Protilátky proti Toxoplasma gondii (IgG)

Protilátky proti virulentním faktorům Yersinia enterocolitica (IgG)
Návod na provedení WESTERNBLOTU
Objednací číslo
Určení
Ig-Třída Substrát
DY 2173-1601 A Yersinia enterocolitica IgG
(faktory virulence)
WESTERNBLOT – proužky
potažené virulentními
faktory kódovanými
plasmidem z kmene O:3
(Vnější membránové
proteiny Yersinie)
Formát
16 x 01 (16)
Indikace: Revmatoidní onemocnění (artritida), erythema nodosum
Princip testu: Kit WESTERNBLOT test se používá ke kvantitativnímu in-vitro stanovení
lidských protilátek proti virulentním faktorům patogenního kmene Yersinia enterocolitica
v séru. Testovací kit obsahuje testovací proužky s virulentními faktory Yersinia enterocolitica
rozseparovanými elektroforézou. V prvním kroku jsou proužky inkubovány s naředěným
sérem pacienta. V případě pozitivního vzorku se specifické protilátky IgG (IgA, IgM) naváží
na antigeny. Pro zviditelnění reakce se používá druhé inkubace s enzymové značenými
protilátkami proti lidským protilátkám IgG, které slouží poté jako katalyzátor pro vlastní
barevnou reakci.
Obsah kitu:
- Testovací proužky s elektroforeticky separovanými virulentními faktory: 16 testovacích
proužků
- Kontrolní proužek
na vyhodnocovací matrici: 1 testovací proužek inkubovaný
s pozitivním kontrolním sérem
- Anti-lidský IgG koncentrát značený alkalickou fosfatasou (kozí): 1 x 3 ml 10x
koncentrátu, ze kterého vznikne 30 ml enzymového konjugátu.
- Koncentrát pufru: 1 x 50 ml 10 x koncentrátu, ze kterého vznikne 500 ml univerzálního
pufru připraveného k použití.
- Roztok substrátu: 1 x 30 ml, připraveno k použití, Nitroblue tetrazolium chloride/5bromo-4-chloro-3-indolyl phosphate (NBT/BCIP)
- Hodnotící matrice a protokol, 1 papír
- Inkubační vanička: 2 x 8 kanálků
- Fólie
- Návod k použití
Uskladnění a stabilita: Diagnostický kit musí být skladován při teplotě mezi +2 oC až +8 oC,
nesmí být zmražen. Datum expirace je vytištěno na štítku na kitu.
Poznámky k použití: Součásti každé série testovacího kitu si vzájemně odpovídají. Aby byla
zaručena správnost kitu, používejte pouze součásti z jedné série. Balení obsahuje testovací
proužek s dvojmístným číslem navíc k sériovému číslu kitu. Toto je sériové číslo proužku a
je rovněž vytištěno na odpovídající hodnotící matrici. K zaručení správného výsledku testu
musí obě čísla souhlasit.
1.
Upozornění: U séra použitého pro kontrolní proužek nebyly detekovány ani HBsAg nebo
protilátky proti HIV-1 nebo HIV-2. Nicméně, s kontrolní proužkem musí být zacházeno se
stejnou opatrností jako s infekčním materiálem. Některé reagencie jsou toxické (pufr, roztok
substrátu). Vyvarujte se kontaktu s kůží. V případě kontaktu, omyjte kůži mýdlem a velkým
množstvím vody.
Příprava reagencií
Poznámka: Všechny reagencie se musí nechat před použitím vytemperovat na pokojovou
teplotu.
Potažené proužky: Připravené k použití. Abyste zabránili zvlhnutí proužků po otevření,
neotevírejte balení obsahující proužky, dokud nedosáhne pokojové teploty. Po odebrání
příslušného počtu proužku, balení dobře uzavřete a uchovávejte ho při +2 - +8 oC. K zaručení
správného výsledku testu musí sériové číslo vytištěné na balení a testovacích proužcích
souhlasit s tím, které je uvedeno na kontrolní matrici.
Univerzální pufr: 10 x koncentrát. K vytvoření univerzálního pufru odpipetujte ze zásobní
lahve příslušné množství a pomocí destilované nebo deionizované vody je zřeďte v poměru
1:10. Například: na 1 testovací proužek zřeďte 1.5 ml koncentrátu 13.5 ml destilované nebo
deionizované vody. Naředěný univerzální pufr může být uchováván maximálně po dobu 1
týdne při při +2 - +8 oC. V koncentrátu se mohou objevit krystaly, proto před naředěním
zahřejte pufr na 37oC a dobře ho promíchejte.
Enzymový konjugát: Anti-lidský IgG koncentrát je 10 x koncentrovaný. K vytvoření
enzymového konjugátu připraveného k použití odpipetujte potřebné množství z lahve a zřeďte
ho v poměru 1:10 univerzálním pufrem. Například: na 1 testovací proužek zřeďte 0.15 ml
anti-lidského IgA 1.35 ml univerzálního pufru.
Roztok substrátu: Připravený pro užití. Uzavřete láhev ihned po použití, obsah je citlivý na
světlo.
Ředění séra a vzorků plasmy
Vzorky séra a plazmy pro analýzu se ředí 1: 51 univerzálním pufrem. Například, přidejte
30 µl séra k 1.5 ml vzorkového pufru a dobře promíchejte.
2.
Inkubace
Blokování:
Naplňte příslušný počet kanálků na misce odpovídajících počtu
vzorků séra 1.5 ml naředěného univerzálního pufru. Z balení
pomocí pinzety odeberte potřebný počet proužků a umístěte je
do kanálků. Inkubujte na třepačce po dobu 15 minut. Poté
veškerou kapalinu odsajte.
Inkubace se sérem:
(1. krok)
Naplňte každý kanálek 1.5 ml naředěného vzorku séra a
inkubujte při pokojové teplotě na třepačce 30 minut.
Promytí:
Odsajte veškerou kapalinu z kanálků a každý kanálek promyjte
na třepačce 3 x 5 minut naředěným univerzálním pufrem.
Inkubace s konjugátem:
(2. krok)
Do každého kanálku pipetujte 1.5 ml naředěného enzymového
konjugátu a inkubujte po dobu 30 minut při pokojové teplotě
na třepačce.
Promytí:
Odsajte veškerou kapalinu z kanálků a každý kanálek promyjte
na třepačce 3 x 5 minut naředěným univerzálním pufrem.
Inkubace se substrátem:
(3. krok)
Pipetujte do každého kanálku 1.5 ml roztoku substrátu.
Inkubujte na třepačce při pokojové teplotě 10 minut.
Zastavení:
Odsajte kapalinu ze všech kanálků a promyjte každý proužek 3x
destilovanou nebo deionizovanou vodou.
3.
Anti-virulentní faktory Yersinia enterocolitica WESTERNBLOT
Inkubační protokol
Příprava:
Pipetujte 1.5 ml univerzálního pufru do
inkubačních kanálků obsahujících proužky
15min
Třepat
1. Inkubace se vzorkem
Odsajte kapalinu, do inkubačních kanálků
napipetujte 1.5 ml naředěného vzorku séra
(1:51).
30min
Třepat
Promytí: 3x5 min
2. Inkubace s konjugátem:
Odsajte kapalinu, pipetujte 1.5 ml
naředěného enzymového konjugátu (1:10)
do inkubačních kanálků.
30min
Třepat
Promytí: 3x5 min
3. Inkubace se substrátem
Odsajte kapalinu, pipetujte 1.5 ml roztoku
substrátu do inkubačních kanálků
10min
Třepat
Zastavení:
Odsajte kapalinu a propláchněte vodou
Vizuální hodnocení
4.
Hodnocení testu a interpretace výsledků anti-virulentních faktorů Yersinia
enterocolitica WESTERNBLOT (IgG)
Zacházení: Položte proužek na filtrační papír, opatrně ho otřete pomocí savého papíru a za
použití průhledné adhesivní pásky ho přilepte na dodaný plastický film. Poté přiložte
plastický film obsahující proužek na vyhodnocovací protokol. Držte hodnotící matrici proti
testovacímu proužku a umístěte ji tak, že černá čárka nad testovacím proužkem bude v přímce
se srovnávací čárou na vyhodnocovací matrici. Sériové číslo na matrici se musí shodovat
s číslem na balení, ze kterého byl proužek vzat. Pruhy na testovacím proužku, které se shodují
s testovacím proužkem zapište do vyhodnocovacího protokolu.
Pod číslem na proužku je kontrolní pruh. Inkubace byla provedena správně pouze
tehdy, když je tento kontrolní pruh silně zabarven.
Antigeny: Lidský patogenní kmen Yersinia enterocolitica obsahuje plasmid o velikosti
přibližně 70 kb. V tomto plasmidu jsou zakódovány důležité virulentní nebo patogenní
faktory. Za podmínek nedostatku vápníku jsou některé z těchto virulentních faktorů
sekretovány do růstového média (1,2). Tyto virulentní faktory jsou popisovány jako “Yersinia
outer membrane proteins“ (YOP) nebo také jako “release proteins“ (RP). Charakteristikou
těchto virulentních faktorů je fakt, že jsou specifické pro Yersinia enterocolitica a nebyly
nalezeny u žádných jiných baktérií. Lidské patogenní kmeny Yersinia enterocolitica (O:3,
O:9, O:8, O:5.27, atd.) vždy nesou tento virulentní plasmid. Virulentní faktory kódované
v tomto plasmidu se mírně liší v molekulových vahách, které závisí na daných kmenech
Yersinia enterocolitica. Charakteristikou je vysoký stupeň zkřížené reaktivity virulentních
faktorů v rámci jedné skupiny lidských patogenních kmenů. V tomto případě, použijete-li
virulentní faktory jednoho patogenního kmene, je zaručena specifita a citlivost u protilátek i
proti jiným patogenním kmenům. Zdroj antigenu u EUROIMMUN WESTERN BLOT testů
pro určení protilátek proti virulentním faktorům Yersinia enterocolitica jsou purifikované
virulentní faktory z kmene Yersinia entorecolitica O:3. Yersinia entorecolitica O:3 byla
kultivována za podmínek nedostatku vápníku a virulentní faktory byly izolované ze
supernatantu kultury. Purifikované virulentní faktory byly solubilizovány za použití dodecyl
sulfátu sodného. Solubilizované proteiny byly separovány pomocí diskontinuální
polyakrylamidové elektroforézy podle molekulových hmotností a takto separované proteiny
byly přeneseny na membránu. Z každého kitu byly odebrány dva proužky a pro kontrolu
inkubovány s referenčním sérem. Jeden z těchto nabarvených proužků byl vrácen do kitu.
Charakteristiky antigenů obsažených na testovacím proužku: (3)
Antigen (mol. hmot., Nomenklaturní
zkratka)
alternativní název)
46 kDa (p46)
YopM (Yop2a)
44 kDa (p44)
YopH (Yop2b)
38 kDa (p38)
LorV (V antigen)
36 kDa (p36)
YopD (Yop4a)
34 kDa (p34)
30 kDa (p30)
25 kDa (p25)
YopN (Yop4b)
YopP (Yop30)
YopE (Yop5)
Funkce
Inhibice agregace destiček
Prevence fagocytózy makrofágy
Zesílení cytotoxického efektu YopE nebo
translokace YopE u Eukaryotické buněčné stěny.
Cytotoxický efekt na HeLa buňky, pokles
5.
fagocytózy makrofágy.
IgA a IgG třída protilátek proti virulentním faktorům Yersinia enterocolitica
Protilátky IgA, IgG a IgM mohou být detekovány v počáteční fázi následující po kontaktu
s virulentními faktory Yersinia enterocolitica. IgA a IgM titry po několika měsících klesnou.
Protilátky třídy IgG zůstávají déle a mohou být v séru detekovány po 12 měsíců a déle po
prvotním kontaktu. U chronických forem onemocnění a imunopatologických komplikací
mohou být IgG a i IgA protilátky detekovány i po delší době (4).
V zásadě může být použito následující vyhodnocovací schéma. Uzavřený kontrolní proužek je
použit ke srovnání intenzit pruhů. Pruh p46 (YopM nebo Yop2a) je jako příklad zřetelného
proužku s vysokou intenzitou. Ostatní pruhy na proužku jsou střední (viz. pruh p25) a velmi
slabé (viz. pruh p38) intenzity. Intenzita pruhu p25 přísluší hraniční intenzitě. Pruhy o slabší
intenzitě musí být brány jako negativní.
IgA třída protilátek
Výsledek
Negativní
Hraniční
Pozitivní
Charakteristika
Žádný pruh.
Alespoň jeden pruh. Praxe ukazuje, že hlavní imunitní
odpověď u IgA testu je namířena proti pruhu p36.
Alespoň jeden silný výrazný pruh.
IgG třída protilátek
Výsledek
Negativní
Hraniční
Pozitivní
Charakteristika
Žádný pruh nebo jeden pruh střední intenzity.
Jeden silný zřetelný pruh nebo alespoň dva pruhy střední
intenzity.
Alespoň dva silné výrazné pruh.
6.
Klinické symptomy infekce Yersinia enterocolitica
Kmen Yersinia z rodu Enterobactoriceae zahrnuje tři typy: Y. pestis, Y. pseudotuberculosis a
Y. enterocolitica. Je známo více než 60 rozdílných serovarů typu Yersinia enterocolitica.
Patogenní serovary nesou virulentní plasmid s asi 70 páry kilo-bazí. Hlavní kauzativní
zástupci infekcí u Yersinia enterocolitica jsou serovary O:3, O:9, O5.27 a O:8 (vyskytující se
převážně v USA). Za infekce Yersinia enterocolitica v Evropě je asi ze 75% odpovědný kmen
O:3 a asi z 20% kmen O:9. Klinické symptom infekce mohou být rozděleny do enteritických
a extramesenteriálních forem (4).
Nejrozšířenější forma infekce Yersinia enterocolitica u dětí a dospívajících je enteritida
dohromady s mesenterickou adenitis, vyjímečnou bolestí, horečkou a průjmem, stejně jako
pseudoapendicitidou. U dospělých se navíc může objevit infekce v tenkém a tlustém střevě.
U asi 20 – 25% hlavně dospělých pacientů a objeví extramesenteriální infekce s nebo bez
předcházející enteritidy. Hlavní charakteristiky těchto infekcí jsou septická forma, vyznačující
se peritonitidou, mnohonásobné orgánové abscesy, vaskulitida, průjem, hepatitida a
lymfadenopatie s průjmem, splenomegalií a ztrátou váhy.
Mezi nefrekventovanější imunopatologické symptomy infekce Yersinia enterocolitica patří
reaktivní artritida a erythema nodosum. Reaktivní artritidy jsou spojeny v mnoha případech
s dolními končetinami. Artiritida může být v některých případech zcela vyléčena za 3-12
měsíců, ale může se rozvinout také chronická a nevyléčitelná artritida. V některých případech
může Yersinia enterocolitica přetrvat roky v intestinální sliznici a v lymfatických tkáních.
Persistence může být spojena s přítomností specifických sérových protilátek třídy IgA. U 6080% pacientu s reaktivní artritidou může být detekován HLA-B27 histokompatibilitní antigen.
Reaktivní artritida je často spojena s erythema nodosum, obzvláště u žen. Symptomy na kůži
se objeví asi 1 – 6 týdnů po infekci.
7.
Literatura
1 . Heesemann, J., Gross, U.. Schmidt, N., Laufs, R.: lmmunochemical Analysis of
Plasmid-Encoded Proteins Released by Enteropathogenic Yersinia sp. Grown in
Calcium-Deficient Media. Infect. Immun. 54(2): 561-567 (1986).
2.
Heesemann, J.: Enteropathogene Yersinien: Pathogenitatsfaktoren und neue
diagnostische Methoden. lmmun. lnfekt. 18: 186 -191.
3.
Paerregard, A.: Interactions between Yersinia enterocolitica and the host with special
refe- rence to virulence plasmid encoded adhesion and humoral immunitiy. Dan.
Med. Bull 39 (2): 155-172 (1992).
4.
Hoogkamp-Korstanje, J. A. A., de Koning, J.: Klinik, Diagnostik und Therapie von
Yersinia- enterocolitica-Infektionen. Irnmun. lnfekt. 18: 192-197 (1990).
5.
Burkhardt, F.: Mikrobiologische Diagnostik: 141-145, Thieme Veriag Stuttgart (1992).
6.
Nesbakken, T., Kapperud, G., Lassen, J., Skjerve, E.: Yersinia enterocolitica 0:3
Antibodies in Slaughterhouse Employees, Veterinarians, and Military Recruits.
Contrib. Microbiol. Immunol. 12: 32-39 (1991).
8.