kap. 5

Příprava materiálu byla podpořena projektem
OPPA č. CZ.2.17/3.1.00/33253
Část 5 – Volba mobilní fáze
Mobilní fáze musí být pochopitelně volena podle jejích chromatografických vlastností, musí
vést k dělení směsi co nejrychleji a nejúčinněji. Výběr mobilní fáze je založen na řadě
hledisek:
(a) UV transparentnost: pokud je k detekci analytů použit UV detektor, musí být mobilní
fáze transparentní, tedy musí vykazovat velmi malou absorbanci, např. ethylacetát
není vhodný jako mobilní fáze pokud má být analyt detekován při vlnových délkách
pod 254 nm (< 10 % absorpce). Dle tohoto hlediska musí být voleny pufry, iontověpárová činidla, a jiná aditiva do mobilní fáze.
(b) Viskozita: rozpouštědla s menší viskozitou poskytují nižší pracovní tlaky na koloně při
daném průtoku. To umožňuje dosahovat rychlejší chromatografii, protože přenos
hmoty
je
rychlejší.
Dynamická
viskozita
η
rozpouštedla
je
vyjadřována
v miliPaskalsekundách (mPa; dříve v cP; hodnoty zůstavají stejné).
(c) Index lomu: je podstatný pouze pokud je k detekci užit detektor na bázi měření indexu
lomu. Pak je třeba, aby rozdíl mezi indexy lomu mobilní fáze a analytu byl co největší.
(d) Čistota mobilní fáze: je třeba, aby neobsahovala látky interferující se separací
a detekcí. Obecně je dobré používat solventy kvality pro HPLC.
(e) Inertnost vzhledem ke složkám vzorku: mobilní fáze nesmí reagovat se složkami
vzorku (pozor na peroxidy). Pokud je potřeba pracovat s mimořádně citlivými látkami
na oxidaci přádává se do mobilní fáze 0.05 % antioxidantu, 2,3-di-terc-butyl-p-kresolu
1
(BHT). BTH může být snadno odstraněn z efluentu odpařením, ale absorbuje v UV
oblasti pod 285 nm.
(f) Bod varu: nižší bod varu je vhodný tehdy, když při separaci mají být sbírány frakce
a z nich izolován analyt. Na druhou stranu platí, že těkavé solventy mohou tvořit
bubliny v HPLC čerpadle a detektoru, a to může vést k velkým potížím při
chromatografii.
(g) Odolnost vůči korozi: světlo způsobuje uvolňování HCl z chlorovaných rozpouštědel.
Spolu s všudypřítomnou vodou vzniká kyselina chlorovodíková korodující nerezovou
ocel. Korozivita je zesilována přítomností polárních rozpouštědel, směsi jako
tetrahydrofuran-tetrachlormethan
nebo
methanol-tetrachlormethan
jsou
zvláště
reaktivní. Všechny látky tvořící komplexy se železem, jako např. chloridy, bromidy,
iodidy, acetáty, citráty a mravenčany (časté složky pufrů) jsou korozívní. Soli lithia
jsou také velmi korozívní za nízkých hodnot pH. Ocel může korodovat i působením
samotného methanolu a acetonitrilu. Pro některé aplikace může být nutné provést
pasivaci instrumentace kyselinou dusičnou nebo zvolit biokompatibilní instrumentaci,
kde do kontaktu s mobilní fází nepřichází nerezová ocel, ale pouze slitiny titanu
a speciální polymery jako je PEEK. V každém případě lze doporučit dokonalé promytí
instrumentu ultračistou vodou, pokud byla použita mobilní fáze obsahující
halogenovaná rozpouštědla nebo pufry.
(h) Toxicita: Je na odpovědnosti každé laboratoře maximálně vyhnout se vystavování
toxických látek. Chlorovaná rozpouštědla mohou uvolňovat jedovatý fosgen. Vždy je
třeba dát přednost užití toluenu před benzenem (karcinogen).
(i) Cena: Také důležitý parametr, ale spíše sekundárního významu pokud jde o separace
v analytickém měřítku. Odlišná situace je u preparativní HPLC, kde se může jednat
o bod zásadní.
Jako obecné pravidlo platí, že mobilní fáze by neměla poskytovat odezvu v detektoru,
až na výjimky, např. v případě tzv. nepřímé detekce. Pokud toto není splněno,
důsledkem bývá nestabilní základní linie a nedefinované píky v chromatogramu.
Nicméně tato podmínka nemusí být splněna vždy a zcela jistě ne v případě, kdy je
detekce založená na měření tzv. kolektivních vlastností mobilní fáze jako celku, např.
pokud je detekce založena na změně indexu lomu apod.
2
Příprava mobilní fáze
Pečlivému výběru mobilní fáze by měla následovat jeho stejně pečlivá příprava.
Obvykle je nejlepší používat solventy a chemikálie prodávané v kvalitě “HPLC grade”.
To platí především pro vodu, pokud v laboratoři není zdroj vody vhodné pro HPLC analýzy.
U komerčních HPLC rozpouštědel je zajištěna malá a definovaná absorpce UV záření
a absence kontaminantů ovlivňujících retenci analytů nebo způsobujících nežádoucí píky při
gradientových separacích. Nicméně pokud takové solventy dostupné nejsou, lze použít
rozpouštědla i menší kvality po jejich destilaci nebo přečištění adsorpční chromatografií.
V případě směsných mobilních fází by měla být jejich příprava vždy detailně popsána.
Vlastnosti mobilní fáze mohou být závislé na pořadí jednotlivých operací během její přípravy,
např. rozpouštění jednotlivých komponent, nastavení pH pufrů, přidání aditiv, apod. Při
míchání vody s methanolem (a i v případě jiných solventů) dochází k podstatné objemové
kontrakci, tzn. objem směsi je menší než objemy míchaných složek. Je tedy třeba odměřovat
tyto solventy odděleně před mícháním.
Pokud není rozpouštědlo použito jako mobilní fáze přímo z originální lahve, je nutné
mobilní fáze filtrovat přes membránový filtr s velikostí pórů 0,45 nebo raději 0,2 µm a to
těsně před použitím. Je třeba počítat s možností mechanických nečistot v mobilní fázi a ty
mohou poškodit ventily čerpadla, případně ucpat kapiláry nebo kolonu. Je třeba správně volit
filtrační membrány z hlediska jejich kompatibility s filtrovanými roztoky.
Z více důvodů je nutné mobilní fázi pro HPLC odplyňovat, týká se to především polárních
solventů, které mohou rozpouštět velké množství vzduchu (voda, pufry, další vodné směsi,
s vodou mísitelná rozpouětědla), jinak lze očekávat nejrůznější potíže: vzduchové bubliny
v detektoru, kde je malý tlak, základní linie začne být zašuměna apod., přesnost měření může
být zhoršena, píky se mohou zmenšit díky zvýšené absorpci mobilní fáze vyvolané
přítomností kyslíku (především na nízkých vlnových délkách v UV oblasti). Zvláště citlivá na
přítomnost rozpuštěných plynů v mobilní fázi je gradientová eluce, protže při míchání
solventů dochází k uvolňování rozpuštěných plynů.
Mobilní fázi lze odplynit “off-line” umístěním zásobníku do ultrazvukové lázně
a sonikací za vakua po dobu jedné minuty. Takto odplyněná fáze pak vydrží po dobu několika
hodin, pokud ovšem požadavky na analytickou přesnost jsou jen malé. Pokud jsou užívána
iontově-párová činidla, může docházet k pěnění. “On-line” odplyňování je ovšem pohodlnější
alternativou, a provádí se buď probuláním mobilní fáze heliem (je daleko méně rozpustné než
vzduch) nebo za využití odplyňovacího modulu, ten je založen na polopropustné membráně,
kterou může procházet jen plyn a nikoliv kapalina, za membránou je podtlak, a tím lze
3
dosáhnut online kontinuálního odplyňování mobilní fáze. Tyto moduly mají ale poměrně
velký objem (řádově jsou to jednotky mililitrů), a to je nevýhodné pokud je třeba měnit
mobilní fázi, ale dnes je to nejběžnější technika odplyňování m.f.
Roztoky by neměly být skladovány v plastových zásobnících, protože se z nich mohou
uvolňovat změkčovadla a jiné nízkomolekulární látky do mobilní fáze. Lahve by měly být
vždy uzavřeny, nehledě na to, jestli jsou nebo nejsou mobilní fáze právě používány.
Množství kapaliny v zásobníku je třeba často kontrolovat. Čerpadla nesmí nikdy pracovat
bez kapaliny, v takovém případě zpravidla dojde k jeho větší poruše. Přívodní trubička mezi
zásobníkem a čerpadlem musí mít dostatečně velký průměr (kolem 2 mm).
4