Prezentace aplikace PowerPoint

Monitorování hladin
jednotlivých antimykotik
pomocí HPLC
E. Klapková, R. Průša
ÚKBP, 2. LF UK a FN Motol
20.9.2010
Invazivní mykotické infekce (IFI)
bakteriální infekce
X
IFI
↓ výskyt
↑morbidita a mortalita
příčiny: pokroky v lék. péči
agresivní terapeutické přístupy
transplantace solidních orgánů
nádorová onemocnění (hematologické malignity)
Spektrum invazivních
mykóz
6% 3%
8%
9%
Aspergillus
44%
Candida
jiné plísně
nespecifikované plísně
Zygomycetes
Fusarium
(Pappas PG. Transnet database
FOFI 2005)
30%
Antimykotika
Polyenová antibiotika (nystatin, amfotericin B)
místo působení - buněčná membrána
Azolová antimykotika (itrakonazol, flukonazol, vorikonazol, posakonazol)
místo působení – buněčná membrána
Echinokandiny (kaspofungin, anidulafungin, mikafungin)
místo působení – buněčná stěna
Ostatní (flucytosin)
místo působení – mykotická RNA
Polyenová antibiotika (nystatin, amfotericin B)
• chemicky podobné látky (streptomycety)
• účinek: fungicidní
zabudování do biol. membrány
vznik hydrofilních pórů
nystatin – lokální aplikace
amfotericin B – široké spektrum
lokálně – kandidózy
intravenózně – poškození ledvin
Azolová antimykotika (ketokonazol, itrakonazol,
flukonazol, vorikonazol, posakonazol)
Imidazolové deriváty
(ketokonazol, mikonazol…)
Triazolové deriváty (itrakonazol,
posakonazol,
vorikonazol)
itrakonazol
flukonazoll
účinek fungistatický
především na kvasinky (Candida),
vláknité houby (Aspergillus)
(Scedosporium, Fusarium), ale i mikromycety
Antimykotický efekt
inhibice cytochromu P450 – 14 – α – demethylasy
hromadění nefunkčních sterolů (defektní mem.)
schopnost inhibice konidiace
v pořadí účinnosti:
vorikonazol >> posakonazol > itrakonazol
pacienti s vysokým rizikem – preventivní antimykotická léčba
(itrakonazol)
pacienti s prokázanou systémovou infekcí – cílená dlouhodobá léčba
(vorikonazol, posakonazol)
Vorikonazol – inhibice syntézy ergosterolu kandid 10 x účinněji než flukonazol
(C. krusei)
fungistatické působení oproti amfotericinu B
lék 1. volby invazivní aspergilózy, kandidózy
Itrakonazol – metabolizován v játrech na aktivní metabolit hydroxyitrakonazol
ve steady state jsou přítomny itrakonazol a hydroxyitrakonazol v
poměru 1:1 – 1:2
nutné stanovovat oba analyty
Echinokandiny (kaspofungin, anidulafungin, mikafungin)
• nová skupina antimykotik, vysoká tolerance
• lipopeptidy ~1200 kD
• odlišný mechanismus účinku – buněčná stěna
• kandidy – fungicidní; aspergily – fungistatický
• odlišná biotransformace, mimo cytochrom P-450
• pouze nitrožilní podání lineární farmakokinetika
výhodné
Buněčná stěna
Candida albicans
Bennett JE. Echinocandins for candidemia in adults without neutropenia. N Engl J Med 2006; 355: 1154–1159
Je nutné monitorovat antimykotika?
• nutnost monitorování hladin při perorální léčbě
– porucha vstřebávání ze zažívacího traktu
• azolová antimykotika – ovlivnění enz. procesů na cyt. P-450
klíčový enz. systém hepatocytů v biodegradaci léčiv
• inter a intraindividuální variabilita
Lékové interakce
závažné lékové interakce:
barbituráty, karbamazepin, sirolimus, rifampin,…
léky snižující koncentraci:
fenytoin, nevirapin, rifabutin
léky zvyšující koncentraci:
ritonavir, omeprazol, delaviridin
léky, jejichž koncentraci zvyšují:
warfarin, cyklosporin, takrolimus, statiny, benzodiazepiny
Terapeutické rozmezí
itrakonazol
Prevence: 0,5 – 1 mg/l
Terapie: 1 – 3 mg/l
posakonazol a vorikonazol
Účinné: 0,5-2,5 mg/l
Tolerované z hlediska nežádoucích účinků: 2-4 mg/l
Toxická koncentrace: > 4 mg/l
Stabilita vzorku
1 týden
laboratorní teplota
2 týdny
2 – 8°C
2 měsíce
-20 °C
Kapalinový chromatograf
Agilent 1200
degasser
kvartérní pumpa
autosampler
termostat kolon
DAD detektor
příprava vzorku na stanovení itrakonazolu a metabolitu:
1 ml séra + 100 μl I.S. (ketokonazol)
protřepat
přidat 5 ml extrakční směsi (heptan:isoamylalkohol; 9:1)
5 min třepat
centrifugace (5 min, 3000 ot/min)
odpipetovat 4 ml org. vrstvy
sušení při 50 °C
rozpuštění odparku ve 150 μl MF
Chromatografické podmínky
DAD detektor, 255 nm
MF: ACN:metanol:fosfátový pufr 50mM (45:20:35)
průtok MF: 2,0 ml/min
kolona: Agilent Zorbax SB C18, 5 μm
t: 40 °C
Kalibrační standard: Chromsystems
Itrakonazol – 0,70 mg/l
Hydroxyitrakonazol – 0,91 mg/l
Sérové kontroly: Chromsystems
Level I
Itrakonazol – 0,153 – 0,225 mg/l
Hydroxyitrakonazol – 0,23 – 0,351 mg/l
Level II
Itrakonazol – 0,288 - 0,432 mg/l
Hydroxyitrakonazol – 0,44 – 0,67 mg/l
Level III
Itrakonazol – 1,08 – 1,62 mg/l
Hydroxyitrakonazol – 1,89 – 2,79 mg/l
Kalibrátor
I.S.
OH itrakonazol
itrakonazol
Khoschsoru, Freuhwirth, Zelzer: Antimicrobial agents and chemotherapy,
2005, 3569-3571
Analýza pacientského vzorku
I.S.
OH itrakonazol
Itrakonazol
Možnost společného stanovení itrakonazolu a vorikonazolu
příprava vzorku na stanovení posakonazolu a vorikonazolu:
100 μl plazmy + 100 μl I.S. (ketokonazol)
protřepat
přidat 3 ml extrakční směsi (hexan:dichlormetan; 7:3)
20 min třepat
centrifugace (5 min, 3000 ot/min)
odpipetovat 2,5 ml org. vrstvy
sušení při 30 °C
rozpuštění odparku ve 150 μl MF
Chromatografické podmínky
DAD detektor, 255 nm
MF: ACN:voda:fosfátový pufr 50mM (52.5:0,25:45)
průtok MF: 0,5 ml/min
kolona: Agilent Eclipse C8, 5 μm, 250 mm
t: 25 °C
Kalibrace
vorikonazol
posakonazol
I.S.
Chhun S., Rey E., Tran A.: Simultaneous quantification of voriconazole and
posakonazole in human plazma by HPLC with UV detection, J. of chromatography
Standard vorikonazol a posakonazol – komerčně nedostupné
Interní kontrola kvality – 2 hladiny
Externí kontrola kvality
Kontrola Chromsystems
I.S.
posakonazol
Validace metody
Opakovatelnost
Analyt
CV (%)
koncentrace
(mg/ml)
(průměr ± SD)
CV
(%)
Výtěž
nost
(%)
0,38 ± 0,01
3,92
0,73 ± 0,04
5,5
96,2
1,45 ± 0,07
4,16
1,01 ± 0,06
5,9
Hydroxyitrakonazol
0,54 ± 0,01
0,96
1,1 ± 0,02
1,8
2,21 ± 0,04
1,83
1,43 ± 0,03
2,1
Vorikonazol
0,52 ± 0,02
3,50
0,51 ± 0,03
6,7
1,17 ± 0,05
4,19
1,22 ± 0,07
5,7
0,46 ±0,02
4,34
0,48 ± 0,03
6,5
1,18 ± 0,04
4,77
1,22 ± 0,07
5,6
Itrakonazol
Posakonazol
koncentrace
(mg/ml)
(průměr ±
SD)
Reprodukovatelnost
95,7
103,1
98,1
Závěr
•
vyvinuta metoda umožňující stanovení itrakonazolu a
hydroxyitrakonazolu v séru
•
vyvinuta metoda umožňující stanovení posakonazolu a vorikonazolu
v plazmě
•
jednoduchá příprava vzorku, vysokou stabilitou
•
nevýhody – žádný kontrolní materiál, nedostupnost analytických
standardů pro kalibraci
•
zkušený personál
Děkuji Vám za pozornost