Jak může analytická glykobiologie pomoci lékařství a biologickým

CO JE ANALYTICKÁ
GLYKOBIOLOGIE?
• - Relativně nová vědní oblast integrující nové
přístupy k měření základních biologických procesů
na buněčné a molekulární úrovni. Staví na znalosti
úlohy konjugátů důležitých látek jako jsou
bílkoviny (proteiny) a lipidy, ve spojení s
cukernými složkami biologické hmoty, takzvanými
oligosacharidy (nebo glykany). Zde hovoříme o
takzvaných glykoproteinech, glykolipidech a
proteoglykanech.
• - I když význam těchto cukerných látek
(glykonjugátů) pro selektivní regulaci důležitých
buněčných procesů je zřejmý po více než dvě
desetiletí, do nedávné doby nebylo možné tyto
biologicky důležité procesy kvantitativně
vyhodnotit.
ROLE MODERNÍ ANALYTICKÉ
CHEMIE
-Nové metody a přístrojová technika otevírají značné
možnosti biologického a lékařského významu.
-Jedním z hlavních úkolů je velice citlivá a
strukturálně detailní analýza biologických matricí v
malých objemech a stopových množstvích biologicky
důležitých látek. Hmotnostní spektrometrie je
klíčovou detekční metodou v glykobiologii.
-Použití nových separačních přístupů chromatografie
a elektroforézy je rovněž žádoucí.
-Kvůli komplexnosti analytických dat je rovněž nutné
využít počítačové techniky a bioinformatiky.
Emil Fischer
Laureát Nobelovy ceny za chemii
1902
Monosacharidové strukturní jednotky glykánů
N-glycolylneuraminová kyselina (NeuGc)
O-glykan
O-glykan
O-glykan
N-glykan
GlcNAc
GalNAc
Man
Gal
Fuc
Sial
GlcN
Inositol
Ethanolamin
Fosfát
O-glykan
GPI membránové
ukotvení
O
O
O
C
C
O
Heterogenita N-glykosylace na glykosylačních
místech fibronektinů z buněk a plazmy
(2350 zbytků a sedm N-glykosylačních míst)
LEKTINY
- Jsou specializované proteiny rostlinného i
živočišného původu, které rozpoznávají určité
motivy sacharidové struktury. Jsou známy již více
než 100 let a empiricky využity po mnoho let jako
histologická kontrastní činidla pro rozpoznávání
různých buněčných seskupení
- Lektiny jsou dále využívány pro izolaci a
přečištění biologických vzorků
- V poslední době je těchto proteinů také využito v
řadě analytických aplikací
Specificita vybraných lektinů
SNA or MAL
Lotus Lectin
SNA or MAL
Con A
Lentil Lectin
PEA Lectin
SNA or MAL
GlcNAc
NeuAc
Gal
Fuc
Man
Lektiny
Con A – Canavalia ensiformis
Lotus Lectin – Tetragonolobus purpureas
SNA – Sambucus nigra
PEA Lectin – Phaseolus vulgaris
R.D.Cummings, Methods in Enzymology, Vol. 230 (1994) 66-86
MAL – Maackia amurensis
Lentil Lectin – Lens culinaris
Povrch buňky je hustě obsazen
oligosacharidy ukotvenými k
proteinům nebo lipidům v buněčné
membráně. Tyto oligosacharidy pak
zprostředkovávají mezibuněčné
interakce a interakce buněk s
mimobuněčnými subjekty.
Důležitá role, kterou sacharidy
zastávají v biologických systémech,
výrazně přispěla k rychlému rozvoji
oboru glykobiologie.
23. březen 2001
"Carbohydrates and Glycobiology"
Vol. 291 Pages 2263-2502
Jun Hirabayashi
Nature Chemical Biology
5(2009)198-199
L. Tong, et al. in Biotechnology & Genetic Engineering Reviews, Vol 20, p. 214 (2003)
Souvislost glykosylace s různými
nemocemi
• Imunita proti infenkčním onemocněním, včetně
HIV
• Revmatická artritida (změny IgG a hladiny
mannosu vázajících proteinů v séru)
• Nemoci prionů
• Vrozené poruchy glykosylace (vzácné, obvykle
se projeví poruchami CNS)
• Nemoci ústní dutiny
• Cystická fibróza
• Srdeční poruchy
• Rakovina
Glycosylation
N‐acetylglucosamine
mannose
galactose
N‐acetylneuraminic acid
(sialic acid)
fucose
Bertozzi, C. R.; Kiessling, L. L. Science Biology 2001, 291, 2357-2364
ANALYTICKÁ GLYKOBIOLOGIE
Glykomika
se zabývá studiem
oligosacharidových složek
glykokonjugátů
Glykoproteomika
se zabývá detaily spojení
oligosacharidových složek s
bílkovinami
GLYKOBIOLOGIE
GLYKOPROTEOMIKA
FUNKČNÍ GLYKOMIKA
% intenzita
fragmenty
M+
m/z
Glykomická analýza
Fragmentace glykánů pomocí MALDI-MS
A. Štěpení glykosidických vazeb
Y2
CH2OH
Z2
OH
OH
B1
O
C1
Y0
O
O
OH
OH
Z1
CH2OH
CH2OH
O
OH
Y1
O
OH
B2
C2
O
OH
B3 C3
Domon, B.; Costello, C. E. Glycoconjugate J. 1988, 5, 397-409.
R
Z0
Glykomická analýza
Fragmentace glykánů pomocí MALDI-MS
B. Cross-ring fragmentace
3,5X
1,5X
2
CH2OH
O
OH
0,2A
OH
OH
1
CH2OH
CH2OH
O
OH
1
O
O
\O
[
OH W
Z
X
Y
OH
OH
2,4A
2
2,5A
3
Domon, B.; Costello, C. E. Glycoconjugate J. 1988, 5, 397-409.
O
R
Glykomická analýza
Fragmentace glykánů pomocí MALDI-MS
3,5
22.9
X4α’
CH2OH
O
90
OH
1,5
OH
80
3,5
X4α”
OH
3,5
X4α”
O
OH
1,5
X
X2
0,2
1,4
A5
2,4
A5
CH2OH
A5
O
O
OH
OH
O
OH
OH
NH
NH
A4 CH3
C O
OH
1,5
1,5
X0
30
41.1
73.3
91.4
20
0
O
3,5
CH3
0,2
C O
A5
B4
OH
40
10
X3β
CH2OH
O
OH
50
CH2OH
CH2OH
0,4
A3
O
1,5
A4
O
OH
60
O
OH
OH
3,5
3,5
A3
O
147.8
164.9
185.1
203.1
226.1
244.1 1,5
272.1 X1
306.9
327.2
347.1
365.1
399.2
429.2
447.2
1,5
X2
475. 2
509.2
527.2
550.2
0,4
A3
3,5
583.2
A3
607.2
625.2 653.2
B3/
655.2 671.2
Z3β
689.2
712.2
745.3
771.3
1,5
X3α
799.3
817.3
849.3
874.3 B4/Y4x,3β
3,5
907.3265 A4
933.37520,2A
953.3788 4
979.3621
3,5
1010.3968 A5
1036.4
1061.4
2,4
A5
1095.4
1,5
X4x,3β
1123.5
0,2
A
1156.4673
3,5 5
1182.4816 X4x,3β
% Intensity
OH
X3 α
X4α’
CH2OH
O
70
CH2 1,5
O
OH
9.0
C1 Y1
B1
X3β
Y2
(Hex)2
Z1
B2α
Ion D
B3/Y3β
C3
C2α
C4
Y3α
Z2
1257.5524
100
Na+
B3
Y4x
271.6
534.2
Mass (m/z)
796.8
1059.4
1322.0
Yehia Mechref, Milos V. Novotny and Cheni Krishnan, Anal. Chem., Anal. Chem., 75 (2003), 4895-4903.
50
40
30
20
070.0
10
233.2
0,2
X1
396.4
463.2581 Y2
NMe
486.2627
Mass (m/z)
R
NMe
R
O
COOMe
OMe
O
OMe
3,5A
588.3689
559.6
722.8
838.7374
A3
CH3
735.6197
748.6714
762.6510
776.7420 B3/Z3
A3 2,4
A3/2,4X2
3,5
X1
A3
OMe
X2
1,5
OMe
A3
OMe
2,4
OMe
0,4A
707.5743
OMe
C
O
O
3,5
C
H
X3
OMe
X1
R
0,3
H
OMe
X2
0,3
2,4
0,1
A2
NMe
604.3752 C2/Y3
618.3984 2,4A3/1,3X3
H
3,5
1,5
OMe
X3
X3
O
0,2
0,2
OMe
CH2OMe
X3
547.3480
X3
A2
572.3797 E2
C
2,5
X3OMe
O
0,1
H
O
533.2890
OMe
0,4
356.1790 B2/0,3X3
O
A2
R=
1,3
A2
3,5
90
A1
4,5
376.2148
385.1949
415.2241 F3 or G2
416.2312
431.2109 B3/Y2
458.2351 0,4A2
100
COOMe
287.1075 1,5X2
R
310.1293
70
X3
A1
0,3
3,5
NMe
254.1401
60
X1
2,5
3,5
155.0871 0,3X1
167.0598 4,5A2/3,5X3
188.1005
211.1080 3,5A2/2,5X3
227.0987
89.1007
111.0778 0,2X
1
127.1017
80
101.0986
% Intensity
CH3
6’-Sialyllaktóza z lidského mléka
C=O
CH3
C=O
O
COOMe
O
2
CH3
C=O
O
C=O
COOMe
O
O
O
OMe
OMe
2
OMe
2,4X
2
2,4A
3
690.5355
886.0
MALDI TOF-TOF (ABI 4800)
Reflektron
Detektor pro
lineární mód
Zdroje vysokého
napětí
TOF 2
CID cela
Ovládaní
iontové optiky
Detektor pro
reflektron mód
Řídící
elektronika
Laser (355 nm)
TOF 1
Ionizační zdroj
Vstup pro platíčko
LTQ-FT Ultra
Platforma na analýzu glykoproteinů
Vzorek
M. Madera, Y. Mechref, I. Klouckova, M. V. Novotny
J. Proteome Res., 2006; 5(9); 2348-2363. .
MARS kolona
Lektinová afinitní
chromatografie
mRP (70oC)
chromatografie
Sběr frakcí a
Trypsinová digesce
Nano LC-MS/MS
Hledání v databázi
Výsledek
Specifické biologické
problémy a předpoklady
Molekulární profilování a –omické
postupy
(genomika, transkriptomika,
proteomika, glykomika,
metabolomika, atd.)
SYSTÉMOVÁ BIOLOGIE
Biologická manipulace
s využitím zvířecích modelů
Počítačová simulace
a vyvození obecných
závěrů
van der Greef, et al., Curr Opin Chem Biol 8,560 (2004).
Jemal, A., R. Siegel, et al. (2007). "Cancer statistics, 2007." CA Cancer J. Clin. 57(1): 43‐66
Komplikovanost analýzy proteinů v
krevním séru
-1
-2
-3
MS
Immunoafitní chromatografie +MS
Koncentrace (g/ml)
-4
-5
-6
Studium
biomarkerů v
různých tkáních
-7
-8
Proteiny ve středu
zájmu
-9
-10
-11
-12
Počet proteinů
Glycomic Profiling of Human Blood Serum
Human Blood Serum
(10-50 μl)
Kyselova, Z.; Mechref, Y.;
Al Bataineh, M.; Dobrolecki,
L.; Hickey, R.; Vinson, J.;
Sweeney, C.; Novotny, M.V.
J. Proteome Res., 6 (2007)
1822-1832.
Proteins/Glycoproteins
PNGase F Digestion
Proteins/N-Glycans
Solid-Phase Extraction
100
2792.8440
N-Glycans
90
80
Solid-Phase
Permethylation
70
60
50
0
849
1181
1513
1845
2177
2509
Mass (m/z)
3003
3507
4011
GLYCOMIC MAPS
4587.5
10
1416.8
MALDI/MS
4052.9
20
4226.1
30
2850.9
2880.9
2967.0
3055.0
3212.2
3242.2
3331.3
3416.4
3603.5
3691.6
3777.7
40
1579.9
1620.9
1661.9
1783.9
1836.0
1866.0
1907.0
1987.0
2040.1
2070.1
2112.2
2192.2
2244.1
2396.0
2401.0
2433.3
2605.7
2676.8
% Intensity
Permethylated
N-Glycans
4515
35
5019
Healthy
Kyselova et al. Clin.Chem.54, 1166-1175(2008)
Breast Cancer Stage IV
1500
2200
2900
3600
Mass (m/z)
4300
5000
PCA of MALDI/MS Profiling of Glycans Derived from
Blood Sera of Healthy Individuals
and Breast Cancer Patients
Healthy (N=19)
Cancer Stage I (N=8)
Cancer Stage II (N=7)
Cancer Stage III (N=4)
Cancer Stage IV (N=50)
PC2 Score
16
15
14
13
12
11
10
9
8
7
6
5
4
3
2
1
0
-1
-2
-3
-4
-5
-6
-7
-8
-9
-10
-11
-12
-13
-14
-26 -24 -22 -20 -18 -16 -14 -12 -10 -8 -6 -4 -2 0
2
PC1 Score
4
6
8 10 12 14 16 18 20 22 24 26 28 30 32 34
Healthy
Prostate Cancer
100
1
70
Healthy
80
PC-02
30
60
PC-03
10
PC2 Score
-10
H-7
PC-14
PC-19
PC-05
PC-24
PC-07
H-10
H-9
PC-17
PC-06
PC-08
PC-22
PC-23
H-2
PC-20
-20
20
H-6
PC-01
PC-11
0
0
-30
PC-16
PC-18
0.6
2285
AUC = 0.94 ± 0.04
highly accurate test
0.4
H-32
0.2
H-5
-50
60
-60
0
-80
Prostate Cancer
100
1500
0
H-4
-70
80
2200
2900
Mass (m/z)
3600
MALDI‐MS
4300
-90
5000
-80
-60
-40
-20
0
20
40
PC1 Score
PCA
60
80
100
120
0.2
0.4
0.6
Specificity
ROC
Healthy, n=10
Prostate Cancer, n=24
20
10
0
H-8
PC-04
PC-15
-40
40
rel. intensity (%
PC-10
PC-09
PC-21
20
0.8
1
rel. intensity (%
PC-12
30
40
Sensitivity
% Intensity
H-1
40
20
% Intensity
0.8
PC-13
50
60
4
1835 2070 2285 2676 2792 3054 3241 3415 3691 3864
4052
detailed
view4226
2
0
1835 2070 2285 2676 2792 3054 3241 3415 3691 3864 4052 4226
Potenciální glykánové
biomarkery
Postup směřující k možné diagnostice a prognostice rakoviny prostaty, který je založen na profilování
permethylovaných glykánů pomocí MALDI‐MS. Výsledky z této metodiky ukazují statisticky významné
rozdíly mezi glykomickými profily 10 zdravých jedinců a 24 pacientů s rakovinou prostaty. Potenciální
glykánové biomarkery pro rakovinu prostaty jsou poté stanoveny pomocí statistických testů jako PCA, ROC a ANOVA.
Kyselova, Z.; Mechref, Y.; Al Bataineh, M.; Dobrolecki, L.; Hickey, R.; Vinson, J.; Sweeney, C.; Novotny, M.V. J. Proteome Res., 6 (2007) 1822‐1832.
PCA of MALDI/MS Profiling of Glycans Derived from
Sera of Cancer Free Individuals (n= 77), Liver Cancer
Patients (n= 73), and Cirrhosis Patients (n= 53)
HC (n= 73)
NC (n= 77)
QT (n=53)
18
16
14
12
10
8
PC2 Score
6
4
2
0
-2
-4
-6
-8
-10
-12
-14
-16
-50
-45
-40
-35
-30
-25
-20
-15
-10
-5
0
5
PC1 Score
10
15
20
25
30
35
40
45
R. Goldman, H.W. Ressom, R.S. Varghese, L. Goldman, G. Bascug, C.A. Loffredo, M. Abdel-Hamid,
I. Gouda, S. Ezzat, Z. Kyselova, Y. Mechref, M.V. Novotny, Clin. Cancer Res. 2009, in press
Quantitative Glycomic Analysis at High Sensitivity through MS
Indiana University
2792.2
Immunoaffinity separation
100
2.4E+4
90
% Intensity
80
6 High-abundance Proteins:
IgG, antitrypsin, IgA, transferrin,
haptoglobin, fibrinogen
70
60
50
3560
Mass (m/z)
4586.9
4412.9
4225.8
3602.6
3690.6
3776.6
3415.5
2966.3
2840
4280
5000
2792.2
2120
3951.7
4051.7
0
1400
3211.4
3241.4
10
1783.9
1835.9
1865.9
20
1579. 8
30
2040.0
2081.0
2111.0
2226.9
2244.0
2285.0
2431.1
2489.1
2605.2
2676.2
40
100
2.6E+4
90
70
60
50
2120
Mass (m/z)
3560
4280
4586.9
4412.9
4225.8
3415.5
2966.3
2840
3602.5
3690.6
3776.6
3864.7
3951.7
4051.7
0
1400
3211.4
3241.4
10
2605.1
20
1783.8
1835.8
1865.9
2040.0
2070.0
2192.1
2227.1
2244.1
30
2431.1
40
1579.7
% Intensity
80
5000
Albumin
6 Highabundance
55%
proteins
28%
Lowabundance
proteins
17%
Quantitative Glycomic Analysis at High Sensitivity through MS
Indiana University
Principal Component Analysis
(
)
(
)
g|
(
)
QT 10-B_38_F14.t2d QT 20-B_80_H8.t2d
8
Controla
Cirrhosis
HCC
7
6
QT 16-B_68_G20.t2d
QT 15-B_59_G11.t2d
QT 13-B_65_G17.t2d
Principal Component 2
QT 14-B_62_G14.t2d
QT 25-B_08_E8.t2d
QT 28-B_17_E17.t2d
4
QT 07-B_44_F20.t2d
HC 14-B_61_G13.t2d
HC 03-B_21_E21.t2d
HC 16-B_52_G4.t2d
1
HC 23-B_73_H1.t2d
-4
NC 05-B_09_E9.t2d
NC 29-B_03_E3.t2d
HC 04-B_49_G1.t2d
NC 10-B_42_F18.t2d
HC 24-B_76_H4.t2d
NC 26-B_90_H18.t2d
NC 20-B_69_G21.t2d
HC 11-B_19_E19.t2d
HC 18-B_31_F7.t2d
NC 01-B_15_E15.t2d
NC 02-B_18_E18.t2d
HC 08-B_10_E10.t2d
-3
NC 08-B_36_F12.t2d
NC 14-B_51_G3.t2d
NC 13-B_48_F24.t2d
HC 27-B_85_H13.t2d
HC 12-B_22_E22.t2d
-2
QT 06-B_89_H17.t2d
QT 11-B_32_F8.t2d
HC 02-B_37_F13.t2d
-1
QT 29-B_20_E20.t2d
HC 01-B_43_F19.t2d
QT 08-B_56_G8.t2d
HC 28-B_07_E7.t2d
0
QT 18-B_74_H2.t2d
QT 21-B_83_H11.t2d
QT 17-B_71_G23.t2d
HC 07-B_46_F22.t2d
3
HC 15-B_58_G10.t2d
NC 17-B_60_G12.t2d
NC 25-B_88_H16.t2d
HC 17-B_55_G7.t2d
-5
-6
QT 22-B_87_H15.t2d
QT 12-B_35_F11.t2d
QT 26-B_11_E11.t2d
5
2
QT 05-B_50_G2.t2d
NC 24-B_86_H14.t2d
NC 12-B_45_F21.t2d
HC 19-B_28_F4.t2d
NC 28-B_84_H12.t2d
NC 06-B_27_F3.t2d
-7
NC 15-B_54_G6.t2d
NC 09-B_39_F15.t2d
-8
NC 23-B_78_H6.t2d
-10
-9
-8
-7
-6
-5
-4
-3
-2
-1
0
1
D1 S
Principal Component 1
Major proteins
2
NC 07-B_30_F6.t2d
3
4
5
6
7
Quantitative Glycomic Analysis at High Sensitivity through MS
Indiana University
Principal Component Analysis
(
)
(
6
Principal Component 2
0
-1
-2
)
NC 28-A_84_D12.t2d
NC 07-A_30_B6.t2d
NC 17-A_60_C12.t2d
NC 04-A_24_A24.t2d
NC 05-A_09_A9.t2d
NC 06-A_27_B3.t2d
NC 24-A_86_D14.t2d
NC 12-A_45_B21.t2d
NC 25-A_88_D16.t2d
NC 01-A_15_A15.t2d
HC 05-A_40_B16.t2d
4
1
(
NC 20-A_69_C21.t2d
HC 22-A_70_C22.t2d
5
2
g|
Control
Cirrhosis
HCC
7
3
)
HC 13-A_25_B1.t2d
HC 30-A_01_A1.t2d
NC 21-A_72_C24.t2d
HC 04-A_49_C1.t2d
NC 27-A_81_D9.t2d
NC 15-A_54_C6.t2d
NC 02-A_18_A18.t2d
NC 16-A_57_C9.t2d
HC 02-A_37_B13.t2d
NC 19-A_66_C18.t2d
HC 17-A_55_C7.t2d
NC 13-A_48_B24.t2d
HC 12-A_22_A22.t2d
HC 18-A_31_B7.t2d
HC 15-A_58_C10.t2d
HC 24-A_76_D4.t2d
NC 11-A_12_A12.t2d
HC 07-A_46_B22.t2d
NC 10-A_42_B18.t2d
QT 27-A_14_A14.t2d
HC 26-A_82_D10.t2d
HC 25-A_79_D7.t2d
HC 11-A_19_A19.t2d
HC 10-A_16_A16.t2d
HC 01-A_43_B19.t2d
HC 16-A_52_C4.t2d
HC 20-A_64_C16.t2d
-3
QT 26-A_11_A11.t2d
HC 28-A_07_A7.t2d
QT 03-A_53_C5.t2d
QT 09-A_41_B17.t2d
QT 20-A_80_D8.t2d
QT 14-A_62_C14.t2d
QT 15-A_59_C11.t2d
QT 16-A_68_C20.t2d
-4
QT 10-A_38_B14.t2d
-5
QT 11-A_32_B8.t2d
-6
QT 01-A_26_B2.t2d
QT 28-A_17_A17.t2d
-7
-12
-11
-10
-9
-8
-7
-6
-5
-4
-3
-2
-1
0
D1 S
1
Principal Component 1
Minor proteins
2
QT 05-A_50_C2.t2d
3
4
5
6
7
ZÁVĚR
• Glykobiologie se rapidně stává důležitou
složkou veškerého výzkumu v oblasti
moderní biologie a medicíny
• Glykomika a glykoproteomika využívá
nových možností instrumentace v
bioanalytické chemii a informační
technologii
• Lze očekávat pokrok v klinické diagnóze a
prognostických měřeních založených na
objasnění otázek struktury a funkce
glykánů