Získání a zpracování obrazu v mikroskopii

Mikroskopické metody v biomedicíně 14. – 18. října 2013
pondělí
8:30-9:00 Registrace účastníků
9.00
9.45
10.00
10.45
12.00
12.45
12.45
14.00
14.00
14.45
středa
čtvrtek
x
x
x
Fyzika mikroskopie v procházejícím Mikroskopické sledování pochodů v živých Obraz v transmisním elektronovém
světle
systémech, přehled technik: FRAP,
mikroskopu, tomografie a EELS
FLAP, FLIP, BRET, FLIM, PRIM, FRET,
FCS, LCS cytometrie
Prof. Plášek
Prof. Hozák
Dr. Benada
Základní metody zpracování obrazu
Superrezoluční světelná mikroskopie
Skenovací elektronový mikroskop;
záznam obrazu v el. mikroskopech
Korelativní mikroskopie
Prof. Plášek
Prof. Hozák
Dr. Benada
Ing. Nebesářová
káva
káva
káva
pátek
x
Praktika (3 skupiny):
3. sled 9.00-10.45
Pokračování z minulého dne
Doc. Hozman
Mikroskop a jeho součásti,
formování obrazu, optické aberace,
typy objektivů
10.45
11:00
11.00
11.45
úterý
Dr.Gerla (1)/ Dr. Radochová,
Dr. Lhotáková, Mgr. Kubínová
(2)/ Dr. Janáček, Mgr.
Čerňavský, Dr. Čapek, Dr.
Kubínová (3)
káva
káva
Formování kontrastu u mikroskopie FRET a FRAP detailně
v procházejícím světle, matematické
metody zvýšení kvality obrazu,
dekonvoluce
Prof. Plášek
Doc. Staněk
Fluorescenční mikroskopie a
Sondová mikroskopie v biologii (AFM)
imunoznačení
Příprava preparátů pro EM chemickou
cestou
Stereologické metody: vzorkování,
Měření trojrozměrných
měření objemu, počtu, povrchu a délky obrazových dat metodami
mikroskopických struktur
analýzy obrazu a stereologie
Ing. Nebesářová
Fyzikální metody v přípravě preparátů
Dr. Kubínová
Firemní prezentace – Leica, Nikon,
Zeiss
Prof. Hozák
Ing. Nebesářová
KRD lunch workshop
Multidimensionální laserová
konfokální mikroskopie – principy a
využití
Prof. Hozák
Demonstrace/praktika (5 skupin)
1) seřízení mikroskopu - Köhlerovo
osvětlení
2) fázový kontrast
14.45 3) interferenční kontrast
4) výběr imunoznačení
cca 17.00 5) fluorescenční mikroskop
Prof. Hozák/Leica/Nikon (2)/ Zeiss
(1,3)/ Dr. O. Šmíd (4)/
Mgr. A. Kalendová (5)
Dr. Dulebo
MTM lunch workshop
Dr. Kubínová a Dr. Janáček
Segmentace obrazu
Dr. Čapek
oběd
oběd
Demonstrace
(5 skupin)
1) sondový mikroskop (AFM)
2) konfokální mikroskop a sledování
pohybu GFP značeného proteinu v živé
buňce
Demonstrace
(5 skupin)
1) demonstrace TEM
2) HPF, FS a ultramikrotomie
3) EM imunoznačení: detekce
klastrování a kolokalizace
Praktika (3 skupiny):
14.00-17.15
1) zpracování obrazu
2) stereologické metody
3) metody hodnocení dat
z konfokálního mikroskopu
Demonstrace/praktika – pokračování
3) FRAP – mikroskopické pozorování
4) FRAP – stanovení difusní konstanty
5) TIRF mikroskopie
Demonstrace/praktika – pokračování 1. sled: 14.00-15.45
4) získání a digitalizace obrazu v TEM 2. sled: 15.45 - 17.15
5) demonstrace SEM
oběd
Obrazová analýza a 3D
vizualizace
Dr. Janáček
Příprava digitální
fotodokumentace pro publikační
účely
Dr. Benada
Ing. D. Novotný/Dr. A. Dulebo/Dr. T. Venit Prof. Hozák/Ing. J. Nebesářová (1)/Dr.
(1) Dr. Petrášek/ Mgr. J. Fukalová (2)/
M. Sobol (2/)/Mgr. A. Filimoněnko (3)/
Mgr. E. Stejskalová (3,4)/ Mgr. A.
Dr. O. Benada (4)/ Dr. O. Kofroňová (5)
Kalendová (4)/ Dr. Horváth (5)
Dr.Gerla (1)/ Dr. Radochová, Dr.
Lhotáková, Mgr. Kubínová (2)/ Dr.
Janáček, Mgr. Čerňavský, Dr. Čapek,
Dr. Kubínová (3)
ZHODNOCENÍ KURZU
15.30 – 15.45
Prof. Hozák
ANOTACE PŘEDNÁŠEK A PRAKTIK
Seřízení mikroskopu - Köhlerovo osvětlení (Zeiss)
Seznámení účastníků s nastavením Köhlerova osvětlení.
Fázový kontrast (Leica)
V naší sekci můžeme teoreticky vysvětlit a prakticky procvičit:
1) Nastavení Koehlerova osvětlení.
2) Nastavení fázového kontrastu a porovnání se světlým polem.
3) Nastavení tmavého pole a porovnání se světlým polem.
Cvičení budeme provádět na mikroskopu LEICA DM1000 s kamerou a monitorem.
Fázový kontrast (Nikon)
Nastavení fázového kontrastu při pozorování v procházejícím světle.
Vysvětlení nastavení fázového kontrastu pomocí pozorovacího okulárového dalekohledu, praktické procvičení nastavení. Nastavení bez pozorovacího dalekohledu a jeho procvičení.
Interferenční kontrast (Zeiss)
Seznámení účastníků s nastavením interferenčního kontrastu.
Výběr imunoznačení (Dr. Šmíd)
Seznámení účastníků s principy výběru vhodných značených protilátek pro fluorescenční a elektronovou mikroskopii. Výběr značených protilátek pro fluorescenční a elektronovou mikroskopii. Přímé a nepřímé
značení, výběr sekundárních protilátek, vícenásobné značení.
Fluorescenční mikroskop (Mgr. Kalendová)
Seznámení účastníků s konstrukcí a nastavením fluorescenčního mikroskopu. Pozorování živých a fixovaných buněk exprimujících fluorescenčně značené proteiny.
Sondový mikroskop (AFM) (Dr. Dulebo, Dr. Venit)
We will image living skin fibroblast cells in physiological media (in situ). We will demonstrate possibilities of combining both AFM and optical microscopy techniques in study live cell dynamics. We will also
measure cell nanomechanical properties (stiffness and Young’s modulus) and demonstrate its local variation within an individual cell.
Konfokální mikroskop a sledování pohybu GFP značeného proteinu v živé buňce (Dr. Petrášek)
1) Představení komponent konfokálního mikroskopu – cílem je demonstrovat, co je kde a jak je to sestaveno.
2) Nahlédnutí do rutinního fluorescenčního mikroskopu – každý uživatel se podívá na buňky tabáku exprimující mGFP5ER čili GFP targetované to lumen endoplasmatického retikula.
3) Představení software ovládání celého konfokálního systému – zde je akcent na to jasně ozřejmit, jak právě viděné buňky můžeme zobrazit pomocí konfokálního mikroskopu, tj. popíši optickou dráhu,
použité lasery, metody výběru excitační a emisní oblasti.
4) Sejmutí obrazu v xy – základní mód představující onen kontrast oproti zamlženému obrázku, co je vidět v mikroskopu. Pěkně kontrastní struktury retikulární struktury ER. Cílem je ukázat správné nastavení
obrázku, pozadi, napětí na fotonásobiči, pinhole, průměrování.
5) Sejmutí obrazu v xyz – nastavení horní a dolní meze snímání podél osy z. Složení maximální projekce a 3D obrazu.
6) Sejmutí obrazu v xyt – snímání pohybu GFP (rychlé pohyby membránových útvarů, přestavba retikulární sítě) v čase. Cílem je ukázat, jak zhruba je mikroskop rychlý, tj. kolik obrazů je schopen vykreslit za
sekundu a jak lze tuto rychlost regulovat.
FRAP – mikroskopické pozorování (Mgr. Stejskalová)
FRAP na lidských buňkách exprimujících sestřihový protein konjugovaný s GFP.
FRAP – stanovení difusní konstanty (Mgr. Kalendová)
Ze vzorových dat pořízených během FRAP měření bude sestrojena křivka a vypočteny parametry včetně difúzní konstanty charakterizující tuto křivku.
TIRF mikroskopie (Dr. Horváth)
Vysvětlení principu TIRF mikroskopie. Porovnání TIRF-M s jinými světelně-mikroskopickými technikami. Demostrace TIRF-M zobrazování na živých buňkách.
Demonstrace TEM (Ing. Nebesářová)
Seznámení s prací na transmisním elektronovém mikroskopu.
HPF, FS a ultramikrotomie (Dr. Sobol)
Seznámení s využitím HPF (vysoko-tlakového mražení), FS (kryo-substituce) a ultramikrotomie pro přípravu biologických vzorků k elektronové mikroskopii. Vysvětlení praktických detailů využití vysokotlakového mražení a kryo-substituce pro zachování ultrastruktury a antigenů v biologických preparátech určených pro elektronovou mikroskopii včetně imunoelektronové mikroskopie. Vysvětlení prace s
vysoko-tlakovým zamražovacím zařízením, kryo-substitučným zařízením, ultramikrotomem.
EM imunoznačení: detekce klastrování a kolokalizace (Mgr. Filimoněnko)
Seznámení účastníků s principy automatické detekce protilátek značených kovovými nanočásticemi na digitálních snímcích, porizených pomocí TEM, a následující statistické hodnocení patternu nanočástic
pomocí software Ellipse. Detekce klastrování a kolokalizace nanočástic různých velikostí po imunoznačení na ultratenkých řezech.
Získání a digitalizace obrazu v TEM (Dr. Benada)
Záznam obrazu v TEM, film vs. digitální záznam, CCD kamery a jejich umístění v TEM, vady digitálního záznamu (on-line shading correction), kalibrace zvětšení v TEM.
Demonstrace SEM (Dr. Kofroňová)
Seznámení s prací na rastrovacím (skenovacím) elektronovém mikroskopu.
Zpracování obrazu (Dr. Gerla)
Praktické ukázky vybraných metod z oblasti zpracování obrazu. Ověření těchto postupů na různých obrazech na PC se zaměřením na postupy využitelné při zpracování digitálních snímků z mikroskopu.
Obsah praktika: interpretace obrazové informace, převodní charakteristiky, práce s histogramem, aritmetické a logické operace, 2D konvoluční filtrace, flat-field korekce, průměrování obrazů, obarvení obrazu
pomocí tzv. pseudobarev.
Stereologické metody (Dr. Radochová, Dr. Lhotáková, Mgr. Kubínová)
Praktická cvičení pro pochopení principů stereologických měření a zvládnutí jejich aplikace v různých oborech výzkumu: praktické vyzkoušení stereologických metod pro odhad objemu mozku krysy
(Cavalieriho princip), pro odhad objemu a povrchu mrkve (Cavalieriho princip a metoda vertikálních řezů) a pro odhad počtu trojrozměrných částic (metoda disektoru).
Metody hodnocení dat z konfokálního mikroskopu (Dr. Janáček, Mgr. Čerňavský, Dr. Čapek, Dr. Kubínová)
Praktické ukázky měření stereologickými metodami na PC (bodová metoda, disektor, metoda vertikálních řezů, fakírská metoda), interakce s 3D objemovými daty, základní postupy úpravy dat a tvorba
povrchové reprezentace 3D objektů. Praktické seznámení se speciálními technikami optické mikroskopie - dvoufotonová mikroskopie, SHG, optická projekční tomografie.