření neliší od doby
exspirace uvedené na produktové etiketě.
Nezamrazujte soupravu CD34 QuantiFlowEx® Kit, ani žádnou
komponentu soupravy.
Nevystavujte soupravu CD34 QuantiFlowEx® Kit, ani žádnou
komponentu soupravy přímému světlu při manipulaci nebo při
značení buněk.
Nepoužívejte soupravu po uplynutí doby exspirace uvedené na
produktové etiketě.
Zamezte dlouhodobé expozici soupravy světlu. Zamezte
kontaminaci komponent soupravy.
Projevy zhoršení kvality
V případě zhoršení kvality komponent soupravy projevující se
viditelnou precipitací obsahu komponenty nebo změnou zbarvení
obsahu komponenty nebo v případě získání výsledků
naznačujících změnu kvality produktu, kontaktujte prosím
výrobce na e-mail adresu: [email protected]
50 tests
C
EXBIO Praha, a.s.
Nad Safinou II 341
Tel: +420 261 090 666
Fax: +420 261 090 660
www.exbio.cz
1. Zamýšlené použití
Souprava CD34 QuantiFlowEx® Kit je určená pro identifikaci a
pro stanovení procentuálního zastoupení všech živých CD34+
kmenových buněk ze všech živých leukocytů v krevním materiálu
se stanoveným počtem leukocytů.
Vzorky krevního materiálu, které lze hodnotit použitím soupravy
CD34 QuantiFlowEx® Kit: normální plná krev a mobilizovaná plná
krev, čerstvé a rozmražené produkty leukafereze, čerstvá a
rozmražená kostní dřeň, čerstvá a rozmražená pupečníková
krev.
Souprava je určená pro In Vitro Diagnostické použití (IVD)
v kombinaci s průtokovým cytometrem vybaveným vhodnými
detektory pro rozptyl světla a fluorescenci a programem určeným
pro získání a analýzu cytometrických dat.
4. Upozornění a opatření
Komponenta Staining Reagent (ED7080-1) obsahuje konzervant
azid sodný. Použitá koncentrace azidu sodného (15mM) však
není považována jako nebezpečná.
Komponenta 7-AAD (ED7080-2) obsahuje 7-Aminoactinomycin
D vitální barvičku, která je potenciální karcinogen. Použitá
koncentrace 7-Aminoactinomycin D však není považována jako
nebezpečná.
Pozorně si pročtěte bezpečnostní list (SDS) pro kompletní
seznam upozornění, nebezpečí a opatření.
2. Složení soupravy
5. Princip metody
Souprava CD34 QuantiFlowEx® Kit, postačuje pro provedení 50
testů a skládá se z následujících jednotlivých komponent:
Kat. č.
Název komponenty
Velikost
balení
ED7080-1
ED7080-2
ED7080-3
Staining Reagent
7-AAD
Lysing Solution
1 ml
1 ml
15 ml
Počet
1 ks
1 ks
1 ks
Tato metoda je založená na specifické vazbě monoklonální
protilátky na cílový antigen exprimovaný na povrchu buněk.
Specifická monoklonální protilátka je kovalentně konjugována
s fluorescenční značkou excitovatelnou vhodným zdrojem záření
(laserový paprsek) z cytometru. Následující emise záření
fluorescenční značky je detekována a analyzována průtokovým
cytometrem v odpovídajícím fluorescenčním detektoru. Rozdíly v
intenzitě fluorescence buněk umožňují separaci buněčných subpopulací na základě exprese analyzovaného antigenu.
Značení buněk exprimujících cílový antigen je provedeno
inkubací suspenze buněk s monoklonální protilátkou a následnou
lyzí červených krvinek. Značené buňky jsou poté analyzovány
pomocí průtokového cytometru.
Komponenta Staining Reagent obsahuje koktejl naředěných
monoklonálních protilátek anti-CD45 FITC, klon MEM-28 a antiCD34 PE, klon 4H11(APG). Značené protilátky jsou naředěné
v optimální koncentraci ve stabilizačním fosfátovém roztoku
(PBS) obsahujícím 15mM azid sodný.
1/8
ED7080_CZ_160427
Pro analýzu nepoužívejte předem fixované a skladované krevní
vzorky. Z analýzy vyřaďte vzorky jevící známky hemolýzy,
sraženin nebo shluků.
V případě, že počet WBC je vyšší než 40 x 103 buněk/µL,
nařeďte krevní vzorek podle standardních postupů laboratoře,
pomocí PBS fosfátového pufru obsahujícího 0.5% hovězí sérový
albumin (není součástí soupravy CD34 QuantiFlowEx® Kit).
Použijte reverzní pipetování pro naředění krevního vzorku.
Zaznamenejte ředící faktor pro hodnocení výsledků počtu CD34
buněk, viz Sekce 11 Počítání a vyhodnocení výsledků.
6. Další potřebné vybavení
Potřebný materiál, který není dodáván
Jednorázové zkumavky s rozměrem 12 × 75 mm pro značení
krevního materiálu
BD Trucount™ Tubes zkumavky (5 ml) obsahující fluorescenční
vnitřní standard pro počítání buněk pro použití s cytometry
Becton Dickinson (Volitelný)
Automatické pipety s jednorázovými špičkami
Vortex mixer
Beckman Coulter Flow-Count™ Fluorospheres - fluorescenční
vnitřní standard pro počítání buněk pro použití s cytometry
Beckman Coulter (Volitelný)
Hematoanalyzátor umožňující stanovení počtu leukocytů (dál
jenom WBC) na µl krevního materiálu
CD34 kontrola, např. CD-Chex CD34®, CD34 control – 3 levels
(Streck, kat. č. 213337, 213347, 213383)
Přístrojové vybavení
Průtokový cytometr vybavený vhodným zdrojem excitace a
detektory rozptylu světla a fluorescence. Cytometr musí být
vybavený vhodným programem pro získání a analýzu
cytometrických dat.
Pro nejvyšší citlivost, reprodukovatelnost a přesnost metody je
doporučené pravidelné nastavení laserů (laser alignment) a
pravidelná kalibrace cytometru pomocí fluorescenčních
mikropartikulí.
Upozornění Každý krevní vzorek a materiál musí být při
kontaktu považován jako potenciálně nebezpečný a infekční a
stejně tak s ním musí být i nakládáno. S krevním materiálem
manipulujte podle správných postupů pro zacházení
s potenciálně infekčním materiálem.
9. Postup vyšetření
Značení krevního vzorku – Single Platform metoda
Pro vyšetření jednoho krevního vzorku postačuje 1 zkumavka.
BD Trucount™ Tube zkumavky můžou být použité pro stanovení
absolutního počtu CD34 kmenových buněk při použití cytometru
společnosti Becton Dickinson. Pro další informace si pozorně
pročtěte instrukce výrobce k produktu BD Trucount™ Tube
1. Pipetujte 20 µl ED7080-1 Staining Reagent do zkumavky.
2. Pipetujte 20 µl ED7080-2 7-AAD do zkumavky.
3. Pipetujte 100 µl krevního vzorku do zkumavky metodou
reverzního pipetování.
Poznámka 1: Pro stanovení procenta CD34+ kmenových buněk
je důležitá přesnost a správnost pipetování. Doporučeno je proto
reverzní pipetování automatickou pipetou pracující na principu
nasátí a vytlačení vzduchu.
Pro nasátí vzorku reverzním pipetováním stlačte píst pipety až
na druhou zarážku a nasajte vzorek. Poté udržujte špičku pipety
u dna zkumavky a stlačte píst po první zarážku pro pipetování
vzorku. Zbylý vzorek ve špičce pipety odstraňte spolu se špičkou
pipety.
Poznámka 2: Zamezte roztírání krevního vzorku špičkou pipety
na stěnách zkumavky. Rozetřený krevní vzorek nebude
označený komponentou ED7080-1 Staining reagent a při lyzi
buněk bude rozpuštěný v ED7080-3 Lysing solution (viz Bod 6)
při vortexování. Neoznačené buňky krevního vzorku rozetřeného
na stěnách zkumavky můžou negativně ovlivnit počítání živých
CD34+ kmenových buněk.
4. Zkumavku jemně vortexujte.
5. Inkubujte 20-30 minut při laboratorní teplotě v temnu.
6. Pipetujte 2 ml ředěné komponenty ED7080-3 Lysing Solution
(příprava ředěného lyzačního roztoku, viz Sekce 7 Příprava
komponent před použitím).
7. Inkubujte 10 minut při laboratorní teplotě v temnu.
9. Flow-Count™ Fluorospheres fluorescenční mikropartikule
můžou být použité pro stanovení absolutního počtu CD34
kmenových buněk při použití cytometru společnosti Beckman
Coulter®.
7. Příprava komponent před použitím
Komponenta soupravy ED7080-1 Staining reagent je připravená
k okamžitému použití.
Komponenta soupravy ED7080-2 7-AAD je připravená
k okamžitému použití.
Komponenta soupravy ED7080-3 Lysing Solution musí být před
použitím naředěná. Připravte lyzační roztok pro lyzi červených
krvinek smícháním 1 objemu ED7080-3 Lysing solution s 9
objemy deionizované vody (např. smíchejte 1 ml ED7080-3
Lysing solution s 9 ml deionizované vody).
8. Vzorek, krevní materiál
Vzorek určený k vyšetření musí být odebraný do vhodné
odběrové zkumavky, specifické pro druh krevního materiálu.
Vyžadovaná je přítomnost antikoagulantu např. EDTA, citrát
sodný nebo heparin ve zkumavce pro odebrání krevního
materiálu.
Manipulace a skladovací podmínky pro různé druhy krevních
materiálů se můžou mezi sebou lišit a je nutné je vzít v úvahu
před odběrem a dalším zpracováním materiálu.
Životnost buněk v krevním materiálu klesá s časem od odebrání
materiálu a s každou manipulací s materiálem, např. cyklus
zamražení / rozmražení může přímo ovlivnit výsledky vyšetření,
kvůli možné ztrátě specifické sub-populace buněk.
U vzorků materiálu s nízkou životností buněk může být
pozorována nespecifická vazba obsahu reagence na mrtvé
buňky.
Analyzujte všechny označené krevní vzorky do 24 hodin od jejich
přípravy. Delší skladování označených vzorků snižuje životnost
buněk.
Reverzním pipetováním (viz Krok 3)pipetujte 100 µl FlowCount™ Fluorospheres fluorescenční vnitřní standard. Pro další
2/8
ED7080_CZ_160427
Analyzujte označený vzorek programem dodávaným
s cytometrem.
2. Dual Platform metoda
Podle druhu a stavu krevního vzorku najímejte 300000 –
1000000 událostí na zkumavku.
Vždy jímejte informace o rozptylu světla analyzovanou událostí:
Pro přední rozptyl světla (Forward Scatter) jímejte výšku signálu i
šířku signálu způsobeného událostí na fotodetektoru.
Pro boční rozptyl světla (Side Scatter) jímejte výšku signálu i
Analyzujte označený vzorek programem dodávaným
s cytometrem.
informace si pozorně pročtěte instrukce výrobce k produktu FlowCount™.
10. Zkumavku vortexujte pro snížení tvorby agregátů před
analýzou na průtokovém cytometru.
Značení krevního vzorku – Dual Platform metoda
Před analýzou na průtokovém cytometru změřte krevný vzorek
určený k vyšetření pomocí hematoloanalyzátoru pro stanovení
počtu WBC na 1 µl krevního materiálu. Pro postup stanovení
počtu WBC a další informace si pozorně pročtěte instrukce
výrobce k hematoanalyzátoru.
Pro vyšetření jednoho krevního vzorku postačuje 1 zkumavka.
1. Pipetujte 20 µl ED7080-1 Staining Reagent do zkumavky.
2. Pipetujte 20 µl ED7080-2 7-AAD do zkumavky.
3. Pipetujte 100 µl krevního vzorku do zkumavky metodou
reverzního pipetování.
Poznámka 1: Pro stanovení procenta CD34+ kmenových buněk
je důležitá přesnost a správnost pipetování. Doporučeno je proto
reverzní pipetování automatickou pipetou na principu nasátí a
vytlačování vzduchu.
Pro nasátí vzorku reverzním pipetováním stlačte píst pipety až
na druhou zarážku a nasajte vzorek. Poté udržujte špičku pipety
u dna zkumavky a stlačte píst po první zarážku pro pipetování
vzorku. Zbylý vzorek ve špičce pipety odstraňte spolu se špičkou
pipety.
Poznámka 2: Zamezte roztírání vzorku špičkou pipety na
stěnách zkumavky. Rozetřený vzorek nebude označený
komponentou ED7080-1 Staining reagent a při lyzi buněk bude
rozpuštěný v ED7080-3 Lysing solution (viz Bod 6) počas
vortexování. Neoznačené buňky vzorku rozetřeného na stěnách
zkumavky můžou negativně ovlivnit počítání živých CD34+
kmenových buněk.
5. Inkubujte 20-30 minut při laboratorní teplotě v temnu.
6. Pipetujte 2 ml ředěné komponenty ED7080-3 Lysing Solution
(příprava ředěného lyzačního roztoku, viz Sekce 7 Příprava
komponent před použitím).
7. Zkumavku vortexujte pro snížení tvorby agregátů před
analýzou na průtokovém cytometru.
Analýza naměřených dat
Emisní spektra fluorochromů FITC, PE a 7-AAD se překrývají.
Před analýzou je nutná kompenzace naměřených dat.
Nekompenzovaná fluorescence CD45 FITC zvyšuje pozadí
v detektoru fluorescence pro PE, čímž se snižuje rozlišení pro
identifikaci CD34 pozitivních buněk. Nekompenzovaná
fluorescence CD34 PE zvyšuje pozadí v detektoru fluorescence
pro 7-AAD.
Pro potřeby kompenzace je doporučeno připravit kompenzační
zkumavky pro každý fluorochrom.
Poznámka: Pro přípravu 7-AAD kompenzační zkumavky je
doporučeno použít krevní vzorek s nízkou očekávanou životností
buněk. Vzorky s vysokou životností buněk obsahují nízké počty
buněk mrtvých. Nízký počet mrtvých buněk, které jsou
fluorescenční v detektoru pro 7-AAD může negativně ovlivnit
kompenzaci.
Pomocí vhodného cytometrického programu analyzujte
naměřená a kompenzovaná data. Pro enumeraci procent živých
CD34+ kmenových buněk musí být použitý mezinárodně
uznávaný protokol společnosti International Society for
Hematotherapy and Graft Engineering, tzv. ISHAGE1 protokol.
Na základě 5 optických parametrů: 2 parametry rozptylu světla a
3 fluorescenční parametry a pomocí sekvenčního a logického
(Boolean) ohraničení je možné na základě charakteristických
vlastností identifikovat CD34+ kmenové buňky.
Skutečné CD34+ kmenové buňky exprimují CD34 a CD45
antigen, kdy exprese antigenu CD45 je srovnatelná s expresí
nezralých buněk. Exprese je dostatečná pro identifikaci, je však
nižší než exprese např. lymfocytů.
Skutečné CD34+ kmenové buňky mají také charakteristický
přední (FSC) i boční rozptyl (SSC) světla podobný nezralým
buňkám a lymfocytům.
Analýza na průtokovém cytometru
Analyzujte označené vzorky pomocí průtokového cytometru, viz
Sekce 6 Přístrojové vybavení.
1. Single Platform metoda
Nastavte threshold na fluorescenci ve fluorescenčním detektoru
pro FITC místo threshold na velikost události (Forward Scatter).
Threshold na Forward Scatter (velikost události) může negativně
ovlivnit akvizici mikropartikulí fluorescenčního vnitřního
standardu, co může mít za následek nesprávné stanovení
absolutního počtu CD34+ kmenových buněk.
Podle druhu a stavu krevního vzorku najímejte 300000 –
1000000 událostí na zkumavku.
Vždy jímejte informace o rozptylu světla analyzovanou událostí:
Pro přední rozptyl světla (Forward Scatter) jímejte výšku signálu i
Pro boční rozptyl světla (Side Scatter) jímejte výšku signálu i
3/8
ED7080_CZ_160427
Obrázky 1-5 naznačují sekvenční a logické ohraničování umožňující správnou identifikaci živých CD34+ kmenových buněk pro
správné stanovení procenta buněk.
Obr.1: Obrázek vlevo reprezentuje všechny buněčné populace
ohraničené Regiony A, B, C, G (získané z Regionu F) a I.
Nejdřív ohraničte živé buňky v dot-plot zobrazení výška signálu bočního
rozptylu světla (SSC-A) proti. 7-AAD vitální barvičce jak je to
znázorněno podle Regionu A na obrázku vpravo.
Poznámka: Při značení stabilizované (fixované) CD34 kontroly, jako
např. Streck CD-Chex CD34®, je nutno upravit Region A tak, aby
obsahoval všechny události, i 7-AAD pozitivní. Fixovaný krevní materiál
má poškozenou buněčnou membránu, která je pak permeabilní pro 7AAD a všechny buňky se jeví jako pozitivní – mrtvé.
Obr. 3: Utvořte region kolem událostí mikropartikulí fluorescenčního
vnitřního standardu jak je to vyobrazeno na obrázku vlevo a vpravo.
Region I odděluje mikropartikule zkumavky BD TruCount™ tube
naměřené cytometrem BD FACSCanto™ a Region J odděluje
mikropartikule Beckman Coulter Flow-Count™ naměřené cytometrem
Beckman Coulter Navios.
Obr. 2: Zobrazte události z Regionu A v SSC-A proti CD45 FITC dotplotu a ohraničte leukocyty reprezentované Regionem B a lymfocyty
reprezentované Regionem C jak je to naznačeno na obrázku vlevo.
Buňky z Regionu B Zobrazte v dot-plotu SSC-A proti CD34 PE a
ohraničte CD34 pozitivní události jak je to naznačeno Regionem D.
Na obrázku vpravo jsou v Regionu E ještě zobrazeny události
fluorescenčních mikropartikulí z Regionu I.
Region E naznačuje optické a fluorescenční vlastnosti mikropartikulí
vnitřního standardu z BD TruCount™ Tube zkumavky.
Obr. 4: Oddělte CD34 pozitivní události kmenových beněk z Regionu D
utvořením Regionu F kolem shluku slabě pozitivních CD45 událostí
v dot-plotu SSC-A proti CD45 FITC jak je to znázorněno na obrázku
vlevo.
Zobrazte události z Regionu C v dot-plotu SSC-A proti výšce signálu
předního rozptylu světla (FSC-H) dot-plot. Utvořte nový Region G kolem
lymfocytů z Regionu C, jak je to znázorněno na obrázku vpravo.
4/8
ED7080_CZ_160427
%
34
34
100
CD34 Abs absolutní počet živých CD34+ kmenových buněk
WBCAbs
%CD34
RegionB
RegionG
RegionH
PM
Obr. 5: Zkopírujte Region G ohraničující lymfocyty k událostem
z Regionu F zobrazeným v SSC-A proti FSC-H dot-plotu, za účelem
oddělení shluku CD34+ kmenových buněk od událostí s menší velikostí,
např. buněčné debris. Region G ohraničuje pravé CD34+ kmenové
buňky.
Vyneste události z Regionu I nebo Regionu J do dot-plotu CD45 FITC
proti času (Time) a umístěním Regionu H ohraničte unikátní
(singletové) mikropartikule, jak je to naznačené na obrázku vpravo.
Poznámka 1: Velikost a fluorescence mikropartikulí vnitřního standardu
se můžou lišit v závislosti od výrobce. Obr. 3 reprezentuje fluorescenční
vlastnosti mikropartikulí ve zkumavce BD TruCount™ Tube (vlevo) a
mikropartikule Beckman Coulter Flow-Count™ Fluorospheres (vpravo).
Poznámka 2: Jakákoliv odchylka při akvizici mikropartikulí v Regionu H
projevující se diskontinuálním shlukem (přerušení akvizice, pokles
fluorescence atd.) musí být podrobena přezkoumání. Nehomogenní
kontinuita akvizice událostí v Regionu H nebo situace, kdy není shluk
událostí Regionu H kolmý na osu y – fluorescence CD45 FITC
naznačuje problém s fluidikou průtokového cytometru.
ŘF
na 1 µl krevního vzorku
absolutní počet živých leukocytů na 1 µl krevního
vzorku
procento živých CD34+ kmenových buněk ze
všech živých leukocytů
počet událostí v Regionu B (leukocyty)
počet událostí v Regionu G (kmenové buňky)
počet událostí v Regionu H (mikropartikule)
počet mikropartikulí na 1 µl krevního vzorku
udávaný výrobcem
ředící faktor (ředění krevního vzorku před
zpracováním). ŘF = 2 znamená, že 1 díl krevního
vzorku (100 µl) byl naředěný v 1 dílu PBS
obsahujícím 0,5% BSA (100 µl).
Dual platform analýza
Použijte hematoanalyzátor pro stanovení absolutního počtu WBC
na 1 µl krevního vzorku. Pozorně si pročtěte instrukce výrobce
k použití hematoanalyzátoru. Pomocí následujících výpočetních
rovnic stanovte absolutní počet a procento živých
CD34+ kmenových buněk ze všech živých leukocytů.
Stanovení absolutního počtu CD34+ kmenových buněk na 1 µl
krevního vzorku:
34
Ř
10. Kontrola měření
Pomocí normálního krevního vzorku značeného soupravou
CD34 QuantiFlowEx® kit nastavte napětí na detektorech, ve
kterých bude detekována fluorescence. Napětí na fotodetektoru
by mělo být nastaveno tak, aby minimum negativních událostí
mělo nulovou fluorescenci.
Před měřením normálního krevního vzorku změřte
CD34 kontrolu, např. Streck CD-Chex CD34®.
Pro další informace si pozorně pročtěte instrukce výrobce ke
specifikacím fluorescenčních detektorů cytometru, které jsou
určené pro detekci fluorescence CD45 FITC+, CD34 PE+ a
7-AAD+ událostí podle emisního profilu fluorochromu.
Stanovení procenta živých CD34+ kmenových buněk ze všech
živých leukocytů:
%
34
100
CD34 Abs absolutní počet živých CD34+ kmenových buněk
WBCAbs
%CD34
11. Hodnocení výsledků vyšetření
Single platform analýza
Pomocí následujících výpočetních rovnic stanovte procento
a absolutní počet živých CD34+ kmenových buněk ze všech
živých leukocytů.
RegionB
RegionG
ŘF
Stanovení absolutního počtu CD34+ kmenových buněk na 1 µl
krevního vzorku:
34
Ř
na 1 µl krevního vzorku
absolutní počet živých leukocytů na 1 µl krevního
vzorku stanovený hematoanalyzátorem
procento živých CD34+ kmenových buněk ze
všech živých leukocytů
počet událostí v Regionu B (leukocyty)
počet událostí v Regionu G (kmenové buňky)
ředící faktor (ředění krevního vzorku před
zpracováním). ŘF = 2 znamená, že 1 díl krevního
vzorku (100 µl) byl naředěný v 1 dílu PBS
obsahujícím 0,5% BSA (100 µl).
Stanovení absolutního počtu živých leukocytů na 1 µl krevního
vzorku:
Ř
Stanovení procenta živých CD34+ kmenových buněk ze všech
živých leukocytů:
5/8
ED7080_CZ_160427
12. Funkční charakteristika, analytické parametry
CD-Chex
replikáty
Specificita
Monoklonální protilátka MEM-28 reaguje 2 se všemi formami
lidského CD45 antigenu (Leukocyte Common Antigen)
s molekulovou hmotností 180-220 kDa. CD45 je jednořetězcový
transmembránový protein typu I exprimovaný ve vysoké úrovni
na všech buňkách hematopoietického původu, kromě erytrocytů
a trombocytů.
Monoklonální protilátka 4H11[APG] reaguje 3 s Class III epitopem
lidského CD34 antigenu (Mucosialin) s molekulovou hmotností
110-115 kDa. CD34 je monomerní transmembránový
fosfoglykoprotein exprimovaný na hematopoietických
progenitorových buňkách a téměř na všech pluripotentních
kmenových buňkách. Na progenitorových buňkách se jejich
diferenciací exprese antigenu postupně snižuje.
Průměrná
hodnota
[%]
Naměřená
průměrná
hodnota
[%]
SD
CV
[%]
95% rozsah
naměřených
hodnot
Level 1
0,02 – 0,12
0,07
0,087
0,006
7,13
0,075 - 0,099
Level 2
0,41 – 0,63
0,52
0,544
0,023
4,23
0,498 - 0,590
Level 3
1,38 – 1,98
1,68
1,610
0,03
1,86
1,55 - 1,67
3. Shoda mezi hodnotami absolutních počtů CD34+ a CD45+
buněk a procenta CD34+ buněk.
CD34 QuantiFlowEx® kit byl použitý pro stanovení absolutního
počtu CD34+ a procenta CD34% buněk paralelně s dalšími
dvěma komerčně dostupnými produkty se stejným účelem
použití pomocí Single Platform metody a pomocí Dual Platform
metody.
4 různé pacientské vzorky byly analyzovány v replikátech (n = 3)
pro stanovení procenta a absolutního počtu CD34+ buněk
pomocí Single Platform metody použitím cytometrů BD
FACSCanto™ a Beckman Coulter Navios. Stanovení počtu a
procenta CD34+ buněk pomocí Dual Platform metody bylo
provedeno použitím cytometru BD FACSCanto™, cytometru
Beckman Coulter Navios a hematoanalyzátoru Sysmex XN1000™. Naměřené hodnoty jsou uvedeny v následujících
tabulkách s příslušným grafem.
Správnost metody
Správnost metody byla hodnocená třemi různými experimenty,
provedenými v různých laboratořích na různých počtech krevních
vzorků.
1. Shoda mezi očekávanými hodnotami naměřenými
akreditovanou metodou za použití jiných komerčně dostupných
reagencií a soupravy CD34 QuantiFlowEx® kit
Stanovení procenta živých CD34+ kmenových buněk ze všech živých leukocytů [%]
Krevní vzorky různého původu (kostní dřeň, periferní krev a
aferezní produkt periferní krve) odebrány na odděleních
Hematologie a Onkologie (n = 23) byly analyzovány
akreditovanou metodou a soupravou CD34 QuantiFlowEx® kit.
Dual platform metoda zahrnující použití hematoanalyzátoru a
cytometru BD FACSCato™ II byla použitá pro získání souboru
dat. Výsledky byly hodnoceny lineární regresí.
BD FACSCanto™ cytometr
Souprava CD34
QuantiFlowEx kit, Dual
Platform analýza
Komerční paralela 2,
Single Platform analýza
Souprava CD34
Platform analýza
0,088
0,086
0,111
0,117
0,680
0,765
0,747
0,703
0,944
1,000
1,210
1,320
0,363
0,345
0,359
0,375
Správnost metody stanovení procenta živých CD34+
kmenových buněk
2,50
Stanovení procenta živých CD34 pozitivních kmenových
buněk pomocí cytometru BD FACSCanto™
y = 0,9921x + 0,01
R² = 0,9873
2,00
1,200
1,50
1,00
0,50
0,00
0,00
0,50
1,00
1,50
Beckman Coulter Navios cytometr
Dual Platform metoda [%]
Hodnoty získané použitím soupravy CD34
QuantiFlowEx®kit [%]
(n = 5)
Očekávaný
rozsah
2,00
0,800
0,600
0,400
0,200
0,000
0,000
2,50
Hodnoty získané akreditovanou metodou [%]
y = 1,0987x - 0,0212
R² = 0,994
1,000
0,200
0,400
0,600
0,800
1,000
1,200
Single Platform metoda [%]
2. Shoda mezi očekávanými hodnotami % buněk CD34
standardu a hodnotami získanými použitím soupravy CD34
QuantiFlowEx® kit
Stanovení procenta živých CD34 pozitivních kmenových
buněk pomocí cytometru Beckman Coulter Navios
1,400
Dual Platform meotda [%]
Použité byly tři druhy CD34 standardů společnosti Streck CDChex® CD34 lišící se podle koncentrace CD34+ buněk ve
stabilizované (fixované) krvi CD34 standardu. Replikace analýzy
(n = 5) byly vyhodnoceny ve smyslu shody procenta CD34+
buněk získaného použitím soupravy CD34 QuantiFlowEx® kit a
procenta CD34+ buněk (v určitém rozsahu) uváděného
výrobcem.
1,000
0,800
0,600
0,400
0,200
0,000
0,000
Dual platform metoda využívající BD FACSCato™ cytometr ve
spojení s hematoanalyzátorem byla použitá pro získání dat
správnosti měření uvedené v následující tabulce.
y = 1,0778x - 0,0256
R² = 0,9898
1,200
0,200
0,400
0,600
0,800
1,000
1,200
1,400
Single Platform metoda [%]
6/8
ED7080_CZ_160427
Přesnost měření
Přesnost měření v rámci jedné laboratoře byla stanovena při
měření dvěma různými operátory na jedném cytometru ve dvou
různých dnech. CD34 standard společnosti Streck CD-Chex®
CD34 ve dvou různých koncentracích CD34+ buněk byl
v replikacích (n = 5 a n = 6) připraven a změřen. Hodnocené bylo
procento CD34+ buněk ve stabilizovaném krevním standardu
v dynamickém rozsahu reprezentovaném dvěma úrovněmi
koncentrace CD34 buněk v rozsahu 0 – 200 buněk / µl.
Hodnocenými parametry jsou celkový průměr, celkové SD a
celkový koeficient variance CV (%) procenta CD34+ buněk
naměřeného a spočítaného dvěma operátory.
Stanovení absolutního počtu živých CD34 pozitivních kmenových buněk na 1µl krevního materiálu [počet
buněk / µl]
BD FACSCanto™ cytometr
Beckman Coulter Navios cytometr
28,2
Souprava CD34
Platform analýza
32,1
26,2
Souprava CD34
Platform analýza
31,3
772,2
1051,8
724,6
1073,0
3817,2
4349,7
3673,2
4780,3
18,8
17,9
18,2
18,6
Dual Platform metoda [buňky / µl]
Stanovení absolutního počtu živých CD34 pozitivních
kmenových buněk pomocí cytometru BD FACSCanto™
5000,0
4500,0
4000,0
3500,0
3000,0
2500,0
2000,0
1500,0
1000,0
500,0
0,0
y = 1,1331x + 49,489
R² = 0,9982
0,0
500,0 1000,0 1500,0 2000,0 2500,0 3000,0 3500,0 4000,0 4500,0
Level 1
SD
Level 1
CV (%)
Level 3
Průměr
Level 3
SD
Level 3
CV (%)
Operátor 1
5
0,07
0,006
8,73
1,52
0,032
2,08
Operátor 2
6
0,05
0,004
9,52
1,32
0,013
0,96
Celková
hodnota
11
0,06
0,011
20,26
1,41
0,107
7,56
Rozmezí biologických hodnot bylo stanoveno měřením
pacientských vzorků (n = 19). Pro stanovení byly použity
pacientské vzorky před mobilizací CD34+ kmenových buněk a
vzorky, kdy pacient podstoupil mobilizaci CD34+ kmenových
buněk.
Stanovení absolutního počtu živých CD34 pozitivních
kmenových buněk pomocí cytometru Beckman Coulter
Navios
Dual Platform metoda [buňky / µl]
Level 1
Průměr
13. Rozmezí biologických hodnot
Single Platform metoda [buňky / µl]
y = 1,2968x + 35,668
R² = 0,9991
6000,0
5000,0
Absolutní počet CD45+ * 10^3 / µl
4000,0
Absolutní počet CD34+ / µl
3000,0
n = 19
Procento CD34+ [%]
Min
Max
Průměr
SD
1,5
41,6
17,7
14,6
1,38
158,08
50,8
43,2
0,02
2,23
0,6
0,6
2000,0
1000,0
14. Limitace metody
0,0
0,0
500,0
1000,0
1500,0
2000,0
2500,0
3000,0
3500,0
4000,0
Produkt označený jako CE IVD je určený k In Vitro
diagnostickému použití v krajinách mimo území USA a Kanady.
Připravené (označené a lyzované) vzorky musí být změřené do 2
hodin od přípravy.
Vzorky, které nemůžou být změřené do 2 hodin, musí být
uložené v lednici v ledové lázni.
Neřeďte ani nezamrazujte komponenty soupravy CD34
QuantiFlowEx® kit. Nepipetujte objemy komponent jiné než
stanovené v Sekci 9 Postup vyšetření.
Nesprávné umístění regionů (Sekce 9 Postup vyšetření) může
mít za následek nesprávné stanovení počtu a procent CD34+
kmenových buněk.
Single Platform metoda [buňky / µl]
Linearita měření
Pro stanovení linearity měření bylo připraveno celkem 11 vzorků
s postupně klesající koncentrací CD34+ buněk smíchaných
s plnou periferní krví. Na replikátech každého ředění (n = 3) bylo
provedeno měření a stanovení absolutního počtu a procenta
CD34+ buněk. Vzorky byly připraveny a označeny pomocí
soupravy CD34 QuantiFlowEx® kit a analyzovány cytometrem
BD FACSCanto™. Pro vyhodnocení očekávaných hodnot a
hodnot získaných z průměru naměřených hodnot pro každé
ředění byla použitá lineární regrese.
15. Reference
Linearita měření
Naměřený počet CD34+ buněk [buňky / µl]
n
3000
y = 1,0648x + 4,8404
R² = 1
2500
2000
1500
1000
500
0
0
500
1000
1500
2000
2500
3000
Očekávaný počet CD34+ buněk [buňky / µl]
7/8
ED7080_CZ_160427
16. Ochranné známky
FlowEx® je registrovanou ochrannou známkou společnosti
EXBIO Praha, a.s.
FACSCanto™ je registrovanou ochrannou známkou společnosti
BD Biosciences, San Jose
TruCount™ je registrovanou ochrannou známkou společnosti BD
Biosciences, San Jose
Flow-Count™ je registrovanou ochrannou známkou společnosti
Beckman Coulter® 17. Použité symboly
V
h
g
In Vitro Diagnostický Zdravotnický
Prostředek
M
i
l
H
Výrobce
X
Katalogové číslo
Číslo šarže
Pozorně pročtěte instrukce k použití
Skladujte při daném rozmezí teplot
Spotřebujte do
Množství postačující pro provedení
<n> testů
8/8
ED7080_CZ_160427
Komponent 7-AAD obsahuje nariedený 7-Aminoactinomycin D
(7-AAD), vitálnu farbičku v optimálnej koncentrácii
v stabilizačnom fosfátovom roztoku (PBS) obsahujúcom
15mM azid sodný.
Komponent Lysing Solution obsahuje 10X koncentrovaný
roztok na báze chloridu amónneho určený k lýze červených
krviniek. Roztok neobsahuje fixačné činidlo.
3. Skladovanie a doba použiteľnosti po prvom
otvorení
Cytometrická súprava na určenie počtu
živých CD34+ kmeňových buniek
vyjadrených ako percento zo všetkých
živých leukocytov.
h
ED7080
V
M
Súprava CD34 QuantiFlowEx® Kit si zachová funkčné
charakteristiky skladovaním pri teplote 2-8°C do dátumu
exspirácie vytlačeného na produktovej etikete.
Doba použiteľnosti produktu sa po prvom otvorení nelíši od doby
exspirácie uvedenej na produktovej etikete.
Nezamrazujte súpravu CD34 QuantiFlowEx® Kit, ani žiadny
komponent súpravy.
Nevystavujte súpravu CD34 QuantiFlowEx® Kit, ani žiadny
komponent súpravy priamemu svetlu pri manipulácii alebo
pri značení buniek.
Nepoužívajte súpravu po uplynutí doby exspirácie uvedenej
na produktovej etikete.
Zamedzte dlhodobej expozícii súpravy svetlu. Zamedzte
kontaminácii komponentov súpravy.
Prejavy zhoršenia kvality
V prípade zhoršenia kvality komponentov súpravy prejavujúcich
sa viditeľnou precipitáciou obsahu komponentu alebo zmenou
zafarbenia obsahu komponentu alebo v prípade získania
výsledkov naznačujúcich zmenu kvality produktu, kontaktujte
prosím výrobcu na e-mail adrese: [email protected]
50 testov
C
EXBIO Praha, a.s.
Nad Safinou II 341
Tel: +420 261 090 666
Fax: +420 261 090 660
www.exbio.cz
1. Zamýšľané použitie
Súprava CD34 QuantiFlowEx® Kit je určená na identifikáciu
a stanovenie percentuálneho zastúpenia živých CD34+
kmeňových buniek zo všetkých živých leukocytov v krvnom
materiáli so stanoveným počtom leukocytov.
Vzorky krvného materiálu, ktoré je možné hodnotiť použitím
súpravy CD34 QuantiFlowEx® Kit: normálna plná krv
a mobilizovaná plná krv, čerstvé a rozmrazené produkty
leukaferézy, čerstvá a rozmrazená kostná dreň, čerstvá a
rozmrazená pupočníková krv.
Súprava je určená pre In Vitro Diagnostické použitie (IVD)
v kombinácii s prietokovým cytometrom vybaveným vhodnými
detektormi pre rozptyl svetla a fluorescenciu a programom
určeným na získanie a analýzu cytometrických dát.
4. Upozornenia a opatrenia
Komponent Staining Reagent (ED7080-1) obsahuje konzervant
azid sodný. Použitá koncentrácia azidu sodného (15mM) však
nie je považovaná za nebezpečnú.
Komponent 7-AAD (ED7080-2) obsahuje 7-Aminoactinomycin D
vitálnu farbičku, ktorá je potenciálnym karcinogénom. Použitá
koncentrácia 7-Aminoactinomycinu D však nie považovaná
za nebezpečnú.
Pozorne si prečítajte bezpečnostný list (SDS) pre kompletný
zoznam upozornení, nebezpečenstiev a opatrení.
2. Zloženie súpravy
5. Princíp metódy
Súprava CD34 QuantiFlowEx® Kit postačuje na vykonanie
50 testov a skladá sa z nasledujúcich jednotlivých komponentov:
Kat. č.
Názov komponentu
Veľkosť
balenia
ED7080-1
ED7080-2
ED7080-3
Staining Reagent
7-AAD
Lysing Solution
1 ml
1 ml
15 ml
Počet
1 ks
1 ks
1 ks
Táto metóda je založená na špecifickej väzbe monoklonálnej
protilátky na cieľový antigén exprimovaný na povrchu buniek.
Špecifická monoklonálna protilátka je kovalentne konjugovaná
s fluorescenčnou značkou excitovateľnou vhodným zdrojom
žiarenia (laserový lúč) z cytometra. Nasledujúca emisia žiarenia
fluorescenčnej značky je detegovaná a analyzovaná prietokovým
cytometrom v odpovedajúcom fluorescenčnom detektore.
Rozdiely v intenzite fluorescencie buniek umožňujú separáciu
bunkových sub-populácií na základe expresie analyzovaného
antigénu.
Označenie buniek exprimujúcich cieľový antigén je realizované
inkubáciou suspenzie buniek s monoklonálnou protilátkou
a následnou lýzou červených krviniek. Označené bunky sú
potom analyzované pomocou prietokového cytometra.
Komponent Staining Reagent obsahuje kokteil nariedených
monoklonálnych protilátok anti-CD45 FITC, klon MEM-28 a antiCD34 PE, klon 4H11(APG). Označené protilátky sú nariedené
v optimálnej koncentrácii v stabilizačnom fosfátovom roztoku
(PBS) obsahujúcom 15mM azid sodný.
1/8
ED7080_SK_160502
Na analýzu nepoužívajte dopredu fixované a skladované krvné
vzorky. Z analýzy vyraďte vzorky prejavujúce známky hemolýzy,
zrazenín alebo zhlukov.
V prípade, že počet WBC je vyšší než 40 x 103 buniek/µL,
narieďte krvnú vzorku podľa štandardných laboratórnych
postupov pomocou PBS fosfátového pufru obsahujúceho 0,5%
hovädzí sérový albumín (nie je súčasťou súpravy CD34
QuantiFlowEx® Kit). Použite reverzné pipetovanie na nariedenie
krvnej vzorky. Zaznamenajte riediaci faktor na hodnotenie
výsledkov počtu CD34 buniek, viz Sekcia 11 Počítanie a
vyhodnotenie výsledkov.
6. Ďalšie potrebné vybavenie
Potrebný materiál, ktorý nie je dodávaný
Jednorazové skúmavky s rozmerom 12 × 75 mm na označenie
krvného materiálu
BD Trucount™ Tubes skúmavky (5 ml) obsahujúce
fluorescenčný vnútorný štandard na počítanie buniek pre použitie
s cytometrami Becton Dickinson (Voliteľný)
Automatické pipety s jednorazovými špičkami
Vortex mixér
Beckman Coulter Flow-Count™ Fluorospheres - fluorescenčný
vnútorný štandard na počítanie buniek pre použitie s cytometrami
Beckman Coulter (Voliteľný)
Hematoanalyzátor umožňujúci stanovenie počtu leukocytov
(ďalej iba WBC) na µl krvného materiálu
CD34 kontrola, např. CD-Chex CD34®, CD34 control – 3 levels
(Streck, kat. č. 213337, 213347, 213383)
Prístrojové vybavenie
Prietokový cytometer vybavený vhodným zdrojom excitácie
a detektormi rozptylu svetla a fluorescencie. Cytometer musí byť
vybavený vhodným programom na získanie a analýzu
cytometrických dát.
Pre najvyššiu citlivosť, reprodukovateľnosť a presnosť metódy je
doporučené pravidelné nastavenie laserov (laser alignment)
a pravidelná kalibrácia cytometra pomocou fluorescenčných
mikropartikúl.
Upozornenie Každá krvná vzorka a materiál musí byť
pri kontakte považovaný za potenciálne nebezpečný a infekčný
a rovnako s ním musí byť aj nakladané. S krvným materiálom
manipulujte podľa správnych postupov na zaobchádzanie
s potenciálne infekčným materiálom.
9. Postup vyšetrenia
Značenie krvnej vzorky – Single Platform metóda
Na vyšetrenie jednej krvnej vzorky stačí 1 skúmavka.
BD Trucount™ Tube skúmavky môžu byť použité na stanovenie
absolútneho počtu CD34 kmeňových buniek pri použití cytometra
spoločnosti Becton Dickinson. Pre ďalšie informácie si pozorne
prečítajte inštrukcie výrobcu k produktu BD Trucount™ Tube.
1. Do skúmavky pipetujte 20 µl ED7080-1 Staining Reagent.
2. Do skúmavky pipetujte 20 µl ED7080-2 7-AAD.
3. Do skúmavky pipetujte 100 µl krvnej vzorky metódou
reverzného pipetovania.
Poznámka 1: Pre stanovenie percenta CD34+ kmeňových
buniek je dôležitá presnosť a správnosť pipetovania. Doporučené
je preto reverzné pipetovanie automatickou pipetou pracujúcou
na princípu nasatia a vytlačenia vzduchu.
Pre nasatie vzorky reverzným pipetovaním stlačte piest pipety až
na druhú zarážku a nasajte vzorku. Potom udržujte špičku pipety
pri dne skúmavky a stlačte piest po prvú zarážku pre pipetovanie
vzorky. Zvyšnú vzorku v špičke pipety odstráňte spolu so špičkou
pipety.
Poznámka 2: Zamedzte roztieraniu krvnej vzorky špičkou
pipety po stenách skúmavky. Rozotrená krvná vzorka nebude
označená komponentom ED7080-1 Staining reagent a pri lýze
buniek bude rozpustená v ED7080-3 Lysing solution (viz Bod 6)
pri vortexovaní. Neoznačené bunky krvného vzorku rozotreného
na stenách skúmavky môžu negatívne ovplyvniť počítanie živých
CD34+ kmeňových buniek.
4. Skúmavku jemne vortexujte.
5. Inkubujte 20-30 minút pri laboratórnej teplote v temne.
6. Do skúmavky pipetujte 2 ml riedeného komponentu ED7080-3
Lysing Solution (príprava riedeného lyzačného roztoku, viz
Sekcia 7 Príprava komponentov pred použitím).
7. Inkubujte 10 minút pri laboratórnej teplote v temne.
8. Skúmavku jemne zvortexujte.
9. Pri použití cytometra spoločnosti Beckman Coulter® môžu byť
na stanovenie absolútneho počtu CD34 kmeňových buniek
použité Flow-Count™ Fluorospheres fluorescenčné
mikropartikule.
7. Príprava komponentov pred použitím
Komponent súpravy ED7080-1 Staining reagent je pripravený
k okamžitému použitiu.
Komponent súpravy ED7080-2 7-AAD je pripravený
k okamžitému použitiu.
Komponent súpravy ED7080-3 Lysing Solution musí byť pred
použitím nariedený. Pripravte lyzačný roztok na lýzu červených
krviniek zmiešaním 1 objemu ED7080-3 Lysing solution s 9
objemami deionizovanej vody (napr. zmiešajte 1 ml ED7080-3
Lysing solution s 9 ml deionizovanej vody).
8. Vzorka, krvný materiál
Vzorka určená k vyšetreniu musí byť odobratá do vhodnej
odberovej skúmavky, špecifickej pre druh krvného materiálu.
Vyžadovaná je prítomnosť antikoagulantu napr. EDTA, citrát
sodný alebo heparín v skúmavke na odobratie krvného
materiálu.
Manipulácia a skladovacie podmienky pre rôzne druhy krvných
materiálov sa môžu medzi sebou líšiť a je nutné ich vziať
do úvahy pred odberom a ďalším spracovaním materiálu.
Životnosť buniek v krvnom materiáli klesá s časom od odobratia
materiálu a s každou manipuláciou s materiálom, napr. cyklus
zamrazenie / rozmrazenie môže priamo ovplyvniť výsledky
vyšetrenia kvôli možnej strate špecifickej sub-populácie buniek.
U vzoriek materiálu s nízkou životnosťou buniek môže byť
pozorovaná nešpecifická väzba reagencie na mŕtve bunky.
Analyzujte všetky označené krvné vzorky do 24 hodín od ich
prípravy. Dlhšie skladovanie označených vzoriek znižuje
životnosť buniek.
Reverzným pipetovaním (viz Krok 3) pipetujte 100 µl FlowCount™ Fluorospheres fluorescenčného vnútorného štandardu.
2/8
ED7080_SK_160502
Analyzujte označenú vzorku programom dodávaným
s cytometrom.
2. Dual Platform metóda
Podľa druhu a stavu krvnej vzorky zaznamenajte 300000 –
1000000 udalostí na skúmavku.
Vždy zaznamenajte informácie o rozptyle svetla analyzovanej
udalosti: Pre predný rozptyl svetla (Forward Scatter)
zaznamenajte výšku i šírku signálu spôsobeného udalosťou
na fotodetektore.
Pre bočný rozptyl svetla (Side Scatter) zaznamenajte výšku
i šírku signálu spôsobeného udalosťou na fotodetektore.
Analyzujte označenú vzorku programom dodávaným
s cytometrom.
Pre ďalšie informácie si pozorne prečítajte inštrukcie výrobcu
k produktu Flow-Count™.
10. Skúmavku zvortexujte pred analýzou na prietokovom
cytometri na zníženie tvorby agregátov.
Značenie krvnej vzorky – Dual Platform metóda
Pred analýzou na prietokovom cytometri zmerajte krvnú vzorku
určenú k vyšetreniu pomocou hematoanalyzátoru na stanovenie
počtu WBC na 1 µl krvného materiálu. Pre postup stanovenia
počtu WBC a ďalšie informácie si pozorne prečítajte inštrukcie
výrobcu k hematoanalyzátoru.
Na vyšetrenie jednej krvnej vzorky stačí 1 skúmavka.
1. Do skúmavky pipetujte 20 µl ED7080-1 Staining Reagent.
2. Do skúmavky pipetujte 20 µl ED7080-2 7-AAD.
3. Do skúmavky pipetujte 100 µl krvnej vzorky metódou
reverzného pipetovania.
Poznámka 1: Pre stanovenie percenta CD34+ kmeňových
buniek je dôležitá presnosť a správnosť pipetovania. Doporučené
je preto reverzné pipetovanie automatickou pipetou pracujúcou
na princípu nasatia a vytlačenia vzduchu.
Pre nasatie vzorky reverzným pipetovaním stlačte piest pipety až
na druhú zarážku a nasajte vzorku. Potom udržujte špičku pipety
pri dne skúmavky a stlačte piest po prvú zarážku pre pipetovanie
vzorky. Zvyšnú vzorku v špičke pipety odstráňte spolu so špičkou
pipety.
Poznámka 2: Zamedzte roztieraniu krvnej vzorky špičkou
pipety po stenách skúmavky. Rozotrená krvná vzorka nebude
označená komponentom ED7080-1 Staining reagent a pri lýze
buniek bude rozpustená v ED7080-3 Lysing solution (viz Bod 6)
pri vortexovaní. Neoznačené bunky krvného vzorku rozotreného
na stenách skúmavky môžu negatívne ovplyvniť počítanie živých
4. Skúmavku jemne zvortexujte.
5. Inkubujte 20-30 minút pri laboratórnej teplote v temne.
6. Do skúmavky pipetujte 2 ml riedeného komponentu ED7080-3
Lysing Solution (príprava riedeného lyzačného roztoku, viz
Sekcia 7 Príprava komponentov pred použitím).
7. Skúmavku zvortexujte pred analýzou na prietokovom cytometri
na zníženie tvorby agregátov.
Analýza nameraných dát
Emisné spektrá fluorochrómov FITC, PE a 7-AAD sa prekrývajú.
Pred analýzou je nutná kompenzácia nameraných dát.
Nekompenzovaná fluorescencia CD45 FITC zvyšuje pozadie
v detektore fluorescencie pre PE, čím sa znižuje rozlíšenie
pre identifikáciu CD34 pozitívnych buniek. Nekompenzovaná
fluorescencia CD34 PE zvyšuje pozadie v detektore
fluorescencie pre 7-AAD.
Pre potreby kompenzácie je doporučené pripraviť si
kompenzačné skúmavky pre každý fluorochróm.
Poznámka: Pre prípravu 7-AAD kompenzačnej skúmavky je
doporučené použiť krvnú vzorku s nízkou očakávanou
životnosťou buniek. Vzorky s vysokou životnosťou buniek
obsahujú nízke počty mŕtvych buniek. Nízky počet mŕtvych
buniek, ktoré sú fluorescenčné v detektore pre 7-AAD môže
negatívne ovplyvniť kompenzáciu.
Pomocou vhodného cytometrického programu analyzujte
namerané a kompenzované dáta. Pre enumeráciu percent živých
CD34+ kmeňových buniek musí byť použitý medzinárodne
uznávaný protokol spoločnosti International Society for
Hematotherapy and Graft Engineering, tzv. ISHAGE1 protokol.
Na základe 5 optických parametrov: 2 parametre rozptylu svetla
a 3 fluorescenčné parametre a pomocou sekvenčného
a logického (Boolean) ohraničenia je možné na základe
charakteristických vlastností identifikovať CD34+ kmeňové bunky.
Skutočné CD34+ kmeňové bunky exprimujú CD34 a CD45
antigén, kedy expresia antigénu CD45 je porovnateľná
s expresiou nezrelých buniek. Expresia CD45 je dostatočná
na identifikáciu, je však nižšia než expresia napr. u lymfocytov.
Skutočné CD34+ kmeňové bunky majú tiež charakteristický
predný (FSC) a bočný rozptyl (SSC) svetla podobný nezrelým
bunkám a lymfocytom.
Analýza na prietokovom cytometri
Analyzujte označené vzorky pomocou prietokového cytometra,
viz Sekcia 6 Prístrojové vybavenie.
1. Single Platform metóda
Nastavte threshold na fluorescenciu vo fluorescenčnom
detektore pre FITC namiesto threshold na veľkosť udalosti
(Forward Scatter). Threshold na Forward Scatter (veľkosť
udalosti) môže negatívne ovplyvniť akvizíciu mikropartikúl
fluorescenčného vnútorného štandardu, čo môže mať
za následok nesprávne stanovenie absolútneho počtu CD34+
kmeňových buniek.
Podľa druhu a stavu krvnej vzorky zaznamenajte 300000 –
1000000 udalostí na skúmavku.
Vždy zaznamenajte informácie o rozptyle svetla analyzovanej
udalosti: Pre predný rozptyl svetla (Forward Scatter)
zaznamenajte výšku i šírku signálu spôsobeného udalosťou
na fotodetektore.
Pre bočný rozptyl svetla (Side Scatter) zaznamenajte výšku
i šírku signálu spôsobeného udalosťou na fotodetektore.
3/8
ED7080_SK_160502
Obrázky 1-5 naznačujú sekvenčné a logické ohraničenie umožňujúce správnu identifikáciu živých CD34+ kmeňových buniek
na správne stanovenie percenta buniek.
Obr.1: Obrázok vľavo reprezentuje všetky bunkové populácie
ohraničené Regiónmi A, B, C, G (získané z Regiónu F) a I.
Najskôr ohraničte živé bunky v dot-plot zobrazení plocha signálu
bočného rozptylu svetla (SSC-A) proti 7-AAD vitálnej farbičke ako je to
znázornené podľa Regiónu A na obrázku vpravo.
Poznámka: Pri značení stabilizovanej (fixovanej) CD34 kontroly, ako
napr. Streck CD-Chex CD34®, je nutné upraviť Región A tak, aby
obsahoval všetky udalosti, i 7-AAD pozitívne. Fixovaný krvný materiál
má poškodenú bunkovú membránu, ktorá je potom permeabilná pre 7AAD a všetky bunky sa javia ako pozitívne – mŕtve.
Obr. 3: Utvorte región okolo udalostí mikropartikúl fluorescenčného
vnútorného štandardu ako je to vyobrazené na obrázku vľavo a vpravo.
Región I oddeľuje mikropartikule skúmavky BD TruCount™ tube
namerané cytometrom BD FACSCanto™ a Región J oddeľuje
mikropartikule Beckman Coulter Flow-Count™ namerané cytometrom
Beckman Coulter Navios.
Obr. 2: Zobrazte udalosti z Regiónu A v dot-plote SSC-A proti CD45
FITC a ohraničte leukocyty reprezentované Regiónom B a lymfocyty
reprezentované Regiónom C ako je to naznačené na obrázku vľavo.
Bunky z Regiónu B Zobrazte v dot-plote SSC-A proti CD34 PE a
ohraničte CD34 pozitívne udalosti ako je to naznačené Regiónom D.
Na obrázku vpravo sú v Regióne E zobrazené ešte udalosti
fluorescenčných mikropartikúl z Regiónu I.
Región E naznačuje optické a fluorescenčné vlastnosti mikropartikúl
vnútorného štandardu z BD TruCount™ Tube skúmavky.
Obr. 4: Oddeľte CD34 pozitívne udalosti kmeňových buniek
z Regiónu D utvorením Regiónu F okolo zhluku slabo pozitívnych CD45
udalostí v dot-plote SSC-A proti CD45 FITC ako je to znázornené
na obrázku vľavo.
Zobrazte udalosti z Regiónu C v dot-plote SSC-A proti výške signálu
predného rozptylu svetla (FSC-H). Utvorte nový Región G okolo
lymfocytov z Regiónu C, ako je to znázornené na obrázku vpravo.
4/8
ED7080_SK_160502
Stanovenie percenta živých CD34+ kmeňových buniek zo
všetkých živých leukocytov:
%
34
34
100
CD34 Abs absolútny počet živých CD34+ kmeňových buniek
WBCAbs
%CD34
Obr. 5: Skopírujte Región G ohraničujúci lymfocyty k udalostiam
z Regiónu F zobrazených v dot-plote SSC-A proti FSC-H za účelom
oddelenia zhluku CD34+ kmeňových buniek od udalostí s menšou
veľkosťou, napr. bunkové debris. Región G ohraničuje pravé CD34+
kmeňové bunky.
Vyneste udalosti z Regiónu I alebo Regiónu J do dot-plotu CD45 FITC
proti času (Time) a umiestnením Regiónu H ohraničte unikátne
(singletové) mikropartikule, ako je to naznačené na obrázku vpravo.
Poznámka 1: Veľkosť a fluorescencia mikropartikúl vnútorného
štandardu sa môžu líšiť v závislosti od výrobcu. Obr. 3 reprezentuje
fluorescenčné vlastnosti mikropartikúl v skúmavke BD TruCount™ Tube
(vľavo) a mikropartikule Beckman Coulter Flow-Count™ Fluorospheres
(vpravo).
Poznámka 2: Akákoľvek odchýlka pri akvizícii mikropartikúl v Regióne H
prejavujúca sa diskontinuálnym zhlukom (prerušenie akvizície, pokles
fluorescencie atd.) musí byť podrobená preskúmaniu. Nehomogénna
kontinuita akvizície udalostí v Regióne H alebo situácia, kedy nie je
zhluk udalostí Regiónu H kolmý na osu y – fluorescencia CD45 FITC
naznačuje problém s fluidikou prietokového cytometra.
RegiónB
RegiónG
RegiónH
PM
RF
na 1 µl krvnej vzorky
absolútny počet živých leukocytov na 1 µl krvnej
vzorky
percento živých CD34+ kmeňových buniek
zo všetkých živých leukocytov
počet udalostí v Regióne B (leukocyty)
počet udalostí v Regióne G (kmeňové bunky)
počet udalostí v Regióne H (mikropartikule)
počet mikropartikúl na 1 µl krvnej vzorky udávaný
výrobcom
riediaci faktor (riedenie krvnej vzorky pred
spracovaním). RF = 2 znamená, že 1 diel krvnej
vzorky (100 µl) bol nariedený 1 dielom PBS
obsahujúcom 0,5% BSA (100 µl).
Dual platform analýza
Použite hematoanalyzátor na stanovenie absolútneho počtu
WBC na 1 µl krvnej vzorky. Pozorne si prečítajte inštrukcie
výrobcu k použitiu hematoanalyzátora. Pomocou nasledujúcich
výpočtových rovníc stanovte absolútny počet a percento živých
CD34+ kmeňových buniek zo všetkých živých leukocytov.
Stanovenie absolútneho počtu CD34+ kmeňových buniek na 1 µl
krvnej vzorky:
ó 34
ó 10. Kontrola merania
Pomocou normálnej krvnej vzorky označenej súpravou CD34
QuantiFlowEx® kit nastavte napätie na detektoroch, v ktorých
bude detegovaná fluorescencia. Napätie na fotodetektore by
malo byť nastavené tak, aby minimum negatívnych udalostí malo
nulovú fluorescenciu.
Pred meraním normálnej krvnej vzorky zmerajte CD34 kontrolu,
napr. Streck CD-Chex CD34®.
Pre ďalšie informácie si pozorne prečítajte inštrukcie výrobcu
k špecifikáciám fluorescenčných detektorov cytometra, ktoré sú
určené na detekciu fluorescencie CD45 FITC+, CD34 PE+ a
7-AAD+ udalostí podľa emisného profilu fluorochrómu.
Stanovenie percenta živých CD34+ kmeňových buniek
zo všetkých živých leukocytov:
%
34
ó ó 100
CD34 Abs absolútny počet živých CD34+ kmeňových buniek
WBCAbs
11. Hodnotenie výsledkov vyšetrenia
%CD34
Single platform analýza
Pomocou nasledujúcich výpočtových rovníc stanovte percento
a absolútny počet živých CD34+ kmeňových buniek zo všetkých
živých leukocytov.
RegiónB
RegiónG
RF
Stanovenie absolútneho počtu CD34+ kmeňových buniek na 1 µl
krvnej vzorky:
ó 34
ó na 1 µl krvnej vzorky
absolútny počet živých leukocytov na 1 µl krvnej
vzorky stanovený hematoanalyzátorom
percento živých CD34+ kmeňových buniek
zo všetkých živých leukocytov
počet udalostí v Regióne B (leukocyty)
počet udalostí v Regióne G (kmeňové bunky)
riediaci faktor (riedenie krvnej vzorky pred
spracovaním). RF = 2 znamená, že 1 diel krvnej
vzorky (100 µl) bol nariedený 1 dielom PBS
obsahujúcom 0,5% BSA (100 µl).
Stanovenie absolútneho počtu živých leukocytov na 1 µl krvnej
vzorky:
ó ó 5/8
ED7080_SK_160502
12. Funkčná charakteristika, analytické parametre
CD-Chex
replikáty
Špecifičnosť
Monoklonálna protilátka MEM-28 reaguje 2 so všetkými formami
ľudského CD45 antigénu (Leukocyte Common Antigen)
s molekulovou hmotnosťou 180-220 kDa. CD45 je
jednoreťazcový transmembránový proteín typu I exprimovaný vo
veľkej miere na všetkých bunkách hematopoietického pôvodu,
okrem erytrocytov a trombocytov.
Monoklonálna protilátka 4H11[APG] reaguje 3 s Class III
epitopom ľudského CD34 antigénu (Mucosialin) s molekulovou
hmotnosťou 110-115 kDa. CD34 je monomerný
transmembránový fosfoglykoproteín exprimovaný
na hematopoietických progenitorových bunkách a takmer
na všetkých pluripotentných kmeňových bunkách.
Na progenitorových bunkách sa expresia antigénu diferenciáciou
postupne znižuje.
Priemerná
hodnota
[%]
Nameraná
priemerná
hodnota
[%]
SD
CV
[%]
95% rozsah
nameraných
hodnôt
Level 1
0,02 – 0,12
0,07
0,087
0,006
7,13
0,075 - 0,099
Level 2
0,41 – 0,63
0,52
0,544
0,023
4,23
0,498 - 0,590
Level 3
1,38 – 1,98
1,68
1,610
0,03
1,86
1,55 - 1,67
3. Zhoda medzi hodnotami absolútnych počtov CD34+ a CD45+
buniek a percenta CD34+ buniek.
CD34 QuantiFlowEx® kit bol použitý na stanovenie absolútneho
počtu CD34+ a percenta CD34+ buniek paralelne s ďalšími dvomi
komerčne dostupnými produktmi s rovnakým účelom použitia
pomocou Single Platform metódy a pomocou Dual Platform
metódy.
4 rôzne pacientske vzorky boli analyzované v replikátoch (n = 3)
pre stanovenie percenta a absolútneho počtu CD34+ buniek
pomocou Single Platform metódy použitím cytometrov BD
FACSCanto™ a Beckman Coulter Navios. Stanovenie počtu
a percenta CD34+ buniek pomocou Dual Platform metódy bolo
vykonané použitím cytometra BD FACSCanto™, cytometra
Beckman Coulter Navios a hematoanalyzátora Sysmex XN1000™. Namerané hodnoty sú uvedené v nasledujúcich
tabuľkách s príslušným grafom.
Správnosť metódy
Správnosť metódy bola hodnotená tromi rôznymi experimentmi,
realizovanými v rôznych laboratóriách na rôznych počtoch
krvných vzoriek.
1. Zhoda medzi očakávanými hodnotami nameranými
akreditovanou metódou za použitia iných komerčne dostupných
reagencií a súpravy CD34 QuantiFlowEx® kit
Stanovenie percenta živých CD34+ kmeňových buniek zo všetkých živých leukocytov [%]
Krvné vzorky rôzneho pôvodu (kostná dreň, periférna
krv a aferézny produkt periférnej krvi) odobraté na oddeleniach
Hematológie a Onkológie (n = 23) boli analyzované
akreditovanou metódou a súpravou CD34 QuantiFlowEx® kit.
Dual platform metóda zahrňujúca použitie hematoanalyzátora
a cytometra BD FACSCanto™ II bola použitá na získanie súboru
dát. Výsledky boli hodnotené lineárnou regresiou.
Komerčná paralela 1,
Súprava CD34
Platform analýza
Súprava CD34
Platform analýza
0,088
0,086
0,111
0,117
0,680
0,765
0,747
0,703
0,944
1,000
1,210
1,320
0,363
0,345
0,359
0,375
Stanovenie percenta živých CD34 pozitívnych kmeňových
buniek pomocou cytometra BD FACSCanto™
Správnosť metódy stanovenia percenta živých CD34+
kmeňových buniek
1,200
2,50
y = 0,9921x + 0,01
R² = 0,9873
2,00
Dual Platform metóda [%]
Hodnoty získané použitím súpravy CD34
QuantiFlowEx®kit [%]
(n = 5)
Očakávaný
rozsah
1,50
1,00
0,50
0,00
0,50
1,00
1,50
2,00
0,800
0,600
0,400
0,200
0,000
0,000
0,00
2,50
y = 1,0987x - 0,0212
R² = 0,994
1,000
0,200
0,400
0,600
0,800
1,000
1,200
Single Platform metóda [%]
Hodnoty získané akreditovanou metódou [%]
Stanovenie percenta živých CD34 pozitívnych kmeňových
buniek pomocou cytometra Beckman Coulter Navios
2. Zhoda medzi očakávanými hodnotami % buniek CD34
štandardu a hodnotami získanými použitím súpravy CD34
QuantiFlowEx® kit
1,400
Dual Platform metóda [%]
Použité boli tri druhy CD34 štandardu spoločnosti Streck CDChex® CD34 líšiace sa koncentráciou CD34+ buniek
v stabilizovanej (fixovanej) krvi CD34 štandardu. Replikácie
analýzy (n = 5) boli vyhodnotené v zmysle zhody percenta CD34+
buniek získaného použitím súpravy CD34 QuantiFlowEx® kit
a percenta CD34+ buniek (v určitom rozsahu) uvedeného
výrobcom.
y = 1,0778x - 0,0256
R² = 0,9898
1,200
1,000
0,800
0,600
0,400
0,200
0,000
0,000
0,200
0,400
0,600
0,800
1,000
1,200
1,400
Single Platform metóda [%]
Dual platform metóda využívajúca BD FACSCanto™ cytometer
v spojení s hematoanalyzátorom bola použitá na získanie dát
správnosti merania uvedených v nasledujúcej tabuľke.
6/8
ED7080_SK_160502
Presnosť merania
Presnosť merania v rámci jedného laboratória bola stanovená
meraním dvomi rôznymi operátormi na jednom cytometri dva
rôzne dni. CD34 štandard spoločnosti Streck CD-Chex® CD34
v dvoch rôznych koncentráciách CD34+ buniek bol v replikátoch
(n = 5 a n = 6) pripravený a zmeraný. Hodnotené bolo percento
CD34+ buniek v stabilizovanom krvnom štandarde v dynamickom
rozsahu reprezentovanom dvomi úrovňami koncentrácie CD34
buniek v rozsahu 0 – 200 buniek / µl. Hodnotenými parametrami
sú celkový priemer, celková smerodajná odchýlka SD a celkový
koeficient variancie CV (%) percenta CD34+ buniek nameraného
a spočítaného dvomi operátormi.
Stanovenie absolútneho počtu živých CD34 pozitívnych kmeňových buniek na 1µl krvného materiálu
[počet buniek / µl]
28,2
Súprava CD34
Platform analýza
32,1
26,2
Súprava CD34
Platform analýza
31,3
772,2
1051,8
724,6
1073,0
3817,2
4349,7
3673,2
4780,3
18,8
17,9
18,2
18,6
Dual Platform metóda [bunky / µl]
Stanovenie absolútneho počtu živých CD34 pozitívnych
kmeňových buniek pomocou cytometra BD FACSCanto™
5000,0
4500,0
4000,0
3500,0
3000,0
2500,0
2000,0
1500,0
1000,0
500,0
0,0
y = 1,1331x + 49,489
R² = 0,9982
0,0
500,0 1000,0 1500,0 2000,0 2500,0 3000,0 3500,0 4000,0 4500,0
Level 1
SD
Level 1
CV (%)
Level 3
Priemer
Level 3
SD
Level 3
CV (%)
Operátor 1
5
0,07
0,006
8,73
1,52
0,032
2,08
Operátor 2
6
0,05
0,004
9,52
1,32
0,013
0,96
Celková
hodnota
11
0,06
0,011
20,26
1,41
0,107
7,56
Rozmedzie biologických hodnôt bolo stanovené meraním
pacientskych vzoriek (n = 19). Na stanovenie boli použité
pacientske vzorky pred mobilizáciou CD34+ kmeňových buniek a
vzorky, kedy pacient podstúpil mobilizáciu CD34+ kmeňových
buniek.
Stanovenie absolútneho počtu živých CD34 pozitívnych
kmeňových buniek pomocou cytometra Beckman Coulter
Navios
Dual Platform metóda [bunky / µl]
Level 1
Priemer
13. Rozmedzie biologických hodnôt
Single Platform metóda [bunky / µl]
y = 1,2968x + 35,668
R² = 0,9991
6000,0
5000,0
Absolútny počet CD45+ * 10^3 / µl
4000,0
Absolútny počet CD34+ / µl
3000,0
n = 19
Percento CD34+ [%]
Min
Max
Priemer
SD
1,5
41,6
17,7
14,6
1,38
158,08
50,8
43,2
0,02
2,23
0,6
0,6
2000,0
1000,0
14. Limitácie metódy
0,0
0,0
500,0
1000,0
1500,0
2000,0
2500,0
3000,0
3500,0
4000,0
Produkt označený ako CE IVD je určený k In Vitro
diagnostickému použitiu v krajinách mimo územia USA
a Kanady.
Pripravené (označené a lyzované) vzorky musia byť zmerané
do 2 hodín od prípravy.
Vzorky, ktoré nemôžu byť zmerané do 2 hodín, musia byť
uložené v chladničke v ľadovom kúpeli.
Nerieďte ani nezamrazujte komponenty súpravy CD34
QuantiFlowEx® kit. Nepipetujte objemy komponentov iné než
stanovené v Sekcii 9 Postup vyšetrenia.
Nesprávne umiestnenie regiónov (Sekcia 9 Postup vyšetrenia)
môže mať za následok nesprávne stanovenie počtu a percent
Single Platform metóda [bunky / µl]
Linearita merania
Na stanovenie linearity merania bolo pripravených celkom 11
vzoriek s postupne klesajúcou koncentráciou CD34+ buniek
zmiešaných s plnou periférnou krvou. Na replikátoch každého
riedenia (n = 3) bolo vykonané meranie a stanovenie
absolútneho počtu a percenta CD34+ buniek. Vzorky boli
pripravené a označené pomocou súpravy CD34 QuantiFlowEx®
kit a analyzované cytometrom BD FACSCanto™. Na
vyhodnotenie očakávaných hodnôt a hodnôt získaných
z priemeru nameraných hodnôt pre každé riedenie bola použitá
lineárna regresia.
15. Referencie
Linearita merania
Nameraný počet CD34+ buniek [bunky / µl]
n
3000
y = 1,0648x + 4,8404
R² = 1
2500
2000
1500
1000
500
0
0
500
1000
1500
2000
2500
3000
Očakávaný počet CD34+ buniek [bunky / µl]
7/8
ED7080_SK_160502
16. Ochranné známky
FlowEx® je registrovanou ochrannou známkou spoločnosti
EXBIO Praha, a.s.
FACSCanto™ je registrovanou ochrannou známkou spoločnosti
BD Biosciences, San Jose
TruCount™ je registrovanou ochrannou známkou spoločnosti BD
Biosciences, San Jose
Flow-Count™ je registrovanou ochrannou známkou spoločnosti
Beckman Coulter® 17. Použité symboly
V
h
g
In Vitro Diagnostický Zdravotnícky
Prostriedok
M
Výrobca
i
l
H
X
Katalógové číslo
Číslo šarže
Pozorne si prečítajte inštrukcie
k použitiu
Skladujte pri danom rozmedzí teplôt
Spotrebujte do
Množstvo postačujúce na vykonanie
<n> testov
8/8
ED7080_SK_160502

CD34 QuantiFlowEx® Kit

Transkript

Podobné dokumenty

Stránka č. 1 z 4 Miloš Filip: Světu investic by pomohlo přehodnocení

EXCELLYSE I Lysing solution, lyzační roztok, lyzačný roztok

Laboratorní příručka

Cytometrické metody pro stanovení proliferace lymfocytů

Adactech-2014-CZ-pro email

Časopis - Beckman Coulter

Časopis - Beckman Coulter

KOMBITEST™ CD3 FITC / CD19 PE / CD45 PerCP