Návod k použití

Návod k použití
LPF 001
FAST FISH Souprava prenatálních sond
Pouze pro profesionální použití
Fluorescenční In Situ Hybridizace (FISH) je technika, která umožňuje detekci DNA sekvencí na kultivovaných metafázních
chromozómech a interfázních jádrech z kultivovaných nebo nekultivovaných cytogenetických vzorků. Tato technika využívá
DNA sondy, které hybridizují buď s celými chromozómy nebo s jednotlivými jedinečnými sekvencemi a slouží jako efektivní
doplněk ke klasické cytogenetice. Cílová DNA je po fixaci a denaturaci připravená na vpuštění podobně denaturované
fluorescenčně značené DNA sondy, která má komplementární sekvenci. Následuje hybridizace. Pomocí série rychlých bezformamidových omytí se odstraní nenavázaná a nespecificky navázaná DNA sonda. Provede se podbarvení pro vizualizaci.
Fluorescenční mikroskop umožňuje pozorování nahybridizované sondy na vybraném vzorku.
Infomace o sondě
Souprava prenatálních sond FAST FISH je určená k rychlé detekci trizomie 13, 18 a 21, která se vyskytuje u Patauova
Edwarsova a Downova syndromu, a rovněž také pohlavních chromozomálních aneuplodií ( Klinefelterův a Turnerův
syndrom ). Souprava sond je určená k detekci a kvantifikaci chromozomů 13, 18, 21, X a Y v interfázních jádrech a buňkách
nekultivovaných amniocytů pomocí FISH. Test by měl být prováděn v kombinaci s karyotypizací.
Specifikace sond
X centroméra, Xp11.1-q11.1 (DXZ1) – zelená
Y centroméra, Yp11.1-q11.1 ( DYZ3) – červená ( orange )
18 centroméra, 18p11.1-q11.1 (D18Z1) – modrá
13 jedinečná sekvence, 13q14.2 – zelená
21 jedinečná sekvence, 21q22.13 – červená ( orange )
Kit obsahuje dvě soupravy sond k provedení dvou oddělených hybridizací
Souprava sond 1
Souprava sond X, Y a 18, přímo značených zeleným, červeným a modrým fluorochrómem, specifických pro satelitní DNA
sekvence chromozomů X, Y 18.
Souprava Sond 2
Souprava sond 13 a 21, přímo značených zeleným a červeným fluorochrómem, obsahuje jedinečné sekvence. Sonda pro
chromozom 13 zahrnuje gen RB1 a rovněž markery R13S1195, D13S1155 a D13S915. Sonda pro chromozom 21 zahrnuje
markery D21S270, D21S1867, D21S337, D21S1425, D21S1444 a D21S341.
Materiál obsažený v soupravě
Sonda: 50µl ve zkumavce ( 5 testů ) , 100µl ve zkumavce (10T), 300µl ve zkumavce ( 30T ) nebo 500µl ve zkumavce ( 50T )
Souprava sond 1
Množství centromérové sondy X (DXZ1) ( zelená ) – 60-75ng/test
Množství centromérové sondy Y (DYZ3) ( červená )– 40-50 ng/test
Množství centromérové sondy 18 (D18Z1 ) ( modrá )– 280-350 ng/test)
Souprava sond 2
Množství sondy 13q14.2 ( zelená ) – 144-180ng/test
Množství sondy 21q22.13 ( červená ) – 48-60ng/test
Sondy se dodávají naředěné v hybridizačním roztoku ( Formamid, Dextran sulfát, SSC ), připravené k použití.
Podbarvení
150µl ve zkumavce ( 15T ), 500µl ve zkumavce ( 50T ), 1000µl ve zkumavce ( 100T), 1200µl ve zkumavce ( 120T)
Podbarvení je DAPI antifade ( ES: 0.125 µg/ml DAPI ( 4,6-diamidino-2-phenylindole )
Upozornění a bezpečnostní opatření
1. Pro použití in vitro. Pouze pro prefesionální použití.
2. Noste rukavice při práci s DNA sondami a DAPI.
3. Směs sondy obsahuje formamid, který je teratogenem: nevdechujte výpary a zabraňte kontaktu s kůží. Noste rukavice,
laboratorní kabát a při práci mějte zapnutý odsávač par. Po použití, vypláchněte dostatečným množstvím vody.
4. DAPI je potencionální karcinogen. Manipulujte s optarností. Noste rukavice a laboratorní kabát. Po upotřebení
vypláchněte dostatečným množstvím vody.
5. Se vším nebezpečným materiálem zacházejte dle vnitřních směrnic pro likvidaci nebezpečného odpadu.
Skladování a použití
Souprava Aquarius by měla být skladována při -20°C do data expirace uvedeného na obalu. Zkumavky se sondami a DAPI
musí být uskladněné v temnu.
Materiál potřebný k práci, nedodávaný v soupravě
1. Ohřívací plotýnka ( s pevnou deskou a přesnou kontrolou teploty do 80C)
2. Různě velké mikropipety v rozsahu 1µl-200µl
3. Vodní lázeň s přesnou kontrolou teploty při 37ºa 72C
4. Mikrocentrifugační zkumavky (0.5 ml)
5. Fluorescenční mikroskop ( viz sekce – Doporučení fluorescenčního mikroskopu )
6. Plastové nebo skleněné nádoby
7. Pinzety
8. Kvalitní imerzní olej pro fluorescenční mikroskop
9. Odstředivka
10. Mikroskopické sklíčka
11. 24x24 mm krycí sklíčka
12. Stopky
13. Inkubátor 37ºC
14. Gumové lepidlo
Doporučení fluorescenčního mikroskopu
Pro optimální vizualizaci sondy doporučujeme 100 watovou rtuťovou výbojku a planapochromatické objektivy 63x nebo
100x. Trojpásmový filtr DAPI/FITC/TRITC je optimální pro souběžné prohlížení zeleného a červeného fluorochrómu a
podbarvení. Modrý fluorochróm je specifický pro spektrum DEAC a Aqua. Rovněž můžete použít trojpásmový filtr
DAPI/FITC/Texas Red k prohlížení všech tří fluorochrómů a DAPI.
Příprava a vhodnost vzorků
Souprava je určená k použití s fixovanými vzorky nekultivovaných amniocytů. Odběr plodové vody by měl být prováděn dle
laboratorních předpisů. Neměly by se používat vzorky amniocytů, které vypadají krvavě nebo hnědě, protože mohou
obsahovat mateřskou krev – toto by mohlo způsobit falešné výsledky.
.
Doporučený protokol
Příprava čerstvé plodové vody pro FISH
1. Odstřeďte 2-5ml plodové vody – 7 minut při 180xg. Opatrně odstraňte tekutinu nad sedimentem, tak abyste nenarušili
sediment.
2. Nařeďte sediment se 2ml 0.075M KCl. Nechte při pokojové teplotě 5 minut.
3. Přidejte 2 ml čerstvého fixativu ( 3:1 metanol: ledová kyselina octová ) k buňkám/hypotonickému roztoku. Při kapání
první kapky neustále míchejte. Dobře smíchejte.
4. Odstřeďte suspenzi 5 minut při 280xg. Opatrně odstraňte kapalinu nad sedimentem a nařeďte sediment se 2 ml
čerstvého fixativu.
5. Takto fixované vzorky mohou být uskladněné při -20ºC v mrazáku.
6. Pokud vzorek není zmražený, odstřeďte ve zkumavce při 280xg 5 minut. Odstraňte co jak nejvíce kapaliny nad
sedimentem, tak, abyste nenarušili buněčný sediment. Zatřeste se zkumavkou, abyste rozředili sediment se zbývajícím
malým množstvím zbývající tekutiny.
7. Připravte si sklíčko pro FISH, nakápněte buněčnou suspenzi přímo na sklíčko. Nechte uschnout.
Doporučená před-příprava sklíček
1. Ponořte připravené sklíčka do 2xSSC na 2 minuty při 37ºC
2. Vložte sklíčka do čerstvě připraveného pracovního roztoku pepsínu ( 5mg pepsínu přidaného do 100ml 0.01M HCl)
na 13 minut při 37ºC
3. Ponořte sklíčka do PBS při pokojové teplotě na 5 minut
4. Ponořte sklíčka do post fixačního roztoku ( 0.95% formaldehyd: 1.0ml 37% formaldehyd, 0.18g MgCl2 a 39.0ml PBS
) na 5 minut při pokojové teplotě
5. Ponořte sklíčka do PBS na 5 minut při pokojové teplotě
6.
7.
8.
Ponořte sklíčka do 70% etanolu při pokojové teplotě. Nechte sklíčka v etanolu na 1 minutu.
Vyjměte sklíčka ze 70% etanolu. Opakujte krok 6 s 85% etanolem a následně se 100% etanolem.
Nechte uschnout
FISH Protokol
Poznámka: Zajistěte, aby sonda v laboratoři nebyla vystavená světlu
Příprava podložního skla ( neprovádějte tento krok, v případě, že jste provedli doporučenou před-přípravu sklíček dle
doporučení výše )
1. Naneste vzorek na čisté mikroskopické sklíčko. Nechte uschnout.
2. Omyjte sklíčko ve 2 x SSC, - 2 minuty ( pokojová teplota )
3. Vysušte v etanolové vzestupné řadě (70%, 85% a 100%), každý 2 minuty
4. Nechte volně uschnout
Pre – denaturace
5. Vyjměte sondu a hybridizační roztok a nechte zahřát na pokojovou teplotu
6. Ujistěte se, zda je roztok sondy a hybridizačního činidla konstantní pomocí opakovaného promíchání
pipetou
7. Napipetujte 10µl roztoku sondy na jeden test a vložte do mikrocentrifugační zkumavky. Okamžitě vraťte zbývající
sondu do mrazáku ( -20ºC)
8. Předehřejte sondu a vzorek na ohřívací plotýnce na 37ºC – 5 minut
9. Nakápněte 10µl sondy na vzorek a opatrně přikryjte krycím sklíčkem. Zalepte gumovým lepidlem a nechte lepidlo
zcela zaschnout.
Denaturace:
10. Denaturujte současně vzorek a sondu na ohřívací plotýnce při 75o C, 2 minuty
Hybridizace:
11. Hybridizujte 2 hodiny nebo přes noc v temné komůrce při 37oC
Posthybridizační omytí:
12. Sejměte krycí sklo a odstraňte všechny zbytky lepidla
13. Omyjte sklo v 0.4 x SSC při 72oC (pH 7.0), 2 minuty
14. Okapejte sklo a omyjte ve 2 x SSC, 0.05% Tween 20 při pokojové teplotě (pH 7.0), 30 sekund
15. Okapejte a napipetujte 10µl DAPI
16. Přikryjte krycím sklíčkem a nechte vyvinout barvu ve tmě 10 minut.
17. Pozorujte pomocí fluorescenčního mikroskopu.
Stabilita výsledných sklíček
Výsledná sklíčka jsou analyzovatelná 1 měsíc, pokud jsou uchované při pokojové teplotě nebo teplotě nižší.
Doporučení při postupu
1. Pečení nebo zestaršování sklíček se nedoporučuje, toto může způsobit slabší fluorescenční signál
2. Používejte kalibrovaný teploměr pro měření teploty roztoků, vodní lázně a teploty inkubátorů. Tyto teploty jsou
rozhodující pro optimální provedení testu.
3. Koncentrace omývacích roztoků, jejich pH a teplota jsou důležité, protože nízká stringence může způsobit
nespecifické navázání sondy a vysoká stringence může způsobit chybění signálu.
4. Nekompletní denaturace může způsobit chybění signálu a přílišná denaturace může způsobit nespecifické navázání
sondy.
Interpretace výsledků
Sensitivita a specificita FISH závisí na spoustě parametrů, které se různí typem buněk, sond, používaných technik apod. Proto
doporučujeme, aby při použití prenatální soupravy, měla každá laboratoř svůj vlastní standardní materiál a určila si svoje
vlastní hraniční hodnoty pro karyotypicky normální a aneuploidní vzorky.
Limitace
Tento test nezjišťuje strukturální chromozomální abnormality a mozaiky. Rovněž nezjišťuje jiné početní abnormality
chromozomů než jsou testovány.
Test není určený ke stanovení rizika trizomie.