Návod k použití

Návod k použití
LPU 010
DNA sonda k detekci DiGeorge/VCFS N25 a 22q13.3 delečního syndromu
Pouze pro profesionální použití
Fluorescenční In Situ Hybridizace (FISH) je technika, která umožňuje detekci DNA sekvencí na kultivovaných metafázních
chromozómech a interfázních jádrech z kultivovaných nebo nekultivovaných cytogenetických vzorků. Tato technika využívá
DNA sondy, které hybridizují buď s celými chromozómy nebo s jednotlivými jedinečnými sekvencemi a slouží jako efektivní
doplněk ke klasické cytogenetice. Cílová DNA je po fixaci a denaturaci připravená na vpuštění podobně denaturované
fluorescenčně značené DNA sondy, která má komplementární sekvenci. Následuje hybridizace. Pomocí série rychlých bezformamidových omytí se odstraní nenavázaná a nespecificky navázaná DNA sonda. Provede se podbarvení pro vizualizaci.
Fluorescenční mikroskop umožňuje pozorování nahybridizované sondy na vybraném vzorku.
Specifikace sondy
N25 ( D22S75)(22q11.2) – červená
22qter subtelomérová sonda (N85A3) - zelená
Úvod
DNA sonda k detekci delečního regiónu DiGeorge/VCFS N25, značená červeně, je dlouhá 90kb a je umístěná v CTP genu a
možná také CLTD genu. Tato sonda je určená k identifikaci delecí 22q11.2 DiGeorge a souvisejících syndromů.
Subtelomérová specifická DNA sonda 22qter ( klon N85A3 ), značená zeleně, je umístěná v genu proSAP2/SHANK3 a slouží
jako kontrolní sonda. Sonda je určená pro použití při fluorescenční in situ hybridizaci na interfázních buňkách a metafázích
chromozomech získaných z fixované kultivované periférní krve.
Materiál obsažený v soupravě
Sonda: 50µl ve zkumavce ( 5 testů ) nebo 100µl ve zkumavce ( 10T )
Množství sondy pro región DiGeorge N25 ( D22S75) – 5.5ng/test
Množství sondy 22qter ( N85A3) – 95.2ng/test
Směs sond je dodávána naředěná v hybridizačním roztoku ( Formamid, Dextran sulfát, SSC ) - připravená k použití .
Sondy jsou přímo značené: N25 – pomocí červeného fluorochromu s vlastnostmi podobnými spektru Texas Red a 22qter –
pomocí zeleného fluorochromu s vlastnostmi podobnými spektru FITC.
Podbarvení
150µl ve zkumavce ( 15T )
Podbarvení je DAPI antifade ( ES: 0.125 µg/ml DAPI ( 4,6-diamidino-2-phenylindole )
Upozornění a bezpečnostní opatření
1. Pro použití in vitro. Pouze pro prefesionální použití.
2. Noste rukavice při práci s DNA sondami a DAPI.
3. Směs sondy obsahuje formamid, který je teratogenem: nevdechujte výpary a zabraňte kontaktu s kůží. Noste rukavice,
laboratorní kabát a při práci mějte zapnutý odsávač par. Po použití, vypláchněte dostatečným množstvím vody.
4. DAPI je potencionální karcinogen. Manipulujte s optarností. Noste rukavice a laboratorní kabát. Po upotřebení
vypláchněte dostatečným množstvím vody.
5. Se vším nebezpečným materiálem zacházejte dle vnitřních směrnic pro likvidaci nebezpečného odpadu.
Skladování a použití
Souprava Aquarius by měla být skladována při -20°C do data expirace uvedeného na obalu. Zkumavky se sondami a DAPI
musí být uskladněné v temnu.
Materiál potřebný k práci, nedodávaný v soupravě
Technické vybavení
a, Ohřívací plotýnka ( s pevnou deskou a přesnou kontrolou teploty do 80C)
b, Různě velké mikropipety v rozsahu 1µl-200µl
c, Vodní lázeň s přesnou kontrolou teploty při 72C
d, Mikrocentrifugační zkumavky (0.5 ml)
e, Fluorescenční mikroskop ( viz sekce – Doporučení fluorescenčního mikroskopu )
f, Plastové nebo skleněné nádoby
g, Pinzety
h, Kvalitní imerzní olej pro fluorescenční mikroskop
i, Odstředivka
Doporučení fluorescenčního mikroskopu
Pro optimální vizualizaci sondy doporučujeme 100 watovou rtuťovou výbojku a planapochromatické objektivy
100x. Trojpásmový filtr DAPI/FITC/Texas Red je optimální pro prohlížení obou fluorochromů a DAPI současně.
63x nebo
Příprava a vhodnost vzorků
Souprava je určená pro použití se vzorky kultivovaných fixovaných buněk periférní krve. Tyto by měly být připravené dle
laboratorních směrnic.
FISH Protokol
Příprava podložního skla:
1. Naneste vzorek na čisté mikroskopické sklíčko
2. Omyjte sklíčko ve 2 x SSC, pH 7.0 - 2 minuty
3. Vysušte v etanolové vzestupné řadě (70%, 85% a 100%), každý 2 minuty
Pre – denaturace
4. Vyjměte sondu nechte zahřát na pokojovou teplotu
5. Ujistěte se, zda je roztok sondy a hybridizačního činidla konstantní pomocí opakovaného promíchání
pipetou
6. Napipetujte 10µl sondy a nakápněte na sklíčko se vzorkem, přikryjte krycím sklem 24x24 mm a zalepte gumovým
lepidlem nechte zaschnout.
Denaturace:
7. Denaturujte na ohřívací plotýnce při 75oC na 2 minuty
Hybridizace:
8.
Hybridizujte přes noc v temné komůrce při 37oC
Posthybridizační omytí:
9.
Sejměte krycí sklo a odstraňte všechny zbytky lepidla
10. Omyjte sklo v 0.4 x SSC při 72oC (pH 7.0) 2 minuty
11. Okapejte sklo a omyjte ve 2 x SSC, 0.05% Tween 20 při pokojové teplotě (pH 7.0), 30 sekund
12. Okapejte a napipetujte 10µl DAPI
13. Přikryjte krycím sklíčkem a nechte vyvinout barvu ve tmě 10 minut.
14. Pozorujte pomocí fluorescenčního mikroskopu.
Stabilita výsledných sklíček
Výsledná sklíčka jsou analyzovatelná 1 měsíc, pokud jsou uchované při pokojové teplotě nebo teplotě nižší.
Doporučení při postupu
1. Používejte kalibrovaný teploměr pro měření teploty roztoků, vodní lázně a teploty inkubátorů. Tyto teploty jsou
rozhodující pro optimální provedení testu.
2. Koncentrace omývacích roztoků, jejich pH a teplota jsou důležité, protože nízká stringence může způsobit
nespecifické navázání sondy a vysoká stringence může způsobit chybění signálu.
3. Pečení nebo zestaršování sklíček se nedoporučuje, toto může snížit intenzitu fluorescenčního signálu.
Očekávané výsledky
1. Metafází buňka je vhodná pro odečet, pokud je sonda 22qter N85A3 ( zelená ) viditelná na obou telomérách
chromozomu 22.
2. Ne-deletovaný vzorek by měl vykazovat signál na obou homolozích se sondou N25 ( červená ) a 22qter N85A3
( zelená ) v 70-90% analyzovaných buněk ( 2R 2G ).
3. Deletovaný vzorek pro region N25 by měl vykazovat pouze jeden červený signál a dva zelené signály viditelné
pomocí 22qter N85A3 sondy ( 1R 2G ).
4. Deletovaný vzorek v regionu 22q13.3 by měl vykazovat pouze jeden zelený signál a dva červené signály v regionu
N25 ( 2R 1G )
Podpora zákazníkům
Kontaktujte: Technické oddělení Cytocell Ltd. nebo INTIMEX s.r.o.