CanAg SCC EIA - Fujirebio Diagnostics, Inc.

CanAg SCC EIA
Prod. No. 800-10
IVD
Návod k použití
2009 -11
CE
Enzymoimunometrická souprava
Pro 96 stanovení
DŮLEŽITÁ INFORMACE PRO UŽIVATELE
Antigen SCC je obsažen v kůži, potu a slinách a snadno se šíří prostřednictvím aerosolů
(například při kýchání). Abyste zabránili falešně zvýšeným hodnotám, způsobeným
kontaminací, po otevření krabice se soupravou a během provádění stanovení, když
manipulujete s lahvičkami reagencií, mikrodestičkami, špičkami k pipetám apod., vždy
používejte rukavice. Všechny zvýšené hodnoty musí být potvrzeny opakovaným stanovením.
POUŽITÍ
Souprava CanAg SCC EIA je určena pro kvantitativní stanovení antigenu rakoviny
skvamózních buněk (SCC) v séru jako vodítko při léčení pacientů s rakovinou skvamózních
buněk.
SHRNUTÍ A VYSVĚTLENÍ TESTU
Antigen karcinomu dlaždicových buněk (SCCA) je skupina glykoproteinů s molekulovou
hmotností ~45 kDa, patřící do rodiny inhibitorů serin/cysteinových proteas (1). Na začátku byl
protein izolován Katoem a jeho spolupracovníky z lidské tkáně karcinomu dlaždicových
buněk a bylo nalezeno, že se skládá nejméně z 10 frakcí s různým isoelektrickým bodem (2).
Poslední studie ukázaly, že antigen SCC je složen ze dvou odlišných, ale vysoce
homologních genových produktů, SCCA1 a SCCA2, s různou inhibiční specificitou (3).
Antigen SCC je sérologický marker karcinomu dlaždicových buněk krčku dělohy, vulvy, plic,
hlavy a krku, a jícnu (4-6). U karcinomu dlaždicových buněk krčku dělohy může být SCCA
použit na začátku před zahájením léčby jako prognostický marker (7). Před zahájením léčby
bylo navrženo použití SCCA za účelem oddělit vysoce rizikové pacienty pro adjuvantní
terapii (4). Dále u pacientů se zvýšenou hladinou SCCA před začátkem léčby profil SCC
koreluje s odpovědí na radio- a chemoterapii, a měření SCCA může proto být použito na
sledování účinku terapie a pro včasnou detekci vracející se nemoci.
PRINCIP STANOVENÍ
CanAg SCC EIA je nekompetitivní imunoanalytické stanovení na pevné fázi, založené na
přímé sendvičové technice. Kalibrátory a pacientské vzorky jsou inkubovány společně
s biotinylovanou monoklonální protilátkou proti SCC a monoklonální protilátkou protiSCC,
značenou křenovou peroxidázou (HRP), v mikroproužcích, potažených streptavidinem.
Po promytí se do každé jamky přidá chromogenní substrát (peroxid vodíku a 3, 3’, 5, 5’ tetramethylbenzidin) v tlumivém roztoku a nechá se proběhnout enzymatická reakce. Je-li
přítomen antigen, během enzymatické reakce dojde k modrému zabarvení roztoku v jamce.
Intenzita zabarvení je úměrná množství SCC, přítomnému ve vzorcích.
Intenzita zabarvení se stanoví spektrofotometrem pro mikrodestičky při 620 nm (nebo
případně po přidání stop roztoku při 405 nm). Kalibrační křivky jsou sestrojeny pro každé
stanovení vynesením hodnoty absorbance proti koncentraci každého kalibrátoru.
Koncentrace SCC v pacientských vzorcích se pak odečítají z kalibrační křivky.
REAGENCIE
•
•
•
•
•
•
Každá souprava CanAg SCC EIA obsahuje reagencie na 96 stanovení.
Exspirační datum soupravy je uvedeno na vnějším štítku na krabici soupravy.
Po uplynutí exspirační doby soupravu již nepoužívejte.
Nemíchejte reagencie z různých výrobních šarží soupravy.
Soupravu skladujte při 2 – 8°C. Nezamrazujte.
Stabilitu otevřených reagencií naleznete v tabulce, uvedené níže. Reagencie jsou
stabilní po uvedenou dobu, pokud nejsou kontaminovány, jsou skladovány v dobře
uzavřených originálních lahvičkách a zachází se s nimi předepsaným způsobem.
Okamžitě po použití je opět uskladněte při 2 – 8°C.
Složka
Množství
Skladování a stabilita
po prvním otevření
Mikrodestička
1 destička
2 – 8°C do data exspirace,
uvedeného na destičce
12 x 8 jamek potažených streptavidinem. Nepoužité proužky po otevření okamžitě vraťte do
hliníkového sáčku, obsahujícího vysoušedlo. Pečlivě uzavřete, aby byly proužky uchovávány
v suchu.
Kalibrátory SCC
5 lahviček,
lyofilizované
4 týdny při 2 – 8°C
3 měsíce při –20°C nebo nižší
1 x 0.75 ml
1 x 0.75 ml
1 x 0.75 ml
1 x 0.75 ml
1 x 0.75 ml
Lyofilizované kalibrátory obsahují lidský SCC v tlumivém Tris-HCl roztoku, obsahujícím
hovězí sérový albumin, vehikulum, inertní žlutou barvu a 0,01% methyl-izothiazolon (MIT)
jako konzervační prostředek. Před použitím rozpustit ve vodě. POZNÁMKA: Přesná
koncentrace SCC je specifická pro každou šarži a je vyznačena na každé lahvičce.
Složka
Množství
Biotin Anti-SCC
1 x 15 ml
Indikátor, HRP Anti-SCC
1 X 0,75 ml
Skladování a stabilita
po prvním otevření
2 – 8°C do data exspirace,
uvedeného na lahvičce
Biotinylovaná myší monoklonální protilátka proti SCC, přibližně 1 μg/mL. Obsahuje fosfátový
tlumivý solný roztok (pH 7,2), hovězí sérový albumin, hovězí imunoglobulin, blokovací
činidla, detergent, inertní modrou barvu a 0,01% methyl-izothiazolon (MIT) jako konzervační
prostředek. Před použitím smíchat s indikátorem, HRP anti-SCC.
2 – 8°C do data exspirace,
uvedeného na lahvičce
Zásobní roztok myší monoklonálníprotilátky, konjugované s HRP, přibližně 40 μg/mL.
Obsahuje konzervační látky. Před použitím smíchat s biotin Anti-SCC.
Substrát TMB HRP
1 x 12 ml
2 – 8°C do data exspirace,
uvedeného na lahvičce
Obsahuje tlumivý roztok peroxidu vodíku a 3, 3’, 5, 5’ tetramethylbenzidinu (TMB). Připraven
k použití.
Stop roztok
1 x 15 ml
2 – 8°C do data exspirace,
uvedeného na lahvičce
Obsahuje 0,12M kyselinu chlorovodíkovou. Připraven k použití.
Koncentrát promývacího roztoku
1 x 50 ml
2 – 8°C do data exspirace,
uvedeného na lahvičce
Tlumivý solný roztok Tris-HCl s Tweenem 20. Obsahuje Germall II jako konzervační činidlo.
Před použitím naředit 25krát vodou.
Známky nestability
Substrát TMB HRP by měl být bezbarvý nebo slabě namodralý. Modrá barva znamená, že
reagencie byla kontaminována a měla by být zlikvidována.
UPOZORNĚNÍ A BEZPEČNOSTNÍ OPATŘENÍ
Pouze pro diagnostické použití in vitro
• Pouze pro profesionální použití
• Dodržujte příslušná bezpečnostní opatření pro práci v laboratoři a všechny další
místní a národní bezpečnostní předpisy.
• Se všemi pacientskými vzorky zacházejte jako s potenciálně infekčními.
• Při likvidaci odpadu postupujte podle místních bezpečnostních předpisů.
ODBĚR A SKLADOVÁNÍ VZORKŮ
Souprava CanAg SCC EIA je určena pro použití sérových vzorků. Krev odeberte ze žíly a
obvyklým postupem oddělte sérum. Vzorky mohou být skladovány 24 hodin při 2 – 8°C. Pro
delší skladování se doporučuje uchovávat vzorky při teplotě -70°C nebo nižší. Vyhněte se
opakovanému zamrazování a rozmrazování vzorků. Zmrzlé vzorky ponechte pozvolna
rozmrzat, nejlépe při 2 – 8°C přes noc a pak je před analýzou vytemperujte na laboratorní
teplotu.
POSTUP
Potřebné materiály nedodávané se soupravou
1. Třepačka pro mikrodestičky
Třepání by mělo být střední až silné. Podélné třepání přibližně 200 kmitů/min., oscilační
700 – 900/min.
2. Promývací zařízení pro mikrodestičky
Automatická promývačka destiček, která umožní nastavit 1 a 6 promývacích
s minimálním objemem plnění 350 µl/jamku/promývací cyklus.
Pokud není k dispozici automatická promývačka na mikrodestičky, doporučujeme
ruční promývačku pásků Nunc Immuno-8.
cyklů
3. Spektrofotometr pro mikrodestičky
S vlnovou délkou 620 nm a/nebo 405 nm a rozsahem absorbance od 0 do 3,0.
4. Přesné pipety
S plastovými špičkami na jedno použití, schopné dávkovat mikrolitrové a mililitrové
objemy. Užitečná, ale ne nezbytná je i 8-kanálová pipeta nebo opakovací pipeta
s plastovými špičkami na jedno použití pro dávkování 100 μl.
5. Destilovaná nebo deionizovaná voda
Na rozpuštění kalibrátorů SCC a pro přípravu promývacího roztoku.
Poznámky k postupu stanovení
1. Aby bylo zajištěno správné používání soupravy CanAg SCC EIA, je třeba důkladně
porozumět obsahu tohoto příbalového letáku. Reagencie dodávané se soupravou jsou
nedílnou součástí při jejím použití. Nemíchejte identické reagencie z této soupravy, které
mají různá výrobní čísla. Nepoužívejte reagencie ze soupravy po uplynutí data exspirace,
vytištěného na vnější straně krabice soupravy.
2. Před použitím je třeba reagencie vytemperovat na laboratorní teplotu (20 – 25°C). Abyste
získali správné výsledky, pracujte pouze při teplotě mezi 20 a 25°C. Zmrazené vzorky
nechte rozmrzat pomalu a po roztátí je jemně, ale důkladně promíchejte.
3. Před započetím pipetování kalibrátorů a pacientských vzorků vám doporučujeme označit
si jednotlivé proužky, abyste byli schopni během stanovení i po jeho skončení
jednoznačně identifikovat všechny vzorky.
4. Požadavek na účinné a důkladné promývání pro separaci navázaného a nenavázaného
antigenu a reagencií z komplexu pevné fáze a protilátka-antigen jejedním z
nejdůležitějších kroků v EIA. Kvůli zajištění dostatečného promytí se ujistěte, že všechny
jamky jsou úplně naplněny až po okraj promývacím roztokem během každého cyklu a že
promývací roztok je dávkován správnou průtokovou rychlostí a že odsávání z jamek mezi
a po cyklech je kompletní a že jamky jsou prázdné. Pokud v nich zůstává kapalina,
obraťte destičku a opatrně ji vyklepejte na savý papír.
- Automatické promývání proužků: Postupujte podle pokynů výrobce pro údržbu a
promývejte požadovaným počtem promývacích cyklů před a po každém
inkubačním kroku. Je doporučováno použít nastavení pro proužky „strip proces“ a
nadbytkové
promývací
nastavení
s objemem
výdeje
800
µl.
V
odsávacím/promývacím zařízení by promývací roztok neměl zůstávat po delší
dobu, protože by se jehly mohly ucpat a špatně dávkovat kapalinu nebo odsávat.
5. Substrát TMB HRP je velmi citlivý na kontaminaci. Abyste zachovali jeho optimální
stabilitu a zabránili kontaminaci, odlijte požadované množství z lahvičky do pečlivě
vymyté nádobky nebo nejlépe do plastové nádobky na jedno použití. Používejte pouze
čisté plastové špičky na jedno použití.
6. Při manipulaci se vzorky a reagenciemi používejte pouze čisté plastové špičky na jedno
použití a správnou techniku pipetování. Špičku pipety držte kousek nad okrajem jamky a
nedotýkejte se plastového proužku ani hladiny kapaliny v jamce, abyste zabránili
vzájemnému přenosu vzorku a reagencií. Správná technika pipetování je zvlášť důležitá
při manipulaci se substrátem TMB HRP.
Příprava reagencií
Stabilita připravené reagencie
Kalibrátory SCC
4 týdny při 2 – 8°C
5 měsíců při –20°C nebo níže
Do každé lahvičky přidejte přesně 0,75 ml destilované vody a jemně promíchejte. Ponechte
alespoň 15 minut stát, aby se obsah dokonale rozpustil.
POZNÁMKA: Koncentrace kalibrátorů je uvedena na štítcích a musí být použita při výpočtu
výsledků.
2 týdny při 2 – 25°C v uzavřeném zásobníku
Promývací roztok
Do čisté zásobní lahve nalijte 50 ml koncentrátu promývacího roztoku a nařeďte 25 x
přidáním 1200 ml destilované nebo deionizované vody, abyste získali tlumivý promývací
roztok.
3 týdny při 2 – 8°C
Roztok protilátky
Připravte požadované množství roztoku protilátky smícháním 50 μl indikátoru HRP Anti-SCC
s 1 ml Biotin Anti-SCC pro jeden proužek (viz níže uvedená tabulka a Tabulka s protokolem):
Počet proužků
Indikátor, HRP Anti-SCC
(µl)
Biotin Anti-SCC
(ml)
1
2
50
100
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
150
200
250
300
350
400
450
500
550
600
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
Pro přípravu roztoku protilátky použijte čistou plastovou nebo skleněnou lahvičku.
Další možnost: Nalijte obsah lahvičky s indikátorem HRP Anti-SCC do lahvičky s Biotin AntiSCC a jemně promíchejte. Přesvědčte se, že jste opravdu všechen indikátor přenesli do
lahvičky s Biotin Anti-SCC.
POZNÁMKA: Roztok protilátky je stabilní po dobu tří týdnů při 2 - 8°C. Nepřipravujte větší
množství roztoku protilátky, než jaké bude použito během této doby a zajistěte, aby byl řádně
skladován.
Postup stanovení
Stanovení kalibrátorů a pacientských vzorků provádějte v duplikátech. Pro každé stanovení
sestrojte novou kalibrační křivku. Všechny reagencie a vzorky musí být před použitím
vytemperovány na laboratorní teplotu (20 – 28°C).
1. Začněte připravovat kalibrátory SCC, promývací roztok a roztok protilátky. Je důležité
používat čisté nádobí. Postupujte přesně podle návodu.
2. Do rámečku na proužky vložte požadovaný počet proužků s mikrojamkami. (Zbývající
proužky okamžitě vraťte do hliníkového sáčku s vysoušedlem a pečlivě ho uzavřete.)
Všechny proužky jedenkrát promyjte promývacím roztokem. Promyjte pouze tolik
proužků, kolik jich bude zpracováno během následujících 30 minut.
3. Do jamek napipetujte 25 μl kalibrátorů SCC (KAL A,B,C,D,E) a pacientských vzorků
(neznámé Nez) podle následujícího schematu:
A
B
C
D
E
F
G
H
1
Kal
A
Kal
A
Kal
B
Kal
B
Kal
C
Kal
C
Kal
D
Kal
D
2
Kal
E
Kal
E
Nez.1
3
4
5
6
7 atd.
Nez.1
Nez.2
Nez.2
Atd.
4. Pomocí přesné pipety na 100 μl (nebo přesné 8-kanálové pipety na 100 μl ) přidejte do
všech jamek 100 μl roztoku protilátky. Pipetu držte kousek nad horním okrajem jamky a
nedotýkejte se plastového proužku ani hladiny kapaliny, aby nedocházelo k vzájemné
kontaminaci v jamkách.
5. Rámeček s proužky inkubujte za stálého třepání po dobu 1 hodiny (± 5 min.) při
laboratorní teplotě (20 – 25°C) v třepačce pro mikrodestičky.
6. Po první inkubaci všechny proužky šestkrát odsajte a promyjte podle promývacího
postupu, popsaného v Poznámkách k postupu stanovení, bod 4.
7. Do všech jamek přidejte 100 μl substrátu TMB HRP. Použijte stejný postup pipetování,
jak je popsán výše v bodě 4. Substrát pipetujte co nejrychleji, doba mezi napipetováním
první a poslední jamky nesmí přesáhnout 5 minut.
8. Inkubujte po dobu 30 minut (± 5 min.) při laboratorní teplotě za stálého třepání. Zabraňte
působení přímého slunečního světla.
9. Okamžitě změřte absorbanci při 620 nm ve spektrofotometru pro mikrodestičky.
Další možnost
Pokud v laboratoři není spektrofotometr na mikrodestičky, schopný měřit při 620 nm, můžete
stanovit absorbanci následovně:
Alt. 9.
Přidejte 100 μl Stop roztoku. Promíchejte a během 15 minut od přidání Stop roztoku
odečtěte absorbanci ve spektrofotometru pro mikrodestičky při 405 nm.
Rozsah měření
Soupravou CanAg SCC EIA lze měřit koncentrace mezi 0,3 a 50 μg/l. Jestliže očekáváte
koncentrace SCC nad tímto rozsahem měření, doporučujeme vzorky před stanovením
naředit normálním lidským sérem.
POZNÁMKA: Sérum, použité pro ředění, musí být rovněž analyzováno, aby byla stanovena
endogenní koncentrace SCC (viz „Výpočet výsledků“).
Kontrola kvality
Pro validaci série stanovení se doporučuje použít kontrolní séra pro tumor markery Can
Check s hladinami 1 a 2 (jsou dodávána zvlášť, REF 107-20). Jestliže se získají hodnoty
mimo hranice specifikovaného rozsahu, je nutno provést důkladnou kontrolu všech reagencií
a účinnosti měřícího deklarováno a analýzu zopakovat.
Referenční materiál
Protože žádné obecné referenční materiály pro antigen SCC nejsou k dispozici, hodnoty
kalibrátorů CanAg SCC byly stanoveny ve srovnání se sadou referenčních standardů
výrobce.
VÝPOČET VÝSLEDKŮ
Používá-li se spektrofotometr na mikrodestičky s vestavěným výpočetním programem, řiďte
se návodem ke spektrofotometru a vytvořte program, ve kterém použijete koncentrace,
uvedené na štítcích každého z kalibrátorů SCC.
Pro automatický výpočet výsledků SCC doporučujeme použít některou z následujících
metod:
• Aproximaci křivky „kubický spline“. Do křivky je nutno zahrnout kalibrátor 0 s hodnotou 0
μg/l.
• Aproximaci křivky „vyhlazený spline“. Kalibrátor 0 se použije jako pozadí destičky.
• Interpolaci proložením od bodu k bodu. Do křivky je nutno zahrnout kalibrátor 0
s hodnotou 0 μg/l..
• Metodu kvadratické aproximace křivky. Do křivky je nutno zahrnout kalibrátor 0
s hodnotou 0 μg/l.
POZNÁMKA: Nepoužívejte 4-parametrovou nebo lineární regresi.
Při manuálním vyhodnocení se kalibrační křivka získá vynesením hodnot absorbance (A),
získaných pro každý kalibrátor SCC, proti odpovídající koncentraci SCC (v μg/l), viz obrázek
níže. Neznámé koncentrace SCC se potom odečtou z kalibrační křivky na základě průměrné
hodnoty absorbance každého pacientského vzorku.
Jestliže při prvním stanovení vzorky vykazují hodnoty SCC vyšší než 50 μg/l, musí být
naředěny normálním lidským sérem v poměru 1/10 a znovu analyzovány, aby se získala
přesná koncentrace SCC.
POZNÁMKA: Vzorek použitý pro ředění musí být také změřen, aby bylo možno stanovit
endogenní koncentraci SCC.
Koncentrace SCC neředěného vzorku se vypočte následovně:
Ředění 1/10:
10 x ([SCC]naředěný vzorek – (0,9 x [SCC]normální sérum))
Příklad výsledků
Vzorek
Calibrator
Calibrator
Calibrator
Calibrator
Calibrator
A
B
C
D
E
Vzorek A
Vzorek B
Hodnota
kalibrátoru
0 µg/l
1 µg/l
5 µg/l
24 µg/l
50 µg/l
Průměrná hodnota
absorbance (A)
0.043
0.119
0.437
1.715
2.818
SCC
(μg/l)
0.245
1.363
2.6
18.3
Příklad
(nepoužívejte tuto křivku ani výše uvedenou tabulku ke stanovení aktuálních výsledků stanovení).
LIMITACE METODY
Antigen SCC je přítomen v normálních dlaždicových buňkách epitelia a zvýšené hodnoty
SCCA můžou být zjištěny při kožních poruchách s hyperkeratinezací (např. psoriasa,
ekzém). Zvýšené hodnoty se vyskytují také u benigních stavů jako je zánětlivá plicní
onemocnění a jaterní nebo ledvinová nedostatečnost (4,9).
Hladiny SCC nemohou být považovány za absolutní důkaz existence nebo neexistence
maligního onemocnění a stanovení SCC nemůže být použito ke screeningu rakoviny. Při
stanovení diagnózy onemocnění a léčení pacientů musí být výsledky stanovení
interpretovány pouze v souvislosti s dalšími vyšetřeními a diagnostickými postupy a
stanovení SCC nemůže nahrazovat jakákoliv používaná klinická vyšetření.
Antigen SCC je přítomen v pokožce, potu a slinách a je jednoduše přenášen aerosoly
(např. jako výsledek kýchání). Proto, aby se zamezilo falešnému zvýšení hodnot kvůli
kontaminaci, měly by se používat ochranné rukavice během analýzy při manipulaci
s reagenčními lahvičkami, mikrotitrační destičkou, špičkami pipet, atd. Navíc všechny
zvýšené hodnoty by měly být potvrzeny opakovaným měřením.
Protilátky proti reagenciím (lidská protilátka proti myši (HAMA) nebo heterofilní protilátky)
v pacientském vzorku mohou příležitostně interferovat se stanovením, i když v tlumivém
roztoku jsou obsažena speciální blokující činidla.
OČEKÁVANÉ HODNOTY
Soupravou CanAg SCC EIA bylo změřeno SCCA u 175 zdravých dárců krve. Dolní a horní
extremní hodnoty mimo normální rozsah byly vyřazeny pomocí IFCC doporučeného
neparametrického statistického zpracování. Referenční interval obsahuje střední 95% pás
referenční distribuce. Horní referenční limit byl určen jako 97,5% horní podíl.
Průměr
(µg/l)
Zdraví dárci 0,58
krve n=175
SD
(µg/l)
0,24
Medián
(µg/l)
0,54
Rozsah
(µg/l)
0,16 – 1,5
Horní referenční limit
(µg/l)
1,2 µg/l
Doporučuje se, aby si každá laboratoř stanovila vlastní normální rozmezí podle jednotlivých
faktorů, jakými jsou dieta, podnebí, životní podmínky, stav pacienta, atd. Také by se nemělo
zapomínat, že individuální počátečný výsledek pacienta poskytuje nejdůležitější referenční
hodnotu pro interpretaci výsledku.
CHARAKTERISTIKY SOUPRAVY
Preciznost
Celková preciznost byla vypočítána podle doporučení NCCLS EP5-A (10) použitím čtyř
hladin zamrazených směsných lidských sér obsahujících přídavek SCC a 18 různých
kombinací reagencií CanAg SCC EIA. Každý vzorek byl náhodně pipetován (n=2/stanovení)
a analyzován dvakrát denně po dobu 20 dní.
Průměr
(µg/l)
2,62
SD (µg/l) na
stanovení
0,05
VK % na
stanovení
SCC 1
Počet
opakování
80
SCC 2
80
7,77
SCC 3
80
SCC 4
80
Vzorek
1,9
SD (µg/l)
mezi denní
0,04
VK %
mezi denní
1,3
0,16
2,0
0,15
1,9
17,7
0,34
1,9
0,20
1,1
30,2
0,71
2,4
0,38
1,3
Detekční limit
Detekční limit soupravy CanAg SCC EIA je ≤ 0,3 µg/l, definovaný jako koncentrace
odpovídající průměrné koncentraci nulového kalibrátoru SCC plus dvě standardní odchylky
vypočítaný podle vzorce:
2 × SD CAL A
× [CAL B ] ng/l
OD CAL B − OD CAL A
Výtěžnost
Do normálních vzorků séra byl přidán lidský antigen SCC. Výtěžnost přídavku antigenu byla
v rozmezí 90 – 110 %.
POZNÁMKA: na zjišťování výtěžnosti by neměly být použity kalibrátory ze soupravy.
Hook efekt
Žádný Hookův efekt nebyl pozorován u vzorků až do koncentrace 50 000 µg/l.
POZNÁMKA: u velmi vysokých hodnot se zabarvení substrátu změní z modré na odstín
zelené (při extrémně vysokých hodnotách až i případně do žluté). To povede k falešně
nízkým hodnotám absorbance u 620 nm, a v extrémních případech může absorbance
klesnout až na rozsah kalibrační křivky a být postřehnutelná jako Hookův efekt.
Linearita
Pacientské vzorky byly postupně ředěny normálním lidským sérem a pak analyzovány.
Získané hodnoty byly v rozmezí 90-110% očekávaných hodnot.
Specificita
Souprava CanAg SCC EIA je postavena na dvou myších monoklonálních protilátkách,
zachytné MAb SCC140 a detekční MAb SCC 107 (11). Doporučení NCCLS EP7-P (12) bylo
dodrženo kvůli odhalení možných zdrojů interferencí. Následující látky byly testovány
v daných koncentracích a bylo zjištěno, že nedošlo k žádné zkřížené reakci.
Lipémie (Intralipid®)
Koncentrace bez žádné významné
interference (± 10%)
10 mg/ml
Bilirubin, nekonjugovaný
0,6 mg/ml
Hemoglobin
5 mg/ml
Porovnání metod
Souprava CanAg SCC EIA byla porovnána se soupravou Imx SCC MEIA. Bylo změřeno 72
vzorků lidských sér s rozsahem hodnot 0 - 4 µg/l a vyhodnoceno lineární regresí.
CanAg SCC = 1,02 x Imx SCC + 0,03
r=0,86
Bylo změřeno 138 vzorků lidských sér s rozsahem hodnot 0 - 50 µg/l a vyhodnoceno lineární
regresí.
CanAg SCC = 0,82 x Imx SCC + 0,06
r=0,98
Záruka
Uvedené výsledky byly získány použitím doporučeného pracovního postupu. Jakákoliv
změna nebo úprava pracovního postupu nedoporučená firmou Fujirebio Diagnostics může
ovlivnit výsledky. V tomto případě firma Fujirebio Diagnostics neuzná žádný reklamační
požadavek v záruční lhůtě, vyplývající ze zákona, na užitnost nebo vhodnost použití.
Literatura
1. Suminami Y., Kishi F., Sekiguchi K., Kato H. (1991) Squamous cell carcinoma antigen is
a new member of the serine protease inhibitors. Biochem Biophys Res Commun 181,
51-58.
2. Kato H. and Torigoe T. (1977) Radioimmunoassay for tumor antigen of human cervical
squamous cell carcinoma. Cancer 40, 1621-1628.
3. Schneider S.S., Schick C., Fish K.E., Miller E., Pena J.C., Treter S.D., Hui S.M.,
Silverman G.A. (1995) A serine protease inhibitor locus at 18q21.3 contains a tandem
duplication of the human squamous cell carcinoma antigen gene. Proc Natl Acad Sci
USA, 92, 3147-3151.
4. de Bruijn H.W.A., Duk J.M., van der Zee A.G.J., Pras E., Willemse P.H.B., Boonstra H.,
Hollema H., Mourits M.J.E., de Vries E.G.E., Aalders J.G. (1998) The Clinical Value of
Squamous cell Carcinoma Antigen in Cancer of the Sterine Cervix. Tumor Biol 19, 505516.
5. Vassiliakopoulos T., Troupis T., Sotiropoulou C., Zacharatos P., Katsaounou P.,
Parthenis D., Noussia O., Troupis G., Papiris S., Kittas C., Roussos C., Zakynthinos S.,
Gorgoulis V. (2001) Diagnostic and prognostic significance of squamous cell carcinoma
antigen in non-small cell lung cancer. Lung Cancer 32, 137-144 .
6. Snyderman C.H., Dámico F., Wagner R., Eibling D.E. (1995) A Reappraisal of the
Squamous Cell Carcinoma Antigen as a Tumor Marker in Head and Neck Cancer. Arch
Otolaryngol Head Neck Surg 121, 1294-1297.
7. Duk J.M., Groenier K.H., de Bruijn H.W.A., Hollema H., ten Hoor K.A., van der Zee
A.G.J., Aalders J.G. (1996) Pretreatment Serum Squamous cell Carcinoma Antigen: A
Newwly Identified Prognostic Factor in Early-Stage Cervical Carcinoma. J Clin Oncol 14,
11-118. 1997
8. Fleisher M. et al. (2002) Practice guidelines and recommendations for use of tumor
markers in the clinic. National Academy of Clinical Biochemistry 15: p.19.
9. Yuyama N., et al., (2002) Analysis of novel disease-related genes in bronchial asthma.
Cytokine 19(6), 287-296.
10. National Committee for Clinical Laboratory Standards, Evaluation of Precision
Performance of Clinical Chemistry Devices. Approved Guideline EP5-A (1999).
11. Röijer E., Nilsson K., Oskarsson M., Dahlén U., Andersson I., Nilsson O. (2003)
Development of Monoclonal Antibodies and Immunoassays against different forms of
Squamous Cell Carcinoma Antigens (SCCA). Tumor Biol 24, p. 83.
12. National Committee for Clinical Laboratory Standards, National Evaluation Protocols for
Interference Testing, Evaluation protocol Number 7, Vol. 6, No 13 , August (1986).
Tabulka s protokolem
CanAg SCC EIA REF 800-10
Bezprostředně před použitím složky promíchejte. Použijte způsob míchání uvedený v návodu.
Krok
Lahvička/Destička
Postup
1. Připravte kalibrátory SCC
CAL / SCC
A,B,C,D,E
Do každé lahvičky přidejte 0,75 ml destilované
vody a jemně promíchejte. Ponechte alespoň 15
minut stát.
POZNÁMKA: Přesná koncentrace každého
kalibrátoru je uvedena na lahvičce. Pro výpočet
musí být použita tato hodnota kalibrátoru.
2. Připravte promývací roztok
WASHBUF / 25X
Nařeďte 50 ml koncentrátu promývacího roztoku
1200 mL destilované nebo deionizované vody
3. Připravte roztok protilátky
CONJ / Anti-SCC
BIOTIN / Anti-SCC
Pro jeden proužek smíchejte 50 ml indikátoru
HRP Anti-SCC s 1 mL Biotin Anti-SCC
Počet
proužků
HPR anti-SCC
(μl)
Biotin anti-SCC
(ml)
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
50
100
150
200
250
300
350
400
450
500
550
600
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
4. Promývejte
MICROPLA
Všechny jamky jednou promyjte promývacím
roztokem
5. Přidejte kalibrátory a vzorky
CAL / SCC
A,B,C,D,E
25 μl do každé jamky
6. Přidejte roztok protilátky
ROZTOK PROTILÁTKY
100 μl do každé jamky
7. Inkubujte
MICROPLA
1 hodinu třepat při laboratorní teplotě
8. Promývejte
MICROPLA
Všechny jamky šestkrát promyjte promývacím
roztokem
9. Přidejte substrát TMB HRP
SUBS / TMB
100 μl do každé jamky
10. Inkubujte
MICROPLA
30 minut třepat při laboratorní teplotě
11. Odečítejte absorbanci
MICROPLA
620 nm
STOP
100 μl do každé jamky
Alt. 12 Inkubujte
MICROPLA
1 minutu třepat při laboratorní teplotě
Alt. 13 Odečítejte absorbanci
MICROPLA
Odečítejte v průběhu 15 minut při 405 nm
®
CanAg is a registered trademark of Fujirebio Diagnostics AB
CanAg Diagnostics AB
Elof Lindälvs gata 13
SE-414 55 Gothenburg
Sweden
Phone + 46 31-85 70 30
Fax + 46 31-85 70 40
[email protected]
www.fdi.com
CanAg SCC EIA Prod. No. 800-10, CS, 2009-11. F5940, r1
Alt. 11 Přidejte Stop roztok