Biotechnologie v ochraně životního prostředí

VYSOKÁ ŠKOLA CHEMICKO TECHNOLOGICKÁ V PRAZE
Ústav technologie vody a prostředí
BIOTECHNOLOGIE V OCHRANĚ
ŽIVOTNÍHO PROSTŘEDÍ
(Přípravné texty pro skripta)
Prof. Ing. Michal Dohányos, CSc.
Dr. Ing. Pavla Šmejkalová
Určeno pro interní potřebu a neprodejné
Praha 2006
Environmentální biotechnologie
A) Biotechnologie přímo ochraňující životní prostředí – čistírenské
odstraňování znečisťujících látek z prostředí (voda, vzduch, půda)
B) Biotechnologie nepřímo ochraňující životní prostředí
- biopaliva (líh, bionafta, bioplyn, biomasa)
- „čisté technologie“ BT nahrazující chemické výroby
- biologické odstraňování síry z uhlí
- použití hub při předúpravě štěpků při výrobě papíru a celulozy
- biologicky rozložitelné plasty
Produkční
Environmentální - čistírenské
Cíl
výroba produktu
odstranění znečišťujících látek
Biomasa
čistá (definovaná) kultura
směsná kultura
Podmínky kultivace
- sterilní
- nesterilní
- optimální podmínky růstu
- limitované podmínky růstu
- relativně malé objemy
- velké objemy
Nutriční požadavky mikroorganismů
1) zdroj energie:
organické látky; anorganické sloučeniny; světlo
2) akceptor elektronů: O2; organické látky; NO3-; NO2-; N2O; SO4=; CO2
3) zdroj uhlíku: CO2; HCO3-; organické sloučeniny
4) anorganické prvky: N; P;K; Mg; S; Fe; Ca; Mn; Zn; Cu; Co; Ni; Mo
5) Růstové faktory:
a) aminokyseliny: alanin; kys. asparágová; kys. glutamová,
b) vitaminy: tiamin; biotin; pyridoxin; riboflavín; kys.nikotinová
c) ostatní: purinové zásady, pyrimidinové zásady, cholin
Aplikace a význam biotechnologií
Odstraňování starého znečištění (sanace půdy, pozemních vod a pod)
Odstraňování stávajícího znečištění – průmysl, zemědělství, domácnosti produkuji nové a
nové znečištění
průmyslový, zemědělský i dopravní sektor produkují znečištění, kterému lze předejít nebo
omezit použitím obnovitelných zdrojů energie a surovin („čisté technologie“).
Biotechnologie přímo ochraňující životní prostředí
2
Biotechnologie a chemické technologie
Cíl obou je stejný – výroba žádaných látek z výchozích surovin
Analogie v postupech – BT se liší od CHT pouze produkční fází. Další fáze – separace
produktu a jeho zpracování stejné u obou (extrakce, filtrace, srážení destilace a pod.)
Vzájemné doplňování obou technologií
Charakteristické rozdíly
Surovinová základna – CHT – převážně fosilní uhlovodíky; BT – biomasa (fytomasa,
odpady ze zemědělství, z pryslové a městské sféry.
Náročnost na energie – CHT –vysoká spotřeba energií, BT – energeticky nenáročné.
Intenzifikace – CHT – zaměřeno na hospodárné využití surovin a energie, funkční činnost
zařízení; BT – zlepšení funkce MO, využití méně hodnotných substrátů
Komerční hlediska
Nejúspěšnější klasické BT – výroba piva a vína (75% obratu všech biotechnol. produktů.
Z hlediska objemu – čistírenské biotechnologie
Využití fytomasy pro výrobu paliva – bionafta, bioetanol, (bioplyn)
Výroba vodíku – z vody, její fotolysou pomocí sluneční energie fotosyntetizujícími
organismy. (Suspense chloroplastů řas by při technickém zvládnutí fotosyntézy vyrobila
20 g vodíku z 1 m2, - pro milionové město by stačila plocha 58 km2.
Bakterie získávají energii oxidačně-redukčními reakcemi
(oxidují redukovanou látku – donor elektronů – za přítomnosti akceptoru elektronů).
Dva způsoby přenosu elektronů:
Fermentace: donor i akceptor elektronů vznikají intracelulárně katabolizmem téže molekuly
organické látky (polovina se oxiduje, polovina se redukuje).
Respirace: konečným akceptorem elektronů je specielní molekula přítomna v médiu (kyslík
– aerobní respirace; NO2-, NO3-, SO4=, fumarát, CO2 aj.)
3
Biotechnologie -definice
Biotechnologie jsou na základě závěrů Evropské federace pro bio-technologii z r. 1981
definovány jako soubor postupů založených na technologickém využití látkové přeměny
mikroskopických organismů.
Jsou to interdisciplinární obory zahrnující a využívající poznatky mikrobiologie, biochemie,
chemie a příslušných průmyslových odvětví.
Vývojové etapy biotechnologií
I.etapa Starověk – 1886
Alkoholové nápoje – víno, pivo,
Mlékárenské produkty - sýry, jogurt
Jiné fermentované potraviny - chleba, ocet
1676 Antonius van Leeuwenhoek – objevení baktérie
1838
Christian Gottfried Ehrenberg – vydání spisu o taxonomii bakterií
1876-1882
Robert Koch – kultivace Bacillus anthracis, barvení baktérií, objev bakterie
Mycobacterium tuberculosis a Vibrio cholera
1886
Luis Pasteur – přelomový rok v oblasti biotechnologií
•
Etanolové, mléčné a máselné kvašení způsobují MO
•
Původ infekčních chorob (cholera, vzteklina, sněť slezinná
•
Přítomnost bakterií ve vzduchu
•
Sterilizace živných půd teplem – pasterizace
II. etapa 1886-1940 – Éra Pasteura
•
Vývoj technologií čistých produktů – alkoholy, ketony, organické kyseliny
•
Biologické čištění odpadních vod, anaerobní, aerobní
III. etapa
1940-1960 – Éra antibiotik
•
Penicilin, technologie submersní fermentace
•
Škála antibiotik
•
Kultivace živočišních buněk
•
Mikrobiální transformace steroidů
IV. etapa
1960-1975
•
Objevy v oblasti vakcín a enzym (biodetergenty)
•
Aminokyseliny
•
Bílkoviny jednobuněčných organizmů (SCP)
•
Etanol do pohonných směsí
V. etapa
•
1975 – současnost
Génové inženýrství, monoklonární látky
4
Mikroorganismy v biotechnologiích
Povaha mikroorganismů
Mikroorganismy jsou živé objekty, které zpravidla nelze pro malé rozměry pozorovat pouhým
okem. Jsou obvykle jednobuněčné. Mikroorganismy se člení na dvě základní skupiny. Jsou to
prokaryota, jejichž genetický aparát (chromosom, případně plasmidy) je v buňce volně
uložen, a eukaryoa, které jako všechny ostatní vyšší organismy obsahují v buňce strukturně
odlišené jádro s genetickou výbavou.
PROKARYOTA:
Archebakterie (Archaebacteria) - buněčná stěna obsahuje glukozaminy, proteiny,
heteropolysacharidy, neobsahuje kyselinu muramovou a Daminokyseliny,mají zcela specifickou 16S-rRNA, líšící se od
eubakteriií a eukaryot.
Eubakterie (Eubacteria) – buněčná stěna obsahuje kyselinu muramovou a Daminokyseliny.
o Sinice (Cyanobacteria) - fotolititotrofní, fotosyntetizující
o Bakterie (Bacteria) – chemolitotrofní, chemoorganotrofní
EUKARYOTA:
Houby (Fungi) – buněčná stěna obsahuje chitin, chemotrofní, chybí chloroplasty
Rostliny (Plantae) – buněčná stěna obsahuje celulozu, foto či chemolitotrofní, mají
chloroplasty.
Živočichové (Animalia) – buněční stěna chybí, heterotrofní organizmy, chybí
chloroplasty.
V biotechnologických postupech se uplatňují zejména bakterie a houby, a to především tzv.
nižší houby (mikromycety). Sinice a zelené řasy obsahují asimilační pigmenty (hlavně
chlorofyly) a bývají přítomny ve vodních nebo vlhkých lokalitách.
Bakterie
Tyto prokaryontní mikroorganismy jsou zpravidla jednobuněčné, mohou však někdy tvořit
vlákna nebo různé typické shluky jednotlivých buněk (dvojice, čveřice, řetízky, hroznovité
útvary apod.). Velikost buněk bakterií se většinou pohybuje řádově v desetinách až
jednotkách mikronu.
Základní tvary bakterií
1 - kok, 2 - tyčinka, 3 - vibrio, 4 - spirilum,
5 - spirocheta, 6 - diplokok, 7 - streptokok,
8 - stafylokok, 9 - vlákno, 10 - vlákna s
konidiemi u aktynomycet, 11 - větvená
buňka, 12 - buňky s endosporami: b centrální spora (typická pro klostridium), a terminální spora (typická pro plektridium)
5
Hlavní struktury bakteriální buňky
1 - buněčná stěna, 2 - kapsule, 3 fimbrie,
4 - bičík, 5 - cytoplasmatická
membrána,
6 - mesosom, 7 - chromatofory, 8 granule, kapičky, inkluse, 9 chromosomální DNA,
10 - plasmidová DNA, 11 cytoplasma
Tvar buňky je determinován buněčnou stěnou. Je pevná, kompenzuje gradient osmotického
tlaku mezi vnitřním a vnějším prostředím, chrání buňku před nepříznivými účinky prostředí.
Z vnitřních buněčných orgánů patří k nejvýznamnějším cytoplasmatická membrána,
mesosomy, chromatofory, vlastní cytoplasma, genetický (jaderný) aparát a spory.
Cytoplasmatická membrána je složena z proteinových a fosfolipidových vrstev, obaluje
vnitřní obsah buňky, má význam v transportních mechanismech (je semipermeabilní) a jsou v
ní lokalizovány různé enzymové. V cytoplasmě je lokalizován rovněž genetický (jaderný)
materiál, který není obklopen žádnou speciální membránou jako tomu je u eukaryont. Je
složen z molekuly deoxyribonukleové kyseliny (DNA) jejíž uzavřený dvojitý řetězec tvoří
chromosom.
Mesosomy - organely spojené s buněčným dělením. U fototrofních bakterií jsou na
cytoplasmatickou membránu navázány i chromatofory.
Chemické složení buňky bakterií: 80 až 85% vody. Typické zastoupení jednotlivých
biogenních prvků v sušině činí 50% C, 20% O, 15% N, 8% H, 3% P a 1% S. Vedle
minerálních látek, zejména uhličitanů, amonných iontů a fosforečnanů, jsou v buňce přítomny
organické sloučeniny nízkomolekulární (např. pyrohroznová kyselina, aminokyseliny,
glycerol, mastné kyseliny, nukleotidy, mono- a oligosacharidy) i vysokomolekulární (např.
polysacharidy, bílkoviny, lipidy a nukleové kyseliny).
Houby
Jsou to eukaryontní mikroorganismy, jejich tělo může být jednobuněčné a jen vyjimečně
pohyblivé (primitivní plísně, kvasinky) či o několika buňkách (např. parazitické vodní plísně)
nebo je tvořeno vlákny (hyfami), s přepážkami či bez nich. Soubor vláken se nazývá
mycelium. Houby se rozmnožují rozrůstáním mycelia nebo vytvářením spor.
Stavba houbové buňky je značně složitější než u bakterií, i když základní struktury jsou
obdobné.
6
Schéma buňky kvasinek.
1 - buněčná stěna,
2 - jizva zrodu,
3 - cytoplasmatická membrána,
4 - jádro,
5 - jaderná membrána,
6 - vakuola,
7 - endoplasmatické retikulum,
8 - mitochondrie,
9 - glykogen,
10 – volutin, (polymetafosfát),
11 - lipidy,
12 – G olgiho komplex
Jako u všech eukaryontních organismů, i v buňkách hub se vytváří buněčné jádro. Od
cytoplasmy je odděleno dvojitou blanou se systémem otvorů a je v něm lokalizováno
genetické vybavení buňky. To je složeno vždy ze dvou či více chromosomů a jejich počet je
typický pro jednotlivé druhy hub (např. u kvasinky Saccharomyces cerevisiae bylo zjištěno
16 chromosomů).
Buněčná stěna, obsahuje stavební polysacharidové složky (celulózu, chitin),
cytoplasmatická membrána, vakuoly obsahují zásobní látky (volutin, glykogen, lipidy,
pigmenty, krystalky různých sloučenin)
Chemické složení houbových buněk se odlišuje od bakteriálních poněkud nižším obsahem
vody (65 - 83%), jinými polysacharidovými složkami buněčné stěny (chitin, celulóza), vyšším
obsahem lipidických látek (až 60% sušiny), některých vitaminů (B,D,A) a popelovin (až 8%).
Některé morfologické útvary mikroskopických hub.
Buňky kvasinek; 1 - Saccharomyces cerevisiae, 2 - Candida robusta, 3 - Candida crusei,
chlamydospory - 4, konidiofory a konidie u Epicoccum nigrum - 5, a u Trichoderma viride 6,
sporangiofory a sporangia u Rhizopus nigricans - 7a, zygospora - 7b.
7
Enzymové reakce
Úloha a typy enzymů v živé buňce
Enzymy /fermenty/ jsou specifické biokatalyzátory, bílkoviny urychlující již v nepatrné
koncentraci chemické reakce v živém organismu. Vznikají výlučně v živých organismech, v
nichž jsou nezbytné pro průběh metabolických reakcí. Enzymy jsou často složitými
bílkovinami, obsahujícími nízkomolekulární nebílkovinnou složku, nutnou k jejich
katalytické účinnosti, která se nazývá koenzym, prostetická skupina, nebo kofaktor. V tomto
případě je tedy možná disociace enzymu na bílkovinnou část (apoenzym) a koenzym.
Katalytický účinek má však jen holoenzym:
apoenzym + koenzym ←→ (holo) enzym.
Látky vstupující do reakce se nazývají substráty a látky vystupující produkty.
Rozdělení a názvosloví enzymů
Mezinárodně se používá dvojího názvosloví enzymů:
systematické (přesné) jejichž názvy se tvoří z názvů substrátů nebo z názvů katalyzovaných
reakcí příponou -asa např. ureasa - rozkládá močovinu, alkohol-dehydrogenaza katalyzuje
oxidativní dehydrogenaci alkoholu).
historické názvy - používají se u nejstarších známých enzymů (např. pepsin, trypsin a pod.).
Enzymy se dělí podle mezinárodní klasifikace do šesti základních tříd podle typu
katalyzátorové reakce:
Tab.1 Klasifikace enzymů
1. Oxireduktázy - katalyzují oxidoredukční reakce (přenos elektronů)
1.1. - působí na -CH-OH
1.2. - působí na -CH=O
1.3. - působí na -CH=CH1.4. - působí na -CH-NH2
1.5. - působí na -CH-NH1.6. - působí na NADH : NADPH
2. Transferazy - katalyzují přenos funkčních skupin
2.1. - jednu karbonylovou skupinu
2.2. - aldehydovou nebo keto skupinu
2.3. - acylovou skupinu
2.4. - glykosylovou skupinu
2.7. - fosfátovou skupinu
2.8. - skupiny obsahující síru
3. Hydrolazy - katalyzují hydrolytické reakce
3.1. - esterů
3.2. - glukosidických vazeb
3.4. - peptidových vazeb
3.5. - jiných C-N vazeb
3.6. - anhydridů kyselin
4. Lyazy - katalyzují nehydrolytické odštěpení skupiny za vzniku dvojné vazby
4.1.
-C=C4.2.
-C=O
4.3.
-C=N-
8
5. Izomerazy - urychlují isomerace
5.1. - racemazy
6. Ligazy - katalyzují reakce slučování dvou molekul., které je spojeno s rozštěpením
makroergické vazby v molekule ATP, nebo analogického nukleosidtrifosfátu.
6.1. C-O
6.2. C-S
6.3. C-N
6.4. C-C
Na základě tohoto roztřídění je každému ze známých enzymů přidělen mezinárodní komisí
čtyřčíselný znak pod nímž se v literatuře uvádí /např.1.1.1.1./ kde první číslo znamená hlavní
třídu, druhé skupinu, třetí podskupinu a čtvrté je pořadovým číslem enzymu v příslušné
podskupině.
Např. skupina u první třídy se týká zasažené vazby v molekule donoru / viz tab.1/.
Podskupina u první třídy označuje akceptor. Např.:
1.1.1. oxidace alkoholu nikotinamidovým koenzymem
1.1.2. oxidace alkoholu cytochromem
Koenzymy - kofaktory
Jak již bylo výše uvedeno nositelem katalytické účinnosti enzymu je nebílkovinná část zvaná
koenzym, nebo kofaktor.
Nejjednoduššími koenzymy jsou ionty kovů, např. :
Zn2+
- alkohol dehydrogenaza, carboxypeptidaza
2+
Mg
- fosfohydrolaza, fosfotransferaza
Fe2+, Fe3+
- cytochromy, peroxidasy, katalazy, ferredoxin
2+
Cu
- tyrosinasa, cytochrom oxidasa
- pyruvát fosfokinasa
K+
Další skupinou koenzymů jsou složité organické molekuly jako např. NAD, FAD, koenzym
A, ATP, F420 a další.
Enzymová aktivita
Katalytický účinek enzymů se obecně označuje jako aktivita enzymu. Její mírou je jakost
katalyzované reakce, tj. množství zreagovaného substrátu za časovou jednotku. Pomocí
rychlostí reakce se vyjadřuje množství enzymu v tzv. enzymatických jednotkách (gr). Jedna
enzymová jednotka je takové množství enzymu, které katalyzuje přeměnu jednoho
mikromolu substrátu za jednu minutu při definovaných podmínkách.
Obr. 1
2
E0
S
1
E1
E2
ES
P
1 - katalyzovaná reakce
2 - nekatalyzovaná reakce
S - substrát
ES - aktivní komplex
P - produkt
E0 - aktiv. energie nekatalyzované reakce
E1 - aktiv. energie tvorby komplexu
E2 - aktiv. energie rozpadu komplexu
E + S ↔ ES ↔ E + P
9
Molární aktivita enzymu je mírou jeho katalytické účinnosti a vyjadřuje se počtem molekul
substrátu přeměněných za jednu minutu jednou molekulou enzymu.
Katalytické působení enzymu je míněno tím, že snižuje aktivační energii katalyzované reakce.
Aktivační energie se snižuje tak, že katalyzované reakce se stávají minimálně
dvoustupňovými. Nejprve se tvoří komplex enzym-substrát, který se dále rozpadá, popřípadě i
přes několik intermediálních komplexů. Aktivační energie dílčích reakcí je mnohem nižší než
aktivační energie nekatalyzované reakce.
Příklad:
Změna aktivační energie podle druhu katalyzátoru:
substrát
katalyzátor
H2O2
H2O2
IH2O2
Pt
H2O2
katalasa
H2CO3
H2CO3
karbonatdehydrogenasa
E cal/mol
18.000
13.000
11.600
5.500
20.500
11.700
Specifičnost enzymů
Enzymy jsou vysoce specifickými katalyzátory.
Substrátová specifičnost
Každý enzym působí jen na přesně vymezený druh substrátu. Tato specifičnost může být
velmi značná např. u opticky aktivních substrátů podléhá účinku enzymu obyčejně jen jeden
antipod (stereochemická specifita).
Reakční specifičnost
Odlišné enzymy mohou katalyzovat rozdílné reakce jediného substrátu a přitom jednotlivým
enzymům odpovídají jednoznačně příslušné reakce.
Přenos energie
Energii, potřebnou pro růst, získává živá hmota z oxidací nebo ze světla. Energie uvolněná při
odštěpení vodíku nebo elektronů ze substrátu se částečně rozptýlí ve formě tepla, avšak část se
využije při vzniku organických sloučenin s tzv. ”makroergickými” vazbami.Tyto sloučeniny
obsahují síru nebo kyselinu fosforečnou v některé z následujících konfigurací:
O
C O
P
R
OH
O
P
OH
O
OH
N
N
O
O
P
OH
C
N
P
OH
OH
O
O
P
OH
OH
C
S
O
~ - vazba, která při hydrolyse uvolňuje velké množství energie
10
Adenosintrifosfát (ATP) je jedna z nejdůležitějších makroergických sloučenin metabolismu buněk,
protože ATP vznikající při oxidacích může být zapojen do endergonických reakcí, které neprobíhají
bez přísunu energie. Při hydrolyse dvou koncových fosforečnanových skupin ATP se uvolňuje
50280 J, avšak hydrolysa adenosin-monofosfátu dává jenom 6285 J. I když ATP obsahuje dvě
”makroergické” fosfátové skupiny, obyčejně (i když ne vždycky) se reakcí zúčastňuje jenom
koncová skupina.
NH2
C
N
C
N
CH
CH
C
N
O
N
H
O
C
C
CH
CH
OH
OH
CH2 O
O
P
O
OH
O
P
O
OH
P
OH
OH
adenosinmonofosfát - AMP
adenosindifosfát - ADP
adenosintrifosfát - ATP
V průběhu oxidačních reakcí v buňce protony a elektrony substrátu obyčejně probíhají systémem
enzymů, jejichž jednotlivé členy se postupně redukují a reoxidují až po některou látku, fungující
jako konečný akceptor elektronů.
Enzymy, které se zúčastní odštěpení protonů a elektronů ze substrátu, se nazývají dehydrogenasy;
každá z nich je specifická pro substrát, který oxiduje. Enzymy, které reagují s kyslíkem přímo, se
nazývají oxidasy. Ta část dehydrogenas, která reaguje s protony a elektrony substrátů, se nazývá
prostetická skupina; je to buď pyridin-nukleoid nebo flavin-nukleoid; oxidace a redukce těchto
dvou prostetických skupin je znázorněna následovně:
H
H
CONH2
N
R
H
CONH2
2H+ + 2e
N
R
když R = ribofosfát-fosfát-ribosoadenin, prostetickou skupinou je nikotinamid-adenindinukleonid
(NAD)
když R = ribofosfát-fosfát-riboso-2-fosfát-adenin, prostetickou skupinou je nikotinamidadenindinukleotid-fosfát (NADP).
11
R
N
CH3
CH3
N
2H+ + 2e
O
CH3
N H
N
R
N
CH3
N
H
O
H
N
O
N H
O
když R = ribofosfát, prostetickou skupinou je flavinmononukleotid (FMN).
když R = ribofosfát-fosfát-adenin, prostetickou skupinou je flavinadenindinukleotid (FAD)
Mnohé houby, kvasinky, řasy a bakterie mohou využívat kyslík jako konečný akceptor elektronů.
Typická sekvence oxidačních reakcí po odebrání vodíku ze substrátu je znázorněna na obrázku 2.
Obr. 2
ATP
ATP
ATP
1/2 O2
Substrát A
NAD
Cyt.b
FAD
Substrát AH2
převáděné
protony a elektrony
E´0
-0,32
-0,22
Cyt.c
Cit.a
Cit.a3
převáděné
2H
O2
elektrony
-0,04
+0,24
+0,28
+0,82
Redukovaný pyridinnukleotid dehydrogenasy se reoxiduje přenosem protonů a elektronů na
flavoprotein. Redukovaný flavoprotein se dále oxiduje přenosem dvou elktronů na dvě prostetické
skupiny cytochromu b obsahující železo a uvolní se dva vodíkové ionty do prostředí. Elektrony pak
přecházejí z cytochromu b na cytochrom c a pak na cytochromy a a a3, cytochromy a a a3 tvoří
enzymový systém přenášející elektrony na molekulární kyslík. Aktivovaný kyslík se potom slučuje
s uvolněnými dříve za vzniku vody. Hodnoty E0´ jsou uvedeny na obrázku 2.
Vztah mezi změnou volné energie a změnou rozdílu potenciálů při přechodu elektronů z jednoho
systému na druhý může být vyjádřen následovně:
∆Fo
∆Fo
n
∆E0
F
= - n F ∆Ε0
kde
- změna volné energie (J/mol) za normálních podmínek
- počet přenesených elektronů
- rozdíl potenciálů (volty)
- faraday (96 634 J/V)
12
Kinetika enzymových reakcí
Teorie kinetiky enzymových reakcí vypracovaná Michaelisem a Mentenovou vychází z toho,
že enzym E a substrát S nejdříve tvoří komplex ES, který se pak štěpí na produkt P a enzym
E.
k1
S+E ↔
ES
k
(1a)
−1
k2
ES →
P+E
(1b)
Rychlost tvorby komplexu ES je dána rovnicí :
d (es )
= k1 .(s * e ) − k1 .(es ) − k 2 (es )
dt
(2)
kde e, s, es znamenají koncentrace enzymu, substrátu a komplexu enzym-substrát.
V případě, že reakce 1a a 1b jsou v ustáleném stavu pak
d (es )
=0
dt
a za předpokladu, že celková koncentrace enzymu (e0) je rovna součtu koncentrací volného
enzymu (e) a komplexu enzym-substrát (es):
e0 = e + (es)
(3)
z rovnice 2 dostáváme :
k1 s e0 = k1 s (es) + (k1 + k2) (es)
k1 .s.e 0
(es ) =
k1 s + k1 + k 2
s.e 0
k + k2
s + −1
k1
(4)
Rozklad komplexu je ireversibilní proto platí :
v=
dp
= k 2 .(es )
dt
(5)
spojením rovnice 4 a 5 dostáváme rychlost enzymové reakce :
v=
k 2 e0 S
VS
VS
=
=
k + k2
k
Km + S
S + −1
S + 2 + Ks
k1
k1
(6)
kde V = k2 . e0 - maximální rychlost produkce; všechen enzym tvoří komplex se substrátem
Ks =
k −1
- rovnovážná konst. disociace komplexu enzym-substrát ES.
k1
13
Km = Ks +
k2
k1
- konstanta Michaelise - Mentenové
Km je nepřímo úměrná chemické afinitě enzymu k substrátu. Čím je menší hodnota Km, tím je
větší afinita enzymu k substrátu.
V se obvykle vyjadřuje v g.e-1.s-1, nebo M.s-1.
Pokud není známa molekulová hmotnost (a tedy i molární koncentrace) vyjadřuje se
specifická aktivita enzymu, totiž mol.s-1.kg-1 bílkoviny.
Pro základní jednotku enzymové aktivity je navrhován katal (kat), jako množství enzymu,
které katalyzuje přeměnu jednoho molu substrátu za vteřinu ( 1 mol je množství látky,
obsahující stejný počet chemických částic jako 12.0 g12C).
Km - Michaellisova konstanta, která je definována jako konstanta poloviční saturace enzymu a
vyjadřuje koncentraci substrátu, při níž reakce probíhá polovinu maximální rychlosti.
Hodnoty Km jednosubstrátových reakcí pro různé enzymy lze nalézt v příručkách a pohybují
se od hodnot 10-1M do 10-6M a v případě vícesubstrátových reakcí i pod 10-8M.
Vyneseme-li v proti S (podle rovnice 6) obdržíme úsek pravoúhlé hyperboly, jejíž rovnice
(a − y ) =
AB
(B + x )
je totožná s rovnicí
V −v=
VK m
Km + S
(8)
na kterýž tvar lze rovnicí (6) převést.
Závislost reakční rychlosti v na koncentraci substrátu S podle rovnice (6) je uveden na obr.3.
Spojnice všech Si s příslušnými vi se protínají v jednom bodě se souřadnicemi (-Km,V).
Z obr.3. je patrno, že při nízkých koncentracích S platí :
v=
V .S
Km
S «K m
(9)
tj. reakce 1. řádu.
Při vysokých koncentracích substrátu: S » Km , bude
v = V = k 2 .e0
(10)
jedná se tedy o reakci nultého řádu, jejíž rychlost závisí pouze na koncentraci enzymu. Lze
tedy konstatovat, že enzymatická reakce je vzhledem k enzymu vždy 1. Řádu. Naproti tomu
vhledem k substrátu může být 1. Řádu pronízké koncentrace substrátu S«Km, 0.řádu pro
vysoké koncentrace substrátu S»Km event. pro S = konst.
14
Závislost reakční rychlosti v na koncentraci substrátu (rovnice 6)
-Km*V
V
v3
V/2
v2
v1
v
Km
0
S1
S2
S3
S
Stanovení Km a V
Pro experimentální stanovení Km a V je třeba pracovat při několika počátečních
koncentracích substrátu a při nich změřit velmi přesně počáteční rychlost reakce.
Měření počáteční rychlosti je důležité ze dvou důvodů:
1/ rychlost měřená v určitém časovém úseku od začátku reakce asi neodpovídá počáteční
koncentraci substrátu (s výjimkou chemostatu, kde je udržována koncentrace substrátu na
konstantní hladině)
2/ většina reakcí probíhá reversibilně, takže produkt ovlivňuje spotřebu substrátu
Počáteční rychlost lze stanovit vynesením p, nebo (S0 - S) proti t (obr.4) a stanovením
směrnice v bodě t = 0.
Časový průběh tvorby produktu
p
tg α = v0
t
15
Principem stanovení Km a V je linearizace rovnice Michaelise-Mentenové. Známe-li počáteční
rychlosti v0 při několika hodnotách S0 použijeme některého z modifikovaných způsobů
linearizace, z něhož nejznámější je způsob dle Lineweavera a Burka a je založen na vynesení
1/v proti 1/S na základě rovnice:
1 1 Km 1
= +
.
v V V S
(11)
která je převrácenou hodnotou základní rovnice:
Obr.5 Linearizace podle Lineweavera a Burka
Km
V
1
v
1/V
-
1
Km
1
S
16
Přeměna substrátu katalyzovaná dvěma enzymy
V praxi se často stává, že určitý substrát je přeměňován dvěma různými enzymy. Např.
membránový transport určitých aminokyselin může být zprostředkován dvěma
saturovatelnými systémy.
Pak platí:
v = V1
S
S
+ V2
S + K m1
S + K m2
(17)
Tato skutečnost se odráží v nelineárním průběhu vynesení 1/v proti 1/S. Tvar získané křivky
závisí na vzájemných poměrech V1 : V2 a Km1 : Km2 . Pro dostatečně odlišné hodnoty V a Km
získá se tvar křivky podobný jako na obr.10.
Obr.10 Substrát je přeměňován dvěma enzymovými reakcemi
v-1
S2
P2
S1
P1
S-1
0
Způsob výpočtu konstant V a Km
Označíme-li průsečíky lineárních částí s osou X jako P1 a P2 a směrnice příslušných částí jako
S1 a S2 platí pro konstanty poloviční saturace substrátem vztah :
K m1, 2 =
1
α +β ±
2 
(α + β ) 2 − 4βγ 
(18)
a pro maximální rychlosti :
V1 =
(K
P (K
1
V2 =
kde
α=
)
m1
−β
m1
− K m2
(19)
)
1
P1 − V1
S1
;
P1
(20)
β=
( S1 − S 2 )
;
( P2 − P1 )
γ =
S2
P2
17
Následné reakce - štěpení polymerů
Následné reakce představují případ, kdy se látka, která jednou reakcí vzniká, přeměňuje v
dalším reakčním kroku. Obecně lze psát:
K1
K2
A 
→ B 
→C
Samozřejmě reakcí může být i několik. Ze skutečných dějů je možno uvést např. bromaci
acetonu:
Br
CH3-CO-CH3 OH
→ CH3COCH2- 
→ CH3COCH2-Br
Mononukleárními reakcemi prvního řádu jsou
např. rozpady izotopů prvků. Z
biochemických reakcí je typickou následnou reakcí štěpení polymerů nebo velkých molekul
na meziprodukty s nižší molekulární hmotností, které jsou pak v dalším sledu zpracovány
jiným enzymovým systémem (např. transport do buňky, za ním následující metabolismus tzn.
3. stupně). Pro lepší názornost probereme nejjednodušší případ radioaktivního rozpadu podle
výše uvedeného schématu.
K1
K2
→ B 
→C ,
A 
C- je konečným produktem
A se spotřebovává rychlostí:
−
da
= k1 . a
dt
(21)
B a C přibývají rychlostí:
db
= k1a − k 2 . b
dt
(22)
dc
= k2 .c
dt
(23)
Pro A jde o případ mononukleární reakce 1. řádu, platí tedy:
a = a 0 e − k1 t
(24)
tento výraz dosazený do (22) poskytuje lineární diferenciální rovnici
db
+ k 2 b = k 1 . a 0 . e k1t
dt
(25)
jejíž integrací dostáváme výraz pro časovou závislost koncentrace B.
b = a0 .
(
k1
. e − k1 t − e − k 2 t
k 2 − k1
)
(26)
Protože v každém okamžiku je součet všech koncentrací roven výchozí koncentraci A; platí
konzervační rovnice :
a0 = a + b + c
(27)
pak můžeme z rovnice (26) po dosazení za a a b z (21) a (23) získat výraz pro c


k2
k1
c = a 0 1 −
. e − k 1t +
e − k2 t 
k 2 − k1
 k 2 − k1

(28)
18
Závislost 24, 26, 28 je uvedena na obr.11
Obr.11 Následné enzymatické reakce
konc.
C
A
B
t
A - ubývá exponenciálně (1. řád)
B - má v čase t = 0 a t = ∞ nulovou koncentraci. Mezi těmito extrémy má maximum, pro
jehož polohu platí:
 k 
−1
t max =  ln 2  ( k 2 − k 1 )
 k1 
(29)
Tento výraz je získán derivací rovnice (26) podle času. Dosazením rovnice (29) do (26)
získáme výraz pro maximální koncentraci B:
a 0 . k1
k 2 − k1
bmax =
 k 1 k 1
 k  k2 

− 1 

 k 2 k 2 − k 1  k 2  k 2 − k 1  
(30)
Z rovnic (29) a (30) je zřejmé, že čím je B nestálejší, tedy čím je k2 větší než k1, tím více
klesá hodnota bmax a tím více se toto maximum koncentrace posunuje blíže začátku reakce.
C přibývá exponenciálně, nejrychleji v době kdy b = bmax.
konverguje v hodnotu a0.
Výsledná koncentrace c
Pro tvorbu c mohou nastat dva krajní případy:
k1 » k2 : Reakce A —› B je řádově rychlejší než B —› C a rovnice (28) se zjednoduší na tvar:
(
c = a 0 1 − e − k2 t
)
(31)
Tento vztah odpovídá integrované rovnici 1. řádu s konstantou k2. Produkt C se tvoří jako by
vznikal přímo z A rychlostí druhé - pomalejší reakce.
k2 » k1 - pak platí:
(
c = a 0 1 − e − k1 t
)
(32)
C vzniká z A rychlostí první-pomalejší reakce.
Z výše uvedeného vyplývá, že celková rychlost vzniku produktu (celková rychlost u několika
následných reakcí) je vždy dána rychlostí nejpomalejší reakce.
19
Faktory ovlivňující rychlost enzymových reakcí
Enzymově katalyzované reakce probíhají různou rychlostí, která závisí na
a) množství enzymu
b) koncentrace substrátu
c) prostředí (teplota, pH, iontová síla atd.)
d) přítomnosti efektorů, tj. látek ovlivňujících rychlost enzymových reakcí.
Mezi hlavní fakty ovlivňující rychlost enzymové reakce počítáme vliv teploty, pH, aktivaci a
inhibici enzymů.
Vliv teploty
Výrazný vliv na aktivitu enzymů má teplota. Zvýšení teploty zvyšuje rychlost všech
chemických dějů, jak to odpovídá růstu kinetické energie reagujících molekul. Reakční
rychlost se obecně při vzrůstu teploty o 10°C zvyšuje asi 2 krát až 3 krát. Jde-li o enzymově
katalyzované reakce, je zvýšení rychlosti menší, asi 1,4 krát až 2 krát. Je to způsobeno
odlišnými hodnotami aktivačních energií než u reakcí nekanalizovaných. Dále je u
enzymových reakcí zvyšování reakční rychlostijen omezené, neboť s růstem teploty současně
roste inaktivace enzymu (v důsledku tepelné denaturace bílkovinné části a popřípadě i
odštěpování kofaktoru). Výsledkem dvou protichůdných dějů je pak vznik teplotního optima
(obr.12), jemu odpovídající teplotu nazýváme optimální teplotou enzymu. Poloha teplotního
optima je dána termolabilitou enzymu. U živočišných enzymů leží v blízkosti tělesné teploty,
u rostlinných bývá vyšší, často i 60 až 70°C. Je však též výrazně ovlivněna dobou, po kterou
necháme při jednotlivých teplotách enzymovou reakci probíhat. Čím kratší jsou doby ohřevu,
tím méně se uplatní proces tepelné inaktivace, který je relativně pomalý a naměřená optimální
teplota bude relativně vysoká. Vzhledem k této závislosti na způsobu měření není optimální
teplota výraznou charakteristikou enzymu.
Zvyšování rychlosti enzymové reakce s teplotou je běžně vyjadřováno tzv. teplotním
koeficientem Q10, pro nějž platí
Q=
k ( T +10)
kt
= 10
0.5 Ea / T ( T +10 )
(33)
kde Ea je aktivační energie reakce. U enzymových reakcí bývá Ea = 40 až 80 kJ/mol, Q10 je
tedy okolo 2.
Na rozdíl od chemických reakcí, kde reakční rychlost se zvyšuje s teplotou neomezeně až do
tepelné disociace reagujících molekul, u enzymových reakcí dosahuje určitého maxima, po
němž se prudce snižuje - obr.12.
v
B
Obr.12 Vliv teploty na enzymovou
reakci
A
A - vzrůst aktivity enzymu teplotou,
B - tepelná inaktivace enzymu
šipka označuje optimální teplotu
0
teplota
20
E + A ↔ E - A*
↔
EA
přechodový stav I.
↔
↔
E - X*
EP
↔
E - P* ↔
přechodový stav II.
aktivní komplex
EP
přechodový stav III.
Z moderní představy reakční koordináty je zřejmé, že teplota může působit na kteroukoli z
dvanácti rychlostních konstant tam zahrnutých. Avšak jejich detailní výzkum nevedl k
žádanému cíli. Skutečnost, že enzymové reakce jsou ve většině případů teplotou pozitivně
ovlivňovány indikuje, že v reakčním sledu existuje určitá řídící reakce o rychlostní konstantě
K směrem od substrátu k produktu, jejíž aktivační energie je nejvyšší v celé sekvenci. Pak lze
odvodit pro teplotní závislost k v rozmezí T1 - T2 vztah
log
kT2
E 1
1
= a . + 
kT1 2,3R  T1 T2 
(34)
což je obdobou známé Arrheniovy rovnice.
Vliv pH
Závislost rychlosti enzymových reakcí na pH vykazuje maximální rychlost při určitém
optimálním pH (pozoroval to už Michaelis v roce 1922).
Koncentrace vodíkových iontů může ovlivňovat enzymové reakce následujícími způsoby:
a/ inversibilní denaturace při vysokých nebo nízkých hodnotách pH. Avšak při těchto
extrémních podmínkách se stejně nepracuje.
b/ schopnost substrátu, nebo produktu reakce disociovat, či přijímat H+, jde-li tedy o reakci
HS ↔ H+ + S-. ......> H+ + P- ↔ HP
bude rovnovážná konstanta :
[ ]
[ ]
+
pe 1 + H / k p
Ke =
=
Se 1 + H + / k s
(35)
Závislost rychlosti enzymové reakce na pH je uvedena na obr.13.
1. typická křivka pro enzym, jehož aktivní forma je inaktivována jak protanací, tak
deprotanací
2. křivka pro enzym, jehož aktivní forma je basická (např. trypsin).
Obr.13 Vliv pH na enzymovou reakci
v
2
1
0
pH
21
Inhibice enzymů
Kineticky se dají inhibitory charakterizovat jako látky, které brzdí průběh enzymové reakce,
chemicky jsou to ionty, anorganické nebo organické sloučeniny nejrůznější povahy, jejichž
společným znakem je afinita k některé komponentě enzymově katalyzované reakce.
Nejčastěji se inhibitor váže přímo v aktivním místě apoenzymu, ale může mnohdy působit i
tím, že poruší strukturu jiné oblasti apoenzymu, která má význam pro funkceschopnost
enzymové molekuly. Může však nastat případ, kdy se inhibitor váže na koernzym, aktivátor,
nebo dokonce substrát.
Většinu pozorovaných inhibicí lze považovat za reverzibilní, protože dostatečně dlouhou
inkubací komplexu enzym-inhibitor v prostředí bez inhibitoru lze inhibitor z komplexu
uvolnit. Jsou však případy, že inhibitor vytvoří kovalentní vazbu s funkční skupinou enzymu
a takový komplex je pak nedisociovatelný za běžných experimentálních podmínek. Taková
inhibice je ireversibilní.
Zde probereme pouze dva nejdůležitější způsoby inhibice a to :
a/ kompetetivní inhibice
b/ reversibilní nekompetetivní inhibice
Konpetetivní inhibice
Předpokládá se, že se ustálí dvě různé rovnováhy - jedna mezi enzymem, substrátem a
komplexem enzym-substrát, druhá mezi enzymem, inhibitorem a komplexem enzyminhibitor. Přitom enzym částečně ztrácí schopnost tvořit produkt P.
+- I
EI
(inaktivní)
E
+- S
E + P
ES
(35)
ki
E +I E
↔
k−i
S - I
Rovnice Michaelise a Mentenové pro tento případ dostává tvar:
k
K i = −i
ki
Rovnice Michaelise a Mentenové pro tento případ dostává tvar:
v=
V.S
(36)
(37)
(38)
K
Km + S + m . I
Ki
po linearizaci:
1 
I  K  1 1
(39)
= 1 +   m  +
v 
Ki   V  S V
Rovnice (39) je na obr.14 vyjádřena jako přímka, její směrnice a průsečík s osou y jsou
(1+I/Ki)Km/V a 1/V za předpokladu, že Ki nezávisí na S.
Z porovnání rovnice (38) s rovnicí Michaelise a Mentenové bez inhibice vyplývá, že rychlost
enzymové reakce se mění s koncentrací i následkem soutěže mezi I a S o místo na povrchu
enzymu.
22
Nekompetetivní inhibice
Může být znázorněna reakčním schématem:
+I
-
E-I
E
+S
E-I-S
E-S
E + S
(40)
Tento model vede k následující rychlostní rovnici:
v=
VSK i
=
( K m + S )( Ki + I )
VS

I 
( K m + S )1 + K 

i 
(41)
Rovnice (41) ukazuje, že rychlost reakce za těchto podmínek je menší než udává rovnice bez
inhibice. Pro tento typ inhibice je charakteristické, že ani substrát, ani inhibitor nejsou
kompetetivní, a že afinita enzymu vůči těmto látkám se nemění bez ohledu na to, zda se
enzym vyskytuje jako volný, v komplexu s inhibitorem, nebo jako komplex s e substrátem.
Obr. 14 Plně kompetetivní inhibice enzymů, podle linearizace Lineweavera a Burka
plně kompetetivní inhibice
v-1
Km(1+I/Ki)
bez inhibitoru
Km/V
1/V
S-1
-1/Km -1/Km(1+I/Ki)
V
v
V/2
Km
K’m
S
23
Po úpravě rovnice (41) podle Lineweavera a Burka dostáváme:
1 
I   Km  1 
I  1
= 1 +

 + 1 + 
v 
K1   V  S 
Ki  V
(42)
Rovnice (42) je znázorněna na obr.15. Dává přímku o směrnici (1+I/Ki)Km/V, průsečík s osou
y je (1+I/Ki)1/V a s osou x 1/Km.
Obr.15 Nekompetetivní inhibice enzymů.
v-
nekompetetivní inhibice
1
(1+I/Ki)Km/V
bez inhibitoru
1/V(1+I/Ki)
Km/V
1/V
-1/Km
v
S
V
V’
Km = K’m
S
Kromě zmíněných způsobů inhibice existuje řada smíšených způsobů inhibice, které byly
způsobeny inhibitorem, existují speciální způsoby tzv. inhibice substrátem a inhibice
produktem.
Inhibice substrátem je často pozorovatelná při vysokých koncentracích substrátu. Příčin
inhibičního účinku může být několik:
a/ při vysokých koncentracích substrátu může nastat případ, že na vazebné místo enzymu se
váže několik molekul substrátu neúplnou vazbou (např. substrát se místo ve třech
vazebních místech váže pouze v jednom nebo ve dvou). Neúplná vazba je ovšem
kataliticky neúčinná.
24
b/ substrát se může vázat na místa blízká vazebnímu místu a tím sfericky bránit vazbě na toto
místo.
c/ ve velmi vysokých koncentracích může substrát snižovat efektivní koncentraci vody,
případně zvyšovat iontovou sílu reakční směsi a tak měnit rychlost reakce.
Inhibici produktem lze vysvětlit:
a/ protože enzymové reakce jsou většinou reversibilní, funguje produkt jako substrát
obrácené reakce a snižuje čistou reakční rychlost.Tento druh inhibice je zvlášť významný u
dvou, nebo třísubstrátových reakcí.
b/ produkt může vytvářet s enzymem neaktivní komplex jako pravý inhibitor.
Aktivace enzymových reakcí
Aktivátory jsou látky, které přispívají při katalytické účinnosti enzymu, aniž se zúčastní
vlastní reakce. Jsou vlastně pozitivním protějškem inhibitorů. V převážné většině se jedná o
anorganické kationty.
Selektivita enzymů vůči kationtům se liší případ od případu. Mezi aktivátory lze počítat
kationty kovů s atomovým číslem od 11 do 55, hlavně však mezi 20 a 30. Naproti tomu
většina kovů s vyšším atomovým číslem zvláště Hg2+, Pb2+, Ag+, působí jako ireversibilní
inhibitory enzymů. Mezi aktivátory patří především: Na+, K+, Rb+, (NH3+), Mg2+, Ca2+, CO3+,
Mo3+, Mn2+, Fe2+, Co2+, Ni2+, Zn2+, Cd2+. Analogicky s řešením inhibovaných reakcí můžeme
řešit reakce aktivované.
k5
ES
k
1s
E
k
E + P
k
2m
k-2
k-1
k
EMS
6
EM + P
k
4s
k3m
k-4
-3
EM
(43)
kde M značí aktivátor.
Budou-li všechny komplexy ve vzájemné rovnováze to znamená, že k5 a k6 budou menší než
ostatní konstanty, můžeme psát jednotlivé děje :
k1
e. S
E + S ↔ ES
Ka =
(43a)
k −1
eS
k2
eS . m
ES + M ↔ EMS
Kam =
(43b)
k −2
eSm
k3
e. m
E + M ↔ EM
Km =
(43c)
k −3
em
k4
em. S K Sm . K S
KmS =
=
(43d)
EM + S ↔ EMS
k −4
emS
Km
ES
k5

→ E + P
k6
→ EM + P
EMS 
25
Obecná rovnice pro podmínky rovnováhy odvozená obdobným způsobem jako rovnice pro
inhibici má tvar:
v m = e0
k 5 . K Sm . S + k 6 S . m
K K .m
S . M + K Sm . S + K Sm K S + m S
Km
(44)
v nepřítomnosti aktivátorů tj. m = 0 Km = Ksm = 1 se rovnice (44) redukuje na tvar:
v=
e0 . k 5 . S
V.S
=
S + KS
Ka + S
(45)
Obr. 16 Grafické znázornění působení neesenciálního aktivátoru v rovnováze
m1
v -1
m2
m3
S-1
-Km
Ksm.Ks
Víceenzymové systémy
Aby mohly probíhat metabolické reakce v biologických systémech, je vždy zapotřebí celé
řady enzymů, jejichž činnost na sebe funkčně navazuje. Produkt jedné enzymové reakce je
substrátem pro následující reakci.
Tyto reakce většinou probíhají v dynamické rovnováze. Dokonalý stacionární stav je málo
pravděpodobný, jedná se vesměs o otevřené systémy. Experimentálně lze krátkodobě navodit
stacionární stav alespoň určité metabolické dráhy a pro určité časové úseky. Avšak celý
systém funguje určitou rychlostí, která je určována tzv. limitující reakcí. To znamená, že při
dané koncentraci substrátu a jeho metabolických produktů je jedna enzymová reakce určující
pro rychlost v celém sledu. Takovou limitující funkci má enzym, jemuž přísluší nejnižší V.
Protože obecně V = k . et, může být tato limitace způsobena jak nízkou rychlostí proměny
aktivního komplexu na produkt, tak koncentrací příslušného enzymu. Zatímco první faktor
může být modifikován inhibitory a aktivátory druhý je předmětem proteosyntézy.
Názorně je role limitujícího enzymu znázorněna na obr. 17. Pokud je koncentrace
intermediálních substrátů dost vysoká, při níž jsou zúčastněné enzymy prakticky nasyceny
(bod 1) bude rychlost celkové reakce určena enzymem 3. Pokud však koncentrace
intermediálního substrátu pro enzym 2 bude na úrovni bodu 2, bude celková rychlost
určována enzymem 2. Nejjednodušším víceezymovým systémem je lineární sled reakcí podle
schématu
A
E1
B
E2
C
E3
...
26
Jestliže rychlosti katalyzované enzymy E1 a E2 označíme v1 a v2 můžeme psát
v1 =
v1 a
a + K1
(46a)
v2 =
v2 b
b + K2
(46b)
Ve stacionárním stavu (pokud existuje) bude v1 = v2 pak
b=
V1 K 2 a
(V2 − V1 )a + V2 K1
(47)
Z rovnice (47) vyplývá, že pokud by jmenovatel byl menší než 0, což nastane, když V1 » V2
pak by b mělo zápornou hodnotu. Tudíž to znamená, že ke stacionárnímu stavu by vůbec
nemohlo dojít a bude se hromadit intermediát B. Celková rychlost reakce pak bude v2.
Obr. 17 Víceenzymové reakce
v
E1
E2
V3
E3
V2
1
koncentrace intermediátu
2
Z komplikovanějších víceenzymových systémů nutno vzpomenout:
větvené sledy
A
E1
B
A
E3
E2
C
A
E1
E2
C
E3
D
B
27
bočné sledy
B
E1
E2
E
A
D
E
3
P
E4
C
C
E2
E1
A
5
E3
B
P
E4
E
D
5
distributivní sledy
C
D
E2
E1
A
E3
B
E
E
4
5
E
F
cyklické sledy
B
E
A
E
1
E
2
D
E5
3
E4
P
C
K regulaci celých metabolických drah buňka využívá tzv. zpětnou vazbu, kde jeden z
intermediátů, nebo konečný produkt inhibuje některý z počátečních enzymů.
Imobilizované systémy
V posledním období se stále více uplatňují i v průmyslovém měřítku enzymové reakce s
vázanými enzymy.
Pro přípravu ve vodě nerozpustných, biologicky aktivních derivátů enzymu jsou běžně
používány tyto metody:
1. Adsorbce enzymů na inertních nosičích (skleněné kuličky, silikagel, aktivní uhlí,
membránové filtry) nebo na syntetických iontoměničích. Adsorbce enzymů často vede k
jejich denaturaci, další nevýhodou je často nedokonalá imobilizace. Vysoká koncentrace
solí nebo substrátu zvyšuje desorpci vázaných enzymů.
28
2. Okluse v gelové mřížce, jejíž póry jsou příliš malé na to, aby z ní molekuly enzymu mohly
uniknout. Nejvhodnější je polyakrylamid. Nevýhodou je široká distribuce póru
syntetických gelů, což má za následek vyplavování enzymu. Kromě toho mohou enzymové
reakce probíhat pouze v oblasti gelové mřížky a tak je katalytická reakce omezena pouze
na substráty, které mohou snadno difundovat do gelu.
3. Kovalentní vazba enzymů na vhodný nosič prostřednictvím funkčních skupin, které nejsou
nutné pro biologickou aktivitu příslušného enzymu. Principiálně to mohou být skupiny α a
ε−NH2, α, b, γ−COOH, fenolové jádro tyrosinu, jádro histidinu a sulfhydrylové skupiny
cysteinu a serinu.
4. Kovalentní překřížení enzymu vhodným bifunkčním činidlem. Používají se bifunkční
sloučeniny, a) které mají identické obě funkční skupiny (glutaraldehyd, 1,5,difluoro-2,4dinitrobenzen a fenol-2,4-disurforylchlorid), b) bifunkční sloučeniny s odlišnými
funkčními skupinami.
Schematické znázornění kovalentního překřížení shodným bifunkčním činidlem je uvedeno
na obr. 18.
Obr. 18 Imobilizace enzymu kovalentním překřížením
nosič
adsorpce
+glutaraldeh
enzym
Příklad kovalentní vazby enzymu na kopolymer ethylenu a maleinanhydridu.
29
CH2 CH2 CH CH CH2 CH2 CH CH
CO CO
CO CO
O
+
O
enzym
aktivní místo
COOCH2 CH2 CH CH CH2 CH2 CH CH
COO-
CO COONH
enzym
NH
CO COO-
COO-
CH2 CH2 CH CH CH2 CH2 CH CH
COO
Kinetika imobilizovaných enzymů
Imobilizované enzymy jsou vázány na nosič s neporézním nebo porézním povrchem.
Obr. 19 Imobilizace enzymů na porézním a neporézním povrchu
Neporézní povrch
Porézní povrch
E
E
S
S
E
kapalná fáze
P
E
P
E
kapalná fáze
Vázaná
vrstva
enzymu
Enzym je vázaný ve formě tenké vrstvy - filmu. Substrát rozpuštěný v kapalné fázi musí
difundovat tímto filtrem, podobně produkt difunduje opačně.
Afinitu imobilizovaných enzymů ovlivňují zejména následující faktory:
1. Navázaný enzym může mít konformaci odlišnou od enzymu v roztoku.
30
2. Interakce mezi vázaným enzymem a příslušným ligandem může probíhat v mikroprostředí
odlišném od prostředí v roztoku. Vlivy prostředí lze do určité míry vysvětlit vlivem
dielektrických konstant na elektrostatické interakce.
3. Reakce na pevných površích mohou být do určité míry kontrolovány difúzí (v
homogenních roztocích nejsou ani nejrychlejší enzymové reakce kontrolovány difúzí).
4. Díky rozdělení substrátu mezi nosič a roztok může být koncentrace substrátu v blízkostí
enzymu odlišná od jeho koncentrace v roztoku.
Všechny tyto faktory ovlivňují kinetiku imobilizovaných enzymů a tím se stává tato kinetika
složitější než u enzymů v roztoku.
Hlavní předností imobilizovaných enzymů je jejich stabilita a možnost násobného použití.
Příprava enzymů a jejich využití v praxi.
I když se podařilo cestou organické syntézy na pevné fázi připravit plně aktivní ribonukleazu,
patří tovární výroba enzymů dosud ještě budoucnosti. Potřebné enzymové preparáty jsme
proto zatím nuceni získávat výhradně jejich izolací z přirozeného materiálu. Užívá se k tomu
stejných metod, jako při izolaci ostatních bílkovin. Enzymy se však vesměs nacházejí v
živých objektech jen ve zcela nepatrném množství, většinou menším než 0,1% sušiny.
Vhodným zdrojem enzymů bývají proto velmi často mikroorganizmy, protože je můžeme v
poměrně krátké době (24 až 48 hodin) připravit příslušnou fermentační technikou v jakémkoli
požadovaném množství.
Jak vyplynulo z předešlých kapitol, představují enzymy vysoce specifické katalyzátory, které
jsou schopné za velmi šetrných reakčních podmínek katalyzovat četné reakce, často i vysoce
stereospecifické. Pro tyto své vynikající vlastnosti nacházejí dnes enzymy stále širší uplatnění
v nejrůznějších oblastech, z nichž mnohé už nemají nic společného ani s biochemií, ani jinou
vědou o živých mikroorganizmech. Uveďme alespoň některé z nich:
a)Analytická chemie užívá stále více enzymů jako vysoce specifických činidel pro stanovení
různých látek, zejména ve složitých směsích. Enzymové metody jsou citlivější a hlavně
specifičtější než metody chemické. Nacházejí rozsáhlé uplatnění v klinické biochemii a
analytice potravin i v oblasti ochrany prostředí.
Příkladem je stanovení obsahu glukozy v různém materiálu pomocí glukosaoxidasy, stanovení
močoviny ureaou, aminokyselin specifickými dekarboxylasami, na základě inhibice
některých enzymů i anorganických iontů, určení obsahu pesticidů v potravinách, stanovení
koncentrace bojových otravných chemických látek ve vzduchu, vodě nebo potravinách.
b) Určování struktury molekul. Degradace biopolymerních řetězců specifickými hydrolasami
na menší fragmenty je součástí strategie nejpoužívanější cesty k určování primární struktury
bílkovin a nukleových kyselin. Použitím enzymů se známou specifitou štěpení chemické
vazby lze rychle získat přesné představy o struktuře organické látky.
Příkladem je použití glykosidas, což jsou enzymy specifické jak typu vázané sacharidové
jednotky (glukosidasy, fruktosidasy apod.), tak i sterickému uspořádání glykosidové vazby
( α -glykosidasy a β -glykosidasy). Pomocí těchto enzymů lze rychle určit charakter vazby
sacharidu v hologlykosidech nebo heteroglykosidech.
c) Preparativní organická chemie. Použití enzymů umožňuje přípravu četných látek ve velké
čistotě (nedochází k bočním a vedlejším reakcím) a s velkým výtěžkem bez použití vysokých
teplot a tlaků. Obvykle se též získá jediný optický izomer.
31
Dalším příkladem použití enzymů v preparetivní organické chemii je dělení racemických
směsí látek. Enzymy totiž často přesně rozlišují optické antipondy svých substrátů, neboť
obvykle vytvářejí komplex enzym-substrát jen s jedním antipondem. Tím vzniká produkt
enzymové reakce z jednoho antipondu, zatímco druhý antipond zůstává nezměněn. Získáme
tedy z racemické směsi směs chemicky rozdílných látek, které potom už zpravidla snadno od
sebe oddělíme.
Například pomocí peptidas, které působí jen peptidové vazby L-aminokyselin,můžeme dělit
racemické směsi synteticky připravených aminokyselin.
d) Chemický a potravinářský průmysl. Použití některých enzymových preparátů má však už
svoje pevné místo při úpravě surovin a výrobků potravinářského průmyslu a dalších
průmyslových odvěví.
Preparáty proteolytických enzymů (např. bakteriálních proteas) používá masný průmysl k
tenderizaci masa a marinaci ryb, pekařský průmysl ke zlepšení struktury pečiva, mlékárenský
průmysl k výrobě sojového mléka a ke srážení mléka v sýrařství. Proteasy lze použít též v
pivovarnictví k částečnému štěpení bílkovin v pivě. Zabrání se tak jejich koagulaci, a tím
vzniku nežádoucích zákalů během skladování a transportu.
Vedle potravinářského průmyslu používá proteolitické enzymy též kožedělný průmysl k
odstraňování srsti a chlupů z kůží. Proteasy nacházejí uplatnění i při rozkladu želatinových
emulzí při regeneraci stříbra z použitých fotografických filmů a pod. Také amylasy se
používají v řadě průmyslových odvětví. V potravinářském průmyslu slouží k částečnému
štěpení škrobu na dextriny, v pekařství ke zlepšení barvy a stravitelnosti výrobků, k přípravě
dextrinů pro výrobu sirupů a cukrovinek. Textilní průmysl užívá amylázových preparátů pro
odstraňování škrobové ochranné vrstvy textilních vláken před barvením, papírenský průmysl
pro úpravu škrobového pojiva, kožedělný průmysl pro činění kůží. Některých hydrolas ze
skupiny pektolytických enzymů se užívá jako tzv. filtračních enzymů, které hydrolýzou
pektinů snižují viskozitu, a tím usnadňují filtraci rostlinných (ovocných) šťáv při jejich
technologickém zpracování. V chemickém průmyslu se vedle enzymové hydrolýzy
polysacharidů (škrobu a celulosy) používají enzymy též k izomeraci sacharidů (např. k
přeměně D-glukosy na d-fruktosu apod.) Levně dostupných preparátů pankreatických enzymů
(směs proteaz, lipaz, amylaz) z jatečního materiálu se dnes užívá při výrobě moderních
pracích prostředků (biodetergenty) a zubních past. Hydroperoxidasy používá textilní,
papírenský a mlékárenský průmysl k likvidaci zbytků peroxidu vodíku použitého k bělení,
resp. ke studené sterilaci sýrů, gumárenský průmysl při výrobě pěnových porézních materiálů
pomocí kyslíku vznikajícího rozkladem peroxidu.
Rozsáhlejšímu využití nesmírných možností enzymových katalyzátorů pro analytické i
preparativní účely v laboratorním i průmyslovém měřítku brání hlavně malá stabilita enzymů,
vysoká cena a neúsporný způsob jejich jednorázového použití. Dosud se totiž enzymové
reakce provádějí většinou přidáním enzymu do reakční směsi. Po ukončení reakce zůstane
tedy drahocenný enzym jako kontaminující příměs a jeho regenerace pro další použití je
velmi nepraktická. Výrazným pokrokem je používání preparátů enzymů zakotvených na
makromolekulárních nosičích; hovoříme o imobilizovaných enzymech neboli enzytech.
Umožňují opakované použití téhož enzymu. Enzym lze oddělit od reakční směsi odstředěním
nebo se celý proces provádí v kolonovém uspořádání. Druhý způsob je obzvláště významný,
neboť umožňuje na základě kontinuální analýzy řídit rychlost průtoku reakční směsi a
vzájemně na sebe navazovat kolony s různou enzymovou náplní; tak lze v podstatě uměle
sestavovat následné enzymové reakce, jak je známe z metabolických procesů živých objektů.
Použití kotvených enzymů je výhodné také proto, že vazbou na vhodný nosič se často
struktura enzymu stabilizuje.
32
KINETIKA RŮSTU MIKROORGANIZMŮ
Základní vlastností živé hmoty, ale také podmínkou její existence, je růst. Růst může být
definován jako přírůstek protoplazmy buněk, normálně je spojený s rozmnožováním jejich
počtu. Pro mikroorganizmy je charakteristická jakost jejich růstu a rozmnožování.
Růst buňky a tedy i mikrobiologické kultury závisí na podmínkách, ve kterých se nachází
(přísun vhodných živin, pH, teplota, kyslík aj.) a je podmíněn metabolismem buněk.
Růst kultury kontrolujeme a posuzujeme následujícími metodami
a) přímé zjišťování počtu buněk (počítáním - celkové, kultivačně - živé)
b) přímé stanovení sušiny mikroorganismů (filtrací a vysušením)
c) nepřímé stanovení sušiny mikroorganizmů (nefelometricky, nebo centrifugací a
stanovením objemu tuhé fáze)
d) na základě tvorby určitého metabolitu (např. kyselina mléčná u laktobacilů
Nejsprávnější výsledky dává metoda a) avšak alespoň po 24 hod kultivaci. V praxi
nejpoužívanější metodou je metoda b), je vhodná hlavně pro mikroorganizmy s většími
buňkami (např. kvasinky, aktivovaný kal, vláknité mikroorganismy aj.)
Růst jednobuněčných mikroorganizmů
Každá buňka se v optimálních podmínkách vegetativně rozmnožuje na dvě nové buňky v
časovém intervalu, který se nazývá generační doba. Je to čas, potřebný na zdvojení počtu
buněk v kultuře.
Jestliže předpokládáme rovnoměrné rozmnožování kultury a to, že všechny buňky zůstávají
živé a rozmnožují se , pak po uplynutí generační doby g je jejich počet :
N1 = N0 . 2
(1)
a po čase t
Nt = N0 . 2
t
g
(2)
Z tho pro generační dobu dostáváme výraz :
g=
ln2( t 2 − t 1 )
lnN 2 − lnN 1
(3)
33
Růst jednotlivé buňky nebo buněk v tzv. statické kultuře, kde neprobíhá výměna substrátu,
probíhá podle známé růstové křivky a prochází několika fázemi:
I.
II.
III.
IV.
V.
- lag-fáze - indukční
- přechodová fáze
- log-fáze - fáze exponenciální růst
- stacionární fáze
- fáze odumírání
Obr. 2.1. Růstová křivka
ln N
I II
III
IV
t
V
I. Lagová fáze - její délka je závislá na změně koncentrace, nebo druhu inokula (kultivačních
podmínek) a od velikosti inokula.
Změna substrátu resp. kultivačních podmínek vyžaduje určitou dobu k adaptaci enzymového
systému.
Přidáním malého množství inokula - velké zředění způsobí značné prodloužení lagové fáze.
Značný vliv na trvání lagové fáze má stáří buněk inokula, se vzrůstajícím stářím doba lagové
fáze vzrůstá. (Starší kultura může obsáhnout větší koncentraci růst inhibujících látek.)
II. Přechodová fáze - navazuje na lagovou fázi, probíhají zde hlavně procesy adaptace
mikroorganizmů inokula.
III. Exponenciální růst - po zakončení lagové a přechodové fáze, kdy jsou mikroorganizmy
dobře adaptovány na nové prostředí, dochází k zvětšování počtu buněk úměrně s časem.
Rychlost růstu mikroorganizmů charakterizuje generační doba, čím je kratší, tím je rychlost
větší.
Specifická růstová rychlost je definována :
µ=
dx 1
.
dt x
nebo
dx
= µ. x
dt
(4)
Tato definice vyplývá ze zákona exponenciálního růstu :
x = x 0 .2
t
g
lnx= ln x 0 + ln 2.
t
g
(5)
34
po derivaci :
1
ln 2
. dx =
. dt
x
g
(6)
1 dx ln 2
=
( µ max )
x dt
g
Z rovnice (6) plyne vztah mezi růstovou rychlostí a dobou zdržení (generační dobou)
µ max =
ln 2
,
g
g = ln 2 = 0,693
(7)
IV. Stacionární fáze - dochází k zpomalování růstu z následkem limitace růstových faktorů
(vyčerpání substrátu nebo živin, nahromadění produktu nebo metabolitů).
V. Fáze odumírání - dochází k postupnému odumírání buněk mikroorganizmů následkem
zhoršení podmínek růstu.
Monodovská koncepce růstu
Při růstu jednobuněčných mikroorganizmů můžeme vyjádřit rychlost růstu jako funkci
limitujícího substrátu:
dx
= f ( X ; S)
dt
kde X - koncentrace, nebo hmotnost buněk
S - koncentrace limitujícího substrátu
Monod ve studii o růstu bakterií v chemostatu, kde růstová rychlost byla limitována jediným
substrátem, zjistil, že závislost růstové rychlosti na koncentraci substrátu je podobná
závislosti Michaelis-Mentenové proto navrhl následující rovnici :

S 

 KS + S 
µ = µ max 
(12)
kde µmax
- maximální růstová rychlost (když není limitována substrátem)
KS - konstanta koncentrace substrátu při níž je
µ=
µ max
2
Obr. 2.4. Grafické znázornění Monodovy rovnice
µ
µxma
µmax
2
KS
S
35
Tvar a průběh křivky µ − S závisí na velikosti konstant µmax a KS. µmax Závislost je patrná z
obrázků 2.5 a 2.6. Je patrné (obr. 2.5), že při vyšších hodnotách konstanty µmax při konstantní
hodnotě KS je průběh křivky µ − S strmější, tj. specifická růstová rychlost nabývá vyšších
hodnot již při nižších koncentracích substrátu.
Na obr. 2.6 je uvedena závislost průběhu křivky µ − S na KS při konstantních hodnotě µmax . Z
obrázku je patrné, že čím je nižší hodnota konstanty KS, tím je průběh křivky strmější, tj. čím
nižší je KS tím při nižší koncentraci substrátu je dosaženo maximální růstové rychlosti (µmax).
To znamená, že nejstabilnější systém bude ten, kdy µmax bude co největší a KS co nejnižší.
Obr. 2.5 Vliv velikosti µmax na tvar Monodovy rovnice.
µmax1 > µmax 2 > µmax 3 > µmax 4 > µmax 5
µ
5
4
3
2
1
Ks = konst.
S
Obr. 2.6. Vliv velikosti KS na tvar Monodovy rovnice
µ
µmax
5
4
3
KS1 > K S2 > K S3> K S4> K S5
2
1
µmax = konst.
S
Mimochodem je nutno poznamenat, že byl pozorován i růst jiného typu než exponenciální.
Např. pro vláknité organizmy se popisuje lineární růst. Pro vláknité organizmy, rostoucí ve
formě kuliček (pelet) je udáváno, že růst probíhá podle zákona druhé odmocniny (převážně
růst kontrolovaný difuzí).
36
Vztah mezi růstem mikroorganizmů a odstraňováním substrátu
Výhodou Monodovy rovnice je skutečnost, že uvádí růst mikroorganizmů do souvislosti s
koncentrací substrátu na rozdíl od jiných rovnic. Nevýhodou je nezahrnutí ostatních faktorů,
které mohou mít vliv na růstovou rychlost.
Rovnice Monodova může být transponována do tvaru vyjadřujícího rychlost úbytku substrátu
v závislosti na čase, což se pro její uplatnění při studiu kinetiky metabolizmu substrátu
rozhodující. To je umožněno zavedením konstanty produkce biomasy:
Y=−
dX
dS
(16)
nebo v závislosti na čase :
dX
dS
= −Y
dt
dt
(17)
Zavedení Y přináší určité problémy v tom, že jeho hodnotu nelze všeobecně považovat za
konstantní. Nesouvisí to jen se známou okolností, že čistá rychlost růstu je rozdílem
specifické růstové rychlosti µ a rychlosti úhynu mikroorganizmů kd (přesněji poklesu
množství buněčné hmoty v důsledku endogenní respirace a konečně až do úhynu buněk
provázené jejich lyzí ), což lze zahrnout do rovnice rychlosti růstu mikroorganizmů
dX
= ( µ − kd ) X
dt
(18)
a vede ke vztahu důležitému pro výpočet skutečných přírůstků biomasy
dX
dS
= −Y
−kd X
dt
dt
(19)
Ten je úspěšně používán nejen v produkční mikrobiologii, ale i při technologických
výpočtech produkce kalu v aktivačním procesu. Nejčastěji zjišťované hodnoty kd pro
aktivovaný kal jsou v rozmezí 0,03 až 0,07 den-1. Dosud neřešenou otázkou je skutečnost, že
jakákoliv změna v metabolizmu substrátu, způsobená např. jeho akumulací v buňce, nebo
obecně podílu respirace a syntézy (známé např. při limitaci dusíkem) ovlivňuje hodnoty Y.
Tam kde podobné okolnosti mohou přicházet v úvahu je proto třeba konstantnost Y zvlášť
posoudit. Uvedené okolnosti přicházejí v praxi v úvahu rovněž při neustálených stavech.
Zavedením konstanty produkce biomasy (pro jednoduchost nekorigované rychlostí kd) do
Monodovy rovnice získáme rovnici pro rychlost úbytku substrátu v čase
dS
X
S
= − µ max .
dt
Y KS + S
(20)
Z hlediska podmínek růstu mikroorganizmů můžeme rozlišit dva případy :
a) koncentraci organizmů lze považovat konstantní, X0 = Xt = konst.
potom rovnice je analogická rovnici Michaelise a Mentenové.
Označíme-li dS/dt = V, pak dostáváme rovnici (21), kde Vmax = µmax /Y
37
V = V max X 0
S
KS + S
(21)
Pro časový průběh získáme jednoduchou integrací rovnice (20) v mezích S0 až S a 0 až t :
K S . LN
S0
X
+ S 0 − S = µ max 0 t
S
Y
(22)
Koncentraci organizmů, resp. fyziologicky aktivní koncentraci organizmů můžeme považovat
za přibližně konstantní v mnoha případech. Patří sem např. všechny modifikace aktivačního
procesu s vyšším stářím kalu, kdy poměr So/Xo natolik nízký, že koncentraci X1, danou
vztahem (S0 - St) Y + X0 můžeme považovat za nevýzmamně odlišnou od X0. Ve skutečnosti
však není řídícím parametrem koncentrace biomasy, ale pouze ta část, která je odpovědná za
příslušný děj. Je-li kultura v dynamické rovnováze se substrátem, pak úbytek substrátu a
přírůstek aktivní biomasy jsou diferenciální děje.
Jinak je tomu při přechodných stavech, kdy hladovějící kultura se dostane do styku se
substrátem. Zde nedochází k okamžitému růstu, ale jen k akumulaci s transformaci substrátu.
Teprve po nasycení všech „poolů“ a vytvoření produktů potřebných pro reprodukci buňky
dochází ke zvětšení enzymatického aparátu odpovědného za substrátový děj. Správnost tohoto
tvrzení potvrzují výsledky mnoha kinetických testů.
Rovnice (22) je součtem kinetiky prvního a nultého řádu. Obdobně jako u funkčím tvarem
shodné rovnice Michaelise a Mentenové platí, že pro vysoké S se průběh blíží nultému řádu,
protože Ks « S. Naopak pro nízké S se průběh blíží prvnímu řádu, protože Ks již není ve
srovnání s S zanedbatelná.
b) koncentraci mikroorganismů
nelze považovat za konstantní. Jestliže dochází k
významnému přírůstku mikroorganismů, pak platí:
X = X0
µ max S
(23
KS + S
což vede k rovnici
Y
µ max
µ max. S


St
+ ( S t − S 0 ) = + X 0 . E K S + S
 K S .ln
S0


(24)
Funkce na pravé straně rovnice není integrovatelná a tento přistup není použitelný. Proto je
nutno vycházet z konstanty produkce a rovnice (17), jejíž integrace vede k výrazu pro X:
X = X0 + Y ( S0 - St )
(25)
Výchozí diferenciální rovnice je pak (po dosazení 25 do20)
µ max X 0 + Y ( S 0 − S t )
dS
S
=−
.
dt
Y
KS + S
(26)
a její integrál ve stejných mezích jeko v prvním případě
t=
 

X 0 + Y(S0 − St )
YK S
S 0  X 0 + YS 0
LN
− ln S t 
ln ( X 0 + Y ( S 0 − S t ))
+
X0 
YK S
X0
µ max ( X 0 + YS 0 )  

(27)
38
Při vyjádření této kinetické rovnice jako funkce S = f(t,X) jde o klesající křivku s inflexním
bodem (sigmoidu)
S inf
1


2


S
X
0
0

= k S 1 +
+
− 1
 k S k S y 



(28)
Rozborem lze zjistit, že pro běžné poměry čištění odpadních vod aktivačním procesem je
Sinf>ks.
Kultivace mikroorganizmů
Podle časového průběhu rozlišujeme kultivace
a) jednorázové (statické)
b) semikontinuální
c) kontinuální
a) Při jednorázové kultivaci přechází kultura postupně celou růstovou křivkou. Jakmile jsou
mikrobní buňky přeneseny do nového média, vstoupí do fáze přizpůsobování (lag.) postupně přecházejí v logaritmickou fázi růstu a po vyčerpání živin, eventuálně
nahromadění metabolitů, nebo produktů se růst zastaví a kultura přejde do stacionární
fáze. Její konečná masa a objem bude záviset od velikosti inokula, výchozích koncentrací
živin a dalších faktorů. Po vyčerpání živin a nahromadění metabolitů systém dospěje k
bodu, kdy už nedochází k přeměně volné energie (dF = 0). Proces se zastavuje a ustaví se
rovnováha. Tak biofáze jako systém původně otevřený, dynamický a krátkodobě na čase
nezávislý se mění ve staticky uzavřeném objemu s časem až se konečně stane systémem
uzavřeným. Podle této charakteristiky můžeme jednorázově pěstovanou kulturu označit
jako systém uzavřený. Matematicé vyjádření logaritmické fáze je jednoduché, avšak v
přechodných fázích značně složité. Rovněž zachycení jednotlivých reakcí, zvláště
jednosměrných, jejich průěhu, změn a souvislostí i při použití termodynamických zákonů
je za těchto podmínek velmi obtížné.
b) Při semikontinuální kultivaci je v pravidelných časových intervalech odebírána část
kultivační směsi a nahražena novým kultivačním médiem. Systém může dosáhnout
ustáleného stavu.
c) Kontinuální kultivace. Kontinuální homogenní kulturu můžeme charakterizovat jako
kombinovaný složitý otevřený systém neměnného objemu. Jako celek je v dynamickém
ustáleném stavu s konstantní koncentrací všech složek, v němž reakce probíhají stále
stejnou rychlostí, sice v čase, ale nezávisle na něm. Při nepřetržité kultivaci se biofáze
dostává do podmínek, které umožní plně využít dynamiky množení mikroorganizmů i
tvorby produktů, což má velký teoretický i praktický význam.
Kultivační techniky
Vlastní kultivační techniky vycházeí jednak z cílů kultivace (tvorba biomasy, produkt, čištění
odpadních vod, analytické sledování) a jednak z charakteru kultivovaných mikroorganizmů.
Nárosty na pevných podložkách
Patří mezi nejstarší způsoby kultivace. Sem patří kultivace na plochách. Užívané zejména při
identifikaci jednotlivých druhů mikroorganizmů a k analytickému stanovení počtu mikrobů. Z
technologických způsobů kultivace na pevném povrchu jsou známé zejména technické
způsoby v kvasném průmyslu. V technologii vody jsou to biofiltry a ponořené filtry aerobní a
39
anaerobní. Tyto metody jsou výhodné zejména pro mikroorganizmy s delší generační dobou
než je požadovaná doba zdržení média. Odpadá nutnost recirkulace biomasy. Při těchto
způsobech rostou mikroorganizmy na pevném povrchu ve formě biofiltru. Matematický popis
bude uveden v další kapitole.
Kultivace na podložkách je možno provádět buď jednorázově, semikontinuálně nebo
kontinuálně.
Jednorázové a semikontinuální kultivace
S výhodou se používá v technické mikrobiologii k přechovávání kmenů mikroorganizmů.
Dále v laboratorní praxi se s výhodou využívá ke studiu různých mikroorganizmů. Výhodou
tohoto způsobu je nutnost malého množství inokula a menší časová náročnost a přístrojová
jednoduchost oproti kontinuální kultivaci. V kvasném průmyslu se semikontinuální kultivace
používá v řadě procesů - pivovarnictví a lihovarnictví aj. V technologii vody se této metody
používá především v laboratorních podmínkách a v poslední době také v provozním měřítku
pod názvem „SBR“.
Kontinuální kultivace
Je to nejrozšířenější způsob kultivace. Nachází široké uplatnění jak v mikrobiologickém
průmyslu tak v technologii vody. Výhodou tohoto způsobu je možnost udržování
mikroorganismů v jejich nejaktivnějším stadiu a možnost automatizace a regulace procesu.
Tato metoda je široce rozšířena v technologii vody. Je známa jako aktivace (čištění odpadních
vod aktivovaným kalem).
Interakce mikroorganismů a prostředí
Mikroorganismy a veškeré projevy jejich aktivity jsou determinovány působením faktorů
prostředí, v nichž se vyskytují.
Tyto faktory jsou povahy:
• abiotické, tj. fyzikální a chemické,
• biotické, dané vztahy s biologickou složkou prostředí.
Přehled hlavních abiotických a biotických faktorů prostředí
__________________________________________________________
Abiotické faktory
Biotické faktory
Zdroje živin a energie
Neutralismus
světlo
Kompetice
kyslík
Amenzalismus
oxidačně-redukční potenciál
Parazitismus
Voda
Predace
osmotický tlak
Komenzalismus
povrchové napětí
sukcese
Teplota
metabióza
Koncentrace vodíkových iontů (pH)
Protokooperace
Adsorpce
synergismus
Antimikrobiální (toxické) látky
Mutualismus
Prostorové podmínky
symbióza
40
Charakter vztahů mezi jednotlivými faktory
•
Charakter těchto vztahů je oboustranný (např. teplota, pH)
•
Působení každého faktoru může být přímé nebo nepřímé: odezva se pak projeví buď na
místě účinku (primárně) nebo na jiné úrovni (sekundárně).
•
Jednotlivé faktory mohou působit současně a vzájemně se ovlivňovat, v pozitivním nebo
negativním smyslu.
•
Účinek každého faktoru závisí na intenzitě, koncentraci či délce expozice, ( hodnoty
minimální (prahové), při nichž lze teprve účinek zjistit, dále hodnoty optimální, kdy je
působení nejvyšší, a hodnoty maximální, při kterých se ještě daný faktor může projevit).
Abiotické faktory
Zdroje živin a energie
Nejvýznamnější jsou prvky biogenní (C,H,O,N,S,P), dále různé kationty (K+, Mg2+, Mn2+,
Ca2+, Fe3+, případně i Co2+, Cu2+ a Zn2+) a anionty (např. MoO42- aj,).
Podle výživových požadavků se rozlišují mikroorganismy na
•
autotrofní (schopné využívat anorganické sloučeniny jako např. CO2, NH4+, NO3-,
PO43-, SO42- aj.)
•
heterotrofní (využívající látky organické). Mezi heterotrofy patří většina bakterií a
hub.
Podle zdroje energie se rozeznávají tři skupiny organismů:
(a) fototrofní organismy získávají energii z energie světelné, kterou mění na energii
chemickou ve fotosyntetických procesech,
(b) chemotrofní organismy čerpají energii z oxidačních reakcí
(chemolitotrofové) nebo organických sloučenin (chemoorganotrofové),
anorganických
(c) paratrofní organismy získávají energii paraziticky z hostitelských buněk.
Světelné záření je zdrojem energie pro fototrofní organismy, jež ji využívají k začleňování
uhlíku z oxidu uhličitého do organických vazeb, zpravidla za účasti porfyrinových barviv
typu chlorofylu, bakteriochlorofylu apod.
Energetické pochody v organismu bezprostředně souvisí s přenosy elektronů a vodíkových
iontů na příslušné akceptory, jimiž je zejména kyslík a jiné oxidační látky (dusičnany, železité
ionty, peroxidy aj.). Koncentrace těchto sloučenin a jejich poměrné zastoupení vůči látkám
redukujícím (vodík, železnaté ionty, sloučeniny obsahující sulfhydrylové skupiny a reaktivní
dvojné vazby apod.) determinují tzv. oxidačně - redukční potenciál prostředí (redoxpotenciál, EH). Ten je definován jako záporný logaritmus tlaku plynného vodíku, s nímž je
daná oxidoredukční soustava v rovnováze. Vyjadřuje schopnost redukce prostředí a závisí na
něm povaha a směr biochemických reakcí.
41
Podle nároků na kyslík se rozlišují mikroorganismy
(i) aerobní, pro něž je vzdušný kyslík nezbytný,
(ii) anaerobní, které jsou přítomným kyslíkem inhibovány,
(iii) mikroaerofilní (anaerobové, u nichž nízké koncentrace kyslíku urychlují množení)a
(iv) fakultativně anaerobní , které mohou růst a metabolizovat za přítomnosti i
nepřítomnosti kyslíku
Voda
Mikrobní buňky obsahují 75 - 80 % vody.
Mimořádně odolné vůči suchu jsou spory bakterií,
Citlivé na nedostatek vlhkosti jsou např. nitrifikační bakterie.
Potřebu vody u mikroorganismů lze vyjádřit hodnotou tzv. vodní aktivity (aw):
aw = Nw / (Nw + Ns),
kde:
Nw je počet molů vody
Ns je počet molů rozpuštěné látky.
Destilovaná voda má aw rovný 1, u roztoků hodnota aw klesá. U koncentrovanějších roztoků je
tedy relativní množství vody nižší. Většině bakterií vyhovují hodnoty aw v rozmezí 0,99 0,93, většině kvasinek hodnoty 0,91 - 0,88, u plísní bývají optimální hodnoty ještě nižší.
Podle solnosti prostředí:
•
halofilní (bakterie, mikromycety) (osmofilní, slanomilné), které se rozmnožují pouze
v koncentrovaných roztocích solí nebo cukrů (aw = 0,6)
•
halotolerantní (osmotolerantní), které nízké hodnoty aw mohou snášet.
Vnitrobuněčný osmotický tlak většiny bakterií je v rozmezí 0,35 - 0,6 MPa, u halofilních až
30 MPa.
Zvýšení osmotického tlaku v prostředí vede ke ztrátě vody v buňce a plasma se odděluje od
buněčné stěny (plasmolýza).
V hypotonickém roztoku nastává zvýšení obsahu vody v buňce, buněčná stěna praskne a
buňka hyne (plasmoptýza).
Povrchové napětí.
Má vliv na smočitelnost buněk.
•
Špatně smočitelné (hydrofobní) buňky rostou při vysokém povrchovém napětí v
tekutém prostředí povrchově, vytvářejí vrstvu na hladině,
•
Dobře smočitelné (hydrofilní) rostou difusně v celém objemu media, lépe využívají
živiny, rychleji rostou.
42
Teplota
Teplota je jedním ze základních fyzikálních faktorů, určujících průběh jakýchkoliv projevů
života. Teplotní rozmezí, tj. oblast mezi minimální a maximální teplotou, při nichž se
biologické procesy mohou projevovat, stejně jako optimální teplota, kdy probíhají nejlépe
jsou charakteristické pro jednotlivé mikroorganismy a enzymy a mohou se lišit pro různé
buněčné aktivity (růst, tvorba metabolických produktů, dýchání, množení apod.).
Zatímco změny, k nimž v buňce dochází pod hodnotami minima, bývají reversibilní (vratné),
teploty překračující maximum mívají letální, ireversibilní (nevratné) účinky, způsobené např.
denaturací bílkovin.
Podle vztahu k teplotě se rozlišují tři skupiny mikroorganismů:
(i)
psychrofilní (kryofilní, chladnomilné), jež jsou běžné v přirozených prostředích vody a
půdy,
(ii)
mesofilní, které jsou nejčastější a patří mezi ně většina saprofytních a patogenních
druhů,
(iii) termofilní (teplomilné,)
Hlavní skupiny mikroorganismů ve vztahu k teplotě
Mikroorganizmy
Teplota [°C]
Minimum
Optimum
Maximum
Psychrofilní
-10 - 0
20 – 30
45
Mezofilní
5 - 25
18 - 45
30 – 50
Termofilní
40
50 - 65
75 – 80
Koncentrace vodíkových iontů (pH)
•
pH ovlivňuje aktivitu enzymů, růst množení a veškeré aktivity mikrobů, směr
metabolických pochodů (regulační procesy), náboj buněčného povrchu a permeabilitu
živin, rozpustnost a dostupnost potenciálních substrátů, odolnost buněk vůči působení
jiných faktorů prostředí (kyselé pH např. brání klíčení spor).
•
Různé mikroorganismy mají odlišná minima, optima a maxima pH pro svou životní
činnost Hodnoty blízké optimu mohou přesahovat oblast 2 - 3 jednotek pH.
•
Většina bakterií roste v rozmezí pH 6,5 - 8, bakterie produkující kyseliny jsou vůči
nízkým hodnotám pH značně odolné (bakterie mléčného kvašení, kvasinky, některé plísně
apod.).
•
Sirné bakterie Thiobacillus thiooxidans např. mohou růst i při pH 0,5.
•
U plísní může být oblast mezi jejich minimem a maximem velmi široká. Aspergillus
niger může růst v mediích s hodnotami pH 1,2 až 11,0.
43
Sorpce
Pevné povrchy v prostředí mohou výrazně ovlivnit aktivitu přítomných mikroorganismů, a to
v pozitivním i negativním smyslu. Může být změněna dostupnost substrátu, enzymu,
produktu, buňky, živin, koncentrace vodíkových iontů a kyslíku či jiných akceptorů
elektronů, inhibitorů, toxických látek a pod.
BUŇKA
SUBSTRÁT
JÍLOVÝ
MATERIÁL
METABOLITY
EXZOENZYM
Termín sorpce zahrnuje jak povrchvé ulpívání a zadržování látek (adsorpce) tak i poutání
uvnitř struktur pevných fyzikálně-chemických i biologických elementů prostředí (absorpce).
Antimikrobiální látky
Jsou to biologicky aktivní prvky nebo sloučeniny s nepříznivým účinkem na mikroorganismy.
Mohou být povahy toxické (jedy), mohou být abiogenního nebo biogenního původu
(antibiotika). Některé tyto látky mikroorganismy usmrcují (mikrobicidní efekt), jiné pouze
zastavují jejich růst (mikrobistatický efekt). Podle cílového organismu se rozlišují látky
baktericidní či fungicidní, bakteriostatické či fungistatické. Účinek závisí na koncentraci
příslušné látky a na délce expozice buňky jejímu působení.
44
Biotické faktory – interakce v mikrobiálních systémech
Mikrobiální ekosystém je suma interakčních faktorů v limitovaném prostoru.
Mikrobiální společenství bude jedinečné z hlediska rozmanitosti druhů a je výsledkem
fyziologické, genetické a sociální adaptace. Změny fyzikálních a chemických podmínek
způsobují změny ve struktuře společenství.
Hlavní ekosystémy v čistírenských biotechnologiích
•
aerobní procesy – aktivovaný kal, představuje široké spektrum mikroorganizmů (čištění
odpadních vod, kompostování),
•
anaerobní procesy (metanizace) – převážně bakteriální kultura (anaerobní čištění
odpadních vod, anaerobní stabilizace kalů a dalších organických materiálů, skládky),
•
biologické filtry – aerobní – mikroorganizmy převážně v nárostech, společenství MO širší
než u aktivovaného kalu,
•
biologické rybníky – nejširší společenství MO, v horní oblasti aerobní, u dna anaerobní,
•
půdní mikroflora – široké spektrum MO přirozeně se vyskytujících.
Uvnitř každého mikrobiálního ekosystému probíhají různé interakce:
a) neutrální – není pozorovatelný efekt interakce
b) benevolentní – jeden organizmus příznivě ovlivňuje druhý
c) antagonické – jeden organizmus negativně ovlivňuje druhý
a) Neutrální interakce.
Neutralismus – MO se vzájemně neovlivňují. V přirozených podmínkách se vyskytuje
zřídka, u nepočetných populací s odlišnými výživovými požadavky.
b) Benevolentní (výhodné) interakce.
Komensalismus Jeden využívá druhého, aniž by ho tím nějak omezoval.
•
(i) jedna populace transformuje substrát na produkt dostupný a využitelný populací
druhou,
•
(ii) jedna populace vytváří růstový faktor nezbytný pro populaci druhou,
•
kdy jedna populace odstraňuje z prostředí faktory inhibující populaci druhou
(toxiny, úprava pH, pO2, osmotické poměry aj.),
•
kdy populace hostitele poskytuje povrch vhodný pro kolonizaci komenzálem,
•
(v) kdy jedna populace vytváří živiny či ochranu pro populaci druhou.
45
Mutualismus je prospěšný vztah pro oba partnery a je pro oba zároveň nezbytný, neboť žádný
z nich nemůže bez druhého v přirozených podmínkách přežít. Patří sem řada ekonomicky
významných případů symbiózy. Příkladem může být symbiotický vztah mezi hlízkovými
bakteriemi rodu Rhizobium a kořeny motýlokvětých rostlin, mezi houbami a řasami v
lišejnících, či mezi houbami a kořeny rostlin (ekto- či endomykorrhiza).
Protokooperace je vztah prospěšný oběma populacím, ale není nezbytný. Opět může jít např
o případ, kdy jeden z partnerů (heterotrof) produkuje oxid uhličitý nutný pro autotrofa a ten
opět vytváří kyslík nezbytný pro aerobního heterotrofa.. Mezi tyto interakce patří rovněž jev
zvaný synergismus, kdy populace obou druhů dokáží společně uskutečnit reakce, které by
individuálně nebyly schopny provést.
c) Antagonické interakce.
Kompetice (konkurence) – soutěž o živiny a prostor. Oba MO mají blízké životní podmínky.
Je důležitou silou přírodního výběru: přizpůsobivější organismus převládne, stane se
dominujícím. Jde o přímé vměšování populace obou druhů se vzájemně omezují, aktivně se
brzdí.
Amensalismus – jeden MO vylučuje faktor škodlivý pro druhý, přitom je sám nedotčen.
Negativní působení může být přímé, kdy organismus vytváří látky škodlivé pro druhou
populaci (antibiotika, inhibitory, toxiny, lytická agens apod.), nebo nepřímé, kdy aktivita prvé
populace vede ke změně podmínek prostředí ve směru nepříznivém pro druhý organismus
(pH, redox-potenciál, parciální tlak kyslíku apod.). V tomto vztahu tedy nejde o výživové či
energetické interakce.
Parazitismus – jeden žije na úkor druhého. Jako příklady mikrobních parazitů lze např. uvést
původce chorob člověka, živočichů, rostlin, viry, bakteriofágy, viry napadající houby, sinice,
prvoky.
Predace – jeden je potravou druhého. Vztah mezi predátorem a kořistí. Vztah je opět
jednostranně prospěšný pouze pro predátora, který oběť přímo napadá a pohltí ji, je na ní
závislý, je mu zdrojem potravy. Běžnými predátory bakterií, hub či řas jsou prvoci, červi.
Predátor bývá zpravidla větších rozměrů než kořist.
46
KINETIKA ODSTRAŇOVÁNÍ SUBSTRÁTU
Mechanizmus odstraňování substrátu bakteriální buňkou může být obecně popsán jako
sekvence tří komplexních procesů:
• kontakt buňky s molekulou substrátu
• transport této molekuly dovnitř buňky
• vnitřní metabolizmus substrátu
Obecně může kterýkoliv z těchto tří souborných dějů limitovat rychlost odstraňování
substrátu.
V podmínkách aktivačního procesu, charakterizovaného vysokou turbulencí v biologickém
reaktoru, je limitace odstraňování substrátu kontaktním dějem málo pravděpodobná.
Transportovatelnost substrátu je obecně dána velikostí molekuly substrátu a její prostorovou
konfigurací. Velké nebo sféricky nevhodné molekuly, které nemohou být snadno
transportovány dovnitř buněk, musí být nejprve štěpeny na transportovantelné štěpy
exoenzymy nebo enzymy vázanými na stěny buněk.
Na základě popsaného obecného mechanismu je praktické klasifikovat různé typy substrátů
do tří hlavních skupin:
a) Jednosložkové substráty, které jsou přímo trasportovatelné dovnitř buňky
b) Vícesložkové substráty, které jsou reprezentovány směsí několika jednoduchých substrátů
c) Komplexní substráty, které musí být štěpeny vně buňky před transportem dovnitř buňky
Kinetika odstraňování jednosložkových substrátů.
Jednosložkové substráty jsou transportovány dovnitř buňky podle Monodovy rovnice, která
může být upravena na diferenciální rovnici popisující rychlost odstraňování substrátu:
−
kde
S
X
Y
t
−
dS − X
S
= µ. .
dt
Y KS + S
(1)
- koncentrace substrátu v čase t (mg.l-1)
- koncentrace biomasy (g.l-1)
- koeficient produkce biomasy (g.g-1)
- čas (h)
µ - maximální růstová rychlost (h-1)
KS - Monodova konstanta (mg.l-1)
Integrací rovnice (1) dostaneme dva různé vztahy podle toho, zda koncentrace biomasy X je
během uvažovaného časového úseku konstantní nebo podstatně vzrůstá. Bylo zjištěno, že
rychlost odstraňování substrátu je konstantní, je-li poměr počátečních koncentrací substrátu a
biomasy S0/Xo menší než 2. Za těchto podmínek je integrálem rovnice (1) vztah :
−
K S ln( S 0 / S ) + S 0 − S = µ.
X
.t
Y
(2)
47
Substrát,
Biomasa
Obr. 1 Odstraňování jednosložkového substrátu
S
X
Čas
Průběh odstraňování jednosložkového substrátu je patrný z obr.1. Pro nízké hodnoty KS ve
srovnání s hodnotami S rovnice (2) přechází na kinetickou rovnici nultého řádu (odstraňování
substrátu konstantní rychlostí ). Pro nízké teploty S se průběh odstraňování substrátu bude
−
přibližovat kinetice prvního řádu. Konstanty µ a KS pro mikroorganismy aktivovaného kalu a
substráty přicházející v úvahu se pohybují v rozmezí :
−
µ = 7,2 - 17,0 d-1, KS = jednotky až desítky mg.l-1.
Je-li počáteční poměr S0/Xo vyšší než 2, pak koncentrace aktivní biomasy a tím i rychlost
odstraňování substrátu vzrůstá během doby jeho odstraňování a integrálem rovnice (1) je
vztah:
t=
X 0 + Y(S0 − S )
S 0  X 0 + YS 0
 

ln
− ln S  (3)
ln  X 0 + Y / S 0 − S /
+
X0 
YK S
X0

µ ( X 0 + YS 0 )  
Y. K S
−
Kinetika odstraňování vícesložkových substrátů.
U vícesložkových směsí jsou jednotlivé substráty odstraňovány z roztoku a transportovány
dovnitř buněk simultánně nebo následně (diauxie). Jak následné tak simultánní odstraňování
je charakterizováno body zlomu na časové závislosti celkové koncentrace substrátu. Každý
bod zlomu indikuje vyčerpání jedné složky ze směsi. Celková rychlost odstraňování
vícesložkového substrátu je pak dána součtem okamžitých rychlostí odstraňování
jednotlivých složek. (obr.3).
Obr.3 Odstraňování vícesložkového substrátu
S
1 - složka 1, rychlost odstraňování v1
2 - složka 2, rychlost odstraňování v2
3 - složka 3, rychlost odstraňování v3
4 - celkový průběh odstraňování
v’1 = v1 + v2 + v3
v’2 = v2 + v3
v’3 = v3
4
v’1
2(v2)
v’2
1(v1)
3(v3)
v’3
t
48
Kinetika odstraňování komplexních substrátů.
Mnoho organických látek v odpadních vodách se chová jako komplexní substráty
(polysacharidy, bílkoviny, tuky aj.). Kinetika jejich odstraňování může být popsána jako
sekvence několika reakcí :
k1
0 ,i
Komplexní substrát 
→ jednosložkové substráty  
→ reakční produkty
k
k - je rychlostní konstanta vnějšího štěpení
k0,i - jsou individuální rychlostní konstanty různých produktů štěpení, které jsou
transportovány dovnitř buněk.
kde
Pokud je první reakce dostatečně rychlá (jako např. u hydrolýzy), pak celková rychlost
odstraňování je řízena rychlostí transportu produktů hydrolýzy, která se řídí stejnými pravidly
jako odstraňování vícesložkového substrátu (obr.4a). Pokud je první reakce (hydrolýza)
pomalejší než rychlost odstraňování je řízena rychlostí hydrolýzy (obr.4b).
Obr. 4. Odstraňování komplexního substrátu (škrob)
a) - řídící reakcí je transport dovnitř buněk
S
b) - řídící reakcí je hydrolýza (vnější štěpení)
S
CHSK
CHSK
k > koi
k < koi
škrob
škrob
monosacharidy
monosacharidy
t
t
Substrátová kinetika
Z výše uvedeného rozboru plyne, že na odstraňování organických látek aktivovaným kalem
můžeme v konečné fázi pohlížet jako na odstraňování vícesložkového substrátu. Okamžitá
rychlost odstraňování je úměrná počtu zbývajících složek (obr.3.)
 m
V = F 
 M
(4)
kde V - relativní rychlost odstraňování
M - počáteční počet složek
m - počet složek zbývajících
V obecném řešení však neznáme počáteční množství buněk. Předpokládáme-li, že těchto
složek je velké množství (např. odpadní voda), pak jejich počet je možno nahradit
koncentrací. Potom však můžeme rovnici (4) vyjádřit diferenciální rovnicí:
 S
dS
−
= k n( s) . X  
dt
 S0 
n
(5)
49
kde
kn( s ) je specifická kinetická konstanta (vztažená na jednotku biomasy) formálně ntého řádu (mg.g-1h-1)
n - formální řád reakce
Takto vyjádřená konstanta substrátové kinetiky
kn( s ) je měřítkem aktivity biocenosy a
současně i biologické reaktivnosti substrátu.
Rovnice (5) je obecnou rovnicí substrátové kinetiky. Její itegrací pro n ≠ 1 dostáváme :
X  1
S 
= 1 + (n − 1)k n( s ) . 0 . t 
S0 
S0  1 − n
(6)
Integrací rovnice (5) pro řád n = 0,1,2 dostáváme rovnice pro substrátovou kinetiku nultého,
prvního a druhého řádu, což jsou v praxi často se vyskytující příklady :
n=0
K 0( S ) . X 0 . t
S
=1−
S0
S0
(7)
n=1

X 
S
= exp −  k 1( s ) . 0 . t 
S0 
S0

(8)
n=2
S
=
S0
(9)
1
X
1 + K 2( S ) . 0 . t
S0
Pro stanovení kn(s) a n z rovnic (5) - (9) je nutno znát časový průběh odstraňování substrátu tj.
Hodnoty Si a ti, které je možno získat z jednorázového kinetického testu. Grafické znázornění
průběhu rovnic substrátové kinetiky pro 0, 1, 2 řád je znázorněno na obr. 2.
Uvedená rovnice (5) vyhovuje základním poznatkům o substrátové kinetice. Jejím
nedostatkem je ponechání řádu reakce analogicky k chemickým reakcím. Jde o aproximaci
dosud neznámých funkcí prostou mocninovou funkcí, která nemusí vždy vyhovovat.
Výslovně připomínáme, že řád reakce u substrátové kinetiky nemá věcný smysl. Z téhož
důvodu není velikost exponentu n omezena na celá čísla. Navržené řešení však podstatnou
měrou zlepšuje matematický aparát substrátové kinetiky a vytváří racionální základ pro další
rozvoj kinetické teorie.
Jako příklad použití navržených rovnic uvádíme kinetiku odstraňování peptonu aktivovaným
kalem. Pepton je částečným hydrolyzátem živočišných tkání a je často používán jako složka
modelových odpadních vod. Kinetika jeho odstaňování se přibližně řídí prvním řádem.
Kinetické pokusy byly provedeny s aktivovaným kalem adaptovaným na pepton jako jediný
zdroj uhlíku. Stáří kalu bylo 10 dní a při kinetických pokusech byla různě volena počáteční
koncentrace peptonu i počáteční koncentrace kalu. Výsledek je uveden v tab.1. Porovnání
variačních koeficientů tří rychlostních konstant, a to konstanty k1 z rovnice pro chemickou
kinetiku, téže konstanty vztažené na sušinu kalu, tj. k1/X0 a specifické rychlostní konstanty
substrátové kinetiky k1(s) jasně ukazuje podstatné zlepšení souhlasu teorie a praxe při použití
nově navržené rovnice.
50
Tab. 1. Knetika odstraňování peptonu aktivovaným kalem - porovnání variability rychlostních
konstant prvního řádu.
Pokus č.
Počáteční Počáteční
koncentrace
sušina
substrátu
S0
X0
-1
-1
Rychlostní konstanta
chemické kinetiky
Rychlostní
konstanta
substrátové kinetiky
k1(s)
(mg.g-1hod-1)
(mg.l )
(g.l )
k1
(hod-1)
K1/Xo
(g-1hod-1)
1
285
2,140
2,38
1.110
317
2
570
2,170
1,64
0.756
430
3
670
2,880
1,37
0,476
319
4
705
1,535
0,73
0,476
334
5
800
0,830
0,34
0,410
327
6
variační
koeficient
860
2,200
1,05
0,477
410
0,314
0,330
0,574
0,442
0,166
Akumulační kapacita aktivovaného kalu
Jak bylo prokázáno v předchozí kapitole, jednoduché substráty jsou odstraňovány
aktivovaným kalem kinetikou nultého řádu. To znamená, že závislost úbytku substrátu na
čase je lineární. Avšak při odstraňování některých substrátů, zejména sacharidů byly
pozorovány zlomy na křivkách odstraňování substrátu. To jest substrát je zpočátku
odstraňován určitou vyšší rychlostí v1 a od určité doby dB (bod zlomu) nižší rychlostí v2.
Typický průběh odstaňování glukósy aktivovaným kalem je uveden na obr. 5. Z obrázku je
také patrné, že odstraňování glukósy koresponduje s přírůstkem cukrů v kalu. Sérií pokusů
bylo zjištěno, že existuje závislost mezi rozdílem rychlostí před a po zlomu (v1 - v2) a dobou
za níž dochází ke zlomu. Tento poznatek umožnil formulovat základní tezi, že k náhlému
snížení rychlosti odstraňování sacharidů dochází v důsledku nasycení jakési kapacity, kterou
má kultura pěstovaná za daných podmínek (semikontinuální kultivace, substrát glukósa věk
kalu 10 dní).
Obr. 5. Průběh odstraňování glukósy
konc.
CHSK
cukry v sušině
tb
t
51
Grafické znázornění kinetické představy akumulační kapacity je na obr. 6. Z obrázku je
patrné, že při styku aktivovaného kalu se substrátem, je na počátku substrát odstraňován
rychlostí v1, která je součtem rychlosti akumulace a rychlosti metabolizmu v2. Po nasycení
akumulační kapacity v čase tb pokračuje děj již jen rychlostí metabolizmu.
Obr. 6 Kinetická představa akumulační kapacity aktivovaného kalu
dS/dt
V1 celková rychlost
V1 - V2
rychlost akumulace
Akumulační
kapacita
V2 rychlost metabolismu
t
tb
Z teoretického hlediska na základě literárních poznatků o machanizmu transportu substrátu do
buněk můžeme výše uvedený jev vysvětlit následujícím způsobem.
Jestliže předpokládáme akumulační kapacitu v buňkách a předpokládáme rozdělení
akumulovaného substrátu do dvoou hlavních částí, z nichž jednou je modifikace na zásobní
látky a druhou je metabolizmus daného substrátu a získávání energie a syntéza nové biomasy,
pak můžeme tyto děje znázornit následujícím schématem znázorněným na obr.7.
Obr.7 Rozdělení substrátu uvnitř buňky
S
vs
Gex
vin
vd
Gin
vm(s)
vex
vm
M
kde :
Gex - koncentrace substrátu vně buněk, Gin - obsah substrátu uvnitř buněk , vin rychlost transportu dovnitř buňky, vex - rychlost transportu z buněk, S - zásobní
látky, M
- metabolizmus, vs - rychlost tvorby zásobních látek, vm - rychlost
metabolizmu substrátu, vm(S) - rychlost metabolizmu zásobních látek, vd - rychlost
depolymerace zásobních látek
Na základě výše uvedeného schématu lze očekávat u aktivovaného kalu dvě kapacity
(akumulační a zásobní) a tři možné rychlosti odstraňování substrátu :
v1 = vinmax
v2 = (vin - vex) = VS + Vm
v3 = (vin - vex) = Vm
52
Obě rychlosti vin a vex jsou závislé na velikosti a tvaru vločky aktivovaného kalu a na
podmínkách, ve kterých se nachází.
Akumulační kapacitu aktivovaného kalu můžeme stanovit z kinetického testu (obr.5) podle
rovnice:
C=
v1 − v 2
.tb
60
(mg.g-1)
Akumulační kapacita závisí na stáří kalu, vykazuje výrazné maximum při stáří kalu 6 - 10
dní, na obě strany od tohoto maxima klesá, směrem k mladším kalům strměji, směrem ke
starším pozvolněji.
Tvar funkce napovídá, že by mohla být složena za dvou základních závislostí a to závislosti
počtu aktivních buněk na stáří kalu a závislosti schopnosti aktivní buňky akumulovat glukósu.
Z teoretického rozboru akumulační kapacity vyplývá, že akumulační kapacita má především
ekologický smysl a je jedním z regulátorů populační dynamiky heterogenní kultury.
V podmínkách semikontinuální kultivace (tj. modelu ideálního postupného toku) dochází ke
styku hladovějící kultury s relativně vysokou koncentrací substrátu. V závislosti na počáteční
relativní koncentraci substrátu S0/X0 a aktivitě biomasy dochází k jeho vyčerpání a v dalším
časovém úseku již probíhá pouze endogenní metabolizmus. Ty mikroorganizmy, které mají
schopnost akumulovat substrát vysokými rychlostmi dosahují pochopitelně větších přírůstků
než mikroorganizmy, které jim v rychlosti přijímání substrátu nemohou konkurovat. Proto
semikontinuální kultivace preferuje mikroorganizmy schopné akumulace. Tento ekologický
mechanizmus působí na selekci kultury. Kultura vykazující akumulační kapacitu vždy
vytvářela flokulující nevláknitý kal charakterizovaný nízkými kalovými indexy. Naproti tomu
u vláknitého kalu, který se vytváří zpravidla ve směšovací kultivaci, nebyla akumulační
kapacita pozorována.
Výklad závislosti akumulační kapacity na stáří kalu, jako funkce složené ze závislosti podílu
aktivní biomasy a schopnosti aktivní biomasy akumulovat sacharidy, rovněž podporuje
hypotézu, že výskyt akumulační kapacity souvisí s flokulací bakterií. Právě mladé kaly i v
semikontinuální kultuře nejméně flokulují.
53
Rozdělení reaktorů z hlediska hydraulického uspořádání
Z hlediska hydrauliky reaktorů rozeznáváme tři ideální případy :
a) vsádkový reaktor
b) průtokový s pístovým tokemprůtokový s ideálním promícháváním
Vsádkový reaktor.
Výchozí látky se do tohoto reaktoru napustí, dokonale promíchají a nechají se určitou dobu
reagovat. Vzniklá směs se pak vypustí. Při tomto postupu se nedosahuje ustáleného stavu a
složení reakční směsi se během času mění, avšak v každém okamžiku je složení směsi v
celém reaktoru stejné - neexistují koncentrační gradienty.
Bilanční rovnice
úbytek látky A
reakcí (mol. čas-1)
reagující moly látky A
(čas) (objem tekutiny)
= (-rA ).V =
φA
objem reaktoru
zaujímaný tekutinou
A
dφ A
dC A
t = C AO ∫
=− ∫
− rA
− rA
0
C AO
C
Průtokový reaktor s ideálním promícháváním:
Obsah průtočného ideálně míchaného reaktoru je zcela homogenní a odtékající směs má
stejné složení jako směs v reaktoru.
Výpočtové vztahy získáme z bilanční rovnice Protože směs má v celém objemu reaktoru
stejné složení, můžeme bilancovat reaktor jako celek.
CA
CAi
(-1/rA)f
-1/rA
CAf
(-rA)f = (rA)
V, ΦA
CA, (-rA)
(-rA)f = (-rA)
ΦA= 0 = ΦA
CA0, = CA
FA
Bilance pro látku A
[přítok] = [odtok] + [úbytek reakcí]
úbytek látky A
reakcí (mol. čas-1)
= (-rA ).V =
reagující moly látky A
(čas) (objem tekutiny)
objem reaktoru
zaujímaný tekutinou
pro molární rychlost nástřiku platí pro látku A
54
FA0 = v0 CA0
a pro celý reaktor:
přítok látky A (mol.čas-1) = FA0 (1-φA0) = FA0
odtok látky A (mol.čas-1) = FA = FA0(1 - φA )
`
Pro prostorový čas
τ
platí:
τ=
1 V C AO φ A
=
=
S v0
−r A
V obecném případě když látka vstupuje do reaktoru již částečně zreagovaná Ai a vystupuje Af
platí:
τ=
V VC AO C Af − C AO
=
=
(− rA ) f
v0
FAO
Graficky je tato závislost uvedena na obr.2.
Obr. 2. Doba zdržení v ideálně míchaném reaktoru (chemická kinetika)
-1/rA
(-1/rA)f
plocha = τ = doba zdržení
CAi
CAf
CA
Vyšrafovaná plocha představuje prostorový čas - tj. dobu zdržení v reaktoru - pro reakci řídící
se chemickou kinetikou. Ideálně míchaný průtokový reaktor nemá žádný přímý vztah k
vsádkovému reaktoru, kromě toho, že ukazuje podmínky, v nichž je vsádkový reaktor v
určitém okamžiku. Z tohoto hlediska můžeme na něj pohlížet jako na diferenciální reaktor.
Rovnice pro tento reaktor ukazuje, že známe-li kterékoliv trojice ze čtyř veličin A, -rA, V a
FAO můžeme čtvrtou přímo určit.
55
Stacionární reaktor s pístovým tokem
Jeho charakteristickým rysem je rovnoměrný průtok tekutiny reaktorem, kdy žádná částice
tekutiny nepředbíhá jinou. Nedochází k podélné difúzi. Nutnou a dostačující podmínkou pro
reaktor s pístovým tokem je shodná doba setrvání kterékoliv částice tekutiny v reaktoru.
Složení směsi se mění podél dráhy toku. Avšak po celou dobu je v určitém místě stejné.
Protože se složení směsi mění podél dráhy toku, látková bilance se musí provádět pro
diferenciální objem dV (obr.3.)
Reaktor s pístovým tokem
v0 ,
ΦA= 0
CA0,
FA0
ΦA
FA
ΦA+d ΦA
FA +dFA
vf
ΦAf
CAf
FAf
ΦA
d
Φ
vzdálenost reaktoru
přítok = odtok + úbytek reakcí
(8)
4.1.3. Vztah mezi jednorázovými a kontinuálními reaktory.
Je důležité znát porovnání různých typů kontinuálních procesů s jednorázovou kultivací
zejména ve vztahu ke produkci biomasy, odstraňování substrátu a výtěžnosti produktu.
Např. Uvažujeme-li produkci biomasy u jednorázové kultivace ve vsádkovém reaktoru, je
reaktor pro vlastní produkci biomasy využit jen po část doby celého fermentačního cyklu.
tb = tg + t0 + t1 + t2
kde
tb - doba celého fermentačního cyklu
tg - doba exponenciálního růstu
to - doba vyklízení reaktoru
t1 - doba na přípravu zařízení
t2 - lagová fáze nového inokula
budiž td součet neproduktivních dob td = t0 + t1 + t2 a předpokládáme exponenciální růst po
dobu tg pak platí:
tg =
1
µ
ln
Xf
X0
(12)
56
kde X0 - počáteční koncentrace mikroorganismů (inokulum)
Xf - konečná koncentrace mikroorganizmů
pak celková doba jednoho cyklu bude :
1
tb =
µ
ln
Xf
X0
+ td
(13)
Obr. 5. Cyklus vsádkového reaktoru
X
Xm
t2
tg
t0
t2
t1
t
t0
t
tb
Naproti tomu doba zdržení u směšovacího reaktoru odpovídající stejné koncentraci
mikroorganizmů bude:
tc =
V
1 X f − X0
= =
F D
µX f
(14)
pak poměr dob zdržení vsádkového a směšovacího reaktoru odpovídající stejné koncentraci
biomasy Xf je :
(
)
t b ln X f / X 0 + µ td
=
1− X 0 / X f
tc
(15)
Z toho vyplývá, že kontinuální proces dává vždycky lepší výtěžky biomasy na jednotku
objemu reaktoru než jednorázový, dokonce i když bude td = 0.
Pro další porovnání vsádkového a kontinuálního reaktoru uvažujme tvorbu jednoduché
komponenty C. Rychlost tvorby C může být vyjádřena jako funkce koncentrace c.
Rychlost tvorby C = rc = f (c)
Pro chemickou kinetiku, která je charakteristická pro většinu nebiologických reakcí funkce f
(c), (nebo rc) je klesající s rostoucí koncentrací C. (Čím více C je přítomno, tím je pomalejší
rychlost jeho tvorby). U autokatalytických reakcí, jakou je např. Růst buněk, f (c) (nebo rc)
stoupá s rostoucí c . Návrh reaktorů pro tyto dva případy se zásadně liší.
Hmotnostní bilance komponenty C pro vsádkový reaktor a ideálně míchaný reaktor je
následující:
vsádkový reaktor (nebo reaktor s pístovým tokem):
dc
= rc
dt
ideálně míchaný reaktor (rovnovážný stav): F (c0 - c) + Vrc = 0
(16)
(17)
57
Poznámka : Pro vsádkový reaktor a reaktor s pístovým tokem platí stejné vztahy (viz rovnice
5 a 11). Vsádkový reaktor možno považovat za ideální model reaktoru s pístovým tokem.
Z rovnic (16) a (17) je možno vyjádřit dobu zdržení v jednotlivém reaktoru potřebnou pro
konverzi komponenty C z koncentrace c0 na cf
C
(18)
V c f − c0
=
F
rc
(19)
C0
tc =
ideálně míchaný
dc
∫r
tf =
vsádkový (pístový)
c
Názornější porovnání doby zdržení ve vsádkovém a směšovacím reaktoru je patrno z
grafického zobrazení rovnic (18) a (19) (obr.6.)
Obr. 6. Porovnání doby zdržení ve vsádkovém reaktoru (pístový tok)
1/rc
tc > tb
1/rcf
tc
1/rcf
tb
c0
a.) chemická kinetika
(rc klesá s c)
tb > tc
1/rc
cf
tb
c0
c
smešovací reaktor
postupný tok
tc
cf
c
b.) autokatakytická kinetika
(rc vzrůstá s c)
Z obrázku vyplývá, že pro autokatalytickou reakci je výhodnější směšovací reaktor než
vsádkový.
Mnoho mikrobiálních procesů se však chová jako kombinace autokatalytické a chemické
kinetiky. Autokatalytické chování převládá ve fázi exponenciálního růstu. Naproti tomu v
oblasti zpomaleného růstu a ve stacionární fázi chování systému odpovídá chemické kinetice.
To naznačuje, že v takových systémech bude nejvhodnější uspořádání kultivace - první
směšovací reaktor, za nám reaktor s pístovým tokem.
58
BIOLOGICKÉ REAKTORY PRACUJÍCÍ S KULTUROU V SUSPENZI
Kontinuální kultivace mikroorganismů
Velkého rozmachu kontinuální kultivace mikroorganismů ve fermentačním průmyslu bylo
dosaženo až v posledních třech desetiletích. Většina dřívějších prací se týkala hlavně studia
fyziologických vlastností mikroorganizmů. V průmyslovém měřítku se kontinuální kultivace
rozšiřuje až v posledním období.
Výjimku tvoří čištění odpadních vod aktivovaným kalem, které je největší a nejstarší
kontinuální kultivací mikroorganizmů.
Tento nedostatek průmyslových kontinuálních fermentací může být připsán následujícím
potížím:
a) možnost nežádoucí mutace mikrobů
b) technické potíže aseptického provozu po dlouhou dobu
c) nedostatek znalostí o dynamických poměrech mikrobiální činnosti
V technologii vody, kde se pracuje se spontánně vzniklou směsnou kulturou bod a a b
nepřicházejí v úvahu a bod c je eliminován dlouholetými zkušenostmi.
Hlavní výhodou kontinuální kultivace před jednorázovou je, že kulturu můžeme udržet při
vysoké růstové rychlosti a tím také dosáhnout vysokou produktivitu mikroorganizmů.
Základní vztahy pro růst biomasy v kontinuální kultivaci můžeme odvodit z látkové bilance
biologického reaktoru.
Platí:
[přírůstek biomasy] = [nárůst] - [úbytek]
dX
= µX − DX
dt
(1)
v rovnici (1) D - zřeďovací rychlost, je definována jako
D=
kde
F
V
F - hodinový průtok [m3h-1]
V - objem reaktoru [m3]
Zřeďovací rychlost je vlastně převrácenou hodnotou doby zdržení.
Za ustáleného stavu bude
dX
=0
dt
pak platí, že
µ−D=0
nebo
µ=D
Zřeďovací rychlost se rovná růstové rychlosti!
Samoregulační schopnost kontinuálního procesu
Pro ustálený stav platí, jak již bylo uvedeno, že µ = D .
59
Nyní analyzujme změny, které nastanou poruší-li se ustálený stav změnou zřeďovací
rychlosti. Zvýší-li se zřeďovací rychlost, pak D > µ
dX
= µX − DX 〈0
dt
hodnota dX/dt je negativní, dochází k úbytku biomasy. Mikroorganismy se ze systému
vyplavují, jejich koncentrace se snižuje. Naproti tomu koncentrace substrátu (vlivem nižší
spotřeby) se zvyšuje. To pozitivně ovlivňuje specifickou růstovou rychlost a její hodnota se
zvyšuje podle rovnice
µ = µ max .
S
KS + S
až se dosáhne ustálený stav kde D´ = µ ´.
Tento ustálený stav odpovídá vyšší koncentraci substrátu a nižší koncentraci mikroorganismů.
Překročí-li zřeďovací rychlost D maximální hodnotu specifické růstové rychlosti µ max
nastává vyplavení mikroorganismů z reaktoru. Naopak při snížení zřeďovací rychlosti D < µ
se prodlouží doba zdržení mikroorganismů, v důsledku vyššího využití substrátu klesá
koncentrace substrátu S a vzrůstá koncentrace mikroorganismů X. Snížení S ovlivní růstovou
rychlost a ustaví se nový ustálený stav při vyšší koncentraci mikroorganismů a nižší
koncentraci substrátu.
Z toho plyne, že kontinuální systém vykazuje samoregulační schopnost do D = µ max (obr.1)
Obr.1. Samoregulační schopnost kontinuálního systému
konc.
X
koncentrace substrátu
produkce bakterií DX
DM - maximální
DC - kritická
DM
DC
D
Zavedení koncentrace substrátu do bilancí rovnice pro kontinuální kultivaci.
Definujeme-li výtěžek biomasy Y jako
Y=−
dX
dS
pak můžeme odvodit rovnici:
60
−
dS
X
S
= µm
dt
Y KS + S
(2)
vyjadřující závislost koncentrace substrátu a produkce biomasy.
Hmotnostní bilanci mikroorganizmů v reaktoru pak pro ustálený stav můžeme psát
přírůstek mikroorganizmů
=
v reaktoru
nárůst
mikroorganizmů
-
úbytek mikroorganizmů
v odtoku
dX
S
= µ max X .
− DX = 0
dt
KS + S
(3)
analogicky bilance substrátu pro ustálený stav:
přírůstek
substrátu
=
rychlost přítoku
substrátu
rychlost odtoku
substrátu
spotřeba
substrátu
dS
X
S
= DS 0 − DS − µ max
=0
dt
Y KS + S
kde
(4)
S0 - koncentrace substrátu v přítoku
S - aktuální koncentrace substrátu
Z rovnic (3) a (4) můžeme pro podmínky ustáleného stavu vypočítat hodnoty X a S.
Pro X z rovnice (4) plyne:
D( S 0 − S ) =
X
S
µ max
Y
KS + S
(5)
Tato rovnice se často nazývá Monodův model chemostatu, protože za ustáleného stavu platí:
D = µ = µ max
S
KS + S
pak bude:
X = Y (S0-S)
nebo

KS . D 
X = Y S0 −

µ max − D 

(6)
(7)
Pro S z rovnice (3) plyne:


S
X  µ max
− D = 0
KS + S


(8)
dále platí:
D = µ max .
S
KS + S
z toho pro koncentraci substrátu vyplývá:
61
S = KS
D
µ max − D
(9)
Pokud je hodnota D znatelně menší než µ max je možno ustálený stav udržet limitací pomocí
koncentrace substrátu. Značné změně zřeďovací rychlosti odpovídá jen malá změna
koncentrace substrátu. Pro tento způsob kultivace se užívá systému zvaného chemostat, to
znamená systém, u kterého stálá koncentrace určité chemické látky (limitujícího substrátu)
udržuje konstantní koncentraci buněk v médiu. Regulaci provádíme řízením rychlosti průtoku.
V blízkosti D = µmax však již malá změna zřeďovací rychlosti vyvolává velké změny v
koncentraci substrátu a tedy i v koncentraci buněk. V tomto případě je výhodné řídit proces na
základě udržování konstantní koncentrace mikroorganizmů. Tento způsob se nazývá
turbidistat a je založen na udržování konstantní koncentrace buněk v médiu jejich měřením.
Na základě měření hustoty populace reguluje přístroj rychlost průtoku tj. zřeďovací rychlost.
Jednostupňová kultivace s recirkulací biomasy
Aby byla zvýšena koncentrace mikroorganizmů v reaktoru může se určitá část
mikroorganizmů recirkulovat.
Směs je z reaktoru odváděna do separátoru, ve kterém se část mikroorganizmů oddělí a vrací
zpět do reaktoru zahuštěna na hodnotu Xr. (Obr.2)
Obr.2.
F
X1, V
F+f
F, X
f. Xr
Jako základní předpoklad platí: Xr > X1 > X
Stupeň zahuštění se udává koeficientem zahuštění mikroorganizmů v recirkulovatelné části
média. Xr = X1.b kde b > 1.
Objemový poměr vraceného média je dán R = f/F kde
f - průtoková rychlost recirkulace
F- přítoková rychlost substrátu
Z bilance vyplývá:
[přírůstek] = [nárůst] + [přírůstek recirkulací] - [odtok z reaktoru]
dX
= µX 1 + f . X 1 − ( F + f ) X 1
dt
(10)
Po převedení na zřeďovací rychlost dostáváme pro jednotkový objem:
µX 1 + RDbX 1 − (1 − R) DX 1 = 0
(11)
62
z toho:
D=
µ
(12)
1 − R(b − 1)
D - takto definovaná udává rychlost průtoku čerstvého média a odtoku po separaci
recirkulátu.
Pro samotný reaktor platí tzv. "vnitřní zřeďovací rychlost D´", která se rovná "vnější
zřeďovací rychlosti D" zvětšené o objemový poměr RD.
D´= (1+R)D
Pak
Hodnota zlomku
µ
musí být větší než µ .
1 − R(b − 1)
Z toho plyne, že pro částečnou recirkulaci musí být b > 1, R vždy kladné číslo a dále
(F+f) X1 > f Xr
z toho plyne, že F > f(b-1) a 1 > R.(b-1) > 0
tím je podán důkaz, že výraz
µ
1 − R(b − 1)
>µ
D> µ
a
(13)
Faktory R a b jsou do určité míry na sobě závislé a nelze je libovolně volit.
Množství odtékajících mikroorganizmů po separaci.
[odtok z reaktoru]
-
[úbytek recirkulací]
FX = (1 + R) F X1 - f Xr
kde f = R.F
FX = (1 + R) F X1 - RF Xr
X = X1 [1 - R (b -1)]
(14)
recirkulací se tedy snižuje koncentrace X v odtoku
Produktivita mikroorganizmů
P = DX
µ
1 − R(b − 1)
[
]
. X 1 1 − R(b − 1) = µX 1
(15)
produktivita reaktoru bez recirkulace je P = µ X, recirkulace tedy umožňuje zvýšit
produktivitu reaktoru, toto zvýšení se rovná výrazu D(X1-X).
63
Bilance substrátu
Pro vztah mezi koncentrací mikroorganizmů a koncentrací substrátu platí X = Y (S0 - S).
Můžeme proto regulací koncentrace substrátu vždy zvýšit i koncentraci mikroorganizmů v
reaktoru bez recirkulace na hodnotu X1, kterou jinak získáme recirkulací.
Recirkulace je výhodná v těch případech, kdy koncentrace substrátu je předem dána a není ji
možno zvýšit (např. při čištění odpadních vod).
Bilance substrátu:
[přítok] + [recirkulát] - [odtok] - [spotřeba] = 0
D S0 + R D S - (1+R) D S
- µ X1/Y = 0
(16)
dosazením za µ z rovnice (12) a po úpravě dostáváme:
X1 =
Y(S0 − S )
(17)
1 − R(b − 1)
po dosazení za X1 z rovnice (14) dostáváme:
X = Y(S0 - S)
(18)
Selekce mikroorganizmů
Selekční působení koncentrace substrátu
Pro rychlost odstraňování jednosložkového substrátu platí diferenciální rovnice vycházející z
Monodova zákona růstu mikroorganismů
dS
X
S
= − µ max
dt
Y KS + S
kde
(33)
S = koncentrace substrátu
t = čas
X = koncentrace biomasy
µ max = maximální růstová rychlost
KS = Monodova konstanta
Y = koeficient produkce biomasy
Hodnoty µmax a KS jsou charakteristické pro jeden druh substrátu a jeden druh
mikroorganismu. Znamená to, že pro jeden druh substrátu dosahují různé mikroorganismy
různých růstových rychlostí využívání substrátu a tím i různých růstových rychlostí podle
svých charakteristik µmax a KS.
64
Při nízkých koncentracích substrátu je růstová rychlost málo závislá na µmax a je hlavně
funkcí KS, naopak při vysokých koncentracích substrátu je málo závislá na KS a je hlavně
funkcí µmax.
Příklad dvou organizmů, rostoucích na jednom substrátu je znázorněn na obr. 4.
Obr. 4. Selekční působení koncentrace substrátu
µ
B
A
S
Z obrázku plyne, že při nízkých koncentracích substrátu je preferován organizmus A, při
vysokých koncentracích naopak organizmus B. Složení biocenózy pak je úměrné
dosahovaným růstovým rychlostem při dané koncentraci substrátu. Protože koncentraci
substrátu v biologickém reaktoru - aktivační nádrži - lze do značné míry ovlivňovat jejím
konstrukčním uspořádáním, lze tohoto principu technologicky využít.
Experimentálně bylo zjištěno, že v systémech, kde biomasa přirůstá převážně při vyšších
koncentracích substrátu, dochází k potlačení růstu bakterie Sphaerotilus i bezbarvých sinic
rodu Leucothrix. Z toho lze soudit, že jejich růstové charakteristiky jsou podobné typu A na
obr. 4., zatímco nevláknité organizmy mají charakteristiky typu B.
5.4.2. Selekční působení akumulační kapacity aktivovaného kalu.
Bylo zjištěno, že určité typy aktivovaných kalů mají schopnost akumulovat sacharidy
glokósového a galaktósového typu. Jde tedy o monosacharidy, di- a oligosacharidy (glukósa,
galaktósa, maltósa, laktósa a další). Kinetická představa akumulační kapacity byla uvedena v
předchozí kapitole.
dS/dt
V1 celková rychlost
konc.
CHSK
cukry v sušině
Akumulační
kapacita
V1 - V2
rychlost akumulace
V2 rychlost metabolismu
tb
t
tb
t
65
Při styku aktivovaného kalu se substrátem je na počátku substrát odstraňován rychlostí v1,
která je součtem rychlostí akumulace a rychlosti metabolizmu v2. Po nasycení akumukační
kapacity v čase tb pokračuje děj již jen rychlostí metabolismu. Rychlost metabolismu je
závilslá na koncentraci substrátu podle rovnice (33). Rovněž pro rychlost akumulace je lze
očekávat závislost na koncentraci substrátu, v oblasti vyšších koncentrací sacharidického
substrátu (řádově stovky mg.l-1) však nebyla nalezena.
Mějme nyní opět jednoduchý případ dvou organismů. Organismus M má akumulační
kapacitu, organismus N nemá. Pro dobu kontaktu kultury se substrátem t ≤ tb je rychlost růstu
mikroorganismů M.
[
dX M
= YM (v 1 − v 2 ) M X M + ( v 2 ) M X M
dt
]
(34)
Rychlost růstu oragnismu N, který nemá akumulační kapacitu je
dX N
= YN v N X N
dt
(35)
Protože specifická růstová rychlost µ je definována
µ=
dX
,
dt
platí
µ M YM (v1 ) M
=
µ N YN v N
(36)
Je-li tedy směs obou organismů v kontaktu se substrátem jen do doby nasycení akumulační
kapacity, dochází k mnohem rychlejšímu přírustku organismu M ve srovnání s N, protože
YM ≥ YN a (v1)M > vN
Symboly v rovnicích (34) až (38) mají následující význam:
M - index označující mikroorganismus s akumulační kapacitou
N - index označující mikroorganismus bez akumulační kapacity
Y - koeficient produkce biomasy
v1 - celková rychlost odstraňování substrátu v období sycení akumulační kapacity
v2 - metabolická rychlost odstraňování substrátu
vN - metabolická rychlost odstraňování substrátu mikroorganismem N
(v1 - v2) - rychlost sycení akumulační kapacity
tb - čas potřebný k nasycení akumulační kapacity
t - průběžný čas
C - akumulační kapacita
Pro nasycení akumulační kapacity musí být zařazen proces, v němž dojde k vyčerpání
akumulovaného endogenního substrátu, tj. regeneraci akumulační kapacity.
Pro dobu kontaktu kultury se substrátem t > tb musí být růstová rychlost organismu M
vyjádřena jako průměrná rychlost, protože po dobu do tb probíhají obě rychlosti tj. v1 a v2
současně, po dobu t > tb probíhá již jen druhá rychlost. Potom platí
66
dX M
dt = YM (v1 − v 2 ) M t b X M + (v 2 ) M X M t
dX N
tYN v N X N
dt
[
]
(37)
poměr specifických růstových rychlostí je
µ M YM C + ( v 2 ) M t
=
vN t
µ N YN
(38)
Jestliže tedy v prvním případě, tj. pro t ≤ t b byla jednoznačně selekce ve prospěch organismu
M, pak v tomto druhém případě, kdy doba kontaktu je prodloužena, závisí značně na poměru
rychlostí (v2)M / vN . Při prodlužující se době kontaktu se substrátem mápůvodní akumulační
kapacita menší vliv a poměr (v2)M / vN stále větší vliv. Pokud (v2)M < vN, může dojít k inverzní
selekci ve srovnání s dřívějším případem.
Uvedený teoretický rozbor ukazuje na význam stáří kalu (resp. zatížení kalu) pro selekci
žádoucích organismů v aktivovaném kalu. Čím vyšší je stáří kalu (a tím koncentrace kalu v
aeračním systému), tím více se snižuje v reaktoru s postupným tokem doba kontaktu
mikroorganismů se substrátem a tím významněji se může projevovat akumulační kapacita při
selekci druhů.
Nasycená akumulační kapcita představuje pohotovou zásobu endogenního substrátu. Po
vymizení exogenního substrátu dochází k spotřebě této zásoby, která je využívána pro získání
energie a z části pro syntézu. Střídání kontaktu se substrátem a regenerace akumulační
kapacity je proto nezbynou podmínkou jejího plného obnovování.
Experimentálně bylo zjištěno, že aktivované kaly vykazující akumulační kapacitu jsou
nevláknité a dobře aglomerované. To je v dobrém souladu s poznatky o akumulaci a tvorbě
zásobních látek v různých mikroorganismech. Vláknité bakterie rodu Sphaerotilus nemají
schopnost akumulace sacharidů, ale vytvářejí zásobní produkt typu poly-β -hydroxymáselné
kyseliny.
67
Nejdůležitější technologické parametry biologických
reaktorů
Obr. 1. Obecné schéma biologického reaktoru s recirkulací biomasy.
Q1
S1
AN
V, S, X
Q1 – Qw
X2, S2
DN
Qr, Xr, Sw
Qw, Xw = Xr
Doba zdržení Θ: Je definována jako poměr objemu nádrže V k přítoku odpadní vody Q1
Θ=
V
Q1
(5.1)
Takto definovaná doba zdržení nezahrnuje recirkulaci. Dobu zdržení můžeme také definovat pro
směs odpadní vody a vraceného kalu Θs:
ΘS =
V
QS
(5.2)
Je-li Qr, přítok vraceného kalu, pak přítok směsy surové vody a recirkulovaného aktivovaného
kalu je Qs = Qr + Q1 = Q1(1 + Qr/Q1). Kde poměr Qr/Q1 = R nazýváme recirkulační poměr.
Objemové zatížení: Je definováno jako hmotnostní množství organických látek přivedené do 1
m3 nádrže za den. Počítá se podle vzorce:
Bv =
24Q1C1 24C1
=
V
Θ
(5.3)
kde C1 - je koncentrace organických látek v odpadní vodě, vyjádřená nejčastěji hodnotou BSK5
nebo CHSK a Q1 - přítok odpadní vody (m3 h-1).
Výkonnost aktivační nádrže Bv: Je definována jako hmotnostní množství organických látek
odstraněné v 1 m3 aktivační nádrže za den:
Bv =
24 S
Θ
(5.4)
kde _S = C1 - S2, S2 - odtoková koncentrace organických látek v roztoku.
68
Zatížení kalu Bx: Je definováno jako hmotnostní množství organických látek přivedené na 1 kg
celkové nebo organické sušiny kalu za den. Počítá se podle vzorce:
24Q1C1 24C1 Bv
=
=
VX
XΘ
X
Bx =
(5.5)
Stáří kalu Qx: Je definováno jako podíl hmotnosti sušiny kalu v aktivační nádrži a hmotnosti
sušiny kalu odebírané za den jako přebytečný kal včetně nerozpuštěných látek unikajících
odtokem:
ΘX =
XV
24[ X W QW + X 2 (Q1 − QW )]
(5.6)
kde Xw je koncentrace sušiny přebytečného kalu, Qw - objem přebytečného kalu odebíraný ze
systému za 1 h, X2 - koncentrace nerozpuštěných látek v odtoku z dosazovací nádrže.
Kalový index KI: Je definován jako objem v mililitrech který zaujímá 1 g sušiny kalu po
půlhodinové sedimentaci:
KI =
V30
X
(5.7)
kde V30 je objem kalu po 30 minutách sedimentace ve válci o objemu 1 litr X - počáteční
koncentrace sušiny kalu v g l-1.
Účinnost aktivačního systému EAS: Je definována vztahem
E AS =
C1 − C 2
100
C1
(5.8)
69
AEROBNÍ ZPŮSOBY BIOLOGICKÉHO ČIŠTĚNÍ ODPADNÍCH VOD
Základní způsoby kultivace směsné kultury
Z praktického hlediska bývá aktivace často rozdělována na různé technologické modifikace, na
níkozatíženou, vysokozatíženou, rychloaktivaci apod.
Z hlediska teorie reaktorů je možno mluvit v podstatě o čtyřech základních uspořádáních. Jsou
to:
1. Jednorázový (vsádkový, diskontinuální, batch) systém.
2. Semikontinuální systém.
2. Kontinuální systém s postupným tokem.
4. Kontinuální systém s ideálním promícháváním (směšovací aktivace).
Jednorázový (diskontinuální) systém
Roztok substrátu (např. odpadní voda) se smísí s aktivovaným kalem a směs se provzdušňuje.
Během provzdušňování dochází k úbytku substrátu (CHSK, BSK5) z počáteční hodnoty So na
hodnotu St, závislou na době provzdušňování. Současně s úbytkem substrátu dochází k přírůstku
sušiny biomasy z počáteční hodnoty Xo na hodnota Xt.
Pro tento systém je charakteristické, že mikroorganismy jsou v prostředí s měnicí se koncentrací
substrátu. Dále je pro toto uspořádání podstatné, že se po určité době (obvykle po vyčerpání
substrátu) sledování procesu ukončí, systém se zruší a dál se neprovozuje.
Pro praktickou aplikaci při čištění odpadních vod nemá tento systém význam. Je však výhodný
pro výzkumnou práci v laboratorním měřítku.
Semikontinuální systém (SBR – Sequential Batch Reactors)
Semikontinuální kultivaci si můžeme představit jako časově se opakující jednorázový proces.
Provozujeme ji tak, že po určité době odebereme část biomasy a kultivačního media a obsah
nádrže doplníme novým roztokem substrátu. Opakujeme-li toto po libovolně dloubou dobu při
konstantní době kultivace a konstantním množství odebírané biomasy a kultivačního média,
realizujeme uspořádání, kterému říkáme semikontinuální kultivace nebo semikontinuální systém.
Tento systém má značný teoretický a praktický význam pro svůj vztah ke kontinuálnímu
systému s pístovým tokem.
Kontinuální systém s postupným tokem
U tohoto uspořádání má aktivační nádrž tvar dlouhého koryta (několik desítek metrů) s relativně
malým průtočným profilem. Odpadní voda o koncentraci substrátu S1 se smísí s vraceným kalem
a směs se vede do aktivační nádrže, kde je provzdušňována. Během průtoku nádrží dochází k
postupnému poklesu substrátu z počáteční hodnoty Ss na odtokovou hodnotu S2, závislou na
délce nádrže.
Pro tento systém je opět charakteristické, že směsná kultura je ve styku se substrátem, jehož
koncentrace se mění. Jeden průchod nádrží odpovídá jedno mu aeračnímu cyklu v jednorázovém
systému.
Aktivaci s postupným tokem lze snadno realizovat pouze ve velkých nádržích. Čím je aktivační
nádrž menší, tím více se poměry v ní přibližují poměrům v ideální směšovací nádrži
70
Kontinuální systém s ideálním promícháváním (směšovací aktivace)
Odpadní voda o koncentraci S1 přichází do nádrže odděleně od recirkulovaného kalu. Ke
smíchání dojde až v nádrži, která je intenzívně provzdušňována a promíchávána. Při dostatečné
homogenizaci má celá aktivační nádrž prakticky stejné složení, a proto i koncentrace substrátu v
odtoku S2 je stejná jako v celé nádrži. Aktivovaný kal prodělává ve směšovací nádrži stejné
cykly jako v nádrži s postupným tokem. Podstatný rozdíl je však v tom, že je stále v prostředí o
přibližně konstantní koncentraci substrátu, dané hodnotou S2.
Pro směšovací nádrž je charakteristická konstantní rychlost odstraňování substrátu v celé nádrži.
Proto je též stejná rychlost spotřeby kyslíku v celé nádrži.
Hydraulické poměry vyplývají z uspořádání na základě směšovacího principu. V celé nádrži je
stejná koncentrace substrátu a proto i rychlost spotřeby kyslíku je stejná. Má velký význam
zejména pro průmyslové odpadní vody s velkým organickým znečištěním a s obsahem
sloučenin, které jsou sice biochemicky snadno rozložitelné, ale ve větších koncentracích jsou
toxické pro mikroorganismy aktivovaného kalu (např. fenol, formaldehyd aj.).
Jednou z nevýhod směšovací aktivace je skutečnost, že podporuje růst nežádoucích vláknitých
mikroorganismů. To platí zejména pro takové odpadní vody které obsahují glycidy.
Čištění odpadních vod aktivací
Q1
S1
AN
V, S, X
Qr, Xr, Sw
Q1 – Qw
X2, S2
DN
Qw, Xw = Xr
Surová nebo odsazená odpadní voda v množství Q1 a o koncentraci organického znečištění S1
(vyhodnocovaného jako BSK5, CHSK, Corg) přitéká do aktivační nádrže, ve které se mísí s
recirkulovaným (vratným) aktivovaným kalem, který se čerpá v množství Qr a má koncentraci
sušiny Xr. Směs se intenzivně provzdušňuje. Po projití směsi aktivační nádrží se aktivovaný kal
separuje od vyčištěné vody v separační nádrži (tzv. dosazovací nádrži). Zahuštěný aktivovaný
kal se recirkuluje zpět na začátek aktivační nádrže. Vzniklá nová biomasa, se ze systému
periodicky odstraňuje ve formě přebytečného aktivovaného kalu, Qw.
Směsná kultura - aktivovaný kal.
Aktivovaný kal je spontánně vzniklá směsná kultura mikroorganismů, jejíž složení je dáno
složením odpadní vody a podmínkami kultivace. Na rozdíl od čistých kultur ve kterých jsou
jednotlivé baktérie většinou volně pohyblivé, vyskytují se baktérie v aktivovaném kalu převážně
ve formě zoogleí (Z. ramigera, Z. uva). Z baktérií se nejčastěji vyskytují následující rody:
Pseudomonas, Flavobacterium, Achrobacter, Azotobacter, Micrococcus, Bacillus,
Acinetobacter, Mycobacterium, Nocardia, aj.
71
Kromě různých druhů baktérií mohou být v aktivovaném kalu přítomny v menším množství také
houby, plísně a kvasinky. Pravidelně bývají přítomny i baktérie nitrifikační Nitrosomonas a
Nitrobacter. V aktivovaném kalu jsou rovněž často přítomny různé vláknité mikroorganismy
například Sphaerotilus, Leptomitus, Leucothrix, Thiothrix, Beggiatoa, Nocardia, Microthrix
parvicella a další.
Z vyšších organismů jsou pravidelnou součástí aktivovaného kalu různá protozoa, vířníci,
hlístice aj. Z ciliátových prvoků jsou nejvíce zastoupena Vorticella, Opercularia, Epistylis.
Kvalitativní i kvantitativní složení aktivovaného kalu závisí hlavně na složení substrátu, na němž
byl daný kal vypěstován, a na hodnotách technologických parametrů během kultivace (na době
zdržení, zatížení a stáří kalu).
Vliv různých faktorů na čisticí účinek aktivace
Základní principy aktivačního procesu
1.
2.
3.
4.
5.
6.
Organické látky v odpadních vodách jsou substrátem pro mikroorganismy aktivovaného
kalu. Kvalita odtoků z biologického čištění je dána organickými látkami rozpuštěnými a
nerozpuštěnými
Organické látky v odtocích z biologického čištění jsou biologicky rozložitelné a
nerozložitelné. Abychom je rozlišili, musíme stanovovat BSK5 a CHSK v nefiltrovaných a
membránově filtrovaných odtocích.
Z rozpuštěných organických látek mohou být aktivačním procesem odstraněny pouze
látky biologicky rozložitelné.
. Vzhledem k platnosti Monodovy resp. Michaelise - Mentenové kinetiky odstraňování
substrátu nemůže aktivační proces zcela odstranit rozpuštěné rozložitelné organické látky (tj.
až na nulové koncentrace).
Aktivační proces sám produkuje organické mikrobiální produkty které mají velice nízké
rychlosti rozkladu.
Není-li při standardním stanovení BSK5 potlačena nitrifikace, mohou být hodnoty BSK5
v odtocích z biologického čištění významně ovlivněny spotřebou kyslíku na oxidaci
amoniakálního dusíku
Vliv pH
Optimální pH pro většinu baktérií leží v rozmezí od 6,0 do 7,5. Kvasinky mají optimální pH od
4,0 do 5,8 a plísně od 3,8 do 6,0. Aktivovaný kal lze adaptovat na pH v poměrně širokém
rozmezí od 6,0 do 9,0. Při čištění městských odpadních vod je optimální pH v rozmezí 7,0 až
7,5. Při hodnotách pod 6,0 je nebezpečí růstu vláknitých hub.
Přípustné pH čištěných odpadních vod bude závislé na tom, zda kyselost či zásaditost je
způsobena organickými či anorganickými sloučeninami.
Vliv nutrientů
Potřebná množství dusíku a fosforu jsou dány přibližně následujícími vztahy:
BKS5 : N : P = 100 : 5 : 1
(5.8)
Tyto poměry vyplynuly ze skutečnosti, že biomasa aktivovaného kalu obsahuje přibližně 10 %
dusíku a 2 % fosforu a že u středně zatížené aktivace přechází přibližně 50 % z odstraněné BSK5
na syntézu. Z toho plyne, že na každých 100 kg odstraněné BSK5 je zapotřebí 5 kg dusíku a 1 kg
fosforu.
72
Spotřeba kyslíku a vzduchu
Reakce v aktivační nádrži spotřebovávající kyslík:
Oxidace organických látek:
CxHyOz, + (x - y/4 - z/2) O2 = x CO2 + y/2 H2O
(5.8)
Syntéza buněčného materiálu:
n(CxHyOz) + n NH3 + n(x + y/4 - z/2 - 5)O2 =
= (C5H7NO2)n + n(x - 5) CO2 + n(y - 4)/2 H2O
(5.9)
Autooxidace buněčného materiálu:
(C5H7NO2)n + 5n O2 = 5n CO2 + 2n H2O + n NH3
(5.10)
Nitrifikační pochody:
2 NH3 + 3 O2 = 2 NO2- + 2 H+ + 2 H2O
2 NO2- + O2 = NO3-
(5.11)
(5.12)
V závislosti na technologických parametrech procesu a na koncentraci amonných iontů může
spotřeba kyslíku na nitrifikaci činit až 25 % z celkové spotřeby. Stechiometricky z rovnice (5.10)
plyne, že na oxidaci 1 kg organické biomasy je třeba 1,42 kg O2. Hodnota tohoto kyslíkového
ekvivalentu je závislá na chemickém složení biomasy a pohybuje se v praxi od 1,3 do 1,5 kg-1
Rychlost spotřeby kyslíku při reakcích znázorněných rovnicemi (5.9) a (5.8) je 10krát až
20krát větší než rychlost spotřeby na autooxidaci podle rovnice (5.10). Prvé dvě rovnice
znázorňují oxidaci exogenního substrátu, třetí rovnice oxidaci substrátu endogenního.
Rovnice spotřeby kyslíku
Z rovnic (5.8) a (5.9) plyne, že celková spotřeba kyslíku organotrofními organismy bude úměrná
množství odstraněných organických látek a množství sušiny biomasy v systému.
Spotřebu kyslíku za den v objemové jednotce aktivační nádrže můžeme vyjádřit vztahem :
r = Y´∆Bv + krXc,o
(5.18)
kde:
r - je objemová rychlost spotřeby kyslíku,
∆Bv - výkonnost nádrže, kg m-3 d-1,
Xc,o - koncentrace organické sušiny kalu v nádrži,
Y´,- koeficient, udává minimální hmotnost kyslíku potřebnou na oxidaci 1 kg odstraněných
organických látek, vyjádřených například jako BSK5, kg kg-1,
kr - rychlostní koeficient endogenní respirace organické sušiny kalu.
73
Pro výpočet koeficientů Y' a kr je vhodnější převést rovnici (5.18) na tvar
r
= Y ´ ∆B X + k r
X c,o
kde
(5.19)
r/Xc,o je spotřeba kyslíku na 1 kg organické sušiny kalu za den
∆Bx = _Bv/Xc,o je specifická rychlost odstraňování BSK5.
Koeficient Y' udává minimální spotřebu kyslíku na 1 kg odstraněného organického znečištění v
limitním případě, kdy ∆Bx.→ ∞.
Pro městské odpadní vody se bere obvykle Y' = 0,5 kg kg-1 (kyslík na BSK5) a kr = 0,1 kg kg-1 d-1
(kyslík na organickou biomasu).
Přestup kyslíku do vody
Kinetika absorpce kyslíku jakožto plynu ve vodě málo rozpustného může být popsána rovnicí
dc
= K L a (c s − c )
dt
(5.21)
Kde:
KLa - je celkový objemový koeficient přestupu kyslíku.
c - aktuální koncentrace kyslíku,
cs - rozpustnost kyslíku za daných podmínek.
Dochází-li k současnému odstraňování kyslíku z roztoku v důsledku probíhají chemické nebo
biochemické reakce, musíme psát rovnici přestupu kyslíku ve tvaru
(
)
dc
= K L a c ´s − c − r
dt
(5.22)
Kde:
r - je rychlost spotřeby kyslíku (respirační rychlost)
KLa' - celkový objemový koeficient přestupu kyslíku do odpadní vody resp. do aktivační směsi,
cs' - rozpustnost kyslíku v odpadní vodě.
Oxygenační kapacita (OC)
Oxygenační kapacita aeračního zařízení je definovaná jako množství kyslíku, které je dané
aerační zařízení schopno dodat za jednotku času do jednotkového objemu dané nádrže při jeho
nulové koncentraci v nádrži:
OC = KLa' c's
(5.24)
74
kde OC je oxygenační kapacita, obvykle udávaná v jednotkách g m-3h-1 nebo kg m-3d-1.
Koeficient KLa, resp. KLa' nelze teoreticky vypočítat, a proto se vždy stanovuje experimentálně.
Aerace, provzdušňování, okysličování
Do aktivačních nádrží se kyslík přivádí ze vzduchu nebo jako čistý plyn (kyslíková aktivace).
Obsah nádrží se provzdušňuje následujícími způsoby:
a) stlačeným vzduchem - při pneumatické aeraci,
b) mechanickými aerátory - při mechanické aeraci,
c) kombinací předchozích dvou způsobů - při kombinované aeraci,
d) ejektory nebo injektory - při hydropneumatické aeraci.
Při pneumatické aeraci se vzduch rozptyluje do vody různými aeračními elementy Rozeznáváme
následující tři druhy pneumatické aerace:
a) jemnobublinnou (d = 1 až 4 mm),
b) středobublinnou (d = 4 až 10 mm),
c) hruboboblinnou (d > 10 mm).
Při mechanické aeraci se používají aerátory s osou horizontální (aerační válce) nebo s osou
vertikální (aerační turbíny např. Simplex, Vortair, BSK turbiny aj.).
Hydropneumatická aerace doznala v poslední době značného rozšíření v zahraničí i u nás,
přestože je energeticky poněkud náročnější než ostatní způsoby aerace
Faktory ovlivňující oxygenační kapacitu
A) Při pneumatické aeraci se uplatňuje především:
a) velikost vzduchových bublin,
b) výška vodního sloupce,
c) intenzita aerace,
d) zatížení aeračního elementu,
e) obsah organických látek ve vodě.
Využití kyslíku ze vzduchu, při vodním sloupci 4 až 6 m, od 2 do 15 %.
B) Při mechanické aeraci se uplatňuje především:
a) hloubka ponoru,
b) počet otáček,
c) obsah organických látek ve vodě.
Výtěžky běžných aerátorů za průměrných provozních podmínek se pohybují od 1 do 2 kg kWh-1.
75
Biologické odstraňování anorganického dusíku z odpadních vod
Biologické odstraňování anorganického dusíku spočívá v biochemické oxidaci amoniakálního
dusíku na dusitany a dusičnany (nitrifikace) a v jejich následující biochemické redukci na plynný
dusíku (denitrifikace).
Nitrifikace
Nitrifikace probíhá ve dvou stupních. V prvním se amoniakální dusík oxiduje na dusitany
pomocí baktérií rodů Nitrosomonas, Nitrosococcus, Nitrospira a Nitrosocystis. Ve druhém jsou
vzniklé dusitany oxidovány na dusičnany mikroorganismy Nitrobacter a Nitrocystis. Obě
skupiny organismů jsou litotrofní a jako zdroj uhlíku potřebují CO2. Nitrifikace probíhá podle
rovnic:
2 NH3 + 3 O2 → 2 NO2- + 2 H+ + 2 H2O
(5.26)
2 NO2- + O2 → 2 NO3
(5.27)
NH3 + 2 O2 → NO3- + H+ + H2O
(5.28)
Sumárně:
Na úplnou oxidaci 1 g NH4+-N 4,57 g kyslíku.
Pokud v systému neprobíhá současně denitrifikace, je třeba na každých 14 mg NH4+-N dávkovat
37 mg Ca(OH)2.
Nitrifikační baktérie patří mezi pomalu rostoucí organismy. Růstové rychlosti jsou o řád nižší
než růstové rychlosti běžných organotrofních organismů aktivovaného kalu.
Kinetika nitrifikace je monodovského typu, tj. při vysokých koncentracích NH4+-N je nultého
řádu a při nízkých prvního řádu.
Biokinetické konstanty nitrifikačních organismů
Nitrosomonas
µ max
(h-1)
0,04 - 0,08
rx,m
(h-1)
0,3 - 1,5
Ks
(mg l-1)
0,6 - 3,6
Y
(mg mg-1)
0,04 - 0,05
Nitrobacter
0,02 - 0,06
0,3 - 2,0
0,3 - 1,7
0,02 - 0,04
Organismus
Faktory ovlivňující rychlost nitrifikace
Rychlost nitrifikace je ovlivněna těmito faktory: koncentrací rozpuštěného kyslíku, hodnotou pH,
teplotou, stářím a zatížením aktivovaného kalu a složením odpadních vod.
Doporučuje se udržovat koncentraci rozpuštěného kyslíku na hodnotě 2 mg l-1.
76
Hodnota pH považuje se za optimální pro rod Nitrosomonas 7,9 až 8,2 a pro rod Nitrobacter 7,2
až 7,6.
Optimální teplota pro čisté kultury je v rozmezí 28 až 32 oC. V aktivačním procesu probíhá
nitrifikace v dosti širokém rozmezí teplot, ovšem s poklesem teploty o 10 oC se její rychlost sníží
přibližně na polovinu. Citlivost vůči teplotě klesá s rostoucím stářím kalu.
Stáří kalu jeho zatížení v každém aktivačním systému spolu souvisí. Účinnost nitrifikace 90% a
vyšší se dá dosáhnout u městských odpadních vod při zatížení kalu pod 0,30 kg kg-1d-1 a stáří
kalu nad 5 dní.
Nitrifikační baktérie jsou velmi citlivé na celou řadu organických a anorganických látek.
Z anorganických látek to jsou především těžké kovy, kyanidy a kyanatany a neiontové formy
NH3 a HNO2.
Z organických látek vykazují nejsilnější inhibiční vliv ty které mají v molekule síru a dusík
(merkaptobenzothiazol, thiomočovina, allylthiomočovina aj.).
Biologická denitrifikace
Denitrifikace je opakem nitrifikace a znamená redukci dusičnanů a dusitanů na N2 nebo N2O.
Mohou ji provádět četné organotrofní baktérie jako např. rody Micrococcus, Pseudomonas,
Chromobacterium, Denitrobacillus aj. Oxidovaných forem dusíku mohou organismy využívat
asimilačně nebo disimilačně. Nitrátová asimilace je proces redukce dusičnanů na amoniak za
účelem získání dusíku pro syntézu buněčné hmoty. Nitrátová disimilace (respirace) je proces, při
kterém organismy využívají dusičnanový dusík jako konečný akceptor elektronů místo
molekulárního kyslíku.
Schematicky můžeme denitrifikaci popsat:
5 CH3OH + 6 NO3- → 5 CO2 + 7 H2O + 6 OH- + 3 N2 (5.29)
3 CH3OH + 6 NO2- → 3 CO2 + 3 H2O + 6 OH- + 3 N2 (5.30)
V procesu denitrifikace se uvolňují ionty OH-, což může v případě nízkých tlumivých kapacit
vést k rychlému vzrůstu pH s následnou možnou inhibicí procesu.
Dusičnanový nebo dusitanový dusík figuruje při anoxické respiraci jako konečný akceptor
elektronů a má tedy stejnou úlohu jako molekulární kyslík při oxické respiraci. U dusičnanů
přijímá dusík pět elektronů, u dusitanů tři elektrony při redukci na plynný dusík. Dusičnanový
dusík (označovaný dále jako NO3--N) je tedy ekvivalentní 2,5 atomům kyslíku (nikoliv třem) a
NO2--N je ekvivalentní 1,5 atomu kyslíku (nikoliv dvěma).
Platí tedy:
1 g NO3--N je ekvivalentní 2,86 g O2
1 g NO3- je ekvivalentní 0,67 g O2
1 g NO2--N je ekvivalentní l,7l g O2
1 g NO2- je ekvivalentní 0,5 g 02
77
Rychlost denitrifikace se zvyšuje s rostoucí teplotou a je vždy vyšší se substrátem exogenním
než endogenním. Denitrifikace probíhá v dostatečně širokém rozmezí pH od 6 do 9.
Z hlediska technologického uspořádání odstraňování dusíku může probíhat v jednokalovém nebo
dvoukalovém systému. V posledních letech je nejvíce provozován jednokalový systém, ve
kterém jedna směsná kultura zajišťuje odstraňování organických látek, nitrifikaci a denitrifikaci
tak, že je periodicky vystavena oxickým a anoxickým podmínkám.
a)
SO
C+N
b)
D
P
CH3OH
SO
C+N
D
P
c)
SO
C+N
D
P
d)
SO
C+N
D
e)
SO
C+N
D
P
f)
Obecná schémata aktivačního systému s nitrifikací a denitrifikací v jednokalovém systému.
SO - selektor oxický, SA - selektor anoxický, C - odstraňování organických látek, N nitrifikace, D - denitrifikace, P - provzdušňování za účelem odstranění N2 a N2O
78
Biologické odstraňování fosforu z odpadních vod
Přísun fosforu do vod povrchových odpadními vodami je nežádoucí, protože (podobně jako
dusík) podporuje jejich eutrofizaci. Přitom fosfor je limitujícím prvkem, neboť v sušině řas je
jeho obsah kolem 2 %, kdežto dusíku kolem 10%.
Z odpadních vod lze fosfor odstranit metodami fyzikálně chemickými a biologickými.
Fyzikálně chemické metody jsou založeny na tvorbě nerozpustných fosforečnanů vápenatých,
hlinitých a železitých.
Biologické odstraňování fosforu je založeno na schopnosti některých mikroorganismů
aktivovaného kalu akumulovat za určitých podmínek fosfor ve formě polyfosfátů. V současné
době je známo kolem 20 druhů mikroorganismů které mohou akumulovat polyfosáty. Mezi
nejznámější patří Acinetobacter sp. baktérie patřící do skupiny Acinetobacter/Moraxella.
Výhodou biologického odstraňování proti srážecím metodám je to, že nepotřebuje chemikálie a
není spojeno se vznikem anorganických kalů a s nutností jejich zpracování.
Mechanismus zvýšeného odstraňování fosforu
Za vhodných podmínek je aktivovaný kal schopen odstranit více fosforu, než je nutné pro jeho
normální růst. Jev se nazývá "luxury uptake".
Při konvenčním aktivačním procesu je fosfor odstraňován z odpadních vod hlavně pro syntézu
adenosintrifosfátu (ATP). Za podmínek, kdy neprobíhá mechanismus "luxury uptake", je syntetizovaný ATP využíván jako zdroj energie pro syntézu buněčného materiálu. Tímto
konvenčním mechanismem využívání fosforu je dosahováno jeho obsahu v sušině biomasy
aktivovaného kalu kolem 2%. Kromě této běžné produkce ATP může dojít i k jeho nadprodukci,
za následujících podmínek:
1. V buňce je uložena jako rezervní látka kyselina polybeta-hydroxymáselná (PHB). Za
přítomnosti kyslíku jsou buňky schopny oxidovat PHB vyšší rychlostí než ostatní rezervní látky.
Energie produkovaná při oxidaci převyšuje běžné potřeby buňky a je transformována do
polyfosfátů, které jsou ukládány v buňkách jako rezerva energie.
2. Buňka musí mít k dispozici specifické uhlíkaté sloučeniny, hlavně však kyselinu octovou.
Pokud tato není v odpadní vodě přítomna musí být aktivovaný kal kultivován následujícím
způsobem:
a) Aktivovaný kal po smíchání s odpadní vodou musí být ponechán určitou dobu v anaerobních
podmínkách. Za těchto podmínek vznikají z organických látek přítomných v odpadní vodě,
činností fermentativních bakterií, nižší mastné kyseliny, hlavně však kyselina octová. Tyto jsou
využívány bakteriemi schopnými akumulovat polyfosfáty (PP bakterie), přičemž energie
potřebná pro aktivní transport do buňek se získává hydrolýzou akumulovaných polyfosfátů.
(Ortofosfáty jsou uvolňovány do roztoku). Uvnitř buňky je z nižších mastných kyselin
syntetizována PHB, která je dále využívána jako endogenní substrát.
b) Po anaerobní fázi musí být směsná kultura kultivována po dostatečnou dobu v podmínkách
oxických nebo anoxických. V těchto podmínkách slouží akumulovaná PHB jako zdroj
organického uhlíku pro syntézu buněčné hmoty PP baktérií a zároveň jako zdroj energie pro
syntézu polyfosfátů (obr. 5.10). Využívají se zde jak fosfáty uvolněné v anaerobních
podmínkách, tak i fosfáty z odpadní vody. Fosfáty jsou ze systému odstraňovány v
79
přebytečném aktivovaném kalu, který v provozních podmínkách obsahuje 4 až 6 % fosforu v
sušině.
koncentrace
2
1
AN
OX
Corg
PHB
PP E
O2
CO2 + H2O
Corg
PHB
PP
E
PO43PO43-
Obrázek 5.10. Základní pochody při biologickém odstraňování fosforu
AN - anaerobní zóny, OX - oxické zóny, E - energie, 1 - Corg, 2 - ortofosfáty
V praxi dochází při biologickému odstraňování fosforu i k paralelnímu odstraňování fosfátů
srážením.
Aktivace se zvýšeným odstraňováním fosforu musí splňovat následující podmínky:
1. V systému musí být vhodně dimenzována anaerobní zóna, ve které dochází k tvorbě nižších
mastných kyselin, depolymeraci polyfosfátů na orthofosfáty a syntéze zásobní PHB v buňkách
PP baktérií
2. Za anaerobní zónou musí následovat aerobní zóna, ve které dochází v buňkách PP baktérií k
depolymeraci a oxidaci PHB a k tvorbě polyfosfátů.
3. Fosfor se ze systému musí odvádět s přebytečným kalem z oxické části.
4. Je-li vyžadováno simultánní odstraňování dusíku musí být oxická zóna dimenzována s
ohledem na nitrifikaci a systém musí být uspořádán tak aby dusičnany co nejméně rušily
uvolňování fosforu v anaerobní zóně.
Systémy se zvýšeným odstraňováním fosforu se jsou schematicky uvedeny na obrázku 5.11.
80
AN
AN
AN OX
OX
OX
OX
OX
OX
OX
a)
AN
AN
AN AO
AO
AO
OX
OX
OX
OX
b)
AN
AO
OX
AO
OX
c)
AN
AO
OX
AO
OX
d
)
Obrázek 5.11 Obecná schémata aktivačních systémů se zvýšeným odstraňováním fosforu
(a) a se simultánním odstraňováním dusíku (b, c, d) v hlavním proudu
AN - anaerobní zóny, AO - anoxické zóny, OX - oxické zóny
Čištění odpadních vod na biofilmových reaktorech
Charakteristickým rysem biofilmových reaktorů je kultivace biomasy ve formě nárostů biofilmu, tj. imobilizované na vhodném nosiči. Z tohoto hlediska je účelné rozdělit biofilmové
reaktory podle typu nosiče a podle způsobu jeho kontaktu s odpadní vodou a případně se
vzduchem. Potom můžeme biofilmové reaktory rozdělit do následujících základních skupin.
1. Zkrápěné biologické kolony (tzv. biofiltry).
Nosičem biofilmu je náplň kolony, která je zkrápěna odpadní vodou a v jejíž mezerách proudí
vzduch. Aerace je buď přirozená nebo nucená.
2. Ponořené biologické kolony
a/ S pevným ložem
Kolona je zcela zaplněna odpadní vodou, která zpravidla protéká zdola nahoru a do níž je
ponořen nepohybující se nosič biomasy.
b/ S expandovaným a fluidizovaným ložem
Kolona je protékána zdola nahoru. Původní objem nosiče (obvykle volně sypané materiály) je u
expandovaného lože zvětšen asi o 10-20 % oproti klidovému stavu. Částečky nosiče se navzájem
nepohybují. Fluidizované lože je charakterizováno vzájemným pohybem částic nosiče biofilmu
vyvolaným proudem čištěné odpadní vody, přičemž expanze lože je obvykle okolo 100% oproti
klidovému stavu.
81
3. Rotační biofilmové reaktory
a/ Rotační diskové reaktory (RDR)
Nosičem biomasy jsou vhodně tvarované kotouče, které pomalu rotují v čištěné odpadní vodě.
Při oxických procesech jsou disky ponořeny do vody jen částečně a dochází k střídavému
kontaktu biofilmu s vodou a se vzduchem.
b/ Rotační klecové reaktory
Pracují na stejném principu jako RDR, nosič biomasy je upevněn v rotující konstrukci.
4. Reaktory s kombinovanou kultivací biomasy
a/ Systémy, kde je nosič biofilmu mimo aktivační nádrž.
b/ Systémy, kde nosič biofilmu je umístěn do aktivační nádrže. Nosič může být do nádrže
instalován pevně, s vlastním pohybem, nebo se pohybuje spolu s aktivační směsí.
Zkrápěné biologické kolony
Zkrápěné biologické kolony patří již téměř jedno století k základním reaktorům v technologii
biologického čištění odpadních vod. Dosáhly značného rozšíření, a to od domovních a malých
čistíren až po čistírny velkých měst. Rovněž jsou s úspěchem aplikovány na čištění řady druhů
průmyslových odpadních vod .
Hlavním důvodem jsou jejich následující výhody :
- jednoduchost stavebního provedení a strojního vybavení,
- nenáročnost na obsluhu a údržbu,
- nízká spotřeba energie a nízké provozní náklady,
- dobré zahušťovací vlastnosti přebytečné biomasy, takže odpadají problémy s
vláknitým bytněním.
Konstrukce a princip činnosti.
Konstrukce klasické zkrápěné biologické kolony kruhového půdorysu je znázorněna na obr.
5.12. Těleso kolony je tvořeno obvodovým pláštěm, který byl u kolon s klasickou minerální
náplní zděný nebo betonový. Při použití náplní z plastů, zejména blokových, postačují lehké
konstrukce obvodového pláště ze dřeva, plechu či plastů, a to s kruhovým nebo pravoúhlým
půdorysem. Vlastní náplň kolony spočívá na roštu, jehož otvory může z náplně vytékat čištěná
voda a proudit jimi vzduch do lože a nazpět.
Obrázek 5.12 Schéma zkrápěné biologické kolony
1 - přítok, 2 - odtok, A - středový sloup, B - Segnerovo kolo, C - náplň, D - rošt, E - větrací
otvory, F - obvodový plášť
82
Princip činnosti: Odpadní voda je přiváděna na hlavu kolony, kde je distribučním zařízením
rovnoměrně rozptylována po celém průřezu kolony. Odpadní voda poté stéká po biofilmu na
náplni, přičemž se zachycují částečky nerozpuštěných látek a rozpuštěné látky ve znečištěné
vodě se sorbují na biofilmu, kde jsou dále zpracovány. Po průchodu ložem odtéká odpadní voda
do sběrné jímky, odkud je vedena spolu se strženou biomasou do dosazovací nádrže. Zároveň s
průchodem vody ložem kolony dochází k její aeraci vzduchem ve volném prostoru lože. Lože
kolony musí být tedy dostatečně ventilováno. Ve většině zkrápěných biologických kolon se
výměna vzduchu v loži děje přirozeným komínovým tahem, který vzniká v důsledku různých
teplot vzduchu uvnitř a vně lože.
Způsoby zkrápění
Rovnoměrné rozdělení přiváděné odpadní vody po celém průřezu kolony je základní podmínkou
dokonalého využití kontaktní plochy náplně.
Rozdělování vody na hlavě kolony lze provádět :
a/ pevnými skrápěči (sprchami, tryskami s odraznými destičkami
b/ podélně kývajícími trubkovými skrápěči
c/ rotačními skrápěči s reaktivním pohonem (Segnerovými koly)
d/ rotačními skrápěči s nuceným pohybem
Zkrápění pomocí Segnerova kola se provádí u konstrukcí s kruhovým půdorysem. Segnerovo
kolo (obr. 5.13) je tvořeno jednou či více dvojicemi ramen s otvory vrtanými na protilehlých
stranách. Celá sestava spočívá na ložisku ve středovém sloupu a je volně otočná. Po zavedení
odpadní vody vyvolá proud vody vytékající z ramen skrápěče točivý moment a skrápěč se
roztočí.
Obrázek 5.13 Segnerovo kolo
83
Náplně zkrápěných biologických kolon
Náplň zkrápěných biologických kolon je nosičem fixované biomasy - biofilmu. Mezi hlavní
vlastnosti náplně, které rozhodujícím způsobem ovlivňují funkci kolony patří specifický povrch a
mezerovitost náplně.
84
AUTOTERMNÍ TERMOFILNÍ AEROBNÍ STABILIZACE
(ATAD)
Princip: Teplo potřebné k udržení termofilních podmínek v reaktoru je získáno při
biologickém rozkladu organických látek. Termofilní mikroorganizmy v systému jsou výrazně
aerobní, jejich metabolismus je exotermní, a rychlejší než u ostatních mikroorganizmů. Při
biologické oxidaci organického uhlíku se uvolní 52 až 55 KJ/g C. Tedy při oxidaci 1g
organických látek se uvolní cca 42 kJ tepelné energie při současné spotřebě 1,42 gramů
kyslíku. Za předpokladu 100 % využití tepelné energie a nulového odparu vody dojde při
oxidaci 1 g/l organických látek k vzrůstu teploty 1 l kalu o cca 10 °C, je však nezbytné
započítat i výparné teplo vody, které je 2257 kJ/kg.
Základní podmínky autotermního provozu
• Dostatečně zahuštěný vstupující kal
• Dostatečné množství snadno rozložitelných organických látek v zpracovávaném
materiálu
• Dostatečná tepelná isolace reaktoru, rekuperace tepla
• Efektivní míchání
• Efektivní aerace
Bilance tepla
HB + HM = HZO + HG + HP + HV
kde:
HB – teplo produkované biologickou oxidací
HM – tepelná energie z mechanického míchání
HZO – ztráty tepla odtokem
HG – ztráty tepla v odtahovaných plynech
HP – ztráty tepla povrchem reaktoru
HV – latentní teplo vodní páry
Teoreticky dosažitelná teplota ATAD závisí především na koncentraci kalu na způsobu
okysličování, zad použijeme vzduch nebo čistý kyslík. Při koncentraci kalu 6 % sušiny se
dosáhne za použití vzduchu 44 °C, za použití čistého kyslíku 83 °C. S kalem o koncentraci
3% sušiny lze dosáhnout pouze 24 °C se vzduchem a 44 °C s čistým kyslíkem.
Návrhové parametry termofilní aerobní stabilizace: vstupní sušina kalu 4-6%, obsah
organických látek v sušině minimálně 60%, doba zdržení 5-9 hod., dodávka vzduchu 4-6
m3/m3 h. Optimální teplotní rozmezí je 55 až 60°C, kdy vedle odstraňování zápachu dochází i
k devitalizaci pathogenních mikroorganizmů. Za těchto podmínek se předpokládá účinnost
odstranění organických látek v rozmezí 25-65%. Schéma procesu je patrné z obrázku 7.
Produktem autotermní aerobní stabilizace je stabilizovaný a hygienizovaný kal třídy A, který
lze odvodnit na sušinu 25-30%. Celý technologický systém je nutno zabezpečit proti úniku
zápachu, všechny odpadní plyny vyžadují čištění – odpachování.
85
Vs tup
kalu
Č iš tění p lynů o d p ac ho vání
Zahuš ťo vání
Zás o b ník
kalu
R eakto r 1
R eakto r 2
Výměník
tep la
O d vo d ňo vání
Zás o b ník
Zás o b ník
S tab ilizo vaný
materiál
Obrázek 7. Schéma konfigurace ATAD
86
KOMPOSTOVÁNÍ
Kompostování řízený proces při kterém jsou organické látky biologicky, za aerobních
podmínek rozloženy na stabilizovaný materiál – kompost, který již není nebezpečný pro
životní prostředí a může být přímo použit ke kondicionaci půdy.
Výhody:
• Skladovatelný produkt
• Možnost prodeje
• Kompostování organických materiálů může být kombinováno s dalšími procesy
• Nízké náklady v porovnání se spalováním
Nevýhody:
• Organický materiál pro kompostování musí být odvodněný min. na 18-30% sušiny
• Potřeba přídavného materiálu
• Potřeba velké plochy
• Proces kompostování je potenciálním zdrojem zápachu a bioaerosolů.
Popis procesu:
Materiál určený ke kompostování ( biologicky rozložitelné odpady, odvodněný čistírenský kal
a pod.) se míchá s další doplňkovým organickým materiálem. Doplňkový materiál je nutný
pro nastavení obsahu vody a/nebo jako zdroj uhlíku pro úpravu energetické bilance a poměru
C/N. Jako doplňkový přídavný materiál lze použít: piliny, slámu všeho druhu, seno, trávu,
kůru, štěpky apod.
V průběhu kompostování dochází k rozkladu organických látek, především snadno
rozložitelné. Konečnými produkty rozkladu jsou především H2O, CO2, vzniklá biomasa a
stabilizovaný kompost. Část energie uvolněné při rozkladu se přemění na teplo. Teplota při
nekontrolovaném procesu kompostování může vzrůst na 70-80°C. Hlavními destruenty jsou
bakterie zpracují 80-90% organické hmoty zbytek actinomycety a houby. Bakterie vydrží
teplotu do 75°C, actinomycety 65°C, houby 60°C.
Dobrý průběh procesu kompostování závisí především na biologické rozložitelnosti
zpracovávaného a přídavného materiálu, teplotě, obsahu vody, struktuře materiálu, poměru
C/N, pH a na přítomnosti kyslíku (aeraci).
Obsah vody. Minimální obsah vody pro dobrý průběh mikrobiálních procesů je 12-25%.
Optimální obsah vody v kompostovaném kalu závisí od druhu a sušiny přídavného materiálu
a pohybuje se okolo 55-60% (tj. 40-45% sušiny). Finální kompost má mít obsah vody 4045%. (při plnění do pytlů 35%). Obsah vody se v průběhu procesu mění: vznik vody při
rozkladu organických látek, odpar v závislosti na teplotě a intenzitě aerace. Schéma
uspořádání procesu kompostování kalů je uvedeno na obrázku 8.
Kyslík – aerace. Pro dobrý průběh aerace je potřebná dostatečná porozita vsádky 20-30%.
Nejvyšší potřeba kyslíku jev první fázi procesu. Kyslík se dodává přirozenou ventilací
(difúze) nebo nucenou aerací. Obsah kyslíku v odplynu 5-18%.
Teplota. Nárůst teploty při kompostování závisí na energetické bilanci celého systému, na
složení a velikosti vsádky, aeraci a izolaci. Optimální teplota v první fázi kompostování je cca
87
55°C. Při teplotě nad 60°C dochází k významné redukci druhu mikroorganizmů. Při 70°C je
celková aktivita mikroorganizmů pouze 10-15% aktivity při 60°C. Při 75-80°C biologická
aktivita ustává.
Poměr C/N. Vhodný poměr C/N je 20:1 až 30:1 pro většinu případů. Větší důležitost má
dostupnost C a N. Při vysokém poměru C/N klesá rychlost rozkladu. Při nízkém poměru C/N
dochází k uvolňování amoniaku.
Technologické uspořádání
Proces kompostování sestává ze tří fází:
• rychlý rozklad (teplota 50-70°C, destrukce patogenů, úbytek hmoty) – „čerstvý
kompost“
• stabilizace - teplota klesá, „čerstvý kompost“ přechází na „aktivní kompost“,
pokračuje stabilizace.
• zrání – teplota klesá na teplotu prostředí, procesy „huminifikace“ pokračují – „hotový
kompost“
Zpracovávaný
materiál
Drcení a
mísení
Přídavný
materiál
Kompostování
Kompost
Prosévání
Recirkulace
kompostu
Skladování
Recirkulace
přídavného
materiálu
Obrázek 8. Schéma uspořádání procesu kompostování kalů
Kompostovací systémy
Otevřené podélné hromady . tvar hromady trojuhelník nebo trapezoid, šířka 3,7-4,9 m, výška
1,4-1,7 m, délka proměnná, nucené provzdušňování, strojové překopávání. Doba zdržení 8-12
týdnů. Pro konečné dozrání se doporučuje doba zdržení až 10 měsíců. Nebezpečí úniku
zápachu.
Otevřená nepřekopávaná hromada. potřeba větří porovitosti materiálu, typické rozměry –
základna 12-15 m, výška 3 m. Doba zdržení – fáze aerace 14-28 dní, zrání nejméně 30 dní.
Kryté systémy – podobné uspořádaní jako otevřené. Výhoda – využití tepla z odplynů,
zabránění úniku zápachu.
Nevýhoda – voda kondenzuje na stropě a stěnách – nebezpečí koroze.
Uzavřené reaktorové systémy lepší řízení procesu (aerace, teplota, vlhkost). Horizontální
„tunely“, kontejnery o objemu 50-60 m3 (7 x 3 x 3 m) až 250 m3 , vertikální reaktory.
88
ANAEROBNÍ ČISTÍRENSKÉ PROCESY
Princip anaerobního rozkladu, jeho fáze, mikroorganismy jednotlivých fází.
Anaerobní methanová fermentace je proces, během kterého směsná kultura mikroorganismů
postupně rozkládá za anaerobních podmínek biologicky rozložitelnou organickou hmotu.
Výslednými produkty tohoto rozkladu je bioplyn (methan, oxid uhličitý, sulfan, dusík, vodík)
a stabilizovaný kal, což je za daných podmínek již nerozložitelný zbytek organických látek,
anorganický podíl vstupních kalů a v procesu vzniklá anaerobní biomasa.
Anaerobní methanová fermentace organických materiálů - methanizace - je souborem procesů
při nichž směsná kultura mikroorganismů postupně rozkládá biologicky rozložitelnou
organickou hmotu bez přístupu vzduchu. Konečnými produkty jsou vzniklá biomasa, směs
plynů (CH4, CO2, H2, N2, H2S) a nerozložený zbytek organické hmoty, který je již z hlediska
hygienického a senzorického nezávadný pro prostředí, tj. je již stabilizován.
Methanová fermentace je tedy soubor několika dílčích, na sebe navazujících procesů, na
kterých se podílí několik základních skupin anaerobních mikroorganismů. Produkt jedné
skupiny mikroorganismů se stává substrátem skupiny druhé a proto výpadek jedné skupiny
může způsobovat poruchy v celém systému.
V prvním stadiu rozkladu - hydrolýze - jsou rozkládány makromolekulární rozpuštěné i
nerozpuštěné organické látky (polysacharidy, lipidy, proteiny) na nízkomolekulární látky
rozpustné ve vodě pomocí extracelulárních hydrolytických enzymů, produkovaných hlavně
fermentačními bakteriemi. Vznikající nízkomolekulární látky jsou na rozdíl od
vysokomolekulárních schopny transportu dovnitř buňky.
Produkty hydrolýzy, nízkomolekulární látky, jsou uvnitř buňky během druhé fáze acidogeneze - rozkládány dále na jednodušší organické látky (kyseliny, alkoholy, CO2, H2).
Fermentací těchto látek se tvoří řada konečných redukovaných produktů, které jsou závislé na
charakteru počátečního substrátu a na podmínkách prostředí. Při nízkém parciálním tlaku
vodíku jsou produkovány kyselina octová, H2 a CO2, při vyšším jsou tvořeny vyšší organické
kyseliny, mléčná kyselina, etanol apod.
V dalším stadiu rozkladu - acetogenezi - probíhá oxidace těchto látek na H2, CO2 a kyselinu
octovou. Ta je také tvořena acetogenní respirací CO2 a H2 homoacetogenními
mikroorganismy. Účast acetogenních mikroorganismů produkujících vodík na rozkladu je
nezbytná, poněvadž katabolizují propionovou kyselinu a ostatní organické kyseliny vyšší než
octovou, alkoholy a některé aromatické sloučeniny.
V posledním stadiu - methanogenezi - dochází pomocí methanogenních mikroorganismů k
rozkladu jejich substrátů, kterými jsou některé jednouhlíkaté látky (metanol, kyselina
mravenčí, methylaminy, CO2, CO, H2) a kyselina octová.
Methanogenní mikroorganismy jsou nejdůležitější trofickou skupinou, mají vysoce specifické
požadavky na substrát i životní podmínky a vedle acetogenů zpracovávajících kyselinu
propionovou se často stávají limitujícím faktorem celého procesu. Podle substrátové specifity
je možno je rozdělit na pouze hydrogenotrofní, pouze acetotrofní a obojetné.
Acetotrofní methanogenní bakterie mají v procesu velmi důležitou úlohu, protože jejich
působením vzniká více jak 2/3 methanu v bioplynu. Rozkládají kyselinu octovou na směs
methanu a oxidu uhličitého. Jsou schopny udržovat pH fermentačního média, protože
89
odstraňují kyselinu octovou a produkují CO2 ale ve srovnání s hydrogenotrofními
methanogeny pomaleji rostou (generační doba několik dnů).
Hydrogenotrofní methanogenní bakterie produkují methan z vodíku a oxidu uhličitého.
Rostou poměrně rychle, jejich generační doba je cca 6 hodin. V anaerobním procesu tyto
vodíkové methanogeny působí jako samoregulátor. Odstraňují ze systému téměř všechen
vodík. Koncentrace vodíku v kapalné fázi při dobré činnosti hydrogenotrofních
methanogenních bakterií by měla být minimální, akumulace vodíku v plynu je způsobena buď
přetížením anaerobního reaktoru nebo inhibicí těchto methanogenů.
V rámci čtyř hlavních souborů biochemických reakcí - hydrolýzy, acidogeneze, acetogeneze a
methanogeneze - je možno rozlišit minimálně devět různých metabolických fází procesu s
odpovídajícími skupinami bakterií, které jsou vzájemně propojené svými specifickými
substráty a produkty.
Bioplyn.
Bioplyn je produktem procesu methanizace - anaerobního rozkladu organických látek, anaerobní
stabilizace kalů a anaerobního čištění odpadních vod. Vzhledem k vysokému obsahu methanu je
cennou energetickou surovinou.
V našich klimatických podmínkách je považován, z hlediska ekologického a ekonomického, za
vedlejší produkt procesu. Hlavním cílem methanizace je likvidace organického znečištění a
stabilizace organické hmoty a to z hlediska ochrany životního prostředí, přitom se odstraněné
organické znečištění přeměňuje na využitelnou energii – bioplyn. Bioplyn patří mezi obnovitelné
zdroje energie, proto se v poslední době stále více zaměřují bioplynové stanice na výrobu
energie. K tomuto účelu se používá různého odpadového nebo méně hodnotného organického
materiálu.
Složení a vlastnosti bioplynu.
Bioplyn se skládá převážně z CH4 a CO2 a menšího množství H2, N2, H2S. Při výstupu z
methanizačního reaktoru obsahuje ještě určité množství vody (3-4%) a může obsahovat stopová
množství amoniaku, mastných kyselin aj. Bioplyn z dobře pracujících reaktorů obsahuje 65-75%
CH4 a 25-35% CO2. Složení bioplynu závisí na složení substrátu a na podmínkách procesu.
Specifickou produkci bioplynu, obsah methanu a výhřevnost bioplynu při rozkladu tří
nejdůležitějších skupin organických látek - tuků, bílkovin a sacharidů a několika komplexních
substrátů uvádí následující tabulka:
Specifická produkce bioplynu.
Látka
tuky
sacharidy
bílkoviny
čistírenský kal
prasečí exkrementy
odpadní vody zvýroby pektinu *)
odpadní vody zvýroby droždí *)
Specifická produkce
bioplynu (Nm3 plynu
kg-1 rozložené látky)
1,125-1.515
0,79 - 0,875
0,56 - 0,75
0,80 - 1,30
1,07
0,56
0,5 - 0,7
Obsah CH4
v plynu
(% )
62-67
50
71 - 84
65 - 75
64 - 70
cca 50
66 - 71
Výhřevnost
(MJ Nm-3)
cca 23,45
17,76
cca 24,87
cca 23,0
cca 22,0
cca 17,0
cca 22,0
*) pozn.: vztaženo na CHSK
90
Vlastnosti bioplynu.
Vlastnosti
průměrný obsah obj. %
třaskavá směs - obj.%
ve směsi se vzduchem
zápalná teplota
°C
kritický tlak
MPa
kritická teplota
°C
hustota
kg m-3
směs (65% CH4
a 35% CO2)
Hlavní složky bioplynu
CH4
55 - 75
5 - 15
CO2
24 -44
-
H2S
0.1 - 0,7
4 -45
100
6 - 12
100
4,7
-81,5
0.72
7,5
31,0
1,98
270
9,0
100
1,54
650 - 750
7,5 - 8,9
-82,5
1,2
Využití bioplynu.
Vysoký obsah methanu a tím i vysoká výhřevnost (17,8-25 MJ m-3) řadí bioplyn mezi ušlechtilé
zdroje energie. Bioplyn se z methanizačních reaktorů odvádí do nízkotlakého plynojemu a odtud
se potom rozvádí k dalšímu zpracování. Část bioplynu se zužitkovává k vyhřívání
methanizačních nádrží a pro další tepelné hospodářství čistírny odpadních vod. Spotřeba
bioplynu závisí na druhu procesu (čištění odpadních vod, stabilizace kalů), na teplotě a na
koncentraci zpracovávaného materiálu. Zbývající část energie se využívá k výrobě tepla pro
vytápění, na výrobu teplé vody, sušení a pod., zbytek bioplynu se spaluje na hořácích
zbytkového plynu.
Za nejefektivnější se v současné době považuje využití bioplynu pro pohon spalovacích motorů
spojených s agregátem na výrobu elektrické energie, tj. kogenerační výroba elektrické energie a
tepla. V kogeneračních jednotkách se z 1m3 bioplynu vyrobí cca 2,2 kWh elektrické energie a
3,6 KWh tepelné energie, přitom celkové využití energie z bioplynu činí až 90%.
Čištění bioplynu
Bioplyn v závislosti na fermentovaném materiálu může vedle svých hlavních složek methanu
a oxidu uhličitého obsahovat i další nežádoucí příměsi. Nejvíce nečistot obsahuje bioplyn ze
skládek tuhých odpadů jsou to především sulfan, vyšší uhlovodíky, aromáty, chlorované
uhlovodíky, alkoholy, ketony a někdy i dioxiny. Nejčistší bioplyn je produkován při
anaerobní stabilizaci čistírenských kalů a anaerobním čištění odpadních vod, který kromě
sulfanu prakticky neobsahuje jiné nečistoty. Obsah sulfanu v bioplynu z anaerobní stabilizace
městských kalů se pohybuje okolo 0,1% obj., v bioplynu z anaerobního zpracování prasečí
kejdy okolo 0,5% obj.. U bioplynu z anaerobního čištění odpadních vod obsah sulfanu závisí
hlavně na koncentraci síranů v čištěné vodě.
Pro některé způsoby využívání bioplynu je často nutné předem odstranit sulfan. Toho lze
dosáhnout buď úpravou podmínek v reaktoru (dostatečná neutralizační kapacita, přítomnost
těžkých kovů, přídavek železnatých iontů a pod.) nebo vlastním čištěním bioplynu. Pro
odstraňování sulfanu z bioplynu se používá řada metod, většinou stejných jako v plynárenství.
Z nových metod je možno připomenout biologickou metodu odstraňování sulfanu, kdy se k
bioplynu přidává cca 5% vzduchu a tato směs se vede přes biofilmový reaktor. Sulfan je
oxidován na síru, která vypadává v reaktoru.
91
Stanovení maximální teoretické výtěžnosti methanu
Výtěžnost methanu závisí na druhu substrátu, zejména na jeho oxidačním stupni, tj. na
množství dostupných elektronů, které má molekula substrátu k dispozici. Měřítkem
oxidačního stupně organické látky je např. průměrné oxidační číslo uhlíkového atomu POXČ.
Čím je POXČ nižší, tím je výtěžnost methanu vyšší. Mezní hodnoty dosahují sloučeniny CO2
(POXČ = + 4 ) a CH4 (POXČ = - 4). Z hmotnostně energetické bilance procesu [1] vyplývá,
že POXČ je úměrné teoretické chemické spotřebě kyslíku dané látky vztažené na množství
organického uhlíku: POXČ = 4 - 1,5*CHSK/Corg .
Z hmotnostně energetické bilance procesu [1] vyplývá, že teoretická hodnota CHSK
vzniklého methanu je rovna teoretické CHSK původního substrátu. Z toho plyne, že
maximální teoretická výtěžnost methanu je daná vztahem:
CHSKsubstrátu = CHSKmethanu
(1)
Skutečná výtěžnost methanu je nižší, protože: a) CHSK zahrnuje i část CHSK biologicky
nerozložitelnou, b) část CHSK se spotřebuje na růst nové biomasy.
Přesnější je bilance odstraněné CHSK:
CHSKodstraněná = CHSKmethanu + CHSKbiomasy
(2)
kde
CHSKodstraněná - skutečně odstraněná (tj. biologicky rozložená) část substrátu v průběhu
methanizace
CHSKmethanu
- množství vzniklého methanu vyjádřeno v CHSK
CHSKbiomasy - představuje část substrátu spotřebovanou na růst a krytí energetických
nároků biomasy.
Ze vztahu (2) můžeme na základě provedeného pokusu stanovit produkci biomasy.
Maximální teoretickou výtěžnost methanu vyjádřenou jako hmotnostní množství methanu na
hmotnostní jednotku přivedeného substrátu YCH4/s spočítáme ze stanovené nebo vypočítané
CHSK podle vztahu:
YCH4/s = 0,25 CHSK [g g-1], (CH4, substrát)
(3)
Pro rychlejší orientaci v přepočtech methanu a CHSK jsou uvedeny v tabulce 1 přepočtové
koeficienty:
Tabulka 2. Přepočtové koeficienty mezi CH4 a CHSK
1 mol CH4
1 g CHSK
1g CH4
1 l CH4
2 moly O2
64 g CHSK
22,4 l *)
0,25 g CH4
0,35 l CH4 *)
4 g CHSK
1,4 l *)
2,857 g CHSK
*) za standardních podmínek
92
V případě přítomnosti dalších prvků v molekule substrátu, např. dusíku a síry, které v
oxidoredukčních reakcích jsou akceptory volných elektronů, dochází ke snížení množství
volných elektronů pro tvorbu methanu a tím ke snížení výtěžnosti methanu. V případě
přítomnosti významnějšího množství dusitanů, dusičnanů nebo sloučenin síry v substrátu je
nutno výtěžnost methanu korigovat o kyslíkový ekvivalent uvedených sloučenin. Maximální
produkce methanu z obecného substrátu je pak dána vztahem:
YCH4/s = 0,25 (CHSK - N - S) [g g-1], (CH4, substrát)
(6)
YCH4/s = 0,35 (CHSK - N - S) [l g-1], (CH4, substrát)
(7)
nebo
kde
N - je kyslíkový ekvivalent dusičnanového a dusitanového dusíku,
N = 2,86 (NO2-N + NO3-N) [g] (O2, CHSK);
S - je kyslíkový ekvivalent síry,
S = 2 (Scelková) [g] (O2, CHSK);
Možnosti použití anaerobních technologií.
Methanizace (anaerobní fermentace) je nejrozšířenějším způsobem stabilizace čistírenských
kalů, stále více se jí využívá pro zpracování různých zemědělských "odpadů" (jako např.
exkrementy hospodářských zvířat, různé organické zbytky rostlinného i živočišného původu a
pod.) a v poslední době se vyvíjejí metody pro anaerobní stabilizaci tuhých městských odpadů
a pro anaerobní způsoby čištění odpadních vod. Anaerobní procesy stabilizace organických
látek jsou nejdůležitějšími procesy probíhajícími uvnitř skládek v nichž se nalézají biologicky
rozložitelné organické látky. Celková produkce bioplynu z čistíren odpadních vod a
bioplynových stanic v ČR se odhaduje na cca 20 milionů m3 za rok. U skládek tuhých odpadů
lze očekávat denní produkci bioplynu 7 až 20 tisíc m3 na milion tun pevného odpadu.
Anaerobní rozklad organických látek je ovlivňován řadou faktorů, které buď mění přímo životní
prostředí mikroorganismů (což je např. teplota, pH, nutrienty, toxické látky), nebo musí být
brány v úvahu při návrhu a posuzování anaerobního reaktoru (doba zdržení, zatížení).
Většina anaerobních methanizačních nádrží v Evropě zpracovává pouze samotné kaly, další
velká část zpracovává exkrementy hospodářských zvířat. Organická frakce tuhého odpadu je
anaerobně zpracovávána v Evropě pouze na několika lokalitách (bioplynových závodech),
buď samostatně nebo ve směsi s čistírenskými kaly, nebo kejdou. V blízké budoucnosti se
očekává významný rozvoj bioplynových závodů zejména z těchto důvodů:
- skládkování a spalování se stává z ekologických a ekonomických hledisek méně atraktivním
- vyvážení odpadů do moře je už zakázané
- intenzívní obdělávání půdy vyvolává potřebu zvyšování humusu v půdě
- využívání produkované energie kompenzuje náklady na zpracování
Anaerobní fermentace je investičně nákladnější než kompostování, její předností je produkce
energie, zmenšení potřebného prostoru a zlepšená kontrola zápachu.
Protože obsah organické frakce tuhého domovního odpadu je kvalitativně i kvantitativně
proměnlivý, proměnlivé je i množství a složení bioplynu. Průměrná produkce bioplynu se
pohybuje od 100 do 125 m3 bioplynu na tunu zpracovaného odpadu. Obsah methanu se
pohybuje okolo 55 %.
93
Čistírenské kaly (primární, aktivovaný) se ve větších čistírnách zpracovávají anaerobní
stabilizací - methanizací. Methanizace je soubor procesů, při nichž směsná kultura
mikroorganismů postupně rozkládá biologicky rozložitelnou organickou hmotu bez přístupu
vzduchu. Konečnými produkty jsou vzniklá biomasa, plyny (CH4, CO2, H2, N2, H2S) a
nerozložený zbytek organické hmoty, který je již z hlediska hygienického a senzorického
nezávadný pro prostředí, tj. je již stabilizován. Anaerobní stabilizace je relativně
nejdokonalejší způsob stabilizace kalů, přičemž současně dochází i k hmotnostnímu a
objemovému úbytku organické hmoty uvolněním velké části organického uhlíku v plynné
formě (CO2 ,CH4) a uvolněním vody, původně vázané chemicky i fyzikálně. Dochází k
potlačení ostatní flóry a fauny, která byla v kalu přítomna. Snížen je výskyt pathogenních
mikroorganismů.
Příklady aplikace anaerobních technologií
Anaerobní stabilizace čistírenských kalů
Organické kaly (primární, aktivovaný) se ve větších čistírnách zpracovávají methanizací. Je to
relativně nejdokonalejší způsob jejich stabilizace, přičemž současně dochází i k
hmotnostnímu a objemovému úbytku organické hmoty uvolněním velké části organického
uhlíku v plynné formě (CO2, CH4) a uvolněním vody, původně vázané chemicky i fyzikálně.
Dochází k potlačení ostatní flóry a fauny, která byla v kalu přítomna. Snížen je výskyt
pathogenních mikroorganismů.
V surovém kalu z městských čistíren odpadních vod je poměr organických látek v sušině k
anorganickým přibližně 2:1, po methanizaci klesne tento poměr na 1:1. Předpokládá se , že
při methanizaci surového kalu klesne obsah organické sušiny o 45-65%. Typický surový kal z
městské čistírny obsahuje kolem 5% sušiny (z toho asi 70% látek organických), po
methanizaci a oddělení kalové vody má asi 7-10% sušiny (z toho asi 50% látek organických).
Změny ve složení kalů v průběhu methanizace vysvětluje obrázek 4.
Bioplyn
40 kg
Organické
látky
70 kg
Anorg.
látky
30 kg
Organické
látky
30 kg
Anorg.
látky
30 kg
Surový kal 100 kg
organická sušina
70%
Anaerobně stabilizovaný
kal 60 kg,
organická sušina 50%
Obrázek 4. Bilanční schéma anaerobní stabilizace kalů
94
Účinnost anaerobní stabilizace kalů se hodnotí podle skutečného úbytku organické sušiny
kalu. Lze ji vypočítat z bilance celkové sušiny kalu a organické sušiny surového kalu a kalu
po methanizaci. Za anaerobně stabilizovaný kal lze považovat kal, ve kterém již neprobíhají
intenzivní biologické pochody, působící senzorické a hygienické problémy. Zbylé organické
látky jsou již velmi obtížně a pomalu rozložitelné nebo nerozložitelné. V praxi se za dobře
stabilizovaný kal považuje takový, ve kterém obsah organických látek byl snížen pod hodnotu
50%.
Hlavní přednosti anaerobní stabilizace kalů před ostatními metodami zpracování kalů jsou:
1) Proces anaerobní stabilizace je díky produkci bioplynu energeticky aktivní. Takto získaná
energie postačuje na plné pokrytí energetických požadavků vlastního procesu (ohřev
reaktorů, míchání). Nadbytečná energie významně vylepšuje energetickou bilanci celé
čistírny odpadních vod (vytápění budov, ohřev teplé vody, elektrická energie pro pohon
různých zařízení).
2) V procesu anaerobní stabilizace dochází v důsledku konverze organických látek na
bioplyn, ke značnému snížení sušiny kalu, přibližně o 45-65% proti surovému kalu. To má
za následek snížení nákladů na další zpracování kalu.
3) Anaerobně stabilizovaný kal je výborným prostředkem k hnojení a zlepšení struktury
půdy. Anaerobní stabilizací se odstraní nepříjemný zápach surového kalu.
4) Při anaerobní stabilizaci dochází k částečné hygienizaci kalu - převážná část patogenů je
průběhem procesu zničena.
Mezi nevýhody patří:
Relativně vysoké investiční náklady.
Dlouhá doba zdržení v anaerobních reaktorech.
Kalová voda po odvodnění anaerobně stabilizovaného kalu je značně znečištěna
rozpuštěnými i nerozpuštěnými organickými i anorganickými látkami a vyžaduje
samostatné čištění.
Současný stav technologie.
V čistírnách městských odpadních vod se vždy zpracovává směs primárního kalu a
přebytečného aktivovaného kalu. Přebytečný aktivovaný kal se vede zpravidla z dosazovací
nádrže do nádrže zahušťovací, kde se míchá s primárním kalem, zde dochází k zahuštění
sušiny kalu na požadovanou hodnotu. Zahušťovací nádrž má současně funkci zásobníku
surového kalu pro methanizaci, v současné době se přebytečný aktivovaný kal často zahušťuje
zvlášť na strojovém zahušťovacím zařízení. Surový kal je semikontinuálně (v pravidelných
intervalech) nebo kontinuálně přidáván do methanizační nádrže za současného odběru
methanizovaného kalu a kalové vody.
V současné době se provozují dva způsoby mezofilní methanizace kalu (standardní, nízko
zatížená) a termofilní metalizace (vysoko zatížená). Rozdíly jsou patrny z tabulky 4.
U nás se ve zatím většině případů provozuje mezofilní methanizace při teplotách 30-35 °C.
Vzhledem k intenzitě anaerobních procesů, se pracuje ve dvou stupních. První stupeň je
vyhřívaný a míchaný a slouží jako anaerobní reaktor, ve kterém probíhá vlastní proces
methanizace. Druhý stupeň slouží jako uskladňovací nádrž, ve které doznívají methanizační
95
pochody a dochází k oddělení kalu od kalové vody. Kalová voda je vrácena do aktivační
nádrže a stabilizovaný kal se vede k odvodnění.
parametr
rozměr
teplota
doba zdržení
zatížení
pH
oxidačně-redukční
potenciál
míchání
počet stupňů
°C
dny
kg.m-3.d-1
(mV)
mezofilní
methanizace
35 - 42
20 - 30
0.5 - 1.5
6,8 -7,4
-520 do -530
termofilní
methanizace
55 - 60
10 - 15
2-5
6,4 -7,8
-490 do -550
přetržité
1 nebo 2
kontinuální
s výhodou 2
Tabulka 4. Základní provozní parametry methanizační nádrže.
Hlavní kritéria pro racionální navrhování methanizačních reaktorů jsou založena na době
zdržení a požadovaném snížení obsahu organických látek v kalu. Reaktory pro anaerobní
stabilizaci kalů pracují na principu chemostatu, tudíž je u nich stejná doba zdržení biomasy
jako hydraulická doba zdržení zpracovávaného kalu. Mezi hlavní provozní návrhová kritéria
tedy patří - doba zdržení v reaktoru, zatížení, teplota a míchání. (Dohányos a kol.1998;
Malina a Pohland, 1992).
Doba zdržení.
Stanovení doby zdržení z těchto požadavků:
dodržení potřebné doby pro růst mikroorganismů - generační doba např. acetotrofních
methanogénů je 7 - 10 dní (pro stabilní provoz biologických reaktorů by měla být
doba zdržení rovna minimálně dvojnásobku generační doby mikroorganismů).
doba zdržení musí být tak dlouhá, aby došlo k rozložení požadovaného množství
přivedených organických látek, tj. závisí kinetice procesu a na zatížení
Dolní limit doby zdržení je stanoven z hlediska potřebné generační doby methanogénních
mikroorganismů protože při nižší době zdržení než je generační doba dochází k vyplavení
biomasy z reaktoru
Horní hranice doby zdržení je dána velikostí zatížení a dosažením potřebné účinnosti
rozkladu.
Vliv koncentrace kalu - zatížení.
Pro danou dobu zdržení bude zatížení reaktoru záviset na koncentraci vstupujícího materiálu.
To jest, čím vyšší bude koncentrace vstupujícího kalu při dodržení požadovaného zatížení,
tím bude potřebný menší objem reaktoru. Koncentrace vstupujícího materiálu ovlivňuje
potřebný objem reaktoru a také ekonomiku reaktoru (ohřev balastní vody). Limitujícím
faktorem pro navrhování velikosti reaktoru je koncentrace surového kalu před vstupem do
reaktoru, respektive schopnost zahuštění surového kalu (primárního, nebo sekundárního).
Vliv teploty
Jak již bylo uvedeno teplota při mezofilní metalizaci se udržuje v rozmezí 35-42°C, u
mezofilní 55-60°C. Pro stabilní provoz anaerobních reaktorů je důležité, aby teplota v
reaktoru byla udržována na konstantní hodnotě, silné kolísání nebo náhlé změny mohou
přivodit nestabilitu až zhroucení procesu.
V současné době se stále více prosazuje ve světě i u nás termofilní anaerobní stabilizace, která
má oproti mezofilní řadu předností:
96
•
•
•
•
zvýšení rychlosti rozkladu organických látek v kalu,
zvýší se účinnost procesu tím, že se prohloubí rozklad organických látek, tím se zvýší
produkce bioplynu,
zvýšená teplota má hygienizační účinek (stabilizovaný kal dosahuje třídy „A“,
odstraní problémy s pěněním metanizačních nádrží.
Míchání
Účelem míchání anaerobních reaktorů je udržení homogenního prostředí uvnitř reaktoru.
míchání zabezpečuje dobrý kontakt aktivní biomasy s přivedeným substrátem,
zamezuje místnímu přetížení, zlepšuje odvod reakčních zplodin.
mícháním se udržuje stejnoměrná teplota v celém objemu reaktoru, což je důležité k
udržení dynamické rovnováhy probíhajících procesů.
rychlým rozmícháním vstupujícího materiálu dochází k minimalizaci vlivu eventuálně
přítomných toxických látek.
míchání působí proti tvorbě tzv. kalové deky v reaktoru a zamezuje tvorbě sedimentů
na dně reaktoru.
hlavní nevýhodou míchaného reaktoru jsou náklady na míchání reaktoru
Anaerobní reaktory pro stabilizaci kalů.
Nejstarším typem methanizačních nádrží u nás jsou dvouúčelové nádrže zavedené Imhoffem,
správně nazývané štěrbinové nádrže. Štěrbinová nádrž je konstruována tak, že v horní části
dochází k sedimentaci kalu a odsazený kal propadá štěrbinou do methanizačního prostoru,
kde dochází k jeho stabilizaci. Poměr sedimentačního a methanizačního prostoru se pohybuje
od 1:3 do 1:5 podle velikosti nádrže (obr. 5A). Bioplyn je jímán v jímacím zvonu nebo
odpouštěn do atmosféry. S jeho využitím se nepočítá. Stabilizovaný kal se v určitých
časových intervalech (zpravidla několikrát ročně) odčerpává. Tyto nádrže jsou nevytápěné a
jsou vhodné pro malé ČOV.
U starších konstrukcí se můžeme setkat s nádržemi s „nasazeným plynojemem“ (B).
Plynojem je často instalován na reaktor druhého stupně (např. pražská ČOV). Moderní
konstrukce methanizačních nádrží vychází z požadavku maximální úspory tepla při provozu
nádrže. Z hlediska dobrého využití tepla je výhodný co největší objem nádrže, protože s
rostoucím objemem relativně klesá povrch nádrže a tím i možné ztráty tepla. Velikost nádrží
je však omezena možností stavební výroby. U velkých čistíren se pak staví několik nádrží,
které se provozují paralelně. Z hlediska minimálního povrchu nejlépe vyhovuje tvar kulový.
Tento má však řadu provozních nevýhod. Proto jako nejvhodnější se ukazuje nádrž vejčitého
tvaru s kuželovým hrdlem (F). Menší reaktory se pak budují jako kombinace válce s kuželem
(C). Další ze speciálních konstrukcí anaerobních reaktorů pro stabilizaci kalů je
vícekomorový tzv. „pulzační” reaktor BIMA firmy ENTEC. Míchání v reaktoru je
zabezpečeno pulzací obsahu reaktoru, způsobenou střídáním tlaku bioplynu v jednotlivých
komorách reaktoru.
97
Obrázek 5. Typy anaerobních reaktorů pro zpracování materiálů v suspenzi
A – historická štěrbinová (Imhoffova) nádrž
B – nádrž s nasazeným plynojemem
C – železobetonová nádrž stojatá válcová s kónickými dny
D – pneumaticky míchaná dvojitá nádrž
E – pulzační nádrž systém BIMA
F – nádrž vejčitá s přepadovou komorou
G – válcová nádrž s programově řízenými míchacími sektory (pohled shora)
H – horizontální nádrž s rotačním míchadlem
Způsoby míchání methanizačních nádrží
a) mechanické - různé druhy míchadel, turbin, vrtulových čerpadel a pod (obr 6a).
b) míchání recirkulací kalu. Kalovými čerpadly různých typů a konstrukcí umístěných uvnitř
nebo vně nádrže (obr 6b)..
c) Míchání recirkulací plynu(obr 6c) Bioplyn je čerpán z plynového prostoru a pod tlakem
vháněn do různých míst nádrže tak, aby došlo k dokonalému promíchání to se provádí:
- přímým vháněním stlačeného bioplynu do reaktoru jednou nebo více trubkami
- různými zařízeními na principu mamutek
- vháněním stlačeného plynu do systému difuzorů, umístěných na dně nebo po obvodu
nádrže.
Dobré promíchání je dosažitelné při spotřebě energie 5 - 8 Wm-3 reaktoru při míchání plynem
to odpovídá 0,27 - 0,42 m3 bioplynu na m3 reaktoru za hodinu
98
a)
c)
b)
3
1
2
1
1
2
4
d)
4
e)
f)
Obrázek 6. Způsoby míchání a vytápění methanizačních nádrží.
a - míchání turbínou, b - míchání recirkulací směsi, c - míchání recirkulací plynu, d - vytápění
vnitřním výměníkem tepla, e - vytápění vnějším výměníkem tepla, f - vytápění přímou párou, 1
- kotel, 2 - výměník tepla mezi vodou a kalem, 3 - parní ejektor, 4 -přívod surového kalu
Způsoby vytápění methanizačních nádrží:
a) teplou vodou nebo párou a topnými tělesy uvnitř nádrže (obr 6d).
b) teplou vodou nebo párou ve výměnících tepla vně nádrže. Ohřívá se recirkulovaný a surový
kal (obr 6e).
c) přímým injektováním vodní páry, buď přímo do nádrže nebo do recirkulovaného kalu (obr
6f).
d) ponořenými plynovými hořáky (k ohřívání surového kalu).
Teplo potřebné k ohřevu reaktorů
Teplo potřebné k udržování provozní teploty v reaktorech je dáno:
• teplem potřebným k ohřátí vstupujícího materiálu
• teplem pro krytí ztrát tepla
Množství tepla potřebného k ohřátí vstupujícího materiálu je dáno vztahem:
qs = Qm Cp (T2 - T1)
kde:
qs - teplo potřebné k zahřátí vstupujícího materiálu z teploty T1 na T2
Qm - hmotnostní tok vstupujícího materiálu
Cp - specifické teplo (můžeme uvažovat Cp vody, vliv suspendovaných látek na
velikost Cp lze zanedbat)
T1 - teplota vstupujícího materiálu
T2 - teplota v reaktoru
Množství tepla potřebné pro krytí ztrát je obecně dáno vztahem:
qz = U . A (T2 - T1)
kde:
qz - tepelné ztráty
U - koeficient přestupu tepla
99
A - přestupní plocha
T1, T2 - teplota vně a uvnitř reaktoru
Vlastnosti a zpracování anaerobně stabilizovaného kalu.
Dobře stabilizovaný (vyhnilý) kal je nepáchnoucí, dobře odvoditelný a z hygienického
hlediska nezávadný. Z fyzikálního hlediska je to tmavá (až černá) amorfní neplastická
heterogenní směs suspendovaných a koloidních látek. Barva je dána hlavně nerozpuštěným
sulfidem železnatým.
Vzhledem k příznivému obsahu organických a anorganických látek je kal po methanizaci
vhodný pro použití jako hnojivo buď přímo, nebo ke kompostování. Podporuje tvorbu
humusu a upravuje strukturu půdy. Zemědělské využití je však omezeno obsahem těžkých
kovů.
100
Anaerobní rozklad exkrementů hospodářských zvířat a odpadní biomasy
Organické odpady ze zemědělské výroby, zejména exkrementy hospodářských zvířat ve
formě kejdy nebo slamnaté mrvy a další rostlinné a živočišné zbytky mají vysoký energetický
potenciál. Anaerobní stabilizace těchto materiálů je zušlechtěním tohoto odpadu za
současného energetického zisku. Principem anaerobní stabilizace těchto materiálů je
anaerobní rozklad snadno rozložitelných látek až na methan a oxid uhličitý.
Kejdy, hnoje a zemědělské zbytky obecně obsahují také značné množství látek typu celulózy,
hemicelulózy a ligninu. Přesto, že všechny tyto látky jsou v zažívacím traktu hospodářských
zvířat efektivně rozkládány za anaerobních podmínek (při době zdržení 1-2 dny, se dosahuje
účinnosti rozkladu 40 - 60%), technologicky v anaerobních reaktorech je zatím účinnost jejich
rozkladu o 2 až 3 řády nižší. Technologické zvládnutí rozkladu materiálu obsahujícího
celulózu (rostlinné zbytky všeho druhu) by znamenalo obrovský energetický a ekologický
přínos. V současné době se vede intenzivní výzkum zaměřený na nalezení shodných
mikroorganismů a vhodných technologických metod dovolujících aplikace ve
vysokovýkonných reaktorových systémech v nesterilním prostředí.
Prasečí kejda
Společným znakem anaerobní fermentace různých druhů kejdy nebo slamnaté mrvy je vysoká
koncentrace amoniakálního dusíku v kapalné fázi po fermentaci. Z tohoto důvodu musí být
věnována značná pozornost zpracování kalové vody. V případě, že nelze tuto kalovou vodu
používat přímo k zavlažování, je nutno amaniakální dusík odstraňovat některou ze speciálních
metod. U nás v současné době je problematika odstraňování amoniaku na bioplynových
stanicích zpracovávajících kejdy řešena těmito způsoby:
- kalová voda se zčásti čistí v aktivaci s následnou nitrifikací a denitrifikací a z části se
používá k přímým závlahám.
- amoniak se odstraňuje destilací.
- amoniak se odstraňuje ze směsi po fermentaci odvětráváním vzduchem po částečné
alkalizaci.
Bioplynová stanice Třeboň
Vlastní methanizace prasečí kejdy a čistírenských kalů probíhá ve dvou nádržích o obsahu
3200 a 2800 m3 řazených za sebou.
První nádrž se vytápí na 41°C. Teplota ve druhé, nevytápěné nádrži je 37-38°C. Obě nádrže
se promíchávají bioplynem čerpaným ke dnu v množství asi 190 m3 za hodinu po dobu 10-18
hodin denně. První nádrž je kromě toho míchaná cirkulací methanizované směsi přes externí
ohřev ve třech kalových ohřívácích. Pro ohřev obsahu methanizačních nádrže jsou k
dispozici tři kombinované ohříváky s tepelným výkonem 290 kW. Spaliny, kterými se ohřev
provádí, se získávají spalováním bioplynu v automatickém plynovém hořáku. Všechny
kombinované ohříváky jsou upraveny jako výměník tepla pro využití odpadního tepla ze tří
agregátů na výrobu elektrické energie z bioplynu.
V současné době se v bioplynové stanici zpracovává denně 190 až 200 m3 surové kejdy s 8,8 t
sušiny a 6,7 t organických látek, 6,4 t BSK5, 9,5 t CHSK a 0,5 t celkového dusíku. Kromě
toho se do bioplynové stanice přivádí denně asi 30-40 m3 čistírenského kalu s obsahem 1,4 t
sušiny a asi 1,05 t organických látek.
101
Střední doba zdržení methanizované směsi v první nádrži je 11-12 dnů a v obou nádržích
celkem asi 22 dnů.
Z methanizace vystupuje denně asi 230 m3 směsi s obsahem sušiny 7,4 t, organických látek
4,8 t a 0,5 t amoniakálního dusíku. Obsah nižších mastných kyselin v přepočtu na kyselinu
octovou je v průměru 130 mg/l.
V průběhu methanizace se snižuje obsah sušiny v průměru o 27%, obsah organických látek o
38%. Zatížení methanizační nádrže prvního stupně přivedenými organickými látkami je 2,4
kg/m3/den. Produkce bioplynu je zhruba 19 m3 na m3 vstupní suroviny, 0,58 m3 na 1 kg
přivedených organických látek a 1,53 m3 na 1 kg rozložených organických látek.
Stabilizovaná směs po methanizaci se separuje na dekantační odstředivce. Tuhý podíl z
odstředivky s obsahem 25-30% sušiny se hlavně využívá ke hnojení polí a rybníků. Jeho
hnojivé hodnoty jsou patrny z tabulky 5.5. Fugát z odstředivky obsahuje v průměru 0,8-1,5%
sušiny, 55-60% organických látek v sušině, 200 mg/l BSK5, 10 000 mg/l CHSK a 1 400 mg/l
amoniakálního dusíku.
Tabulka 5.5. Složení tuhého podílu ČOV Třeboň 1994.
x)
sušina (%)
organický podíl podíl (% v suš)
N celkový (% v suš)
P2O5 (% v suš)
K2O (% v suš)
CaO (% v suš)
MgO (% v suš)
Na2O (% v suš)
pH
Pb (mg/kg suš.)
Cd (mg/kg suš.)
Hg (mg/kg suš.)
poznámka - normy pro kompost I. třídy
29,0
55,0
11,7
12,0
3,1
8,6
3,4
0,3
7,1
12,0
0,5
0,3
100 x)
2 x)
1 x)
Významným produktem methanizace je bioplyn, obsahující 61-63% obj. methanu, 34-36%
obj. methanu, 34-36% obj. oxidu uhličitého, okolo 1% vodíku, 0,2-0,4% obj. sulfanu, příměsi
dusíku a kyslíku. Bioplyn se jímá v membránovém plynojemu objemu 2100 m3.
Na ČOV jsou instalovány tři kogenerační jednotky GEB 160 (ČKD Hořovice) o celkovém
výkonu 330 kW elektrické a 630 kW tepelné energie. Tepelná energie se využívá k ohřevu
fermentoru přes výměníky KO 250 a elektrická energie se využije pro provoz čistírny.
ČOV je tak díky vlastní produkci bioplynu nezávislá na vnější dodávce tepla a elektrické
energie.
Anaerobní stabilizace slamnatého hnoje.
Charakteristickým rysem slamnatého chlévské mrvy (slamnatého hnoje) je vysoký obsah
sušiny, obyčejně nad 20%. Slamnatý hnůj je směsí exkrementů (nejčastěji hovězích) a slámy,
která je používaná jako podestýlka.
102
Vzhledem k tomu, že v trávících traktech hospodářských zvířat, zejména přežvykavců, je
silně rozvinuta methanogenní mikroflóra, obsahuje slamnatý hnůj dostatečné množství
potřebných druhů mikroorganismů a není tudíž nutná speciální inokulace.
Princip anaerobní fermentace slamnatého hnoje je založen na tom, že hnůj se z počátku
intenzivním působením anaerobních procesů zahřeje na teplotu 40-60°C, přitom se spotřebuje
asi 10% organické hmoty. Po vyčerpání kyslíku za anaerobních podmínek a v důsledku
zvýšené teploty nastává rozvoj anaerobních procesů za tvorby bioplynu.
Metoda anaerobní stabilizace slamnatého hnoje a potřebné zařízení je patrné na obr. 5.16.
Vlastní pracovní postup stabilizace slamnatého hnoje začíná vynášením hnoje dopravníky ze
stáje skotu a jeho ukládáním na pomocné složiště, kde zůstává 7-8 dnů. To je potřebná doba,
aby došlo k dobrému „předehřátí” hnoje. Poté je „předehřátý” materiál pomocí nakladače
nebo portálového jeřábu ukládán do speciálních „košů“. Koš je konstruován z ocelových
prutů a má objem 170 m3. Plnění košů trvá v plném provozu bioplynové stanice 4 až 5 dnů.
Po naplnění je koš přikryt izolovaným zvonem. V uzavřeném prostoru dochází postupně k
odstranění kyslíku za zvyšování teploty na 40 až 60°C a k vytvoření anaerobních podmínek
pro rozvoj methanogenní mikroflory a k tvorbě bioplynu. Doba fermentace se pohybuje okolo
28 až 32 dní. Po této době se zvon zvedne a přemístí se na další čerstvě naplněný koš.
2
1
3
4
5
6
8
7
Obr. 5. 16. Anaerobní stabilizace slamnatého hnoje.
1 - předběžná skládka, 2 - nakladač, 3 - plnící se koš, 4 - koš po ukončení fermentace, 5 - fermentující
koš přikrytý zvonem, 6 - plynojem, 7 - jímka močůvky, 8 - bioplyn k využití.
Fermentační systém tvoří 9 košů a 8 zvonů. Koše jsou umístěny na betonové ploše. Zvony
jsou utěsněny gumovou tesnící vložkou, nebo hydraulicky ve žlábku okolo každého koše.
Žlábky slouží také k odvodu močůvky, respektive ,,kalové vody“ uvolňující se v průběhu
stabilizace. Bioplyn je z fermentačních jednotek odsáván potrubím do plynojemu.
Výsledky provozu bioplynové stanice uvádí tabulka 5.6.
Tabulka 5.6. Výsledky bioplynové stanice.
Produkce bioplynu
Obsah CH4
Provozní teplota
Minimální obsah sušiny
Optimální obsah sušiny
Objemová produkce bioplynu
Objem bioplynu z jedné jednotky
0,8 -1,6 m3d-1 (VDJ)-1
do 60%
30 - 50°C
20%
22%
0,684 m3. (m3 reaktoru)-1 d-1
3 016 m3 za 32 denní cyklus
103
Anaerobní stabilizace organické frakce tuhého domovního odpadu.
Tuhý domovní odpad, jehož produkce se pohybuje okolo 0,7-0,9 kg na jednoho obyvatele a
den, obsahuje přibližně 60-70% organických látek. V současné době se u nás tuhý domovní
odpad především ukládá do skládek a pouze v menší míře se spaluje ve speciálních
spalovnách nebo se zpracovává jiným způsobem.
Vzhledem k vysokému obsahu organických látek má tento materiál vysoký energetický
potenciál a je vhodný pro zpracování biotechnologickými metodami jakou je anaerobní
stabilizace. K tomuto zpracování je však vhodná pouze organická frakce tuhého odpadu.
Racionální zpracování tuhého domovního odpadu vyžaduje separovaný sběr odpadu a
samostatné zpracování jednotlivých druhů materiálů.
Z ekologického hlediska nejvýhodnější metodou zpracování organické frakce tuhého
domovního odpadu je anaerobní stabilizace, byla také vypracována řada konkrétních postupů.
a) - Zpracování společně s městskými kaly nebo zemědělskými odpady, eventuálně
samostatně vždy po rozsuspendování odseparované organické frakce tuhého odpadu ve
vodě (tj. zpracovává se stejně jako kaly).
b) - Konsistentní tuhý odpad s vyšší koncentrací sušiny se může zpracovávat samostatně ve
speciálních reaktorech pracujících s vysokou koncentrací sušiny.
c) - Anaerobní stabilizace organické části tuhého odpadu za tvorby bioplynu probíhá také na
skládkách tuhého odpadu.
Většina anaerobních methanizačních nádrží v Evropě zpracovává pouze samotné kaly, další
velká část zpracovává exkrementy hospodářských zvířat. V některých zemích, hlavně v
severní Evropě se úspěšně rozšiřují tzv. „centrální bioplynové stanice”. Jedná se o regionální
zařízení pro komplexní zpracování všech druhů organického odpadu (kaly, kejdy, organická
frakce domovního odpadu, odpadní biomasa a pod.). V blízké budoucnosti se očekává
významný rozvoj bioplynových závodů zejména proto, že:
- skládkování a spalování se stává z ekologických a ekonomických hledisek méně
atraktivním
- vyvážení odpadů do moře je už zakázané
- intenzívní obdělávání půdy vyvolává potřebu zvyšování humusu v půdě
- využívání produkované energie kompenzuje náklady na zpracování
Anaerobní fermentace je investičně nákladnější než kompostování, její předností je produkce
energie, zmenšení potřebného prostoru a zvýšené odstranění zápachu.
Protože obsah organické frakce tuhého domovního odpadu je kvalitativně i kvantitativně
proměnlivý, proměnlivé je i množství a složení bioplynu. Průměrná produkce bioplynu se
pohybuje od 100 do 125 m3 bioplynu na tunu zpracovaného odpadu. Obsah methanu se
pohybuje okolo 55 %.
Přímá anaerobní fermentace tuhých odpadů - Proces DRANCO
DRANCO - (DRY Anaerobic Composting) proces byl vyvinut v Belgii pro anaerobní
stabilizace organické frakce tuhého domovního odpadu při koncentraci sušiny veškerých látek
30-50%. Obecné schéma procesu je uvedeno na obr. 5.17.
104
Bioplyn
Kogenerační
jednotka
Plynojem
Organická
frakce tuhého
domovního
Methanizační
reaktor
odpadu
55% sušiny
Deaktivační
reaktor
Kalolis
Elektrická
energie
Odpadní teplo
Sušárna
Recyklovaná voda
Obr. 5. 17. Schéma procesu DRANCO.
Organická frakce domovního odpadu po separaci spalitelného (papír, plasty) a využitelného
odpadu (sklo, kovy, kamení a pod.) je homogenizována a vedena do anaerobního reaktoru s
dobou zdržení 12 až 18 dní, kde proběhne hlavní rozklad. Dále je materiál veden do druhého
anaerobního reaktoru s dobo zdržení 2-3 dny, kde se dokončí anaerobní rozklad. Oba reaktory
pracují při teplotě 55°C. Bioplyn je využíván v kogeneračních jednotkách. Odpadní teplo z
chlazení motorů a spalin je využíváno k ohřevu vody anaerobních reaktorů a pro sušení a
zahušťování. Směs po fermentaci je odvodňována na kalolisech. Získá se „koláč“ o sušině 55
až 60%. Filtrát obsahuje 3-5% sušiny a je vracen před anaerobní reaktor, kde slouží k
naředění a inokulaci vstupujícího materiálu, ten je ředěn ze sušiny 45-55% na 30-35%.
Přebytečný filtrát se vede k zahuštění a zahuštěná frakce se vrací do procesu.
Odvodněný koláč je rozmělněn a sušen odpadním teplem z kogenerace na sušinu 70-75%.
Suchý produkt je homogenizován a rafinován za účelem odstranění zbývajících cizorodých
částí (sklo, plasty, písek). Konečný produkt nazývaný „humotex“, je humusu podobný
materiál, vysoce stabilizovaný a hygienicky nezávadný. Může být použit přímo jako hnojivo.
Proces DRANCO se aplikuje buď samostatně, nebo v různých kombinacích zpracování
odpadů. Například v Holandsku byla vyvinuta metoda „Duobak-Dranco“. Metoda je založena
na důsledném separovaném sběru odpadů, kdy je do speciálních kontejnerů sbírán biologicky
rozložitelný odpad. Zpracování takto separovaného organického odpadu probíhá podle
schematu na obr. 5.18. Vstupující materiál je homogenizován v bubnovém reaktoru s velkou
rychlostí otáčení při době zdržení 6-12 hodin, poté je separován na sítu o velikosti ok 40 mm,
frakce nad tento rozměr se podrobuje přímému spalování, frakce prošlá sítem se vede na
anaerobní fermentaci. Hmotnostní a energetická bilance procesu je patrna z obr. 5.18.
Anaerobní procesy ve skládkách tuhých odpadů
Anaerobní rozklad - methanizace - organické frakce tuhého komunálního odpadu spontánně
probíhá ve skládkách tuhého odpadu. Tento proces probíhá při koncentraci sušiny 45-65%. V
průběhu prvních 5 let po uložení se produkuje okolo 25 m3 CH4 na tunu odpadu a po dobu
dalších 20 let produkce vzrůstá na 75 m3 CH4 na tunu odpadu. Produkce plynu postupně klesá
po 25 do 35 let.
105
Průměrný obsah organických látek v tuhém komunálním odpadu je 60% vztaženo na sušinu.
Energetický potenciál 1 tuny tuhého komunálního odpadu je cca 250 m3 bioplynu z toho asi
40-50% může být využito.
V případě, že se bioplyn ze skládek nezachycuje, mohou jeho emise způsobit řadu potíží:
- methan je plyn způsobující zvýšení skleníkového efektu
- bioplyn je výbušný a dusivý
- nepříznivě ovlivňuje rostlinné porosty na skládce a jejím okolí
Procesy probíhající na skládkách
Biologicky rozložitelná organická frakce odpadů deponovaných na skládkách podléhá
postupně spontánnímu anaerobnímu rozkladu. Průběh biologického rozkladu organických
látek ve skládce je sledem několika následných procesů:
1) Aerobní stadium - organické látky jsou za přítomnosti vzdušného kyslíku rozkládány
aerobními a fakultativně aerobními mikroorganismy na CO2 a H2O za vzniku tepla. Tím se
těleso skládky prohřívá, teplota může dostoupit 40 až 60°C. To příznivě ovlivňuje následující
fáze rozkladu.
2) Anaerobní stadium acidogenní (nemethanogenní). Po vyčerpání kyslíku se rozbíhají
anaerobní procesy předmethanizační fáze - hydrolýza a acidogenese. Hlavními produkty této
fáze rozkladu jsou alifatické mastné kyseliny a další nízkomolekulární látky a CO2.
3) Anaerobní stadium methanogenní nestabilizované. Jedná se o počáteční stadium rozvoje
methanogenních mikroorganismů, začíná produkce bioplynu. Koncentrace methanu v
bioplynu postupně vzrůstá.
4) Anaerobní stadium methanogenní stabilizované. Rozkladné procesy se dostávají do
dynamické rovnováhy, což se projevuje konstantním složením a konstantní rychlostí
produkce bioplynu. Tato fáze trvá až do vyčerpání biologicky rozložitelných organických
látek.
Rozhodující vliv na rozvoj methanogenních procesů ve skládce má kvantitativní složení
deponovaného materiálu a to organické i anorganické frakce, dále vlhkost odpadu
(mikrobiální procesy vyžadují určitou vlhkost), stupeň hutnění tělesa skládky, teplota uvnitř
skládky. Negativně působí přítomnost různých toxických látek. Na těchto faktorech závisí
také výtěžnost bioplynu.
Průběh biologických procesů probíhajících ve skládce je charakterizován změnami ve složení
skládkového plynu. Methanogenní fáze se stabilizuje během půl roku až do dvou let do
ustáleného stavu methanogenese.
Složení bioplynu ze skládek je podobné jako při jiných typech methanizace. V ustáleném
stavu se CH4 vyskytuje v rozmezí od 52 do 75%, CO2 25-45%. Z dalších plynů je přítomen
dusík, sulfan a v první fázi procesu může být přítomen také vodík. Bioplyn ze skládek může
být kontaminován celou řadou různých těkavých organických látek jako vyšší uhlovodíky,
aromáty, chlorované uhlovodíky, alkoholy, kyseliny, ketony a další v množství řádově mg.m-3
106
Anaerobní čištění odpadních vod
Přednosti a nevýhody
Anaerobní čištění odpadních vod zaznamenalo v posledních letech značný rozmach a stává se
platnou alternativou čištění odpadních vod. Podmínky pro aplikaci anaerobního čištění
odpadních vod se neustále rozšiřují, počet omezujících kritérií pro jeho použití se zmenšuje.
Intenzivní anaerobní procesy umožňují čištění odpadních vod se širokým rozsahem koncentrace
organického znečištění. Spodní hranice koncentrace znečištění se již přiblížila koncentraci
domovních splašků, horní hranice koncentrace je prakticky neomezená.
Porovnání anaerobních způsobů čištění s aerobními, jejichž výhody a nevýhody uvádí řada
autorů lze shrnout do těchto bodů:
1. Nízká spotřeba energie. Na rozdíl od aerobních procesů se nevynakládá energie na aeraci,
navíc je anaerobní proces za optimálních podmínek energeticky aktivní (tvoří se bioplyn).
2. Nižší produkce biomasy. Produkce anaerobní biomasy je asi desetkrát nižší ve srovnání s
produkcí aerobní biomasy. Z toho vyplývají i nižší náklady na zpracování přebytečného kalu.
Anaerobní kal nemusí být již dále stabilizován.
3. Nízké požadavky na živiny. Esenciální živiny jsou využívány hlavně k tvorbě nové biomasy
(pro růst). Vzhledem k nízké produkci biomasy proti aerobním mikroorganismům klesá v tomto
poměru i potřeba živin.
4. Možnost udržet vysokou koncentraci biomasy v reaktoru. Koncentrace biomasy není
limitována rychlostí přestupu kyslíku, jak je tomu při aktivačním procesu. V anaerobním
reaktoru je koncentrace biomasy limitována pouze reologickými vlastnostmi kalu a konstrukcí
reaktoru.
5. Nízká reakční rychlost. Rychlost metabolismu v anaerobních systémech je výrazně nižší než
v aerobních, z tohoto důvodu vyžadují anaerobní procesy delší dobu zdržení, eventuálně vysoké
koncentrace mikroorganismů.
6. Relativně vysoká koncentrace organických látek na odtoku. Ve většině případů je nutno odtok
z anaerobních reaktorů aerobně dočistit před vypouštěním do recipientu. Platí to hlavně pro
čištění odpadních vod s vysokou koncentrací organického znečištění.
7. Citlivost methanogenních bakterií. Methanogenní bakterie, které jsou součástí anaerobní
biomasy, jsou poměrně citlivé na změny životních podmínek.
8. Dlouhá doba zapracování anaerobních procesů. Vyplývá z nízkých růstových rychlostí
anaerobních mikroorganismů, zejména methanogenních bakterií. Optimální je zapracování s
vysokou koncentrací inokula adaptovaného na daný substrát.
Rozvoj anaerobních procesů zejména pro čištění odpadních vod se širokým rozsahem
koncentrací znečištění je v posledních letech založen na využití výhod těchto procesů a potlačení
jejich negativních vlastností. Toho lze dosáhnout zajištěním takových provozních podmínek,
které se co nejvíce blíží optimálním podmínkám pro anaerobní mikroorganismy, zejména pro
methanogenní bakterie, které jsou na změnu podmínek nejcitlivější. Nízkou rychlost
107
metabolismu a nízkou růstovou rychlost lze eliminovat udržováním vysoké koncentrace
biomasy v reaktoru. Vysoká koncentrace biomasy v reaktoru je hlavním charakteristickým
rysem nových vysokozatěžovaných" způsobů anaerobního čištění odpadních vod.
Přehled reaktorů pro anaerobní čištění
Souběžně s rozvojem výzkumu anaerobního čištění odpadních vod dochází i ke konstrukci
nových druhů reaktorů, využívajících nových poznatků výzkumu. Některé typy se často liší
pouze určitými detaily v konstrukci.
Výkonnost reaktorů ovlivňují především následující faktory:
• množství biomasy, která zůstává v reaktoru i při vysokých zatíženích,
• kontakt biomasy s přiváděným substrátem (odpadní vodou),
• specifická aktivita biomasy vůči danému substrátu,
První dvě kritéria jsou přímo závislá na konstrukci reaktoru a způsobu kultivace biomasy.
Aktivita biomasy závisí na její historii, tj. původu, stupni adaptace, morfologii apod. a na
reakčních podmínkách (teplotě, koncentraci a charakteru substrátu, inhibici atd.). Z hlediska
způsobu kultivace lze anaerobní reaktory pro čištění odpadních vod rozdělit do dvou hlavních
skupin:
• s kultivací biomasy v suspenzi,
• s kultivací imobilizované biomasy.
Kritéria volby typu anaerobního reaktoru
Volba typu anaerobního reaktoru pro čištění odpadních vod závisí především na
a) druhu a složení odpadních vod
b) koncentraci odpadních vod
c) teplotě odpadních vod
d) místních a ekonomických podmínkách
a) Mezi nejdůležitější parametry odpadních vod patří biologická rozložitelnost přítomných
organických látek, množství a druh suspendovaných látek a přítomnost toxických nebo
inhibujících látek. Doba zdržení biomasy tj. stáří anaerobního kalu musí být udržována na takové
hodnotě, aby nedošlo k vyplavení potřebných skupin bakterií z reaktoru. Z tohoto hlediska pro
čištění odpadních vod s obsahem dobře rozložitelného organického znečištění vyhovuje reaktor s
biomasou v suspenzi. Pro odpadní vody s obsahem hůře rozložitelných organických látek je
výhodnější reaktor s imobilizovanou biomasou. Reaktory s imobilizovanou biomasou, zejména
biofilmové reaktory, jsou více odolné proti účinku inhibujících a toxických látek. Pro odpadní
vody s vysokým obsahem suspendovaných látek (rozložitelných i nerozložitelných) je
nejvýhodnější reaktor s biomasou v suspenzi, např. směšovací reaktor. Pro odpadní vody s
menším množství suspendovaných látek je možno použít i biofilmové reaktory, zejména
reaktory s průtokem shora dolů. Reaktory s kalovým mrakem mohou zpracovávat odpadní vody
s menší koncentrací suspendovaných, biologicky rozložitelných látek. UASB systém je však
citlivý na přítomnost inertních suspendovaných látek.
b) Pro vysoce koncentrované odpadní vody je možné použít i reaktor s biomasou v suspenzi,
avšak větších výkonů dosahují reaktory s imobilizovanou biomasou, které umožňují vysokou
108
akumulaci biomasy a tím i kratší doby zdržení odpadních vod v reaktoru. Pro zředěné odpadní
vody jsou výhodnější reaktory s imobilizovanou biomasou a z nich jsou nejvýhodnější reaktory s
fluidním nebo expandovaným ložem, které pracují s nejvyšší koncentrací biomasy.
c) Anaerobní reaktory jsou nejčastěji provozovány při teplotách 30 -35 oC tedy v mezofilní
oblasti, při nižší teplotě odpadní vody se zpravidla využívá produkovaného bioplynu k ohřevu
reaktoru na požadovanou teplotu. V takovém případě je zpravidla potřeba externí zdroj tepla
pouze pro úvodní etapu zapracování reaktoru. Jiná situace nastává při čištění zředěných
odpadních vod, kdy produkce bioplynu již nestačí na ohřátí vstupující odpadní vody. Pak je třeba
posoudit zda je ekonomicky únosné zvyšování teploty jiným zdrojem nebo zda je možné
provozovat reaktor bez vyhřívání při teplotě odpadní vody. Řada reaktorů je již dnes schopna s
vhodnými odpadními vodami pracovat v teplotním rozmezí 20 - 25 oC. Reaktory UASB pracují
běžně při těchto teplotách v pivovarech. Biofilmové reaktory, zejména reaktory s expandovaným
a fluidním ložem, mohou pracovat i při nižších teplotách. Při teplotě odpadních vod nad 30 oC
lze použít kterýkoli reaktor s imobilizovanou biomasou. Jsou-li teploty odpadních vod
mimořádně vysoké lze využít teplotního optima methanogenních organismů v termofilní oblasti
a zvolit provozní teplotu okolo 55 oC. Nejčastěji se pro vysoké teploty používají reaktory UASB,
nebo se suspenzní biomasou.
d) Místní podmínky a ekonomické faktory mnohdy významně ovlivňují volbu typu reaktoru a
nutí navrhovatele hledat kompromis mezi optimálním návrhem z hlediska ekologického,
technologického a optimem místně-ekonomickým. Jako příklady takových faktorů lze uvést:
• klimatické podmínky
• prostorové možnosti (maximální zastavitelná plocha, tvar pozemku)
• způsob vypouštění vod (dočišťování, recipient a jeho kvalita, kanalizace apod.)
• poptávka po energii (optimální využití bioplynu, zdroje odpadního tepla)
• investiční možnosti (minimalizace sumy investičních a provozních nákladů, nebo jen
investic)
• možnost kvalifikované obsluhy, laboratorní zázemí apod.
Potřebná velikost biologického reaktoru nepřímo úměrně závisí na udržitelném množství
aktivní biomasy uvnitř systému, proto lze většinou všechna nová konstrukční řešení reaktorů
charakterizovat jako nové variace na řešení hlavního motivu - maximální doba zdržení
anaerobního kalu v systému a tedy jeho maximální koncentrování. Narozdíl od aerobních
procesů v tomto případě nehrozí limitace aktivity biomasy v důsledku nedostatku kyslíku, a
proto je možnost zvyšování koncentrace biologického kalu v reaktoru limitovaná jen
sedimentačními vlastnostmi anaerobní biomasy a efektivitou její imobilizace.
Výkonnost reaktorů závisí především na :
- množství aktivní biomasy, která zůstává v reaktoru i při vysokých zatíženích,
- kontaktu biomasy s přiváděným substrátem (odpadní vodou),
- rychlosti biologické konverze.
První dvě kritéria jsou přímo závislá na konstrukci reaktoru. Rychlost biologické konverze závisí
především na koncentraci biomasy a na dalších reakčních podmínkách (teplotě, koncentraci
substrátu, inhibici atd.). Množství biomasy v reaktoru závisí na způsobu kultivace. Z hlediska
způsobu kultivace lze anaerobní reaktory pro čištění odpadních vod rozdělit do dvou hlavních
skupin :
- s kultivací biomasy v suspenzi,
- s kultivací imobilizované biomasy.
109
Reaktory s imobilizovanou biomasou se vyznačují tím, že doba zdržení biomasy je podstatně
delší než doba zdržení kapaliny a je nezávislá na době zdržení kapaliny. To umožňuje dosáhnout
vysoké koncentrace anaerobní biomasy v reaktoru a tedy proces intenzifikovat. Druhým
charakteristickým rysem je podélný průtok odpadní vody u většiny reaktorů této skupiny
zachovávající koncentrační gradient organických látek podél reaktoru.
Z hlediska způsobu imobilizace biomasy je možno anaerobní reaktory rozdělit do dvou hlavních
skupin:
• reaktory s biomasou ve formě nárostů biofilmu na povrchu inertního materiálu,
• reaktory s agregovanou (granulovanou) biomasou.
Biofilmové reaktory lze z hlediska uspořádání náplně dělit na:
- reaktory s pevnou náplní - s průtokem zdola nahoru (upflow),
- reaktory s pevnou náplní - s průtokem shora dolů (downflow),
- reaktory s pohyblivou náplní,
Reaktory s agregovanou (granulovanou) biomasou se dělí na:
- reaktory s vnitřním separátorem plynu a biomasy,
- reaktory s externím separátorem biomasy,
- přepážkové reaktory.
Vyznačují se tím, že pracují s vysoce aktivní agregovanou biomasou. Biomasa v reaktorech se
nachází převážně ve vločkách, peletách nebo granulích. V důsledku průtoku odpadní vody
reaktorem zdola nahoru dochází ke koncentračnímu gradientu v reaktoru. Vnější míchání
reaktoru není nutné. Hlavní míchací efekt způsobuje vznikající bioplyn, průtok vody, případně
recirkulace. Intenzita míchání pak závisí na zatížení (při vyšším zatížení ve vyšší produkce
bioplynu) a na konstrukci reaktoru (čím větší je výška reaktoru, tím vyšší je vzestupná rychlost
bioplynu i kapaliny).
Vedle tohoto základního rozdělení existuje řada dalších variant založených na kombinaci
některých konstrukčních uspořádání uvedených reaktorů. Nejznámější z nich je spojení
biofilmového reaktoru s reaktorem s agregovanou biomasou (tzv. hybridní reaktor).
Protože většina anaerobních reaktorů pro čištění odpadních vod se vyznačuje vertikálním
průtokem substrátu a vyšším poměrem výšky ku šířce, používá se pro ně také název anaerobní
kolony.
110
BIOREMEDIACE
STRATEGIE BIOREMEDIACE
FAKTORY OVLIVŇUJÍCÍ BIOREMEDIACI
♦ Biologické
♦ Chemické
♦ Geologicko-fyzikální
REMEDIAČNÍ METODY
♦ Ex situ
♦ In situ
CÍLE BIOREMEDIACÍ
♦ Snížení množství nebezpečných organických látek v půdě a v podpovrchových vodách
stimulací mikrobiálních rozkladných procesů
♦ Mineralizace nebezpečných organických látek až na CO2 a H2O
♦ Dosažení požadovaných znečišťujících látek a vyhovění požadavkům klienta v
požadovaném čase a za definovanou cenu
STRATEGIE DOSAŽENÍ CÍLŮ
♦ Každá lokalita je z hlediska mikrobiologického, chemického a geologicko-fyzikálního
jedinečná a komplexní
♦ K dosažení úspěšné bioremediace musí být zapojena řada vědeckých a technických
disciplin jako jsou: Geotechnika, Mikrobiologie, Chemie, Analytické techniky, Inženýrský
návrh
♦ Ve většině případů se postupuje v následujících krocích:
∗ Průzkum dané lokality
∗ Laboratorní studie
∗ Poloprovozní pokus
∗ Vlastní remediace
∗ Rekultivace a dlouhodobé monitorování
111
Možnosti ovlivňování nákladů na bioremediaci
Stupeň
možnosti
ovlivnění
nákladů
na
remediaci
Nejlepší možnost ovlivnění
ceny remediace
Maximální náklady
Náklady
na
remediaci
( %)
(%)
Průskum místa
Laboratorní průskum,
studie, výběr metody
Vypracování projektu
Implementace zvolené
metody
Provoz a udržování
112
Možnosti čištění plynů na biofiltru
Výborně
Toluen
Xylen
Alkoholy
Metanol
Butanol
Tetrahydrofuran
Formaldehyd
Acetaldehyd
Kyselina máselná
Trimethylamin
dobře
Benzen
Styren
Aceton
Etylacetat
Fenol
Dimethyl sulfid
Thiocyanidy
Thiofen
Methyl merkaptan
Carbondisulfid
Amidy
Pyridin
Acetonitryly
Chlorfenoly
trochu
Methan
Pentan
Cyklohexan
Dietyleter
Dioxan
Dichlormethan
vůbec ne
1,1,1-trichletan
113
FAKTORY OVLIVŇUJÍCÍ BIOREMEDIACI
Zkoumají se především v průběhu průzkumu místa a laboratorního průzkumu.
Cílem je výběr vhodné metody remediace a nalezení optimálních podmínek pro poloprovozní a
provozní aplikaci
♦ Biologické
♦ Chemické
♦ Geologicko-fyzikální
Substrát - (Znečištění)
Geo-fyzikální faktory
(mobilita, dostupnost)
Chemické faktory
(rozložitelnost)
Prostředí
Mikroorganizmy
Biologické faktory
(fyziologické požadavky)
BIOLOGICKÉ FAKTORY
•
•
•
Biologická rozložitelnost
Vývoj a kompetice mikroorganizmů
Mikrobiologické enzymatické reakce
Biologická rozložitelnost
∗ Používané mikroorganizmy: bakterie (plná mineralizace) a/nebo houby (natartování
procesu)
∗ Nekontaminovaná zemina: obsah množství dekontaminujících mikroorganizmů je menší
než 0,1% celkového množství
∗ Po kontaminaci toto množství vzroste až nad 10%
Metody pro stanovení degradační aktivity mikroorganizmů
◊ Kultivace na plotnách (není vhodná pro stanovení reální aktivity mikroorganizmů v
zeminách)
◊ Respirace (spotřeba O2, produkce CO2, někdy je vhodné použít 14C)
◊ Rozlišení biotické a abiotické dekontaminace
Vývoj a kompetice mikroorganizmů
114
∗ Každá kontaminovaná lokalita je jedinečná. Nejvýhodnější je využití místně specifických
MO rozkládajících dané znečištění. (Přídavek živin stimuluje všechny přítomné MO)
∗ Aplikace specifické kultury MO ne vždy dává dobré výsledky, někdy způsobuji inhibici
přirozených MO rozkládajících dané znečištění
∗ Nežádoucí stimulace růstu „vedlejších“ MO ( poměr C:N:P)
Mikrobiologické enzymatické reakce
∗
∗
∗
∗
Hlavní úloha při remediaci
Extracellulární/intracellulární
Indukce enzym. aktivity (závisí na dostupnosti indukujících substrátů)
Dostupnost možno zvýšit přídavkem (bio)surfaktantů
CHEMICKÉ FAKTORY
•
•
•
•
•
Aerobní nebo anoxické/anaerobní podmínky
pH
Obsah organických látek
Živiny, mikroelementy a vitaminy
Inhibitory
Aerobní podmínky
∗ Aerobně se rozkládají benzin, nafta, PAU, nízko chlorované uhlovodíky
∗ Zdroje kyslíku: vzduch, čistý kyslík, H2O2
Anaerobní/anoxické podmínky
∗ Nepřítomnost kyslíku, jiné akceptory elektronů
∗ Rozklad výšechlorovaných uhlovodíků, pomalejší rychlosti
∗ Konečné produkty: Fe(II), H2S, NH4, CH4, HCl
pH
∗ Bakterie - optimum pH 6 - 8
∗ Houby - větší interval, závislost na druhu (pH 4,5-5,5, pH 3,8 - 9,6)
∗ Nesprávné pH může snadno inaktivovat žádoucí MO a někdy zvyšuje mobilitu iotů kovů
Obsah organických látek
∗ Vyšší obsah humínových látek často snižuje mikrobiální dostupnost kontaminantů a
meziproduktů
115
∗ Vyšší obsah humínových látek často dává vyšší koncentrace mikroorganizmů a ovlivňuje
výběr zdroje kyslíku
Živiny mikronutrienty
∗ Důležité pro růst MO. Nejdůležitější jsou dusík a fosfor
∗ Poměr C:N:P v rozmezí 100:20:1 až 100:3:0,3
∗ Vitaminy, růstové faktory, enzymy
Inhibitory
∗ Snižují aktivitu enzymů/mikroorganizmů
∗ Těžké kovy, vysoká solnost, vlastní kontaminant, meziprodukty rozkladu
GEOLOGICKÉ A FYZIKÁLNÍ FAKTORY
•
•
•
•
Hydro geologická struktura půdy, transport znečištění
Obsah vlhkosti
Teplota
Míchání
Hydro geologická struktura půdy, transport znečištění
∗ Nesaturované a saturované zóny
∗ Faktory ovlivňující transport v horninách:
◊ Gravitace (spec. hmotnost kontaminantu) - vertikální transport
◊ Kapilární síly - horizontální i vertikální transport
◊ Geologie podloží (půda, kámen)
◊ Velikosti částic půdy (štěrk, písek, jíl)
◊ porosita půdy
◊ Obsah huminových látek
◊ Směr a rychlost toku podpovrchových vod
◊ Rozpustnost kontaminantů ve vodě
◊ Obsah vlhkosti v půdě
◊ Vlastnosti kontaminatů (spec. hmotnost, rozpustnost - zvyšuje zvyšuje
mikrobiální dostupnost, hydrofobní, hydrofilní)
116
Ropustnost některých uhlovodíků ve vodě
Uhlovodíky - skupina
n - Alkány
C4
C5
C6
C7
C8
C9
C10
Rozvětvené alkány
C4
C5
C6
C7
C8
C9
Cykloalkány
C6
C7
C9
Olefiny
C4
C5
C6
Monoaromatické
Benzen
Toluen
Xyleny
Ethyl benzeny
C3-benzeny
C4-benzeny
Uhlovodíky - chemická individua
Rozpustnost (mg/l)
n-butan
n-pentan
n-hexan
n-heptan
n-oktan
n-nonan
n-dekan
61,4
38,5
13,3
2,2
0,43
0,12
0,05
Izobutan
Izopentan
2-methylpentan
2-methylhexan
2,4-dimethylhexan
2,2,4-trimethylhezan
49
48
78
2,54
1,29
0,53
Cyklohexan
Methylcyklhexan
1,1,3-trimethylcyklohexan
55
14
1,77
1-butén
1-pentén
1-hexén
222
148
69,7
Benzen
Toluen
m-xylen
Ethyl benzen
1,3,4-trimethylbenzen
1,4-diethylbenzen
1 760
470
172
140
48,2
15
117
Vlhkost, teplota, míchání
∗ Optimální vlhkost půdy - pro aerobní procesy: 60-70% saturace
- pro anaerobní: vodou nasycena
∗ Teplota: rychlost závisí na teplotě ( 2 x na každých 10oC)
∗ Míchání: zabezpečení kontaktu MO se substrátem a živinami
REMEDIAČNÍ TECHNIKY
Metody in situ
• Injektáž plynů
◊ Bioventing (provětrávání půdy)
◊ Air Spatging (provzdušňování spodních vod)
• Injektáž kapalin
◊ Aerace v studních
◊ Vhánění okysličené vody
Metody ex situ
• Landfarming (otevřený systém, tlošťka vrstvy 0,2-0,5m,živiny, provzdušňování)
• Biopile (uzavřený systém, tloušťka vrstvy 2-3 m,živiny, provzdušňování, recirkulace
vody a vzduchu)
• Kompostování (otevřené, uzavřené, přídavek org. hmoty
• Bioreaktory (reaktory pracující s vodní fází - podpovrchové vody, výluhy, reaktory
pracující se suspenzí kontaminované zeminy)
• Čištění plynů
◊ Bioscruber (probublávání kyslíku a plynných kontaminamtů přes vodu a
suspendovanou nebo imobilizovanou biomasu)
◊ Biofiltr (směs kyslíku a plynných kontaminamtů je vedena přes specielní náplň
filtru, koncentrace organických kontaminantů nad 1-2 g/m3)
118
Přístupy ke kontrole znečištění
Způsoby odstraňování polutantů nebo alespoň snížení jejich negativních účinků využitím mikrobní
aktivity jsou intenzivně studovány. Biodegradační procesy jsou podstatou příslušných postupů a
jsou mnohdy jedinou cestou, jak snížit zátěž prostředí nežádoucím substrátem. Nezanedbatelnou
předností těchto postupů jsou i pozoruhodně nízké náklady na jejich realizaci. Současná úroveň
poznání nabízí tři základní možnosti kontroly průběhu rozkladu cizorodých či znečišťujících látek v
prostředí (tab. 3.2).
Tab. 3.2 . Přístupy k biotechnologické dekontaminaci prostředí
_________________________________________________
- Inokulace
- Optimalizace a využití podmínek prostředí
- Úprava polutanty
_________________________________________________
Aplikace:
- „in situ“
- „ex situ“
______________________________________________________________
Prvou možností je přímé vnesení (inokulace) čisté nebo směsné kultury příslušných mikrobních
rozkladačů. Posílí se tím biodegradační potenciál prostředí a používá se v případech, kdy mikrobní
rozkladači nejsou přítomni nebo je jejich počet nízký. Tato metoda sama o sobě však zpravidla
nemá valnou naději na úspěch. Vnesené mikroorganismy se dostávají do kompetice s nativní
mikroflórou a často nenacházejí vhodné podmínky ke svému rozvoji, nejsou obvykle schopny v
prostředí přetrvávat potřebnou dobu v aktivním stavu při zachování žádoucích vlastností. Tato
technika má oprávnění v případech nízké koncentrace polutantu (aby jej mohly vnesené organismy
bezprostředně degradovat) a za předpokladu rychlého průběhu rozkladu, jenž by se musel realizovat
během omezené životnosti inokula. Vyšší kvality může nabýt inokulační metoda v souvislosti s
využitím možnosti přenosu genetického materiálu kódujícího příslušnou degradační schopnost.
Vnesený mikrobní dárce této vlastnosti by nemusel sám v prostředí přežívat, jakmile by ji předal
nativním recipientům, kteří jsou v daném prostředí dokonale adaptováni. Takové přenosy budou
probíhat s dostatečnou frekvencí zejména v místech se zvýšenou akumulací mikroflóry. Jako
inokulum, případně jako donor genetického materiálu mohou být využity i kultury geneticky
modifikovaných mikroorganismů. Tato možnost je však dosud legislativně limitována.
Dalším přístupem ke stimulaci mikrobiálního rozkladného procesu je optimalizace podmínek
prostředí nezbytných pro přežití, vývoj a aktivitu nativních i vnesených rozkladačů a pro expresi
jejich degradační schopnosti. Je tedy třeba dodat potřebné živiny, zajistit vhodnou vlhkost, aeraci,
pH apod.
Třetí cestou je předběžná úprava molekuly polutantu nebo formy preparátu tak, aby vlastnosti
umožňovaly v potřebné chvíli jeho napadení se strany mikroflóry, tj. aby se zvýšila jeho dostupnost
a snížila resistence vůči rozkladu. K tomu musí např. přihlížet i výrobci pesticidů.
Při úvahách o biologické rozložitelnosti polutant je nezbytné bedlivě hodnotit všechny zmíněné
okolnosti.. Žádný mikrobní rozkladač není univerzálně použitelný pro různé polutanty nebo různé
podmínky prostředí, každý polutant je rozkládán odlišnými mechanismy. S úspěchem jsou proto
119
používány jako degradační agens preparáty obsahující smíšené kultury mikrobních rozkladačů
(půdní suspenze, rašelina aj.).
Biodegradační technologie zaznamenávají v současnosti výrazný rozvoj. Byly vyvinuty důmyslné
postupy dekontaminace „in situ“, tj. přímo na znečištěné lokalitě (půda, povrchová či spodní voda,
skleníky, havarijní situace), nebo „ex situ“, tj. po přenesení kontaminovaného materiálu na jiné
místo Tam dochází k vlastnímu ošetření buď v bioreaktorech nebo na speciálně upravených
plochách či v kompostových hromadách. Existuje značné množství takovýchto systémů a každý z
nich vyžaduje individuální řešení. Biodegradace „in situ“ jsou levnější, odpadají náklady na
transport kontaminovaného materiálu. Náklady se však mohou zvyšovat instalací měřících a
podpůrných přístrojů a odběrem a následným zpracováním vzorků. V různých typech bioreaktorů
lze k dekontaminaci vody využít i systémů s immobilizovanými degradativními enzymy nebo
buňkami mikrobních rozkladačů..
Dekontaminační technologie představují moderní, ekologický a levný prostředek k odstraňování
nežádoucích polutant. Jsou podstatou bioremediačních systémů a mají obecnou povahu. Dají se
aplikovat na různé druhy polutantů (pesticidy, polychlorované bifenyly, halogenované alifatické a
aromatické látky, fenoly, ropná residua apod), a nejen na půdu, ale i na povrchové i spodní vody,
aktivované kaly, průmyslové a zemědělské odpady aj. V neposlední řadě lze stejných principů
využít nejen k urychlení, ale i k záměrnému zpomalení rozkladného procesu. Význam a uplatnění
zmíněných přístupů narůstá a při řešení problematiky ochrany a zlepšování životního prostředí
zaujímají nezastupitelné místo.
Biodegradace xenobiotik
Xenobiotické sloučeniny lze definovat jako syntetické produkty, které nebyly vytvořeny v
přirozených biosyntetických procesech a jsou v prostředí cizorodé, jak bylo ostatně už zmíněno
výše. Mnohé z nich jsou významné polutanty, často vysoce resistentní vůči metabolickým
přeměnám. Přesto bylo zjištěno, že mohou podléhat biotransformaci, tj. může být změněna jejich
chemická struktura, mohou být detoxifikovány či zcela mineralizovány a tak ireversibilně
eliminovány z prostředí. Schopnost rozkládat tyto látky byla nalezena u všech u všech hlavních
taxonomických skupin mikroorganismů. Chemická povaha xenobiotik je různorodá, mnohé jsou
halogenované, mohou mít specifické fyziologické účinky na biotickou složku prostředí. Proto i
povaha metabolických biodegradačních procesů je pestrá. V mnohých případech jde o zcela nové
syntetické látky, jejichž molekulární struktura nemá v přírodě obdoby a přirozené enzymatické
systémy se v průběhu fylogeneze nevyvinuly. Nicméně příroda relativně rychle reaguje na takové
nové zátěže: během několika posledních desetiletí (což je z hlediska trvání fylogenetického vývoje
zanedbatelné období) se vytvořily nové enzymy atakující např. nové pesticidy, nebo vznikly nové
mechanismy resistence vůči zaváděným antibiotikům. V následujících odstavcích bude stručně
pojednáno o biodegradaci některých typických skupin xenobiotik, jako jsou např. chlorované látky,
pesticidy, organofosforové či heterocyklické sloučeniny.
Chlorované organické látky
Syntetické chlorované organické sloučeniny se užívají už více než století, od zavedení chloroformu
jako anestetika a chloralhydrátu jako sedativa. V současné době přichází do prostředí široká škála
alifatických i aromatických látek, vznikajících při různých průmyslových výrobách (papírenský a
farmaceutický průmysl, plasty, barviva) nebo ve formě pesticidů, rozpouštědel a chladicích směsí. Z
hlediska ochrany životního prostředí stojí v centru zájmu látky s dlouhou persistencí, odolné vůči
120
biodegradaci. K sloučeninám tohoto typu patří zejména polychlorované bifenyly (PCBs), alifatické
halogenované sloučeniny nebo insekticid DDT, jehož aplikace je dnes už zakázaná. Kromě značné
rekalcitrance mohou tyto látky být toxické a mohou se hromadit v organismech, půdách a
sedimentech. Rekalcitrance pak u nich závisí zase na chemické struktuře (množství a lokalizace
halogenu v molekule) a na rozpustnosti, která je obvykle omezená.
Bylo nicméně zjištěno, že čisté i smíšené kultury bakterií a hub jsou v různé míře schopny tyto látky
rozkládat za aerobních i anaerobních podmínek. Metabolické dráhy zahrnují opět hydrolytické,
oxidační, redukční a různé eliminační (zejména specifické dehalogenační) reakce, může dojít k
mineralizaci nebo k využití jako zdroje uhlíku a energie pro růst. Z ekologického hlediska jsou
významné i částečné biotransformační změny ve struktuře molekul, pokud jsou produkty
toxikologicky přijatelné nebo méně hydrofobní.
Rozkladu DDT se většinou zúčastní více mikroorganismů, z nichž každý může provádět reakce
určitého úseku metabolické dráhy. Technikou genového inženýrství byly tyto sekvence úspěšně
vpraveny do jediné bakteriální kultury a takto zkonstruovaný kmen pseudomonády insekticid
kompletně mineralizoval.
Metabolická dráha rozkladu polychlorovaných bifenylů obsahuje několik výrazných kroků, z nichž
prvým je dioxygenázový atak méně chlorovaného jádra (A) s následnou hydrogenací na katechol
(B), dále dochází k otevření aromatického kruhu meta-štěpením (C) a další hydrolytické reakci (D).
Metabolickými produkty zmíněných polychlorovaných aromatických substrátů bývají chlorované
benzeny, benzoáty, fenoly či katecholy. K dehalogenaci může dojít před nebo po otevření
aromatického jádra.
Pesticidy
Pesticidní látky jsou významnou skupinou xenobiotik s výraznými specifickými účinky vůči
organismům. Používá se jich k odstranění či snížení výskytu nežádoucích rostlin a plevelů
(herbicidy, defolianty), hmyzu (insekticidy), hlodavců (rodenticidy), roztočů (akaricidy), červú
(nematocidy), houbových původců chorob či jiných škod (fungicidy) apod. Použití pesticidů se
stalo v posledních desetiletích integrální součástí zemědělské výroby a hygienických opatření.
Jejich ekonomický význam spočívá v tom, že pomáhají zvyšovat výnosy a snižovat množství
vynaložené práce. Jsou aplikovány ve značném rozsahu, všechny složky biosféry jich v současné
době obsahují měřitelná množství. I když běžné dávky se pohybují v kg účinné složky na hektar,
znamenají pesticidy významný zásah do přírodního prostředí. Mohou migrovat mezi vodou, půdou,
vzduchem, mohou se v prostředí i v tkáních organismů hromadit. Nebezpečí hrozí zejména při
použití persistentních preparátů, při opakovaných aplikacích a v havarijních případech. Pesticidy se
staly ekologickým faktorem s přímými nebo nepřímými účinky na necílové organismy, na
agroekosystémy a životní prostředí vůbec.
Chemická struktura a vlastnosti pesticidů jsou rozmanité, mnohé z nich obsahují v molekule
halogen. Mohou být aplikovány v různé formě (fumigancia, postřiky, poprašky, granule, pecičky) a
v různých kombinacích. Přetrvávají v prostředí různě dlouhé období, od několika dní až po řadu let.
Některé příklady uvádí tab. 3. .
121
Tab. 3. 3. Doba persistence některých skupin pesticidů v půdě
__________________________________________________
Organofosfáty
dny až týdny
Karbamáty, alifatické kyseliny
2 - 12 týdnů
Fenoxyalkanové kyseliny
1 - 6 měsíců
s-Triaziny
6 - 18 měsíců
Benzoové kyseliny,amidy
12 - 18 měsíců
Deriváty močoviny
0,5 - 3 roky
Chlorované uhlovodíky
2 až desítky let
__________________________________________________
Schopnost metabolicky přeměňovat pesticidy byla nalezena u představitelů bakterií, aktinomycet,
hub a řas. Příslušný substrát může být oxidován, redukován, hydrolyzován, dealkylován,
dehalogenován, hydroxylován, může být otevřeno aromatické jádro, může dojít k mineralizaci látky
na jednoduché anorganické sloučeniny, produkty mohou být mikroflórou využity k růstu jako
zdroje uhlíku či jiných prvků a energie, atd. Taková mikrobní aktivita vede k detoxikaci pesticidu a
k jeho eliminaci z prostředí. Jindy mohou být některé polutanty, ač původně netoxické, přeměněny
na produkty toxičtější, nebo takové, které postihnou svými účinky odlišné spektrum organismů.
Degradační aktivita bezprostředně souvisí s podmínkami prostředí, enzymovým vybavením
zúčastněných mikrobů a vlastnostmi pesticidu. Kromě rychlosti procesu je možno ostatně posuzovat
i tvorbu metabolických produktů, biochemické reakce a metabolické dráhy a ovšem, účinek
ekologických faktorů. Některé zmíněné skutečnosti jsou nadále doloženy několika příklady.
Metabolické produkty vznikající při rozkladu téhož herbicidu mohou být odlišné, jestliže proces
probíhá za aerobních či anaerobních podmínek. Údaje v tab. 3.4 dokládají, že v přítomnosti
vzduchu bylo z bromoxynilu produkováno vyšší množství bromovaných látek a zejména příslušné
kyseliny.
Tab. 3.4. Rozklad bromoxynilu v černozemní půdě za aerobních a anaerobních podmínek
_______________________________________________________________________
Atmosféra
Bromované látky v eluátu a
Vzduch
Dusík
_______________________________________________________________________
3,5-dibromo-4-hydroxybenzonitril (bromoxynil)
53
3,5-dibromo-4-hydroxybenzamid
12
17
3,5-dibromo-4-hydroxybenzoová kyselina
25
34
2
Celkem
90
53
_______________________________________________________________________
a
% vneseného bromoxynilu, průměrné denní hodnoty v období ustáleného stavu, nalezené v
roztoku prošlém půdním sloupcem
Organofosfáty
Sloučeniny organofosforové povahy jsou aplikovány do prostředí především jako pesticidy v
zemědělské výrobě, s dosahem do oblasti zdravotnictví a hygieny, jako plnidla do plastů a
122
potenciálně i jako bojové chemické látky (nervové plyny - soman, sarin, tabun). Organofosforové
preparáty tvoří kolem 20 % všech používaných pesticidů. V České republice dosahuje roční
spotřeba stovek tun a jsou jimi ošetřeny statisíce hektarů půdy, zejména ve formě insekticidů, ale i
jako akaricidy, nematocidy fungicidy a herbicidy. Organofosforové látky doznaly širokého
uplatnění pro jejich významné přednosti, jimiž jsou vysoká insekticidní aktivita, široké spektrum
účinku, krátká doba persistence v prostředí (dny až týdny), systemický a rychlý účinek, nízké
dávkování, rychlý metabolismus v organismu obratlovců. Nevýhodou je v mnohých případech
značná toxicita vůči obratlovcům.
Obecnou podstatou toxického působení je narušení přenosu impulzů v nervovém systému, a to
zpravidla blokováním acetylcholinesterázy. Paralýza nervové činnosti má pak letální následky.
Účinek závisí na řadě okolností (chemická struktura , způsob metabolických přeměn, podmínky
prostředí aj.). Vliv organofosfátů na mikroorganismy a jejich aktivitu není v běžně používaných
koncentracích pozorovatelný, někdy mohou působit i stimulačně (na bakterie, houby, aktinomycety,
celulolytické bakterie, amonifikaci, nitrifikaci, respiraci aj.), mohou být využívány jako zdroj uhlíku
a energie.
Co do chemické struktury, organofosforové látky zahrnují fosfáty, fosfonáty, fosforamidy,
fosforothioláty, fosfothionáty a fosforothiolothionáty. Obsahují tedy fosfátovou vazbu P = O nebo
P = S, jsou však i složitější struktury. Z nejtypičtějších látek lze zmínit parathion, diazinon,
dichlorvos, malathion atd.
Organofosforové látky nepřetrvávají v prostředí dlouhou dobu a proto např. nahradily dříve
používané rekalcitrantní insekticidy typu DDT. Významnou účast na jejich odbourávání mají
mikroorganismy, u nichž je degradační schopnost obecně rozšířena. Potřeba inokulace
kontaminovaného prostředí specifickým rozkladačem je proto spíše řídká. Při transformacích
organofosfátů existuje nevelké množství běžně rozšířených obecných metabolických drah. V jejich
molekule zpravidla bývá více bezprostředně enzymaticky atakovatelných vazeb, jak naznačuje na
příkladu malathionu. Enzymově katalyzované štěpení zahrnuje hydrolytické, oxidační, redukční,
dehydrochlorační, transalkylační a konjugativní (např. glykosidační) reakce. Některé typy
hydrolytických a oxidačních reakcí jsou uvedeny v tab. 3.5. V některých případech může být
toxicita původního preparátu dokonce zvýšena. Z hydrolytických reakcí je pak nejvýznamnější
aktivita alkalických nebo kyselých fosfatáz. Byly provedeny i úspěšné pokusy s aplikací hrubého
enzymového fosfatázového preparátu.
Tab. 3.5 . Některé hydrolytické a oxidační reakce při biodegradaci organofosforových
sloučenin
_____________________________________________________________________
Hydrolýza
Oxidace
(i) P = S → P = O
(i) fosfátů (P → X, P → alkyl)
(ii) esterů karbonových kyselin
(ii) sulfid → sulfoxid → sulfon
(iii) amidů karbonových kyselin
(iii) N-alkyl → N-oxyalkyl
(iv) alkylaminů
(iv) arylalkyl → aryloxyalkyl
_____________________________________________________________________
Heterocyklické sloučeniny
Látky obsahující v molekule heterocyklický kruh představují široké spektrum sloučenin, mnohdy s
výraznými fyziologickými účinky. Do prostředí se dostávají jako odpadní produkty průmyslových
123
výrob (farmacie, barviva, rozpouštědla atd.) a jsou hojně aplikovány jako nejrůznější pesticidní
preparáty. Mnohé z nich mohou způsobit kritické znečištění půdního a vodního prostředí pro svou
toxicitu a rekalcitranci. I když persistence těchto látek může být limitována řadou fyzikálních,
chemických, fyzikálně-chemických a biotických faktorů, i zde je biodegradace nejvýznamnější
cestou jejich nevratného odstranění z prostředí.
Co do chemické struktury je pro tyto látky charakteristická přítomnost heterocyklů zahrnujících
jako heteroatomy dusík, síru, kyslík a jejich kombinace; jejich molekulu dále tvoří alifatické boční
řetězce, aromatická jádra a různé substituenty včetně halogenů. Mezi dusíkaté heterocykly se řadí
symetrické a asymetrické triaziny, pyridiny, pyrimidiny, triazoly, imidazoly a pyroly, kyslíkový
heteroatom obsahují furany a benzofurany, síra je součástí thiofénů atd. Substituenty a boční řetězce
mohou být rovněž rozmanité (hydroxyly, karboxyly, aminy, amidy, nitrily, karbonáty, thioáty,
fosfothioáty, estery fosforečných kyselin atd.).
124