Obsah

Transkript

Obsah

/1
Obsah
Podmínky získání zápočtu.................................................................................................2
Laboratorní řád..................................................................................................................3
Bezpečnost práce v laboratoři............................................................................................3
Základní techniky práce v laboratoři ................................................................................4
1.Obecné zásady odměřování objemů...................................................................................................4
2.Pipetování skleněnou pipetou ............................................................................................................4
3.Odměřování objemů automatickou pipetou........................................................................................5
4.Vážení.................................................................................................................................................6
5.Příprava roztoků..................................................................................................................................7
6.Ředění roztoků, ředicí řady ................................................................................................................8
7.Filtrace................................................................................................................................................9
8.Centrifugace .....................................................................................................................................10
Zpracování experimentálních dat....................................................................................11
1. Zaokrouhlování a platné číslice.......................................................................................................11
2. Chyby měření, základy statistického zpracování výsledků.............................................................11
3. Zásady pro sestrojování grafů..........................................................................................................12
4. Pracovní protokoly...........................................................................................................................13
Úloha 1. ODMĚŘOVÁNÍ OBJEMŮ, ŘEDĚNÍ ROZTOKŮ.........................................14
Pracovní postup....................................................................................................................................14
Úloha 2. PŘÍPRAVA ROZTOKŮ ..................................................................................16
Pracovní postup....................................................................................................................................16
Úloha 3. CHARAKTERISTICKÉ REAKCE
VYBRANÝCH PŘÍRODNÍCH LÁTEK........................................................................17
Pracovní postup....................................................................................................................................18
Úloha 4. SPEKTROFOTOMETRICKÉ METODY........................................................19
Pracovní postup....................................................................................................................................22
Úloha 5. REVERZIBILNÍ A IREVERZIBILNÍ PRECIPITACE BÍLKOVIN..............23
Pracovní postup....................................................................................................................................24
Úloha 6. SEPARAČNÍ A CHROMATOGRAFICKÉ METODY
- DĚLENÍ LÁTEK DLE POLARITY.............................................................................26
Pracovní postup....................................................................................................................................28
Úloha 7. pH A PUFRY....................................................................................................30
Pracovní postup....................................................................................................................................32
Úloha 8. "STANOVENÍ BÍLKOVIN"............................................................................34
Pracovní postup....................................................................................................................................35
Úloha 9. IZOLACE ROSTLINNÉ DNA,
SPEKTRA BIOCHEMICKY VÝZNAMNÝCH LÁTEK..............................................36
Pracovní postup....................................................................................................................................37
Podmínky získání zápočtu
/2
Podmínky získání zápočtu
1. vypracování všech úloh se ziskem alespoň 50 % bodů (viz dále)
2. vypracování protokolů se ziskem alespoň 50 % bodů (viz dále)
3. složení praktické zkoušky (max. 3 pokusy)
4. absolvování zápočtového testu s úspěšností ≥ 60 % (max. 3 pokusy)
Praktickou zkoušku i test je možné absolvovat nezávisle na sobě, avšak pouze v případě, že
jste splnili 1. podmínku a ze všech úloh odevzdali protokoly (není nutno, aby již byly
opravené). U praktické zkoušky budete mít k dispozici vlastní pracovní deník a odevzdané
protokoly.
Bodové hodnocení
ad 1 – DOMÁCÍ PŘÍPRAVA A PRÁCE V LABORATOŘI
Na každou úlohu je nezbytné se dopředu připravit. Pozorně si přečtěte celý návod. Teoretická část před
vlastním návodem k úloze vám pomůže k pochopení daného tématu a toho, co budete v praktiku dělat. Do
pracovního deníku (vázaný sešit A4) před každou úlohou zpracujte kontrolní otázky, veškeré výpočty
potřebné k postupu a schematicky návod tak, abyste se v laboratoři nezdržovali výpočty objemů nebo
navážek, ale rovnou mohli pracovat bez zbytečných prostojů. V případě zcela nedostatečné přípravy bude
student z praktika vyloučen a úlohu vykoná v náhradním termínu (max. 2x).
Během práce v laboratoři zapisujete veškeré experimentální hodnoty do pracovního deníku – například
přesné navážky a objemy při přípravě roztoků, ředění vzorků, výsledné naměřené hodnoty, typ a šířku
použitých kyvet, vlnové délky při kterých jste měřili, podmínky centrifugace nebo dobu, po kterou probíhala
reakce.
Vaši domácí přípravu a přístup k práci včetně zpracování pracovního deníku budeme hodnotit 0 – 5b./úlohu.
Sankcionovány budou zejména prohřešky proti laboratornímu řádu či bezpečnosti práce, konkrétně
např.:
•
neomluvená absence
•
pozdní příchod (v ojedinělých případech lze tolerovat zpoždění do 15 min)
•
opouštění praktika během experimentu
•
nedostatečná domácí příprava (včetně přípravy v pracovním deníku)
•
nedodržení návodu či pokynů vyučujícího praktika
•
nedbalost při práci (např. hrubá nepřesnost při odměřování objemů, vážení apod.)
•
vyhýbání se práci (pracuje převážně 1 z dvojice)
•
neuklizené pracovní místo
Opakované závažné prohřešky proti laboratornímu řádu (např. neomluvené absence, nedostatečná domácí
příprava) nebo dokonce bezpečnosti práce budou potrestány vyloučením z praktik a tedy neudělením zápočtu
již v průběhu semestru.
ad 2 – HODNOCENÍ PROTOKOLŮ
Protokoly ze všech úloh je nutno odevzdat vždy do týdne (před vypracováním následující úlohy). Za každý
týden prodlevy bude odečtena desetina maximálního počtu bodů, který lze z protokolu získat. Protokoly
nebudeme vracet k přepracování, pouze je ohodnotíme body (protokoly z úloh č. 1, 2 a 3 v rozsahu 0 - 5 b.,
ostatní protokoly 0 - 10 b.). K nahlédnutí a konzultaci budou protokoly k dispozici vždy cca týden po
odevzdání v konzultačních hodinách. Všechny protokoly vám budou vráceny na konci praktik.
K udělení zápočtu je třeba za protokoly dosáhnout ≥ 50 % bodů. Bodové hodnocení bude zohledňovat
dodržení požadavků na zpracování protokolu uvedených na str. 12 těchto skript. Opsaný protokol či jeho část
hodnotíme 0 b., a to i při pozdějším odhalení!
Laboratorní řád
/3
Laboratorní řád
Student je povinen
✔ před zahájením práce v laboratoři se seznámit s laboratorním řádem, s bezpečnostními předpisy a
poskytováním první pomoci (nutno stvrdit podpisem).
✔ vypracovat všechny úlohy v řádném termínu; případnou absenci (pouze ze závažných důvodů) je
nutno předem omluvit a ihned dohodnout s vedením praktika náhradní termín pro vypracování úlohy
(možnosti náhrady úlohy jsou velmi omezené!).
✔ přicházet do laboratoře včas a řádně připraven, tj. mít v prac. deníku provedeny potřebné výpočty,
zodpovězené kontrolní otázky, schematický nákres či základní body pracovního postupu apod.
(v opačném případě bude student z praktika vyloučen a úlohu vykoná v náhradním termínu).
✔ průběh práce a dosažené výsledky zaznamenávat do pracovního deníku (vázaný sešit formátu A4),
který vždy po skončení cvičení předkládá ke kontrole vedoucímu cvičení.
✔ používané chemikálie neprodleně vracet na původní místo.
✔ po skončení práce uklidit pracovní místo, použité sklo řádně umýt a opláchnout destilovanou vodou,
doplnit destilovanou vodu do příslušných střiček a stůl předat laborantovi/laborantce.
✔ samostatně vypracovat protokol a odevzdat do týdne (ještě před vypracováním další úlohy).
Bezpečnost práce v laboratoři
1. Při práci v laboratoři je nezbytné mít vlastní pracovní plášť a obuv k přezutí (boty s pevnou špičkou;
zcela nevhodné jsou vysoké podpatky či žabky); tašky, oblečení a venkovní obuv uložit do skříňky
mimo laboratoř.
2. V laboratoři je zakázáno jíst, pít, kouřit, telefonovat a přijímat návštěvy.
3. Pracujte pouze dle pracovního návodu či pokynů vyučujícího.
4. Všechny přístroje (spektrofotometry, centrifugy, pH-metr) lze používat až po konzultaci
s vyučujícím.
5. Během práce udržujte čistotu.
6. Nikdy nepipetujte ústy, používáme k tomu určený nástavec či balonek.
7. S jedovatými, těkavými a páchnoucími látkami pracujte pouze ve spuštěné a zapnuté digestoři.
8. Při provádění pokusů držte ústí zkumavek odvrácené od obličeje.
9. Koncentrované kyseliny a zásady ředíme tak, že kyselinu nebo zásadu lijeme tenkým proudem po
tyčince do vody za současného míchání, případně i chlazení.
10. Při práci s hořlavinami nesmí být v blízkosti otevřený oheň.
11. Skleněné střepy musí být odkládány do nádoby zvlášť k tomu určené.
12. Zbytky jedů a organických rozpouštědel likvidujte podle pokynů vyučujícího.
13. Případné závady, nedostatky, nehody nebo poranění (i drobná) je nutné neprodleně hlásit
vyučujícímu a v případě potřeby poskytnout okamžitě první pomoc.
Voda z vodovodu obsahuje značné množství solí, proto je pro experimenty v biochemické laboratoři
nepoužitelná. Pro účely laboratorních cvičení (včetně oplachování nádobí) je nutné používat vodu
destilovanou.
Z nebezpečných látek budete v laboratoři pracovat zejména s organickými rozpouštědly. Při práci s těmito
látkami se vždy chráníme ochrannými pomůckami – používáme rukavice a pracujeme v digestoři. Do
zvláště nebezpečné skupiny těkavých látek s mutagenním a karcinogenním účinkem patří chloroform.
Základní techniky práce v laboratoři
/4
1. Obecné zásady odměřování objemů
Odměrné sklo i automatické pipety jsou běžně kalibrovány na měření objemu při 20 ºC. U zásobních kapalin, které
byly uskladněny v lednici, necháme láhev ještě před otevřením (kvůli možné kondenzaci vzdušné vlhkosti) vždy
nejprve vytemperovat na laboratorní teplotu. Při měření objemu pak odměrné sklo nezahříváme rukou.
Nikdy kapalinu nenabíráme ze zásobní lahve - mohli bychom totiž do kapaliny zanést pipetou nečistoty. Přibližné
potřebné množství kapaliny odlijeme do pracovní kádinky. Zásobní láhev při odlévání držíme tak, aby byl štítek
v dlani a případná kapka nezničila označení zásobní lahve. Kapalinu se také doporučuje nalévat pomocí tyčinky.
Zabráníme tak vystřikování kapaliny z kádinky (to je obzvláště důležité u nebezpečných a žíravých kapalin).
Objem na stupnici vytištěné nebo
Při odečítání objemu se oko musí
vyleptané na stěně skleněného
nacházet v úrovni menisku (tj.
nádobí odečítáme v místě, kam
kružnice rysky splyne v úsečku).
dosahuje meniskus povrchové
Pokud by oko bylo výše či níže,
blanky odměřované kapaliny:
odečtený objem by neodpovídal
skutečnosti (paralaxní chyba)
Odměrné nádobí je kalibrováno buď na dolití, nebo na vylití. Tento dvojí způsob kalibrace je opodstatněn tím, že při
vylití kapaliny z nádoby ulpí trvale vlivem smáčivosti skla určité množství kapaliny na stěnách nádoby v podobě
tenkého filmu. Vyteklý objem je pak o toto množství menší, než byl původní objem kapaliny v nádobě.
Nádoby kalibrované na vylití
„EX“.
přesný objem vypuštěné kapaliny
Nádoby kalibrované na dolití
„IN“.
přesný objem kapaliny uvnitř nádoby
odměrné válce, pipety,
byrety (používají se na titrace - mají u svého ústí ventil)
Je počítáno s tím, že určitá část vypouštěného roztoku ulpí na
stěnách nádoby vlivem smáčivosti skla nebo je zadržena
kapilárními silami, skutečný vnitřní objem takto kalibrovaných
nádob je tedy o toto malé množství kapaliny větší.
odměrné baňky (a některé odměrné válce)
na nádobě vyznačeno zkratkou
na nádobě vyznačeno zkratkou
Slouží k přípravě roztoků o přesných koncentracích (viz dále).
K přesnému odměřování objemu
NESLOUŽÍ:
Kalibrace uváděná na tomto
nádobí je pouze orientační!
Kádinky
Erlenmayerovy baňky
Pasteurovy pipety
(plastová či skleněná
kapátka)
2. Pipetování skleněnou pipetou
Sklo je poměrně inertní materiál, který na svůj povrch neváže ani látky značně hydrofobní. Obecně jsou pipety přesnější
než odměrné válce, což je dáno velkým poměrem výšky a průměru pipety, kdy se stejná chyba v odečtení menisku
projeví v podstatně menším objemu. Pipety mohou být vyrobeny buď jen pro jeden určitý objem (např. 1 ml, 2 ml,
5 ml, 10 ml a 25 ml) nebo pro více objemů, tedy tzv. dělené pipety.
Roztok nikdy nepipetujeme ze zásobní láhve, ale z kádinky, do které si odlijeme přiměřené množství roztoku určeného
k pipetování (viz výše). Pokud pipeta není zcela čistá a suchá, je vhodné začít několikanásobným promytím pipety
destilovanou vodou a poté alespoň dvakrát odměřovaným roztokem - tím se odstraní z pipety voda, která by
odměřovanou kapalinu zředila.
/5
Dříve se mnoho látek pipetovalo ústy, což mělo za následek v lepším případě znečištění vzorku slinami, v horším pak
poleptání úst. Při pipetování kapalinu nikdy nenasáváme ústy, ale k nasátí vzorku používáme pístový nástavec na
pipetu nebo balónek. Roztok je vhodné nasát asi 2 až 3 cm nad rysku, následně je třeba pipetu rychle uzavřít
ukazováčkem, vyjmout nad hladinu roztoku, špičku opřít o vnitřní stěnu nádoby a opatrným nadzvedáváním
ukazováčku upouštět nadbytečnou kapalinu tak, aby se meniskus právě dotýkal rysky (viz výše) u požadovaného
objemu.
Kapalinu z pipety necháme pozvolna vytékat po stěně kádinky. Při kalibraci se předpokládá, že roztoky budou
vypouštěny při svislé poloze volným výtokem bez napomáhání pístovým nástavcem, foukáním nebo poklepem.
Aby vytekla i kapalina pomalu stékající po vnitřních stěnách, je třeba vyčkat ještě alespoň 10 sekund (tzv. výtoková
doba), ačkoli se pipeta jeví již prázdná. V ústí pipety i poté vždy zůstane malá část objemu odměřované kapaliny.
Vzhledem k tomu je důležité ihned po použití pipetu promýt destilovanou vodou, aby v ní roztok nevyschl a
nekrystalizoval, a následně vysušit.
3. Odměřování objemů automatickou pipetou
a) ZÁKLADNÍ TECHNIKA PIPETOVÁNÍ
K odměřování přesných objemů roztoků se v současné laboratorní praxi nejčastěji používají
pístové automatické pipety. Dávkování je prováděno tlačítkem, které pohybuje pístem ve válci
pipety. Automatické pipety mohou být buď na fixní objem nebo plynule nastavitelné. Vzorek
je nabírán do nesmáčivé (polypropylenové) vyměnitelné špičky, takže s pístem ani tělem
pipety vůbec nepřichází do styku. Základní jednorázové špičky používané pro automatické
pipety bývají odlišeny barevně, nejčastěji viz tabulka:
barva špičky:
rozsah objemů:
Nastavení požadovaného objemu: Vždy je nutné dodržet bílá
0.2 až 10 μl
2 až 200 μl
rozsah objemů, pro které je pipeta určena a použít žlutá
200 až 1000 μl
odpovídající jednorázovou špičku. Objem je modrá
bílá
1 až 5 ml
nastavován otáčením šroubu, u některých pipet
případně otáčením ovládacího tlačítka pístu. Nastavování by mělo být prováděno pomalu
a plynule. K dosažení nejvyšší správnosti a reprodukovatelnosti při změnách nastavení
pipetovaného objemu překročte požadovaný objem o jednu třetinu otáčky a potom
pomalu snižujte na požadovaný objem. Nastavením objemu se píst v těle pipety pohne do odpovídající pozice.
Vlastní pipetování (viz schéma vpravo):
1)Stiskněte ovládací tlačítko pipety k prvnímu dorazu (mimo
pipetovaný vzorek!), píst v těle pipety vytlačí stejný objem
vzduchu, jako je nastavený objem.
2)Pipetu ve vertikální poloze ponořte špičkou jen asi 2 - 4 mm pod
hladinu kapaliny. Pokud byste špičku ponořili více, množství
tekutiny ulpělé zvenku na špičce by vedlo k hrubé nepřesnosti pipetování. VELMI POMALU a plynule
uvolňujte tlačítko, špičku přitom udržujte stále ponořenou ve stejné hloubce. Vznikající podtlak postupně nasává
do špičky tekutinu, přičemž pomalým nasáváním kapaliny do špičky se omezí možný vznik turbulence, která
může vyvolat vznik aerosolu a bublinek plynu, vycházejících z kapaliny. Po úplném uvolnění ovládacího tlačítka
vyčkejte ještě alespoň 1 sekundu, poté vytáhněte špičku z kapaliny. Vždy sledujte, zda do špičky nevnikly
bublinky vzduchu (např. při prudším povolení pístu ovladače nebo špatně nasazené špičce). Pipetu s nasátou
kapalinou udržujte ve svislé poloze tak, aby kapalina nemohla vniknout do těla pipety.
3)Umístěte špičku pipety k vnitřní stěně cílové nádoby v úhlu 10-40o. Při pipetování vzorků s biologickou aktivitou,
kde nesmí dojít k porušení solvatačního obalu makromolekul (např. proteiny, zejména enzymy) vypouštíme
vzorek pod hladinu rozpouštědla. Plynule stiskněte tlačítko k prvnímu dorazu. Vyčkejte 1 sekundu a stiskněte
tlačítko k druhému dorazu a tím vypudíte zbytek kapaliny. Za současného držení stisknutého tlačítka na druhém
dorazu vytáhněte špičku podél vnitřní stěny nádoby.
4)Uvolněte tlačítko (mimo vzorek). Odhoďte špičku stisknutím tlačítka odhazovače. (Stejnou špičku lze pro další
pipetování použít jen při pipetování téže kapaliny.)
Přípravné propláchnutí: Při pipetování se na vnitřní stěně špičky vytváří tenký film kapaliny. Tato chyba vypuzeného
objemu se tedy projeví významně pouze u prvního vzorku s novou špičkou. V okamžiku, kdy je vytvořen film,
jsou následující vzorky pipetovány s lepší přesností a reprodukovatelností. Proto je vhodné před pipetováním
provést přípravné propláchnutí špičky tak, že nasajete pipetovanou kapalinu z první polohy pístu tak, jak je
uvedeno výše v bodech 1 a 2, špičku z kapaliny nevytáhnete, ale stisknutím pístu do první polohy vypudíte
kapalinu zpět do původní nádoby. Propláchnutí musí být provedeno vždy při zvětšení pipetovaného objemu nebo
výměně špičky. Snižujete-li pipetovaný objem, použijte novou špičku.
/6
b) DALŠÍ VYUŽITÍ AUTOMATICKÉ PIPETY
Těkavé kapaliny: Výpary rozpouštědel mohou porušit těsnost pístu běžně používaných automatických pipet, pro
pipetování těkavých rozpouštědel je proto nutné použít speciální automatické pipety, které k nasávání vzorku
používají kapiláry s písty na jedno použití, které zabraňují kontaktu a proniknutí aerosolu do těla pipety.
V praktiku k pipetování těkavých kapalin používejte pipety skleněné, případně (pokud nezáleží na přesném
objemu přenášeného rozpouštědla - např. k oddělení těkavého rozpouštědla od vodné fáze po extrakci) lze použít
plastové Pasteurovy pipety. Zde je však nutno uvážit, zda dané rozpouštědlo nebude reagovat s plastem použitým
pro výrobu pipety (nejčastěji deriváty PE). Při pipetování těkavých kapalin dochází k odkapávání kapaliny ze
špičky způsobené tlakem par nad kapalinou. Tento efekt lze významně omezit vícenásobným propláchnutím špičky.
Viskózní kapaliny a kapaliny s vysokou hustotou: K manipulaci s hustými, viskózními kapalinami nebo i krémy se
doporučuje používat pipety k tomu určené, s aktivním vypuzováním. Při použití běžných pipet je nutné velmi
prodloužit nasávání i vypuzování vzorku, nejlépe ještě za použití reverzní techniky pipetování. Pro urychlení
pipetování je možné rozšířit otvor ve špičce ustřižením konce, v tom případě však nelze pipetovat celý maximální
objem špičky. Pokud je však potřeba odměřit opravdu přesný objem, je nutné použít gravimetrické ověření
(= vážením).
Reverzní technika pipetování (viz schéma vpravo): oproti základnímu
postupu nasajeme vzorek do celého objemu pipety, tedy ze druhého
dorazu (2), a vypustíme jen požadované množství, tj. stiskneme
pouze k prvnímu dorazu pístu (3).
Tato technika je vhodná pro pipetování viskózních či těkavých
kapalin a vzorků, které snadno tvoří pěnu.
Automatická pipeta je zcela nevhodná pro pipetování agresivních a korodujících kapalin. U hydrofobních látek může
docházet k jejich „vychytávání“ z vodného roztoku adsorpcí na vnitřní povrch špičky.
(adsorpce = hromadění látky rozpuštěné v kapalině na povrchu pevné látky účinkem mezipovrchových přitažlivých sil)
4. Vážení
a) OBECNÉ ZÁSADY VÁŽENÍ
Navažujte zásadně objekty pokojové (laboratorní) teploty. Nádobu se vzorkem vyjmutou z lednice či mrazícího boxu
otevírejte vždy až po jejím vytemperování na laboratorní teplotu, abyste zabránili kondenzaci vzdušné vlhkosti.
Nedodržení této zásady má za následek nejen hrubou chybu navážky, ale i znehodnocení celého vzorku. Naopak
teplý nebo horký objekt způsobí vedení proudu vzduchu kolem váženého objektu, přičemž tato síla redukuje tlak
vzduchu na misku vah a způsobuje problémy s kolísáním vážené hodnoty.
Navažujte pokud možno suché objekty. Vlhkost odpařovaná ze vzorku vede k hrubé nepřesnosti celého vážení.
Vyhněte se přímému kontaktu vážené chemikálie s miskou vah. Používejte váženky, tj. speciální polypropylenové
mističky s nízkou adhezivitou, případně alobal či přímo mikrozkumavky („eppendorfky“). Váženku umístěte do
středu plochy misky vah. Abyste nemuseli hmotnost nádobky od váženého vzorku odečítat, pomocí tlačítka
TARE (RE-ZERO) můžete předvážky i analytické váhy vynulovat i s nádobkou. S naváženým vzorkem na
vážence či alobalu neodcházejte, vzorek převeďte do baňky či kádinky přímo u vah!
Předvážky jsou velmi jednoduchými elektrickými váhami, váží většinou s přesností ± 0.01 g a jsou proto vhodné
například k odvážení pouze přibližného množství chemikálie, která má být v reakci v nadbytku a nevyžaduje vysokou
míru přesnosti. Dále, jak samo označení napovídá, jsou vhodné k předvážení přibližného množství látky a přesná
hmotnost je posléze navážena diferenčně na analytických vahách.
Analytické váhy. K přesnému vážení a vážení velmi malých hmotností (v řádu mg) je nezbytné použít analytické váhy,
které jsou o několik řádů citlivější než předvážky. Jsou velmi citlivé na chyby v podmínkách okolního prostředí,
vyžadují opatrnější manipulaci než předvážky. Měření mohou například ovlivnit nepatrné otřesy (pohyb osob ve stejné
místnosti, opíraní se o stůl), nerovnosti podlahy místnosti či proud vzduchu směřovaný na plochu vah. Proto se váhy
umísťují na těžký stůl (nejlépe z kamene) a poblíž stěny, kde jsou otřesy nejmenší, případně se budují tzv. váhovny,
tedy místnosti, kde jsou pouze váhy. Při odečítaní přesné hodnoty se pak doporučuje zavírat skleněná dvířka.
Obecně při vážení na analytických vahách není vhodné použití skleněných nádob, zejména pro jejich vlastní vysokou
hmotnost. V případě, že jsme nuceni skleněné nádoby použít, se jich nedotýkáme rukou (přenos nečistot z pokožky) používáme buď rukavice, pinzetu nebo kontakt přes papír. Stejně tak na skleněné objekty nedýcháme, protože z dechu
na nich kondenzuje voda a zvyšuje hmotnost objektu.
Používejte stejné váhy (analytické i předvážky), zejména v případě, že pracovní postup vyžaduje více než jedno měření
(například níže uvedené vážení z rozdílu). Každý přístroj může být totiž kalibrován s jemnými odchylkami.
/7
b) DŮLEŽITÉ POJMY PŘI NAVAŽOVÁNÍ PEVNÝCH LÁTEK
NAVÁŽENÍ „ASI PŘESNÉHO“ MNOŽSTVÍ. Ve většině případů potřebujeme navážit „asi přesné“ množství
chemikálie. Pojem "asi přesně 1 g" představuje množství okolo 1 g (0.9 – 1.1 g), ale navážené s vysokou
přesností na analytických vahách (tj. např. 1.0723 g). Nestačí tedy navážit na předvážkách 1.00 g, ale je také
zcela nesmyslné snažit se navážit 1.0000 g na analytických vahách, zvláště pokud nevážíme přímo do cílové
nádoby.
Chemikálii nikdy nepřeneseme z jedné nádoby do druhé (např. z váženky do kádinky) beze ztrát. Pokud není možné
vážit přímo do cílové nádoby (mikrozkumavka „eppendorfka“), jsou možné následující přístupy:
DIFERENČNÍ VÁŽENÍ NEBOLI VÁŽENÍ Z ROZDÍLU. Navažte přibližné množství dané chemikálie (možno i na
předvážkách). Poté hmotnost vzorku i s váženkou zvažte na vahách analytických (případně váhy na tuto
hmotnost vynulujte), chemikálii z váženky přesypte do cílové nádoby a opět važte vyprázdněnou váženku na
stejných analytických vahách (i se zbytkem nepřenesené chemikálie). Rozdíl hmotností získaných v těchto dvou
krocích určí přesnou hmotnost navážené chemikálie.
KVANTITATIVNÍ PŘEVEDENÍ VZORKU. Při přípravě vodného roztoku do odměrné baňky (již obsahující malé
množství vody či roztoku), navážku do baňky kvantitativně převedeme, což prakticky znamená, že navážku
látky sklepneme do malé nálevky zasunuté do hrdla odměrné baňky a následně vodou ze střičky opláchneme
váženku i nálevku.
5. Příprava roztoků
Směšovací objem
Při rozpouštění „vychytává“ rozpouštědlo z rozpouštěné tuhé látky molekuly nebo ionty, přerušuje síly, které je drží
pohromadě, a tak je dostává do roztoku. Rozpuštěné molekuly nebo ionty jsou rovnoměrně rozptýleny a obaleny
molekulami rozpouštědla neboli solvatovány (u vody mluvíme o hydrataci). V důsledku změn uspořádání molekul
rozpouštědla při tvorbě solvatačních obalů při rozpouštění pevných látek i ředění roztoků často dochází ke snížení
výsledného objemu roztoku oproti součtu objemů složek roztoku (směšovací objem). Roztok o požadované
koncentraci připravíme navážením přesného množství dané látky a doplněním rozpouštědlem na přesný objem
v nádobě kalibrované na dolití (IN - odměrná baňka). Správně postupujeme tak, že přidáváme rozpouštěnou látku či
ředěný roztok do rozpouštědla a ne naopak.
Příprava vodného roztoku v odměrné baňce
Látku naváženou na analytických vahách (s přesností ± 1 %) či odměřené množství kapaliny kvantitativně
převedeme do odměrné baňky již obsahující malé množství vody, tj. navážku látky sklepneme do malé nálevky
zasunuté do hrdla odměrné baňky, vodou ze střičky do nálevky opláchneme i váženku tak, aby by celkový objem
směsi zaujímal cca 1/3 celkového objemu baňky. Rozpouštění urychlíme mícháním krouživým pohybem celé
baňky (ne tyčinkou ani míchadlem). Teprve po úplném rozpuštění (a případném vytemperování roztoku na teplotu,
na kterou je baňka kalibrována) doplníme baňku po rysku destilovanou vodou - poslední kapky přidáváme opatrně
pipetou. Naplněnou baňku uzavřeme suchou zátkou a několikrát promícháme obrácením baňky dnem vzhůru a zpět,
přičemž zátku přidržujeme palcem.
Rychlost rozpouštění (nikoliv však
rozpustnost – viz odstavec vpravo)
můžeme
ovlivnit
intenzívním
mícháním směsi (odstraníme tak
lokální přesycení danou látkou
v roztoku)
či
ultrazvukem.
Biologicky aktivní látky jsou však na
tyto vlivy citlivé - vysoká teplota,
příliš bouřlivé míchání či působení
ultrazvuku mohou vyvolat ztrátu
jejich biologické aktivity.
Schopnost látek se rozpouštět v daném rozpouštědle za daných podmínek a vytvářet
s rozpouštědlem roztok se nazývá rozpustnost. Látky úplně nerozpustné neexistují, avšak u
špatně rozpustných látek je rozpuštěné množství těžko postřehnutelné. Jsou možné tyto stupně
rozpustnosti látek:
•neomezená rozpustnost (resp. mísitelnost, př. voda-ethanol),
•omezená/částečná rozpustnost (př. voda-ether, většina pevných látek a plynů v kapalinách –
viz dále)
•praktická nerozpustnost (př. voda-petrolej, voda-PbCl2).
Většina pevných látek i plynů je v daném objemu rozpouštědla částečně rozpustná, tedy existuje
určitá maximální možná koncentrace, nasycený roztok. Míru rozpustnosti tuhých látek za
daných podmínek proto charakterizujeme právě jejich koncentrací v nasyceném roztoku.
Na zvýšení rozpustnosti má vliv teplota (s rostoucí teplotou se u většiny
tuhých látek zvyšuje i rozpustnost).
Příprava roztoků v biochemické laboratoři
Práce s odměrnou baňkou neumožňuje např. úpravu pH roztoku a práce s ní je prakticky nemožná, pokud je
rozpouštěného vzorku větší množství a zároveň je hůře rozpustný. Tam, kde nezáleží na zcela přesné koncentraci
roztoku – např. u pufrů nebo činidel přidávaných do reakčních směsí v nadbytku – se uchylujeme k ne zcela přesnému
postupu, kdy si sami orientačně kalibrujeme vhodnou nádobu na potřebný objem (na dolití).
Pomocí odměrného válce odměříme např. do kádinky s magnetickým míchadlem požadovaný objem destilované vody, popisovačem vyznačíme
rysku, část destilované vody odlijeme (dále použijeme). V kalibrované nádobě s částí vody rozpustíme vzorek a po úpravě pH atd. doplníme po rysku
destilovanou vodou.
V biochemii často pracujeme jen s roztoky o malých objemech a nízkých koncentracích, kde zanedbáváme směšovací
objem. Při práci s malým množstvím vzorku pak nejčastěji postupujeme tak, že navážíme (přesně) přibližnou
hmotnost, nejlépe přímo do mikrozkumavky, a spočítáme jaký objem rozpouštědla je nutno přidat, aby vznikl
roztok o přesné požadované koncentraci.
/8
VYJADŘOVÁNÍ SLOŽENÍ ROZTOKŮ
Látková koncentrace,
molarita (c)
= látkové množství
rozpuštěné látky A
připadající na jednotku
objemu roztoku.
cA =
nA
mA
=
V V.Mr( A)
[mol · l-1 ]
Hmotnostní koncentrace
(cm)
= hmotnost rozpuštěné
látky A připadající na
jednotku objemu roztoku.
cm( A) =
mA
V
[ g · l-1 ] [ %(w/v) ]
Hmotnostní zlomek (w)
Objemový zlomek (φ)
= podíl hmotnosti
rozpuštěné látky A
a hmotnosti roztoku.
= podíl objemu rozpuštěné
látky A a objemu roztoku.
wA =
mA
.100%
m
[ %(w/w) ]
ϕA=
VA
.100%
V
[ %(v/v), obj. % ]
Roztoky o stejné molaritě obsahují v jednom litru roztoku stejný počet molekul rozpuštěné látky neboli stejné látkové
množství n [mol]. 1 mol jakékoliv látky obsahuje počet molekul rovný Avogadrově konstantě (6.023 x 10 23). Hmotnost
1 molu látky označujeme jako molární hmotnost - např. M(NaOH) = 40 g/mol. Molekulová relativní hmotnost má
stejnou hodnotu, ale je bez jednotky- např. Mr(NaOH) = 40.
Při rozpouštění pevných látek ve vodě se také běžně (nepříliš správně) uvádí podíl hmotnosti rozpouštěné látky a
objemu roztoku jakožto %(w/v), tj. vlastně hmotnostní zlomek, kde uvažujeme hustotu roztoku rovnu jedné. Roztok o
koncentraci 1%(w/v) odpovídá hmotnostní koncentraci 10 g · l-1.
Jednotky SI [mol · m-3] pro molaritu nebo [kg · m-3] pro hmotnostní koncentraci se v praxi nepoužívají. Při vyjadřování
koncentrace látky pomocí objemového a hmotnostního zlomku je vždy nutné uvést, zda se jedná o objemová (v/v) či
hmotnostní (w/w) procenta. Číslo a příslušnou jednotku v textu vždy oddělujeme mezerou (např. "0.1 mol/l").
Výjimku tvoří případy, kdy je jednotka použita jakožto přídavné jméno, tedy např. "50% EtOH" (= 50procentní vodný
roztok ethanolu). Molarita se někdy označuje tak, že se vzorec látky uvede do hranaté závorky - koncentraci NaCl tak
označujeme [NaCl]. "1molární vodný roztok" NaCl se také často zkracuje na "1M" NaCl.
6. Ředění roztoků, ředicí řady
Při ředění roztoků se setkáváme s různými
formami zápisu, v těchto skriptech se
budeme držet tohoto: ředění zásobního
roztoku v poměru 1 : 2 znamená totéž, co
ředění 3x, tj. že ke 2 dílům rozpouštědla
přidáme 1 díl zásobního roztoku.
Při mísení dvou roztoků o známých hmotnostech m a hmotnostních
zlomcích w (event. procentualitách) se používá směšovací rovnice:
m1w1 + m2w2 = (m1 + m2) · w3
Hmotnostní zlomek čisté látky v pevném stavu se rovná jedné (resp.
100 %), hmotnostní zlomek čistého rozpouštědla je roven 0.
Směšovací rovnice se často převádí na diagonální schéma křížového
pravidla:
Výpočty ohledně mísení (či ředění) roztoků
o známé molaritě je možno uskutečnit na
principu zachování látkového množství
dané složky v různých objemech:
n1 + n2 = n3
c1V1 + c2V2 = c3V3
Zcela analogicky postupujeme při ředění
roztoků o známé hmotnostní koncentraci
(na základě zachování hmotnosti dané
složky v různých objemech).
Poměr (w3 – w2) / (w1 – w3) udává poměr mísení roztoků o složení w 1 a
w2. Pokud např. potřebujeme smísením 100% roztoku (= w 1) a 25%
roztoku téže látky (= w2) připravit roztok 50% (= w3), je nutno smísit:
w3 – w2 = 50 – 25 = 25 dílů 100% roztoku
w1 – w3 = 100 – 50 = 50 dílů 25% roztoku
- dle typu zlomku (%w/w či %w/v) se může jednat jak o díly hmotnostní , tak i objemové
Potřebujeme-li připravit sérii roztoků s klesající koncentrací, nabízí se následující přístupy:
Geometrická ředící řada
Postup*) (např. desítková řada o objemu 9 ml):
(„serial dillution“)
1.do všech zkumavek odměříme stejný objem rozpouštědla odpovídající
Koncentrace v každé následující požadovanému výslednému objemu (např. vždy 9 ml dest. vody)
zkumavce je zlomkem (např.
2.do první zkumavky přidáme objem zásobního roztoku z pracovní kádinky tak,
desetinou) koncentrace
aby odpovídal požadovanému ředění (např. 1 ml roztoku)
předchozí
3.obsah zkumavky důkladně promícháme a tentýž objem (tj. 1 ml ředěného
roztoku) přeneseme do zkumavky následující
4.bod 3 opakujeme, dokud se nedostaneme až k poslední zkumavce
5.abychom získali stejný výsledný objem i v poslední zkumavce, je nutné z ní
také odpovídající objem roztoku (tj. 1 ml) odebrat.
/9
Aritmetická ředící řada
Postup*):
Koncentrace v sérii zkumavek 1.do všech zkumavek odměříme příslušný vypočtený objem rozpouštědla (např.
klesá lineárně.
dest. vody)
2.do každé zkumavky přidáme příslušný objem zásobního roztoku z pracovní
kádinky.
*
Při přípravě roztoků uvedeným postupem zanedbáváme směšovací objem. Pokud bychom požadovali přesné koncentrace, je
třeba pracovat s odměrnými baňkami – tj. např. při použití geometrické řady odebírat z baňky po jejím doplnění na požadovaný
objem.
Nevýhody obou metod:
•Použití aritmetické řady je omezeno malým rozsahem koncentrací a je časově náročnější na přípravu i praktické
provedení.
•Ředění geometrickou řadou může být zatíženo systematickou chybou (např. při pochybení při přípravě prvního roztoku
bude koncentrace odlišná ve všech roztocích).
7. Filtrace
Filtrace je separační metoda, která umožňuje oddělit složky suspenze: pevná látka se zachytí na filtru, kapalina proteče
jako filtrát. Nejjednodušší aparaturu pro filtraci představuje filtrační nálevka, do níž vkládáme vhodně složený filtrační
papír:
Filtr zhotovíme ze čtverce filtračního papíru, který složíme pravoúhle na čtvrtinu
a okraje složeného papíru pak sestřihneme do kruhového výseku tak, aby jeho
poloměr byl o 0.5 cm menší než výška nálevky.
„Hladký filtrační papír“ získáme tak, že jednu „kapsu“ filtru rozevřeme a
získaný kornout, jehož jedna strana je tvořena pouze jednoduchou stěnou filtru a
druhá trojitou, vsuneme do nálevky, navlhčíme rozpouštědlem (nejčastěji vodou
ze střičky) a přitiskneme na stěny. Pozor, neprotrhnout špičku!
Tento tzv. hladký filtr filtruje zejména špičkou a poměrně pomalu. Používáme jej
všude tam, kde je tuhé látky v suspenzi malé množství a jde nám o zužitkování
právě tuhé látky na filtru zachycené.
Rychleji pracuje filtr skládaný čili francouzský. Připravíme jej tak, že kruhový
výsek filtračního papíru rozložíme v polokruh a překládáme vějířovitě od středu
k obvodu střídavě po stranách v menší výseky, přičemž špička filtru musí být
ostrá. Zároveň se však snažíme, aby se několikerým složením filtr nepoškodil ve
špičce - proto při překládání dbáme na to, aby jednotlivé záhyby neprocházely
jedním bodem, nýbrž byly od sebe poněkud vzdáleny. Doporučuje se složený
filtr před vložením do nálevky rozevřít a obrátit tak, aby původní vnější stěna
filtru tvořila stěnu vnitřní, poněvadž se plocha papíru obvykle v místě ohybu
přímým stykem s prsty ruky může poškodit nebo i ušpinit; tak zabráníme
znečištění filtrátu papírovými vlákny a jinými nečistotami. Skládaný filtr se opírá
o nálevku jen hranami, čímž se zvětší filtrační plocha, takže filtrace
francouzským filtrem je daleko rychlejší než filtrace hladkým filtrem téhož
průměru.
/ 10
Nálevku s filtrem vkládáme do kruhu železného
stojanu a pod ni umisťujeme nádobu k zachycování
filtrátu. Stonek nálevky se má při filtraci špičkou
šikmo seříznutého konce dotýkat stěny nádoby filtrát pak klidně stéká po stěně nádoby a
nevystřikuje.
Roztok naléváme na filtr po skleněné tyčince,
kterou ve vhodném úhlu přiblížíme ke stěně filtru.
Při použití hladkého filtru proud kapaliny řídíme
vždy proti místu, kde je papírová vrstva trojitá,
poněvadž jednoduchá stěna filtru by se mohla
snadno protrhnout. Filtr plníme podle jeho velikosti
nejvýše 10 až 15 mm pod jeho okraj.
Rychlost filtrace závisí na ploše a
vlastnostech filtračního prostředí - na
počtu a velikosti pórů, na povaze
sraženiny i na viskozitě a aciditě
filtrované kapaliny. Chceme-li filtraci
urychlit a použité látky to nepoškodí,
filtraci můžeme provádět za horka či
snížit odsáváním vzduchu tlak v prostoru
pod filtrem. Filtrační materiál je určován
chemickým charakterem filtrovaného
roztoku – vedle filtračního papíru se
využívá např. vrstva vaty, pórovitá
skleněná nebo porcelánová frita či různé
typy membrán (ze smíšených esterů
celulózy, teflonové, polykarbonátové)
s různou
velikostí
pórů
pracující
v aparaturách založených na vakuovém
nebo tlakovém principu.
8. Centrifugace
Centrifugace neboli odstřeďování slouží k oddělení složek na základě rozdílných hustot. Vedle využití k rychlejšímu
oddělení složek emulze při extrakci slouží centrifugace zejména k oddělení složek suspenze jako často výhodnější
alternativa k filtraci; dále ke speciálním účelům jako např. k přípravě buněčných struktur (frakční či gradientová
centrifugace) či stanovení relativních molekulových hmotností makromolekulárních sloučenin.
V centrifugách se používají 2 typy rotorů: ve výkyvných rotorech jsou centrifugační zkumavky či kyvety uloženy
v pouzdrech volně zavěšených na čepech vlastního rotoru a kyvety jsou během odstřeďování ve vodorovné poloze,
naproti tomu v úhlových rotorech jsou kyvety fixovány v určitém úhlu (45 - 50°) k ose otáčení.
Protilehlé kyvety musí být vždy stejné (= stejná velikost, materiál), mít stejně umístěné těžiště (= musí být naplněny
stejnou suspenzí) a stejnou hmotnost - protilehlé kyvety vždy vyvažujeme (u výkyvných rotorů včetně pouzder).
Nikdy centrifugu nezapínejte bez rotoru!
Centrifugaci charakterizujeme údajem o odstředivém zrychlení, které se uvádí nejčastěji relativně vůči zemskému
gravitačnímu zrychlení (např. „20 000 g“, kde g = 9.81 m·s-2). Druhou možností je uvést rychlost otáčení jakožto
počet otáček za minutu (= revolutions per min, RPM), pro jednoznačné vyjádření odstředivého zrychlení je nutné
k tomuto údaji uvést ještě poloměr otáčení, což se v praxi řeší uvedením typu centrifugy a rotoru.
Na sedimentující částici o
hmotnosti m působí odstředivá
síla P:
P=m.a
kde a je odstředivé zrychlení.
Odstředivé zrychlení a vedle
úhlové rychlostí otáčení ω
[rad.s-1] závisí na poloměru
otáčení r [cm]:
a = r · ω2
Počet otáček za minutu [RPM]
je v podstatě vyjádřením úhlové
rychlostí ω:
2π
60
Tento údaj je tedy nutno uvést
společně s údajem o poloměru
otáčení r (případně typu
centrifugy a rotoru)
ω = (RPM) ⋅
Relativní odstředivé zrychlení
R je vyjádřením odstředivého
zrychlení
a
vztaženého
k zemskému
gravitačnímu
zrychlení g:
R=a/g
kde g = 9.81 m·s-2
Pro přepočet mezi relativním
odstředivým zrychlením R a
počtem otáček za minutu
(RPM) pak platí vztah:
R = r ⋅ f ⋅ (RPM ) 2
2
 2π  1
-5 2
−1
kde f = 
 ⋅ = 1.118 · 10 s cm
 60  g
Zpracování experimentálních dat
/ 11
1. Zaokrouhlování a platné číslice
Při každém měření je nutné si uvědomit, s jakou přesností měříme. Naměřená hodnota 4.00 opravdu není totéž, co
naměřená hodnota 4. Experimentální hodnoty je nutno uvádět s příslušným počtem desetinných míst.
Pojem platných číslic výsledku měření osvětlíme na příkladu délky změřené pravítkem:
L = 3.0 cm = 0.030 m = 30 mm
tj. stále 2 platné číslice
Při odečtu hodnoty jakékoli měřené veličiny ze stupnice lze poslední platné místo odhadnout, tj. v případě měření
pravítkem je možno výsledek vyjádřit i přesněji:
L = 3.05 cm = 0. 0305 m = 30.5 mm
tj. stále 3 platné číslice
Výsledek jakéhokoli výpočtu musí být zaokrouhlen tak, aby obsahoval právě jen platné číslice. Počet platných cifer
výsledku by měl respektovat nejméně přesnou hodnotu ze všech, jež do vzorce dosazujeme - např. je nutno zvážit, jak
přesná byla koncentrace kalibračních roztoků, jak přesně byly pipetovány přídavky činidla a pod. Obvykle tak uvádíme
výsledek na tři, maximálně na čtyři platné číslice.
Pravidla při výpočtech:
Na kalkulačce se počítá se všemi místy, zaokrouhlí se až výsledek, tj. nezaokrouhlují se mezivýsledky.
Při sčítání, odčítání:
počet desetinných míst ve výsledku
= minimální počet desetinných míst
čísel, z nichž počítám.
Při násobení, dělení:
počet platných číslic ve výsledku
= minimální počet platných číslic
čísel, z nichž počítám.
např.: odměříme skleněnou pipetou 25.0 ml, k tomu
přidáme automatickou pipetou 20 μl vzorku.
Výsledný objem roztoku:
V = 25.0 ml + 0.020 ml = 25.020 ml
správný výsledek je 25.0 ml (tj. 1 desetinné místo)
např.: navážím 0.0034 g vzorku, přidám 300 μl
destilované vody.
Výsledná koncentrace roztoku:
cm = 3.4 mg / 0.300 ml = 11.3333333 mg/ml
správný výsledek je 11 mg/ml (tj. 2 platná místa)
2. Chyby měření, základy statistického zpracování výsledků
NÁHODNÉ CHYBY vznikají při každém měření, mají
nepravidelný charakter a jsou zpravidla malé s tendencí
vzájemné
kompenzace;
ovlivňují
tedy
přesnost
(reprodukovatelnost) výsledků. Jsou způsobeny fluktuací
tlaku, teploty, vlhkosti, magnetického pole, drobnými
nepřesnostmi při vážení nebo měření, nedokonalostí
odečítání sledované veličiny (paralaxou při čtení na stupnici,
nepřesným odhadem částí dílků stupnice) apod.
CHYBY SYSTEMATICKÉ (SOUSTAVNÉ) zkreslují při
opakovaném měření konaném za stejných podmínek hodnotu
měřené veličiny stále stejným způsobem. Teoreticky je
možné tyto chyby vyloučit, pokud je můžeme ohodnotit
pomocí přesnějších přístrojů a/nebo zavést korekci na
zpřesnění měřicí metody; v praxi je však tento úkon mnohdy
těžko uskutečnitelný. Podle původu těchto chyb je třeba
odlišit chyby způsobené nepřesností měřících přístrojů,
chyby metody a chyby pozorovatele. Systematické chyby
použité metody vznikají nedokonalostí použitého způsobu
měření (zjednodušujícími podmínkami měřicí metody,
přibližností použitých vztahů, nevhodností použitého
způsobu měření). Systematické chyby pozorovatele vznikají
např. reakční dobou při měření časových údajů, omezenou
rozlišovací schopností oka atd. Tyto chyby způsobují, že ne
vždy je využita přesnost měřicích přístrojů uváděná
výrobcem a lze je vyloučit tím, že subjektivní měření
nahradíme objektivním (pomocí přesného čidla spojeného
s měřicím přístrojem).
CHYBY HRUBÉ vznikají v důsledku omylů při provádění
měření (analýzy) nebo při vyhodnocení výsledku, mají
objektivní i subjektivní charakter. Velká hodnota chyby může
způsobit nepřesnost a nesprávnost konečného výsledku, proto
je nezbytné odlehlý výsledek vyloučit ze souboru hodnot.
Statistické vyhodnocení odlehlosti výsledku (eliminace hrubé
chyby) a testování správnosti výsledku (statistická
významnost systematických chyb) se provádí pomocí různých
typů testů a nebude náplní tohoto praktika.
Rozdělení náhodných chyb, tj, závislost pravděpodobnosti výskytu chyb na
jejich absolutní velikosti, představuje v grafickém vyjádření Gaussova křivka.
U souboru
konečného
počtu
měření
je
nejlepším
odhadem
nejpravděpodobnější hodnoty měřené veličiny (= polohy maxima křivky)
ARITMETICKÝ PRŮMĚR naměřených hodnot:
n
kde xi je naměřená hodnota při i-tém měření
∑i = 1 xi
n je počet měření
x=
n
Míru „přesnosti“ série paralelních výsledků budeme
vyjadřovat jako směrodatnou (standardní) odchylku σ
(„sigma“), tj. ROZPTYL HODNOT okolo hodnoty
aritmetického průměru (přesněji řečeno pološířka Gaussovy
křivky v místě inflexního bodu). Čím je rozptyl hodnot menší,
tím je křivka užší, symetričtější s velkou četností správných
dat, tj. hodnocený soubor je přesnější.
∑ (x
n
σ =
i= 1
i
− x
)
2
n− 1
Aritmetický průměr i směrodatná odchylka mají stejný
rozměr (jednotky) jako experimentální hodnoty, ze kterých
byly určeny.
„Správnost“ výsledku budeme pro účely tohoto praktika
vyjadřovat jako relativní chybu měření (t), tedy relativní
odchylku [%] aritmetického průměru experimentálních
hodnot x od správné (= teoretické) hodnoty (μ):
t=
x− µ
µ
⋅ 100 %
/ 12
3. Zásady pro sestrojování grafů
Pokud je u úlohy uveden požadavek, aby byl graf vynesen ručně na milimetrový papír či na počítači, tento požadavek
respektujte. Jeden graf vždy uvádějte na 1 papír A4. Grafy musí mít všechny potřebné náležitosti:
▪
název, z něhož je zřejmé, o jaké stanovení se jedná, jakou závislost vyjadřuje.
▪
souřadnicové osy s řádným popisem, tj. označení nanášené veličiny včetně příslušné jednotky
○ na ose x je nezávisle proměnná veličina (= proměnná, na které závisí ta druhá), kterou experimentátor sám
mění, tedy nenáhodná a (měla by být) přesná - např. koncentrace roztoku
○ na ose y (svislá) je závisle proměnná, náhodná, zatížená chybou měření - např. absorbance, pH a pod.
▪
měřítko, tj. rovnoměrně vynesená stupnice v lineárním měřítku. Všechna čísla na stupnici musí mít stejný
počet desetinných míst, který odpovídá přesnosti měření. Nikdy na osy neuvádíme přímo naměřené nebo
vypočítané údaje jednotlivých měření, ty uvedeme v přiložené tabulce. Při sestrojování grafu zvolte na osách
optimální rozsah (např. když pracujete v zásadité oblasti pH, tj. v rozsahu 7 až 11, je nesmyslné, aby osa začínala
nulou), snažte se tedy využít co největší možnou plochu papíru pro vlastní výnos. Při vynášení grafu na mm papír
však volte "rozumné" měřítko, kdy např. hlavním jednotkám či jednotlivým přídavkům odpovídají alespoň celé
milimetry.
▪
viditelně vynesené experimentálně získané „body“ – nejlépe + (u grafů na mm papíře nepoužívejte •).
Neuvádějte spojnice bodů k osám – ty se uvádějí jen u hodnot „odečítaných“ z kalibrační křivky.
▪
příslušnou funkční závislost - proloženou přímku (úloha 4, 8) nebo spojitou křivku (úloha 7). Vždy zvažte, zda
přímka proložená vynesenými body (lineární regrese) má či nemá procházet bodem [0;0], tj. jaká je hodnota
koeficientu b v rovnici přímky y = a · x + b.
Při zpracování dat v Excelu označte číselné řady hodnot (i se záhlavími) a vložte typ grafu XY-bodový. Po kliknutí
na jeden z bodů pravým tlačítkem myši vyberte „Přidat spojnici trendu", vyberte „Lineární regresi“ a následně
zvolte možnosti „zobrazit rovnici přímky“ a také, zda má přímka procházet bodem [0;0] („Hodnota Y = 0“).
Při sestrojování grafu na milimetrový papír budete v rámci těchto praktik prokládat přímku naměřenými body
odhadem. Nespojujte první a poslední měřený bod, ale snažte se, aby přímka co nejlépe respektovala všechny
naměřené hodnoty. Předpokládáme, že z grafu na milimetrovém papíře umíte rovnici přímky určit.
Důležité pojmy:
Kalibrace = určení závislosti mezi dvěma fyzikálními veličinami, kdy veličina přímo měřitelná ( y – např. absorbance)
se mění v závislosti na druhé veličině, jejíž hodnoty nejsou přímo měřitelné (x – např. koncentrace). K tomu
potřebujeme standardy, u nichž známe hodnoty x a odpovídající hodnoty y změříme. Určíme kalibrační závislost tj. ve
výsledku nepřímo měříme koncentraci stanovované látky.
Lineární regrese je matematická metoda používaná pro proložení souboru bodů v grafu přímkou (či jinou funkcí). O
bodech reprezentujících měřená data se předpokládá, že jejich x-ové souřadnice jsou přesné, zatímco ypsilonové
souřadnice mohou být zatíženy náhodnou chybou. Pokud měřené body proložíme přímkou, tak mezi ypsilonovou
hodnotou měřeného bodu a ypsilonovou hodnotou ležící na přímce bude odchylka. Podstatou lineární regrese je
nalezení takové přímky, aby součet druhých mocnin „ypsilonových odchylek“ všech bodů, tj. ∑(yi – (a ·xi + b))2, byl co
nejmenší („metoda nejmenších čtverců“).
Interpolace = odhad hodnoty x na základě změřené hodnoty y v rámci rozsahu kalibračních standardů.
Extrapolace = nalézání přibližné hodnoty mimo interval známých hodnot.
/ 13
4. Pracovní protokoly
Protokoly budou v praktiku řešeny formou formuláře, vypracovává je každý student samostatně a odevzdává je
vždy do týdne (před vypracováním další úlohy).
Obecně je protokol nutno vypracovat na volné listy papíru formátu A4, přičemž na každém listu je uvedeno jméno,
číslo pracovní skupiny, název úlohy a datum, kdy jste úlohu v laboratoři vypracovali. Pokud úloha sestává z více úkolů,
je přehlednější uvést pro každý úkol „samostatný protokol“. Protokol by měl být stručný, výstižný a přehledný, bez
zbytečných duplicit a měl by obsahovat následující části:
1.TEORETICKÝ ÚVOD = principy použitých metod
2.POUŽITÝ MATERIÁL, POMŮCKY A PŘÍSTROJE
3.VÝPOČTY navážek, ředění roztoků apod. nutné k postupu, a to včetně vztahů a vzorců nutných k početnímu
zpracování. Výsledné hodnoty adekvátně zaokrouhlete (viz výše).
4.PRACOVNÍ POSTUP = podrobně vlastními slovy (v minulém čase) co a jak bylo opravdu uděláno včetně
odchylek od návodu, přesných navážek (uveďte, zda jste použili diferenční vážení), použitých přístrojů, pomůcek,
podmínek měření apod. - tedy tak, aby byl podle protokolu experiment přesně reprodukovatelný. Dodržujte počet
platných míst - navážka 0.1 g není totéž co 0.10 g !!!
5.VÝSLEDKY (+ jejich vyhodnocení, grafy) = (pouze) to, co jste pozorovali či naměřili, případně co jste
z naměřených hodnot vypočetli (tedy NE jak experiment „měl vyjít“, NE co z experimentu usuzujete – obojí je
součástí diskuze!). Počet platných cifer výsledku musí respektovat nejméně přesnou hodnotu ze všech, nejen přesnost
měřících přístrojů, ale např. i přesnost pipetování. Obvykle tak uvádíme výsledek na tři, maximálně na čtyři platné
číslice. Výsledky uvádějte co nejpřehledněji, nejlépe formou tabulky. Grafy uvádějte společně s tabulkou hodnot, ze
kterých byly sestrojeny. Zásady pro sestrojování grafů jsou uvedeny v předcházející kapitole.
6.DISKUZE = zhodnocení dosažených výsledků s vysvětlením, co z výsledků vyplývá; porovnání naměřených nebo
vypočítaných hodnot s údaji tabelovanými, teoreticky vypočítanými apod., porovnání výsledků získaných za použití
různých metod - zdůvodnit přednosti i nedostatky každé metody. Pokud výsledek neodpovídá výsledku
předpokládanému, zaměřte se na možné zdroje systematických chyb odrážejících správnost celého měření či metody,
tedy chyby, které nelze odstranit opakovaným měřením za stále stejných podmínek - např. nevhodně zvolený postup
(při určování koncentrace jedné látky může být stanovení rušeno současným stanovením příměsi apod.), špatnou
kalibrací atd.
7.ZÁVĚR (= velice stručné shrnutí důležitých výsledků / poznatků).
Úloha 1. ODMĚŘOVÁNÍ OBJEMŮ, ŘEDĚNÍ ROZTOKŮ
/ 14
K vypracování úlohy je nutná znalost následujících kapitol z úvodní části skript:
kapitoly 1, 2, 3, 4A, 5, 6
kapitoly 1, 2, 4
Kontrolní otázky
1. Jaký objem je odměřen pomocí odměrného válce na obrázku? Jde přímo o objem vody
přítomný v odměrném válci?
2. Jak byste postupovali při přípravě následujících ředicích řad o výsledném objemu 600 μl?
a) šestkové (tj. ředění 1:5 - každý následující roztok má oproti předchozímu šestinovou
koncentraci)
b) desítkové (tj. každý následující roztok má oproti předchozímu desetinovou
koncentraci)
3. Určete, zda jsou výsledky na jednotlivých obrázcích „správné“ a
hodnotou je střed):
„přesné“ (správnou
4. Na misku vah bylo vždy pipetováno 700 μl destilované vody. Vypočítejte a určete, která z následujících sérií
měření byla měřena „správně“ a která „přesně“. Uvedené hodnoty jsou v gramech:
a) 0.6195, 0.7922, 0.7298, 0.6527
b) 0.6555, 0.6387, 0.6462, 0.6570
c) 0.6973, 0.7081, 0.6817, 0.7124
✔určete „správnou hodnotu“ μ, tedy jaká je teoretická hmotnost 700 μl destilované vody (uvažujte hustotu vody při
laboratorní teplotě 0.9986 g/ml)
✔vypočítejte aritmetický průměr x i z hodnot naměřených v rámci jednotlivých měření [g].
✔vyjádřete v procentech, jaká je „správnost“ daného měření t, tedy odchylka hodnoty průměrné x i od hodnoty správné
μ, a to relativně vůči μ.
✔z jednotlivých naměřených hodnot vypočítejte směrodatnou odchylku σi [g]. Výsledné hodnoty σ vyjádřete také
v procentech relativně vůči x i .
✔určete, která série měření je správná, přesná. Za správné resp. přesné považujte měření, kdy je příslušná odchylka ≤ 5
%.
Pracovní postup
Chemikálie a vzorky: zásobní roztok barviva o koncentraci 5 g/l, glycerol, ethylacetát
Přístroje a pomůcky: automatické pipety + špičky (fixní 200 μl, nastavitelné 200 a 1000 μl), skleněné pipety (2, 5, 10
ml) + nástavec, odměrné baňky (10 ml) + zátky, kádinky (100 ml), zkumavky, stojánek na zkumavky, plastové
mikrozkumavky (0.5 a 1 ml), mikrotitrační destička, váženky, analytické váhy, Vortex
V následujících úkolech budete při ředění roztoků zanedbávat směšovací objem.
1. Ředění roztoků
Do zkumavky připravte za pomoci skleněné pipety následující roztoky o objemu 5 ml. Při ředění
roztoků vždy postupujte tak, že ředěný roztok přidáváme k alespoň malému objemu rozpouštědla
(zde destilované vody).
a) Připravte 3 x (tj. 1 : 2), 7 x respektive 12 x zředěný zásobní roztok barviva. Uveďte výsledné
koncentrace roztoků.
b) Z výše uvedeného 3 x naředěného roztoku (odlijte do kádinky) připravte ředěním v poměru 1 : 4
další roztok. Uveďte výsledné ředění a koncentraci roztoku.
/ 15
2. Ředící řady
a) Z výchozího roztoku barviva za pomoci automatické pipety připravte do stejných zkumavek
aritmetickou ředící řadou roztoky s narůstajícím poměrem ředění roztok : rozpouštědlo,
konkrétně v poměru 1 : 9, 2 : 8, 3 : 7 až 9 : 1 o celkovém objemu 1 ml.
Nejdříve do všech zkumavek napipetujte požadovaný objem destilované vody. Pokud to rozsah pipety umožní a
budete pipetovaný objem postupně zvyšovat, lze používat stále stejnou špičku. Následně přidávejte požadovaný
objem zásobního roztoku barviva. Opět postupujte od nejmenšího objemu a pokud špičku neponoříte do kapaliny ve
zkumavce, můžete ji používat opakovaně.
b) Z výchozího roztoku barviva za pomoci skleněné pipety připravte 5 roztoků o objemu po 5 ml
trojkovou ředicí řadou, tj. následující roztok bude mít vždy 3 x nižší koncentraci než roztok
předchozí.
Aby bylo dodrženo ředění 1 : 2, budeme mezi jednotlivými zkumavkami přenášet 2.5 ml roztoku barviva. Do všech zkumavek
pipetujte 5 ml vody. Odeberte 2.5 ml zásobního roztoku barviva, přeneste do první zkumavky a důkladně promíchejte. Odměřte
2.5 ml z první zkumavky, přeneste do následující a důkladně promíchejte. Postup opakujte až k poslední zkumavce. Abyste
získali 5 ml i v poslední zkumavce, je nutné z ní také 2.5 ml roztoku odebrat.
c) Mikrotitrační destička. Do řady v mikrotitrační destičce připravte za pomoci automatické pipety
ze zásobního roztoku barviva roztoky ředicí řadou dle zadání vyučujícího.
Do protokolu uveďte koncentrace všech připravených roztoků.
3. Pipetování těkavých a viskózních kapalin automatickou pipetou
U všech použitých kapalin je nutno odlít přiměřené množství do pracovní kádinky!
a) Pipetování ethylacetátu
Ethylacetát je těkavý, proto pracujte v digestoři a použijte pipetu vyhrazenou pouze k tomuto
účelu, přičemž omezte setrvání ethylacetátu ve špičce pipety na minimum. Do jedné
mikrozkumavky ("eppendorfky") každý samostatně pipetujte základní technikou 200 μl ethylacetátu
a do druhé stejnou technikou stejný objem zásobního roztoku barviva. Vyzkoušejte bez i
s přípravným opakovaným propláchnutím špičky, každý pokus zopakujte alespoň 2x.
b) Pipetování glycerolu
Do jedné mikrozkumavky pipetujte 200 μl glycerolu (nastavitelnou pipetou na objem 200 - 1000 μl)
a do druhé stejný objem zásobního roztoku barviva. Vyzkoušejte základní i reverzní techniku
pipetování. Pro glycerol vyzkoušejte pipetování s ustřiženou špičkou. Každý pokus zopakujte
alespoň 2x.
U obou úkolů porovnejte naměřené objemy, popište odlišnosti při pipetování těchto 3 kapalin a
jejich příčiny. Výsledky diskutujte. Vedou změny v technice pipetování ke zlepšení předchozích
výsledků? Zapamatujte si, že pro přesné odměření objemu těkavých a viskózních kapalin je nutné
použít speciální automatické pipety, případně s gravimetrickým ověřením.
4. Přesnost pipetování automatickou pipetou, analytické váhy
a) Určete přesnost a správnost při pipetování téhož objemu
Na analytické váhy umístěte váženku, váhy vynulujte tlačítkem TARE a na váženku napipetujte
800 μl destilované vody (hustota vody při laboratorní teplotě je 0.9986 g/ml) automatickou pipetou
opatřenou čistou špičkou. Váhy znovu vynulujte a na stejnou váženku přidejte v druhém kroku
dalších 800 μl destilované vody. Zopakujte 5krát. Do protokolu uveďte, jaká je „správnost“
(relativní chyba měření, t), tj. relativní rozdíl aritmetického průměru experimentálních hodnot od
správné (= teoretické) hodnoty a také „přesnost“ pipetování (rozptyl naměřených hodnot okolo
hodnoty průměrné) pomocí směrodatné odchylky σ (uveďte v g a následně přepočítejte na %).
b) Porovnejte správnost odměření objemu 200 μl pipetováním 10 x 20 μl a 1 x 200 μl
Automatickou pipetou o rozsahu 20 až 200 μl na váženku (po vynulování vah) postupně pipetujte
10krát 20 μl destilované vody. Po každém přídavku odečtěte celkovou hmotnost dosud
napipetované vody, z těchto údajů vypočítejte hmotnost i objem vody přidané v jednotlivých
krocích. Jaká je správnost pipetování výsledného objemu? Porovnejte s pokusem, kdy napipetujte
toutéž pipetou přímo 200 μl (v jednom kroku, 3x opakujte). Výpočty uveďte do protokolu.
Diskutujte možné zdroje chyb a pokuste se určit, o jaké chyby se jedná.
Úloha 2. PŘÍPRAVA ROZTOKŮ
/ 16
Úloha 2. PŘÍPRAVA ROZTOKŮ
kapitoly 1, 2, 3A, 4, 5
kapitoly 1, 4
Pracovní postup
Chemikálie a vzorky: ethanol, Na2HPO4.12H2O, NaH2PO4.2H2O, octan měďnatý (monohydrát), NaCl, glycerol, cystein,
tyrosin, alanin, trypsin, lysozym, BSA, hemoglobin
Přístroje a pomůcky: automatické pipety (nastavitelné 1 a 5 ml) + špičky, odměrné válce (25 a 50 ml), odměrné baňky
(10, 25 a 100 ml) + zátky, nálevka, plastové mikrozkumavky, teploměr, váženky, špachtle, analytické váhy, předvážky
1. Směšovací objem a teplota
Do odměrného válce na 50 ml odměřte 25 ml ethanolu. Přidejte 25 ml destilované vody
(odměřených jiným válcem) a promíchejte. Změřte teplotu jednotlivých roztoků i výsledné směsi.
Jaký je objem výsledného roztoku? Změnila se teplota? Vysvětlete. Vznikl tímto postupem 50%(v/v)
roztok ethanolu? (Výpočet uveďte do protokolu.)
2. Příprava roztoků o přesné koncentraci v odměrné baňce
Vypočítejte, jaké množství látek je nutno navážit pro přípravu následujících roztoků. Postup
přípravy roztoku v odměrné baňce pečlivě nastudujte v úvodní části skript. Dle pokynů vyučujícího
připravte vybrané roztoky a v dostatečně označených nádobách (včetně čísla pracovní skupiny)
odevzdejte:
a) 25 ml roztoku octanu měďnatého o konc. 30 g/l, přičemž máte k dispozici jeho
monohydrát;
Mr[Cu(CH3COO)2.H2O] = 199.65 Mr[Cu(CH3COO)2] = 181.63
b) 25 ml roztoku obsahujícího dvě složky: 5%(w/v) NaCl a 3%(w/v) glycerol
Mr(NaCl) = 58.44
Mr(C3H8O3) = 92.09; odměřte gravimetricky (hustota glycerolu je 1.26 g/cm³)
c) 100 ml roztoku obsahujícího dvě složky: 0.1M Na2HPO4 a 0.1M NaH2PO4
Mr(Na2HPO4.12H2O) = 358.14
Mr(NaH2PO4.2H2O) = 156.01
3. Ředění roztoků do odměrné baňky
Vypočítejte, jaké množství výše uvedeného roztoku octanu měďnatého je nutno naředit na 10 ml,
aby vznikl roztok o níže uvedené koncentraci. Odlijte potřebné množství výše připraveného roztoku
do pracovní kádinky a následně roztoky do příslušných odměrných baněk připravte a odevzdejte.
a)25 mM
b)1 mg/ml
4. Příprava roztoků o malých objemech
Vypočítejte, jaké množství látek je nutno navážit pro přípravu následujících roztoků. Postup
přípravy roztoků v biochemii pečlivě nastudujte v úvodní části skript. Dle pokynů vyučujícího
připravte vybrané roztoky a v dostatečně označených nádobách (včetně čísla pracovní skupiny)
odevzdejte. Vždy navažte asi přesně vypočítané množství přímo do plastové mikrozkumavky
Eppendorf, přesný objem rozpouštědla dopočítejte a přidejte automatickou pipetou:
a) 0.1M roztoky aminokyselin o objemu 1 až 1.5 ml
cystein; Mr = 175.64
alanin; Mr = 89.08
tyrosin; Mr = 181.19
b) roztoky bílkovin o koncentraci 2 mg/ml o objemu 1 až 1.5 ml
trypsin Mr = 23.3 · 103
lysozym Mr = 14.3 · 103
3
BSA Mr = 66.4 · 10
hemoglobin Mr = 64.0 · 103
Se vzorky bílkovin je nutno pracovat opatrně, vyvarovat se intenzivního míchání, použití
ultrazvuku apod.
Do protokolu uveďte vždy molární i hmotnostní koncentrace (mg/ml) připravených roztoků.
Úloha 3. CHARAKTERISTICKÉ REAKCE VYBRANÝCH PŘÍRODNÍCH LÁTEK
/ 17
Úloha 3. CHARAKTERISTICKÉ REAKCE
VYBRANÝCH PŘÍRODNÍCH LÁTEK
kapitoly 1, 2, 3A, 4, 5
kapitola 1, 4
SACHARIDY jsou nejrozšířenějšími organickými sloučeninami v živočišných i rostlinných tkáních. Obsahují 50 %
veškerého uhlíku biosféry. Monosacharidy a oligosacharidy jsou bílé krystalické látky sladké chuti, rozpustné ve vodě,
bezbarvé, bez zápachu. Polysacharidy většinou ve vodě rozpustné nejsou. Nejznámější polysacharid - celulosa představuje strukturní pletivo rostlin, další polysacharidy - škrob a glykogen - představují zásobní formu sacharidů
jakožto zdroje energie. Monomerní strukturní jednotkou všech tří výše jmenovaných polysacharidů je glukosa. Glukosa
je základním metabolicky aktivním monosacharidem.
Monosacharidy můžeme rozdělit podle přítomnosti aldehydové (polyhydroxyaldehydy) nebo ketonové skupiny
(polyhydroxyketony). Chemicky je tedy lze definovat jako karbonylové deriváty vícesytných alkoholů (nejméně triolů).
Kvalitativní reakce sacharidů jsou dány jednak vlastnostmi jejich karbonylových skupin (je-li karbonylová skupina
sacharidů volná – nevyužita pro vazbu na nějakou komponentu sacharidu – je schopna vystupovat redukčně v řadě
oxidoredukčních reakcí s charakteristickými produkty),
jednak tvorbou furanu a jeho derivátů, vznikajících ze
sacharidů
dehydratací
minerálními
kyselinami.
Kondenzační produkty takto vzniklých furanů s fenoly nebo
aromatickými aminy mají charakteristická zabarvení,
svědčící o přítomnosti sacharidů ve vzorku.
Pro polysacharid škrob je typická barevná reakce
s Lugolovým roztokem (to je roztok jodidu draselného a
jodu). Přesný mechanismus této reakce není dosud znám.
Součástí škrobu jsou (vedle větvených řetězců
amylopektinu) helikální molekuly amylosy, do kterých
vstupuje zřejmě molekula I3- a vzniklý komplex má
charakteristické modré zabarvení.
BÍLKOVINY (PROTEINY) tvoří základní součást každé živé buňky, kde plní rozmanité funkce: enzymovou
katalýzu, transport sloučenin (např. hemoglobin v krvi), pohyb, oporu kostry, imunitní obranu, regulaci, kontrolu růstu a
diferenciace buněk atd. Skládají se z aminokyselinových monomerních jednotek, každá molekula bílkoviny obsahuje
více než 100 aminokyselinových zbytků spojených navzájem peptidovými vazbami. Všechny bílkoviny se v podstatě
skládají pouze z 20 různých proteinogenních aminokyselin.
Pro detekci či stanovení volných aminokyselin se používá ninhydrinová reakce. S ninhydrinem reagují všechny
α-aminokyseliny a menší peptidy (respektive jejich koncové aminokyseliny). Reakce je poměrně složitá, probíhá
nejméně ve třech krocích. Podstatné je, že jedna molekula aminokyseliny kondenzuje se 2 molekulami ninhydrinu.
Výsledná sloučenina má modrou či fialovou barvu. Jen prolin reaguje s ninhydrinem za vzniku žlutého kondenzačního
produktu (není totiž typickou α-aminokyselinou, ale α-iminokyselinou).
Kontrolní otázky
1.
Nakreslete strukturní vzorec prolinu a uveďte, čím se prolin liší od jiných α-aminokyselin.
2.
Zjistěte, které enzymy jsou obsaženy v lidských slinách.
3.
Uveďte nejdůležitější zásobní polysacharid rostlin a živočichů.
4.
Jak by se projevilo přidání oxidačního resp. redukčního činidla k Lugolovu roztoku, tj. roztoku jodidu draselného
(bezbarvý) a jodu (hnědý)?
Úloha 3. CHARAKTERISTICKÉ REAKCE VYBRANÝCH PŘÍRODNÍCH LÁTEK
/ 18
Pracovní postup
Chemikálie a vzorky: droždí, sušenky, uzenina, maso, cukr, paralen, kancelářský papír, glukosa, galaktosa, fruktosa,
sacharosa, laktosa, 5% roztok sacharosy, bezbarvé sladké nápoje, Fehlingovo činidlo I (7 g CuSO 4.5H2O/100 ml H2O),
Fehlingovo činidlo II (36 g vínanu sodno-draselného + 10 g NaOH / 100 ml H 2O), škrob, Lugolův roztok (2.5 g KI ve
30 ml H2O + 1.3 g I2; doplnit H2O na objem 1 l), kyselina askorbová („Celaskon“), 0.1M roztoky aminokyselin (prolin,
alanin, tyrosin), 0.1% vodný roztok ninhydrinu
Přístroje a pomůcky: skleněná pipeta (2 ml) + nástavec, zkumavky, stojánek na zkumavky, kádinka (na vodní lázeň),
kádinka (100 ml), nálevka, vata, kruh na nálevku, stojan, Pasteurova pipeta, třecí miska s tloučkem, držák na zkumavky,
lihový kahan, zápalky/zapalovač, váženka, špachtle, analytické váhy, předvážky, elektrický vařič, vodní lázeň (37 °C)
1. Důkaz redukujících cukrů.
A) Do označených zkumavek nejdříve připravte po 2 ml vzorků glukosy, galaktosy, fruktosy,
sacharosy a laktosy (vždy roztok o koncentraci přibližně 50 mg/ml) a také po 2 ml vzorků slazených
nápojů. Připravte potřebné množství Fehlingova činidla smísením roztoků I a II v poměru 1 : 1,
získáte temně modrý roztok. Ke 2 ml vzorků přidejte 0.5 ml připraveného Fehlingova činidla a
zahřejte ve vodní lázni (zkumavky umístěte do kádinky s vodou zahřívané na vařiči). Důkazem
redukujících cukrů je vznik cihlově červené sraženiny Cu2O. Do protokolu zakreslete strukturní
vzorce glukosy, galaktosy, fruktosy, sacharosy i laktosy a označte případné funkční skupiny
zodpovědné za reakci s Fehlingovým činidlem. Pro vybraný sacharid zapište proběhlou reakci
vyčíslenou chemickou rovnicí.
Reakce s Fehlingovým činidlem je založena na oxidaci aldehydů na karboxylové kyseliny v bazickém prostředí za současné redukce
iontů Cu2+ na Cu2O. Vínan sodno-draselný udržuje ionty Cu 2+ v roztoku i po přidání NaOH, bez něj by se v alkalickém prostředí
vysrážel hnědý Cu(OH)2.
B) Ve třecí misce rozetřete asi 2 g droždí s 10 ml destilované vody. Vzniklou směs filtrujte přes
smotek vaty. Ke 20 ml 5% roztoku sacharosy přidejte získaný filtrát, promíchejte. Směs zahřívejte
ve vodní lázni na 37°C přibližně 45 minut. Poté odeberte 2 ml do zkumavky a přidejte 0.5 ml
připraveného Fehlingova činidla a nechte reakci probíhat za laboratorní teploty. Pozorování
zaznamenejte, výsledky porovnejte s předchozím úkolem a diskutujte.
2. Reakce škrobového mazu s jodem.
Rozetřete 0.5 g škrobu se 2 ml destilované vody a pipetou přeneste do 30 ml vroucí destilované
vody - rozpustí se na téměř čirý roztok.
A) Ke 2 ml vychladlého roztoku škrobu do zkumavky přidejte 1 kapku Lugolova činidla a pozorujte
vznikající zabarvení.
B) V paralelním pokusu zkuste ke 2 ml roztoku škrobu přidat vlastní sliny, řádně promíchejte a nechte
stát 2 minuty při laboratorní teplotě (občas promíchejte), teprve poté přidejte Lugolovo činidlo.
C) Zkumavku A vložte do vroucí vodní lázně - sledujte změny barvy doprovázející reverzibilní
rozvolnění šroubovice amylosy při zahřátí. Zkumavku poté nechte samovolně schladnout.
D) Do zkumavky A poté přidejte malé množství (několik krystalků) kyseliny askorbové, tj.
„antioxidačního“ vitaminu C (např. rozdrcená tableta Celaskonu). Jak můžete působení slin a
kyseliny askorbové vysvětlit?
E) Dokažte přítomnost škrobu v následujících vzorcích: sušenka, uzenina, cukr, droždí, maso, paralen,
filtrační a kancelářský papír. Zamyslete se nad tím, zda škrob do těchto vzorků patří a jakou v nich
plní funkci.
3. Stanovení aminokyselin – reakce s ninhydrinem
Pro tuto úlohu je nutné použít vysoké zkumavky (nikoli centrifugační). Ke 2 ml 0.1M roztoku
aminokyseliny (alanin, tyrosin, prolin aj.) přidejte 0.2 ml roztoku ninhydrinu a velice opatrně
zahřívejte k varu (ústím zkumavky nemiřte nikomu do obličeje). Pozorujte barevnou změnu. Do
protokolu zakreslete strukturní vzorce všech použitých aminokyselin a vysvětlete, proč nedochází u
všech ke stejné barevné změně.
prolin Mr = 115.13; alanin Mr = 89.08; tyrosin Mr = 181.19
Úloha 4. SPEKTROFOTOMETRICKÉ METODY
/ 19
Biochemie hojně využívá optických metod, protože jsou to metody rychlé, citlivé, vesměs velmi přesné a navíc nedestruktivní, tudíž po měření
můžeme roztok vzorku dále používat a zpracovávat. Optické metody jsou založeny na interakci elektromagnetického záření s hmotou. Vedle metod
spektrofotometrických (založených na absorpci nebo emisi záření) se v biochemii uplatňují zejména metody založené na rozptylu záření a dále
metody polarimetrické, založené na měření stáčení roviny lineárně polarizovaného světla po interakci s opticky aktivními molekulami (tj. většina
biochemicky významných látek - např. sacharidy, většina aminokyselin, ... )
ABSORPCE ZÁŘENÍ
Při absorpci elektromagnetického záření se pohlcená energie využije k převedení molekuly (atomu) do excitovaného, tj.
energeticky bohatšího stavu. Jednoduchým molekulám (atomům, iontům) přísluší řada odlišných kvantových stavů a
jim odpovídajících diskrétních energetických hladin, proto nemohou měnit energii spojitě, ale mohou přijímat nebo
vydávat energii jen po určitých kvantech. Co se tedy týče energie ve formě záření, molekuly či atomy absorbují i
emitují záření pouze o určitých frekvencích, odpovídajících rozdílu energií mezi jednotlivými energetickými stavy
(Planckova podmínka):
∆ E = h ⋅ν
kde ν je frekvence záření a h Planckova konstanta.
UV-VIS ABSORPČNÍ SPEKTROFOTOMETRIE
Pojmem spektrofotometrie označujeme metody založené na sledování absorpce záření vzorkem v závislosti na
vlnové délce záření. „Absorpčním spektrem vzorku“ pak rozumíme charakteristický soubor vlnových délek záření,
které vzorek pohltí.
•U atomů se jedná o omezený počet absorbovaných či emitovaných frekvencí a výsledné spektrum označujeme jako
čárové.
•Molekuly mají spektra pásová (spojitá), neboť mohou být vzhledem k dalším stupňům volnosti (vibrace, rotace) ve
více energetických stavech.
V biochemii nejčastěji využívanou spektroskopickou metodou je spektrofotometrie v ultrafialové (UV) oblasti
(přesněji řečeno v blízké UV oblasti, tj. 200-400 nm) a ve viditelné (VIS) oblasti spektra (400-750 nm). Příčinou
absorpce molekul ve viditelné a blízké ultrafialové oblasti jsou energetické přechody vazebných elektronů dvojných a
trojných vazeb a aromatických či heterocyklických kruhů. Funkční skupiny zodpovědné za absorpci záření nazýváme
chromofory. Téměř všechny biologicky zajímavé látky (kromě sacharidů) mají v oblasti UV-VIS charakteristické
absorpční pásy a lze je poměrně snadno na základě jejich spektrálních vlastností kvantitativně i kvalitativně stanovit.
Absorpce látek v oblasti viditelného záření, tj. v rozsahu vlnových délek 400-750 nm, vede k tomu, že je naše oko
vnímá jako barevné. Barevný roztok absorbuje záření doplňkové barvy (roztok, který se okem jeví jako červený,
absorbuje z viditelného světla především barvu modrozelenou, propouští barvu červenou).
Absorpční vlastnosti (vlnová délka absorpčního maxima i intenzita absorpce) do jisté míry závisí na interakci
příslušného chromoforu s okolím, mohou být ovlivněny např. denaturací (bílkoviny, nukleové kyseliny), změnami pH
(disociace např. tyrosinových zbytků v proteinech) a pod..
/ 20
SPEKTROFOTOMETR je přístroj pro měření absorpce světla jako funkce vlnové délky; základem
měření je tedy použití záření monochromatického neboli proudu fotonů se stejnou energií. V praxi se
monochromatické záření charakterizuje nejčastěji právě vlnovou délkou λ , ale můžeme se setkat i
s její převrácenou hodnotou - vlnočtem ~
ν - nebo případně frekvencí ν . Tyto veličiny vzájemně
souvisejí vztahy:
λν = c
E = hν = hc ~
ν=
hc
λ
kde
c = 2.9976 · 108 m·s-1 (rychlost světla)
h = 6.6256 · 10-34 J·s (Planckova konstanta)
Spektrofotometr tedy obsahuje tyto základní části:
• zdroj světla (pro UV vodíková nebo deuteriová výbojka, pro VIS oblast lampa se žhnoucím
kovovým vláknem)
• monochromátor (dnes nejčastěji kombinace optického hranolu a difrakční mřížky)
• kyvetu/y se vzorkem
• detektor (fotonásobič / fotobuňka)
Spektrofotometr může být buď dvoupaprskový (jeden paprsek prochází vzorkem, druhý referentní
kyvetou) nebo jednopaprskový, kde nejprve měříme referentní vzorek a poté na stejném místě měříme
vzorky.
U spektrofotometrů typu „Diode-Array Detectors“ (DAD) je světlo rozloženo na monochromatické
paprsky až po průchodu vzorkem - intenzita světla všech vlnových délek je pak současně snímána
řadou světlocitlivých diod. Toto uspořádání má poněkud nižší rozlišovací schopnost, ale DAD přístroje
nacházejí široké uplatnění díky rychlosti měření zejména při kinetických měřeních nebo jakožto
detektory chromatografických zařízení (HPLC).
/ 21
LAMBERTŮV A BEERŮV ZÁKON - ZÁVISLOST ABSORBANCE NA KONCENTRACI DANÉ LÁTKY
Prochází-li světelný paprsek prostředím, které je schopno absorbovat, je intenzita paprsku prošlého tímto prostředím (I)
menší než intenzita paprsku vstupujícího (Io). Propustnost vzorku neboli procento záření, které vzorkem projde (tj.
poměr I / Io), charakterizuje veličina zvaná transmitance (T). Jak již v roce 1729 popsal Bouguer a později formuloval
Lambert, propustnost vzorku exponenciálně klesá s délkou dráhy (l), kterou paprsek v absorbujícím prostředí
urazí, tedy:
T=
I
= e − konst .l
I0
V r. 1852 ukázal Beer, že u mnoha roztoků vzniklých rozpuštěním látek, jež absorbují světlo, je výše uvedená
konstanta přímo úměrná koncentraci (c) rozpuštěné látky. Spojením Lambertova vztahu a Beerových poznatků je
popsán základní vztah pro spektrofotometrické metody chemické analýzy, Lambert-Beerův zákon platný pro
monochromatické světlo:
A = − log T = − log
I
= ελ. c .l
I0
kde:
A – absorbance (bez jednotek)
T – transmitance (bezrozměrné či v %)
I - intenzita záření prošlého vzorkem
I0 - intenzita dopadajícího záření (viz dále)
ελ - molární absorpční koeficient (viz dále)
c - koncentrace rozpuštěné látky (mol . l-1)
l - tloušťka absorbující vrstvy (cm)
Při zjišťování absorbance látky rozpuštěné v roztoku považujeme za I0 hodnotu absorbance referenčního vzorku
(srovnávací vzorek, "blank"). Referenčním vzorkem je zpravidla kyveta naplněná čistým rozpouštědlem, používaným
pro rozpouštění vzorku (voda, pufr, organické rozpouštědlo...).
Hodnoty molárního absorpčního (extinkčního) koeficientu ελ, tj. absorbance 1M roztoku měřené látky při vnitřní šířce
kyvety 1 cm pro monochromatické světlo o vlnové délce λ (charakteristické pro danou látku, tj. o vlnové délce
odpovídající absorpčnímu maximu dané látky), bývají tabelovány. O konstantu se však jedná jen za určitých
podmínek, z nichž nejvýznamnější je požadavek dostatečně nízké koncentrace rozpuštěné látky. V praxi se nejlépe
o splnění těchto podmínek ve studovaném koncentračním rozmezí přesvědčíme proměřením kalibrační křivky.
Teoreticky je nejpřesnějších výsledků dosahováno pro hodnotu absorbance do jedné. Obecně, mimo jiné s ohledem
na vlastnosti měřících přístrojů, nelze předpokládat linearitu kalibrační křivky (a tedy platnost Lambertova a Beerova
zákona) pro hodnotu absorbance větší než 2 (A > 2, tj. T < 1 %).
KYVETY
Pro měření ve viditelné oblasti se používají klasické skleněné či plastové kyvety, protože tyto materiály v uvedené
oblasti spektra neabsorbují. Pro práci v UV oblasti je nezbytné použít kyvety křemenné – ty jsou velmi křehké, takže
s nimi manipulujeme obzvláště opatrně. Navíc je jejich pořízení finančně náročné. V poslední době se také vyvíjejí
speciální plasty, které v UV oblasti neabsorbují.
Pro měření absorbance musí být měřený vzorek dokonale rozpuštěn. Není-li tomu tak, přítomné částice způsobují
rozptyl světla, které následně nedopadá na detektor. Díky tomu jsou naměřené hodnoty oproti skutečné absorbanci
falešně vyšší.
Vždy je nutné nejdříve přístroj vynulovat na referenční vzorek, pro který uvažujeme A = 0 (T = 100 %, I = I 0).
U jednopaprskových přístrojů je nutno použít stejnou kyvetu (ve stejné orientaci) pro referenční i měřený vzorek.
U dvoupaprskových přístrojů používáme kyvety identické, kalibraci na referenční vzorek provádíme v rámci měření
každého vzorku.
K vypracování úlohy je dále nutná znalost následujících kapitol z úvodní části skript:
kapitoly 1, 2, 3A, 4, 5, 6
kapitoly 1, 3, 4
Kontrolní otázky
1.Jaká je absorbance vzorku, je-li za daných podmínek jeho propustnost 29 %?
2.Vypočítejte transmitanci a absorbanci vzorku, absorbuje-li tento vzorek 99 % záření, kterému byl vystaven.
3.Jaké kyvety se používají pro měření absorpce ve viditelné oblasti spektra?
4.Stručně vysvětlete pojem „extrapolace“.
/ 22
Pracovní postup
Chemikálie a vzorky: Remazol Brilliant Blue R
Přístroje a pomůcky: automatická pipeta + špičky (5 ml), odměrná baňka (25 ml) + zátka, zkumavky, stojánek na
zkumavky, nálevka, váženka, analytické váhy, spektrofotometr Spekol 11, plastové nebo skleněné kyvety
1. Příprava vzorků RBBR
Do odměrné baňky na 25 ml připravte roztok modrého barviva Remazol Brilliant Blue R (RBBR,
Mr = 626.6) v destilované vodě o koncentraci 2 mmol/l. Z tohoto roztoku připravte ředěním
dvojkovou řadou postupně 2mM, 1mM až 0.001mM roztoky RBBR o objemu 2 ml.
2. Spektrum připraveného 0.125mM roztoku RBBR ve viditelné oblasti spektra
Jako referenční vzorek („blank“, tj. nastavení hodnoty A = 0 resp. T = 100 %) použijte destilovanou
vodu. Na spektrofotometru typu Spekol nastavte nejdříve na vlnovou délku 400 nm, kterou budete
postupně zvyšovat po 10 nm až do 700 nm. Pro každou vlnovou délku přístroj nejdříve
vynulujte na referenční vzorek, poté změřte absorbanci vzorku RBBR.
Vyhodnocení: Z naměřených hodnot sestrojte graf závislosti absorbance na vlnové délce. Jaká je
experimetálně určená vlnová délka absorpčního maxima RBBR?
3. Oblast platnosti Lambert-Beerova zákona pro roztok RBBR při vlnové délce 595 nm
Na spektrofotometru typu Spekol nastavte vlnovou délku 595 nm. Měřte absorbanci jednotlivých
roztoků z úkolu 1, a to vždy proti referenčnímu vzorku (tj. roztok o nulové koncentraci RBBR
neboli destilovaná voda). Budete-li postupovat od nejzředěnějšího po nejkoncentrovanější roztok,
kyvetu nemusíte mezi jednotlivými měřeními proplachovat (zbytky zředěnějšího roztoku na stěnách
kyvety zatíží měření menší chybou, než zbytky destilované vody po promytí). Roztok vracejte do
příslušné zkumavky, kyvetu následně otočte dnem vzhůru na kousek buničiny.
Vyhodnocení:
Závislost absorbance roztoku RBBR na jeho koncentraci vyneste do grafu.
Pro oblast koncentrací, v níž je sledovaná závislost lineární (cca do A ~ 1), sestrojte nový graf a
určete směrnici přímky proložené vámi naměřenými body. Uvědomte si, zda přímka vyjadřující
příslušnou funkční závislost prochází počátkem (tj. bodem [0;0]).
Na základě rovnice přímky (extrapolací) určete:
•hodnotu molárního absorpčního koeficientu RBBR při 595 nm (porovnejte s tabelovanou
hodnotou, která pro RBBR činí ε595 = 5820 mol-1· l · cm-1)
•teoretickou absorbanci, jakou by měly mít vzorky, které jste již pro sestrojení kalibrační křivky
nepoužili (porovnejte s experimentálně získanými údaji).
Úloha 5. REVERZIBILNÍ A IREVERZIBILNÍ PRECIPITACE BÍLKOVIN
/ 23
Úloha 5. REVERZIBILNÍ A IREVERZIBILNÍ PRECIPITACE
BÍLKOVIN
Základní stavební kameny bílkovin – aminokyseliny – jsou vzájemně spojeny peptidovými vazbami v dlouhý
polypeptidový řetězec. Sled jednotlivých aminokyselin určuje tzv. primární strukturu bílkovin. Polypeptidový
řetězec, který je tedy jakousi „páteří“ bílkovinné molekuly, však není rigidní "tyčkou", ale může v prostoru zaujímat
různé konformace - toto prostorové uspořádání polypeptidového řetězce se nazývá sekundární struktura bílkovin.
Konkrétní tvar celé jednoduché bílkovinné molekuly v prostoru se pak označuje jako terciární struktura. Na základě
terciární struktury se bílkoviny zjednodušeně dělí na bílkoviny globulární (např. hemoglobin, prakticky všechny
enzymy) a fibrilární (vláknité - např. keratiny, kolageny, fibroin). Pro vznik sekundární a terciární struktury jsou
nezbytné tzv. vedlejší vazby (slabé nekovalentní interakce typu vodíkových vazeb, hydrofobní efekt). Je-li funkční
bílkovina složena z podjednotek (z více bílkovinných řetězců), mluvíme o kvartérní struktuře, tedy vzájemném
uspořádání více podjednotek.
ROZTOKY BÍLKOVIN
Některé bílkoviny jsou ve vodě prakticky nerozpustné (např. fibrilární bílkoviny), jiné se ve vodě rozpouštějí
(albuminy, histony, globuliny). Povrch molekuly bílkoviny se při styku s vodou elektricky nabíjí: povrchový náboj
vzniká obvykle elektrolytickou disociací povrchové vrstvy bílkoviny, tedy disociací postranních řetězců aminokyselin
přístupných rozpouštědlu. Náboj molekule bílkoviny udílejí zejména pozitivně nabité (lysin, arginin a histidin) či
negativně nabité (asparagová a glutamová kyselina) aminokyseliny, svou roli v tomto procesu však samozřejmě hrají
také polární aminokyseliny. Disociace postranních řetězců a tedy rozpustnost bílkoviny závisí v první řadě na pH bílkoviny jsou nejméně rozpustné v roztoku o pH rovném jejich izoelektrickému bodu (pI, tj. pH, při kterém je
výsledný náboj molekuly roven nule - molekuly se navzájem neodpuzují). Okolo nabité molekuly bílkoviny se
v roztoku tvoří vrstva orientovaných molekul rozpouštědla, tzv. solvatační obal. Tento obal stabilizuje molekuly
bílkovin v roztoku a brání jejich vzájemnému spojování ve větší celky (agregaci). Rozpustnost bílkovin, ale i ostatních
biomolekul ve vodných roztocích je závislá na koncentraci rozpuštěných solí (iontové síle roztoku). Rozpustnost
proteinů se s rostoucí koncentrací solí zpravidla nejprve zvyšuje (vsolovací efekt), prochází maximem a posléze klesá
(vysolovací efekt). Vsolování je způsobeno vytvořením iontového oblaku kolem ionizovaných skupin biopolymerů –
dochází ke snížení interakce nabitých skupin biopolymerů mezi sebou a zvýšení interakcí s rozpouštědlem. Vsolování
se velmi často používá pro frakcionaci globulinů, které jsou v čisté vodě téměř nerozpustné a mohou tudíž být
frakcionovaně rozpuštěny zvyšováním iontové síly roztoku. Dalším přídavkem neutrálních solí, které odnímají
molekulám bílkovin solvatační obal pro solvataci vlastních iontů (afinita dipólů vody k iontům solí je vyšší než
k bílkovinám), vyvolává shlukování molekul bílkovin a jejich vyloučení z roztoku – precipitaci, „vysolení“.
FRAKCIONACE SMĚSI BÍLKOVIN PRECIPITACÍ NEUTRÁLNÍMI SOLEMI („VYSOLOVÁNÍ“)
patří mezi nejužívanější techniky dělení biologických vzorků. Výhodou metody je, že při ní neprecipitují bílkoviny
ireverzibilně (nedenaturují) a že není třeba žádné speciální laboratorní vybavení. Vhodnou koncentrací soli v roztoku
(tzv. procenta nasycení) lze dosáhnout frakčního vysolení různých druhů bílkovin lišících se právě rozpustností ve
vodných roztocích. Precipitovaná frakce bílkovin se následně rozpustí v malém množství vody nebo pufru, srážecí sůl
před dalším zpracováním vzorku odstraníme např. dialýzou, ultrafiltrací či chromatografií (gelovou, na iontoměničích).
V praxi se tento princip využívá k frakcionaci bílkovin síranem amonným (NH 4)2SO4, který je velmi dobře
rozpustný ve vodě a lze tak připravit roztoky o velké iontové síle. Jeho rozpustnost je jen velmi málo závislá na teplotě.
Při „vysolování“ dáváme přednost práci s připraveným nasyceným roztokem před přidáváním pevného (NH4)2SO4
z důvodu menšího rizika lokálního přesycení. Nasycený roztok (NH 4)2SO4 je při 25 °C 4.1M. Množství přidaného
(NH4)2SO4 se proto většinou vyjadřuje v procentech jeho nasycení. Užitím vhodných koncentrací lze jednotlivé
bílkoviny navzájem dělit. Po přidání takového množství síranu amonného, které odpovídá 30 % množství potřebného ke
vzniku nasyceného roztoku této soli (=“30% nasycení“), se srážejí nukleové kyseliny a poměrně málo typů proteinů.
Většina proteinů charaktaristicky precipituje při nasycení v rozmezí 30 – 70%. Jako albuminy jsou pak označovány
bílkoviny, které jsou obvykle rozpustné ve vodě a které lze vysolit teprve vysoce koncentrovanými roztoky síranu
amonného (70 - 100%).
DENATURACE BÍLKOVIN
Složitá prostorová struktura nativních bílkovin je stabilizována zejména intramolekulárními nevazebnými interakcemi
(vodíkové můstky, iontové interakce, van der Waalsovy síly, hydrofobní vazby). Již po několik desetiletí je známa
reakce, kdy bílkovinná molekula pod vlivem vnějšího (denaturujícího) „tlaku“ tuto svou nativní konformaci ztratí a
přejde tak na méně uspořádanou náhodnou strukturu. V této nové konformaci, kdy jsou často odkryty funkční skupiny
hydrofobní povahy původně schované uvnitř molekuly, mají většinou molekuly bílkovin tendenci agregovat a vytvářet
zákaly až sraženiny. Jedná se o proces ireverzibilní (na rozdíl od agregace proteinů při vysolování).
Denaturační vliv má například vyšší teplota, činidla jako močovina, dodecylsulfát sodný (SDS), některé
těžké kovy, změna pH a podobně - tedy jevy, které ruší vodíkové, hydrofobní a elektrostatické intramolekulární
interakce. Nikdy však při denaturaci nedochází ke štěpení peptidových vazeb (primární struktura bílkoviny je stále
stejná). V posledních letech se ustálila tato definice denaturace: „Denaturací nazýváme každou podstatnou změnu
prostorového uspořádání biopolymeru, která vede ke ztrátě jeho biologické aktivity.“
/ 24
Kontrolní otázky
1.
2.
3.
4.
Je při denaturaci bílkovin ovlivněna primární struktura bílkovin?
Zjistěte, jaké je pI kaseinu. Jak souvisí pI s rozpustností proteinu?
Vyberte, které z faktorů působí reverzibilní precipitaci bílkovin: intenzivní míchání, zvýšená teplota, srážení
v isoelektrickém bodě, (NH4)2SO4, CuSO4,, NaCl, HCl.
Do jakého objemu roztoku bílkoviny s 20% nasycením (NH4)2SO4 přidáte přesně 50 ml nasyceného roztoku
(NH4)2SO4, aby výsledné nasycení (NH4)2SO4 bylo 70%?
Pracovní postup
Chemikálie a vzorky: vaječný bílek, (NH4)2SO4, 10% CuSO4, 0.8M kyselina octová, 0.1M octan sodný, odtučněné
mléko, ethanol
Přístroje a pomůcky: skleněné pipety (1 a 5 ml) + nástavec, kádinky (150 ml, 250 - 400 ml), odměrný válec (100 ml),
zkumavky, stojánek na zkumavky, nálevka, vata, kruh na nálevku, stojan, skleněná tyčinka, Erlenmeyerova baňka,
nůžky, klema, teploměr, Pasteurova pipeta, centrifugační kyvety, centrifuga, elektrický vařič, vortex, předvážky
magnetická míchačka, míchadlo
1. Frakcionace proteinů "vysolováním"
Vaším úkolem je provést frakcionaci proteinů vaječného bílku nasyceným roztokem síranu
amonného. První frakci bílkovin precipitujte síranem amonným do 30 % jeho nasycení (saturace),
druhou frakci bílkovin precipitujte v rozmezí 30 – 50 % saturace a poslední 50 – 90 % saturace
touto solí.
Vypočítejte objem nasyceného roztoku síranu amonného, který je nutno přidat ke směsi bílkovin
1. o objemu 25 ml (dosud neobsahující žádný síran amonný), aby bylo dosaženo stupně nasycení 30 %.
2. o objemu 25 ml již z 30 % nasycené síranem amonným k dosažení 50% nasycení.
3. o objemu 10 ml s 50% nasycením abychom získali roztok o 90% nasycení.
Jaký celkový objem nasyceného roztoku síranu amonného tedy budete potřebovat?
Nasycený roztok síranu amonného je při 25 °C 4.1M, Mr[(NH4)2SO4] = 132.14 (ověřte na zásobní
lahvi). Do kádinky vámi kalibrované na potřebný objem navažte síran amonný a za stálého míchání
na magnetické míchačce rozpouštějte v destilované vodě (minimálně 15 minut; v případě, že látka
nebude zcela rozpuštěna, roztok přefiltrujte přes filtrační papír).
Roztok vaječného bílku (pro úkol 1, 2 a 4): bílek oddělte od žloutku a v baňce jej protřepte
s trojnásobným množstvím vody. Roztok bílku přefiltrujte (např. přes smotek vaty).
Ke 25 ml roztoku vaječného bílku po kapkách a za stálého mírného míchání na magnetické
míchačce (aby nedošlo k lokálnímu přesycení) přidávejte vypočtený objem nasyceného roztoku
síranu amonného tak, aby bylo dosaženo 30% saturace. Jakmile přidáte celý vypočtený objem,
nechte směs ještě asi 15 minut míchat pro ustavení rovnováhy. Pozorujte vznikající zákal svědčící o
agregaci proteinů. Precipitát oddělte centrifugací a uchovejte. Ke 25 ml supernatantu přidejte další
část síranu amonného (opět pomalu a za stálého míchání), aby celkové nasycení dosáhlo 50 %,
15 minut vyčkejte a suspenzi odstřeďte. Postup zopakujte s 10 ml supernatantu pro 90% nasycení
síranem amonným.
Subjektivně porovnejte míru zakalení v důsledku agregujících proteinů v jednotlivých krocích.
Vaším výsledkem jsou 3 precipitáty: první obsahuje proteiny, které se vysolily účinkem 30%
síranu amonného, druhý proteiny agregující při 30% až 50% nasycení a poslední proteiny vysolené
účinkem 50% - 90% nasycení síranem amonným. Porovnejte subjektivně množství proteinů
v jednotlivých frakcích (uvědomte si, že v krocích 2 - 3 jste již nepracovali s celým původním
preparátem). Z výsledků experimentu se pokuste odvodit, jaká skupina proteinů je ve vaječném
bílku majoritně obsažena.
2. Teplota denaturace proteinů vaječného bílku
Zkumavku upevněnou na stojanu vnořte do vodní lázně (kádinka s vodou). Do zkumavky aplikujte
asi 3 ml roztoku vaječného bílku, do vzorku vložte teploměr upevněný na stojanu a vodní lázeň
zahřívejte na elektrickém vařiči. Odečítejte teplotu a zaznamenejte, při jaké teplotě se bílek „srazí“
(začne ireverzibilně precipitovat).
/ 25
3. Závislost rozpustnosti kaseinu na pH
Z 0.8M zásobního roztoku kyseliny octové připravte čtyřkovou ředící řadou 4 roztoky o objemu
1 ml (od koncentrace 0.8 po 0.0125 mol·l-1). Do všech zkumavek následně přidejte 1 ml octanu
sodného (0,1 mol.l-1). Vypočítejte skutečnou koncentraci kyseliny a soli v jednotlivých zkumavkách
a následně také pH takto připravených acetátových pufrů z Hendersonovy-Hasselbalchovy rovnice:
pH = pKHAc+log (cNaAc/cHAc)
kde pKHAc = 4.76.
Do všech zkumavek napipetujte 1 ml odtučněného mléka předem zředěného v poměru 1 : 1
destilovanou vodou. Směs promíchejte a po 5 minutách vyhodnoťte stupeň zákalu (podle stupnice
0, +, ++, +++). Ve zkumavce s maximálním zákalem bude hodnota pH přibližně rovna pI. Výsledky
uveďte ve formě přehledné tabulky.
4. Další faktory a činidla, která mohou způsobit denaturaci bílkovin
Do 8 zkumavek odměřte 2 ml roztoku vaječného bílku a ověřte denaturační vliv těchto faktorů:
1. síran měďnatý
2. ethanol (přidejte 2 ml 96% EtOH)
3. intenzivní míchání (Vortex)
Do zkumavek přidávejte uvedené činidlo po kapkách. Pozorování zaznamenejte do tabulky.
Úloha 6. SEPARAČNÍ A CHROMATOGRAFICKÉ METODY - DĚLENÍ LÁTEK DLE POLARITY
/ 26
Úloha 6. SEPARAČNÍ A CHROMATOGRAFICKÉ METODY
- DĚLENÍ LÁTEK DLE POLARITY
POLÁRNÍ A NEPOLÁRNÍ ROZPOUŠTĚDLA
Kovalentní chemická vazba je tvořena elektrony sdílenými
příklady polárních skupin: příklady nepolárních skupin:
dvěma atomy. Dva sdílené elektrony označujeme jako vazbu
karboxylová skupina –COOH
methylová skupina –CH3
jednoduchou. Je-li poloha sdílených elektronů symetrická vůči
hydroxyskupina –OH
a jiné alkyly
oxoskupina >C=O
fenylová skupina –Ar
oběma atomům, jedná se o vazbu nepolární. Ve sloučeninách
aminoskupina –NH2
methylenová –CH2–
tvořených prvky s rozdílnou elektronegativitou (schopností
thiolová skupina –SH
a polymethylenové skupiny
přitahovat elektrony) poloha vazebných elektronů není zcela
symetrická, vazba se pak označuje jako polární (resp. polarizovaná) a molekula tak vytváří dipól. Často hovoříme
nejen o polárních a nepolárních vazbách v molekulách, ale i o polárních a nepolárních skupinách a látkách vůbec.
Nejběžnějším rozpouštědlem s mimořádnými rozpouštěcími vlastnostmi, které vyplývají z dipólového charakteru jeho
molekul, je voda – látky často dělíme dle rozpustnosti ve vodě na hydrofilní („vodu milující“), tj. ve vodě rozpustné
polární látky (např. elektrolyty, cukry) a hydrofobní („bojící se vody“), tj. nepolární látky (např. uhlovodíky, mastné
kyseliny), které se ve vodě nerozpouštějí, ale rozpouštějí se v nepolárních nebo alespoň méně polárních rozpouštědlech
(pravidlo „podobné se rozpouští v podobném“). Poměr počtu polárních a nepolárních částí molekul určuje rozpustnost
látek – např. rozpustnost mastných kyselin ve vodě klesá s prodlužováním uhlovodíkového řetězce. Nepolární skupiny
nemohou tvořit vodíkové vazby a tudíž narušují síť vodíkových vazeb ve vodě již vytvořených. Z energetického
hlediska je tedy nejvýhodnější stav, kdy hydrofobní skupiny zaujmou co nejmenší objem, jsou pohromadě a tudíž
narušují vodíkové interakce jen minimálně. Tomuto efektu se říká hydrofobní efekt a je mimo jiné nesmírně důležitý
pro uspořádání makromolekul bílkovin v roztocích. Nejčastěji používaná rozpouštědla (dle stoupající polarity): pentan,
heptan, hexan, petrolether, toluen, ethylether, dichloromethan, chloroform, ethylacetát, aceton, methanol,
acetonitril, dimethylsulfoxid, voda
EXTRAKCE
Sestaví-li se rozpouštědla dle vzájemné rozpustnosti, získá se tzv. mixotropní řada., zde pro vybraná rozpouštědla:
pufry, anorganické kyseliny, voda, formamid, acetonitril, kyselina octová, methanol, ethanol, fenol, aceton,
estery kyseliny octové, diethylether, chloroform, dichlorethan, benzen, toluen, heptan, hexan, parafinový olej.
Čím jsou v ní dvě rozpouštědla od sebe vzdálenější, tím hůře se mísí.
Přidá-li se do soustavy tvořené dvěma nemísitelnými kapalinami určitá látka, rozdělí se po ustavení rovnováhy celkové
množství této látky mezi obě kapaliny podle Nernstova rozdělovacího zákona: po ustavení rovnováhy v soustavě je
poměr koncentrací uvažované látky v obou kapalinách za dané teploty konstantní tj.:
(cx) I
KN =
(cx) II
(cx)I , (cx)II ........ rovnovážné koncentrace rozpuštěné látky v obou kapalinách (v přesnějším popisu vystupují
místo koncentrací aktivity).
KN ....................Nernstův rozdělovací koeficient, poměr rozpustnosti dané látky v obou kapalinách.
Rozdílné rozpustnosti látky ve dvou nemísitelných rozpouštědlech je možno využít k extrakci dané látky do jiného
rozpouštědla. (V širším slova smyslu rozumíme pod pojmem extrakce i selektivní rozpuštění látky z pevné fáze – např.
chlorofyl z listu rostliny.) Velmi často extrakci provádíme z vodného prostředí (nejčastěji pufru), kterým in vitro
simulujeme fyziologické poměry v buňkách. Studujeme-li například určitou enzymovou reakci, jejíž substrát a/nebo
produkty jsou hydrofobní látky, technika extrakce se výborně hodí k oddělení a izolaci produktů (příp. substrátu)
reakce. Nejčastěji používanými rozpouštědly jsou ethylacetát či chloroform.
CHROMATOGRAFIE
Chromatografické metody umožňují separaci prakticky všech organických látek, některé jsou vhodné i pro dělení směsí
biopolymerů. Chromatografie ve svém principu znamená dělení látek mezi nepohyblivou (stacionární) a pohyblivou
(mobilní) fázi. Tyto dvě fáze se od sebe odlišují některou základní fyzikálně-chemickou vlastností, např. polaritou. Při
chromatografickém dělení je směs unášena rozpouštědlem (lépe řečeno mobilní fází) po vrstvě papíru nebo vrstvě či
sloupci jiného materiálu (= stacionární fáze). Jednotlivé složky směsi interagují se stacionární fází různou měrou, proto
jsou mobilní fází unášeny různou rychlostí, čímž se od sebe dělí. Složky s vyšší afinitou ke stacionární fázi se pohybují
pomaleji a jsou tedy zadržovány déle, než látky s nižší afinitou.
První chromatografii provedl v roce 1906 Michail Semjonovič Cvet (1872–1919, ruský botanik, fyziolog a biochemik), za účelem rozdělení barviv
vyskytujících se v listech rostlin. Na koloně uhličitanu vápenatého, kterou použil, mohl sledovat proces dělení pouhým okem. Cvet získal dva zelené
pruhy - listová barviva chlorofyl a a chlorofyl b - a několik žlutých barviv (karotenoidy). Teprve za deset let byl Cvetův objev uznán za velký
technický přínos tomuto způsobu separace. Podle řeckého chroma - barva - byl odvozen název chromatografie.
ZÁKLADNÍ ROZDĚLENÍ CHROMATOGRAFICKÝCH METOD
klasifikace dle skupenství fází
fáze
Chromatografie
mobilní stacionární
pevná
„plynová“
plynná
kapalná
pevná
„kapalinová“ kapalná
kapalná
Typ chromatografie
GSC („gas-solid chromatography“)
GLC („gas-liquid chromatography“)
LSC („liquid-solid chromatography“)
LLC („liquid-liquid chromatography“)
klasifikace dle způsobu provedení:
▪ kolonová chromatografie („column chromatography“ - CC)
▪ chromatografie na tenké vrstvě („thin layer chromatography“ TLC)
▪ chromatografie na papíře („paper chromatography“ – PC)
klasifikace dle podmínek separace
▪ izokratická chromatografie (konstantní podmínky)
▪ gradientová chromatografie (měníme teplotu/pH/složení mobilní
fáze)
/ 27
klasifikace dle fyzikálně chemického principu dělení
▪ rozdělovací chromatografie (viz dále)
▪ adsorpční chromatografie (látka rozpuštěná v kapalině se váže na povrch
pevné látky adsorbentu účinkem mezipovrchových přitažlivých sil)
▪ iontově výměnná chromatografie (na povrchu stac. fáze jsou chemické
skupiny nesoucí náboj, s nimi interagují částice s opačným nábojem)
▪ gelová chromatografie (rozdílná průchodnost stacionární fáze pro různě
velké částice dělené směsi)
▪ afinitní chromatografie (specifické interakce obvykle nevazebné povahy,
jeden z partnerů je pevně vázán na vhodný nosič a tvoří tak stacionární fázi)
ROZDĚLOVACÍ CHROMATOGRAFIE
je příkladem LLC, dělení látek tedy probíhá na základě rozdílné rozpustnosti ve dvou kapalných fázích (obdobně jako
extrakce), jedna z kapalných fází je však ve formě filmu zakotvena na pevném nosiči (= stacionární fáze). Pohybem
mobilní fáze dochází k neustálému porušování a novému ustavování rovnováhy podle rozdělovacího koeficientu KD:
KD = cs / cm
kde cs a cm jsou rovnovážné koncentrace v příslušných fázích. Při tomto typu chromatografie tedy dochází k dělení
látek s rozdílnou hodnotou KD, tedy látek s rozdílnou rozpustností ve dvou rozpouštědlech s rozdílnou polaritou.
Příkladem rozdělovací chromatografie je chromatografie papírová - chromatografický papír je nosičem stacionární
fáze - tou je voda vázaná na celulosu papíru (v množství asi 5 %). Rozdělovací chromatografie se používá vedle
chromatografie na papíře i v dalších uspořádáních, tj. na tenké vrstvě (komerční nebo sypané tenké vrstvy) i
v kolonovém uspořádání. Jako nosiče pro TLC či do kolon se používají silikagel, alumina, mikrokrystalická celulosa,
křemelina (CaCO3) – stacionární fází je nejčastěji voda adsorbovaná na tyto nosiče. Jako mobilní fáze se používají
různé směsi organických rozpouštědel. Ta jsou podle rostoucí polarity řazena do tzv. eluotropické řady: benzín, benzen,
chloroform, ether, aceton, ethanol, methanol, voda.
K vyhodnocení chromatogramu při papírové a tenkovrstevné
chromatografii používáme tzv. retenční faktor Rf, který je roven
poměru vzdálenosti start-skvrna ku vzdálenosti start-čelo. Např. na
uvedeném obrázku retenční faktor pro skvrnu blíže startu
Rf1 = d1 / d, pro skvrnu blíže čelu Rf2 = d2 / d; vzdálenost se měří
v místě nejintenzívnějšího zabarvení. Hodnoty Rf jsou závislé na
podmínkách separace, především na teplotě a vlhkosti prostředí,
proto se v praxi provádí dělení neznámých vzorků zároveň se
známými standardy.
Pokud je stacionární fází voda, hovoříme o tzv. chromatografii s normální fází. Často se však setkáváme se
zakotvenými organickými kapalinami s obvykle nízkou polaritou a tehdy hovoříme o tzv. obrácené fázi.
ROSTLINNÁ BARVIVA
Rostliny obsahují mnoho různých látek schopných absorbovat záření ve viditelné oblasti spektra. Souborně se tyto látky
označují jako barviva či pigmenty, protože působí zbarvení rostlin. Chemicky i funkčně jsou rostlinná barviva velmi
různorodá. Jejich společným charakteristickým rysem je větší počet konjugovaných dvojných vazeb v molekule.
Barva listů rostlin je dána zejména pro fotosyntézu nezbytnými zelenými barvivy chlorofyly (cyklické tetrapyroly) a
dále pomocnými karotenoidy (zahrnují xantofyly a karoteny). V menší míře jsou v listech přítomné flavonoidy (př.
anthocyaniny). Na podzim je chlorofyl v případě opadavých listů odbouráván a jeho složky uchovány v zásobních
pletivech rostlin, v listech pak převáží barviva žlutá a červená.
-karoten
lutein
chlorofyl a
chlorofyl b
/ 28
Kontrolní otázky
1.
2.
3.
4.
Na základě čeho je možné určit, která ze soustavy dvou nemísitelných kapalin (např. olej a voda) bude po ustálení
rozhraní v horní resp. dolní části zkumavky?
Která z fází (mobilní či stacionární), které budete používat při papírové chromatografii, je polárnější?
Jak se liší chlorofyl a od chlorofylu b a jak to ovlivní jejich chromatografické vlastnosti (v nepolární mobilní fázi)?
90 ml mobilní fáze obsahuje ethanol, aceton a destilovanou vodu v poměru 45:15:40. Kolik mililitrů jednotlivých
rozpouštědel musíte k přípravě této mobilní fáze smíchat?
Pracovní postup
Chemikálie a vzorky: ethylacetát, chloroform, benzín, pomeranč, pomerančový džus, nepřírodní ovocná šťáva (např.
Fanta), zelené listy (břečťan, špenát), aceton, ethanol, isopropylalkohol, mořský písek
Přístroje a pomůcky: skleněné pipety (2 a 5 ml) + nástavec, odměrný válec (50 a 100 ml), kádinky (100 ml, vyšší 250
ml), centrifugační zkumavky, stojánek na zkumavky, dělící nálevka + zátka, nálevka, kruh na nálevku, stojan,
Erlenmeyerova baňka se zábrusovým uzávěrem (100 ml), skleněná tyčinka, Petriho misky různých velikostí, Pasteurova
pipeta, fén, nůžky, obyčejná tužka, fixy, pravítko, rukavice, bavlněný knot, třecí miska s tloučkem, chromatografická
destička (Silufol), chromatografický papír, předvážky, Vortex
1. Extrakce
a) Porovnání podílu extrahovatelných barviv ve šťávě vymačkané z ovoce s odpovídající
komerční ovocnou šťávou (např. pomeranč + pomerančová limonáda). Pro tento účel použijte
3 různá rozpouštědla (v pořadí s klesající polaritou): ethylacetát, chloroform a benzín (= směs
vyšších nasycených alkanů, tj. heptan, oktan, nonan atd.). S organickými rozpouštědly pracujte
v rukavicích, a to zásadně pouze v zapnuté digestoři! Do popsaných zkumavek pipetujte vždy 2
ml ovocné šťávy a pomocí skleněné nebo kalibrované Pasteurovy pipety přidejte 2 ml organického
rozpouštědla. Extrahujte 20 sekund pomocí Vortexu a pro lepší oddělení obou fází centrifugujte.
Zakreslete, popište a diskutujte výsledek. V případě, že jsou obě fáze zabarvené, do čisté zkumavky
opatrně odeberte Pasteurovou pipetou organickou fázi, k vodné fázi přidejte další 2 ml téhož
rozpouštědla a extrakci zopakujte.
b) Práce s dělící nálevkou. Připravte ethylacetátový extrakt vybrané čiré komerční ovocné šťávy
pomocí dělící nálevky. Pracujte v rukavicích, pouze v digestoři! Dělící nálevku umístěte na stojan a
zkontrolujte, zda je uzavřen výpustný kohout. Do nálevky odměřte 40 ml šťávy a stejný objem
ethylacetátu. Nyní dělící nálevku opatřete zátkou, uchopte do rukou - jistěte stále jak zátku, tak
výpustný kohout - a prudce protřepávejte. Po prvním protřepání, když máte děličku v ruce tak, že
výpustný kohout směřuje vzhůru, otevřete kohout a uvolněte přetlak par (směrem do digestoře).
Kohout uzavřete a třepání opakujte. Obě fáze se musí dostat důkladně do styku. Po asi 10 min dělící
nálevku umístěte na stojan a vyčkejte, až se utvoří mezi oběma kapalinami rozhraní (tvorbě
rozhraní můžete napomoci mírným krouživým pohybem děličkou ve svislé poloze). Odstraňte zátku
a do připravené kádinky opatrně odpusťte spodní vodnou fázi. V dělící nálevce zůstane
ethylacetátový extrakt - ten přelijte do zábrusovým uzávěrem opatřené Erlenmeyerovy baňky a
popište.
2. Kruhová papírová chromatografie
Vaším úkolem je prostřednictvím papírové chromatografie rozdělit směsi barviv: např. fixy,
propisky apod.
Pracujte každý samostatně (ne ve skupině). Použijte chromatografický papír, který je silnější než
filtrační; vystřihněte kruh o poloměru o cca 1 cm větším než spodní Petriho miska (pozor, všechny
misky nejsou stejně velké). Okolo středu papíru vyznačte obyčejnou tužkou kružnici o poloměru asi
1 cm, na ní označte (s odstupem alespoň 2 mm) místa, kam budete nanášet vzorky (8 až 12).
Použijte raději měkčí tužku a netlačte na ni - je třeba se vyhnout jakémukoli poškození struktury
chromatografického papíru. Vzorky na chromatogramu popište obyčejnou tužkou „dovnitř
startovního kroužku“. Do středu papíru zasuňte cca 2 cm dlouhý bavlněný knot.
Po nanesení vzorků připravte mobilní fázi (vyzkoušejte každý jinou): odměřte ethanol i aceton
v náhodném poměru tak, aby výsledný objem byl 40 až 70 ml, doplňte vodou na cca 80 ml; objemy
/ 29
všech rozpouštědel zaznamenejte a následně vypočítejte objemová % ethanolu a/nebo acetonu
v mobilní fázi.
Do spodní Petriho misky nalijte příslušnou mobilní fázi a přes
misku položte filtrační papír tak, aby byl knot ponořen
v mobilní fázi. Následně vyvíjecí soustavu přiklopte velkou
Petriho miskou, aby došlo k nasycení soustavy parami
rozpouštědla (mobilní fáze).
Jakmile dostoupí rozpouštědlo téměř k okraji Petriho misky, papír vyjměte, obyčejnou tužkou
obkreslete hranici, kam dostoupilo čelo mobilní fáze (aby bylo následně možno změřit pro každý
vzorek vzdálenost čela od startu), a chromatogram usušte. Popište, zda při chromatografii došlo
k oddělení jednotlivých složek barviv. U jednotlivých pigmentů určete retenční faktor a pro stejně
barevné skvrny z různých vzorků Rf porovnejte. Do chromatogramu naznačte, kde jste odečítali
hodnoty pro výpočet Rf. Jak souvisí hodnoty Rf získané v rámci vašeho experimentu s polaritou
jednotlivých pigmentů?
3. Rozdělení směsi rostlinných barviv pomocí chromatografie na tenké vrstvě
Připravte extrakt rostlinných barviv: asi 2g sušených nebo čerstvých zelených listů důkladně
rozdrťte v třecí misce s malým množstvím křemenného písku. Veškeré používané sklo musí být
suché, v kontaktu s vodou by mohlo dojít k vysrážení barviv. Větší kusy listů je vhodné předem
nastříhat na menší kousky. K rozmělněnému materiálu přidejte 3 - 5 ml acetonu (je možné
kombinovat i s benzínem) ještě několik minut rostlinná barviva extrahujte (= roztírejte). Extrakt
přefiltrujte přes filtrační papír.
Mobilní fázi připravte smísením benzínu, propan-2-olu a vody v poměru 100:10:0,25. Do
chromatografické nádoby (zde vyšší kádinka) nalijte mobilní fázi tak, aby její hladina dosahovala
asi 0.5 - 1 cm vysoko. Nádobu uzavřete a nechte ji stát, aby se vzduch uvnitř nasytil parami
rozpouštědla. Mezitím si připravte chromatografickou destičku, na níž asi 1.5 cm od dolního okraje
vyznačte měkkou tužkou startovní čáru tak, aby nedošlo k porušení vrstvy silikagelu. Na tuto
linii pak nanesete rostlinné extrakty.
Nanášení vzorků je dobré si nejdříve vyzkoušet na odstřižek Silufolu či
chromatografického papíru. Správně nanesený vzorek nesmí tvořit velkou
skvrnu, každý vzorek je proto nutno nanášet po malých dávkách (max.
2 μl) opakovaně do jednoho bodu tak, aby vznikla malá skvrna o
intenzívním zabarvení. Opět je nutno pracovat tak, aby nedošlo k porušení
vrstvy silikagelu. S dalším přídavkem vždy vyčkejte do odpaření
rozpouštědla (k urychlení odpařování můžete použít například elektrický
vysoušeč).
Desku s nanesenými vzorky opatrně vložte do chromatografické nádoby
tak, aby její spodní okraj byl ponořen v mobilní fázi (startovní linie nesmí
být do mobilní fáze ponořena). Sledujte průběh dělení barviv.
Chromatografii je třeba ukončit dříve, než čelo rozpouštědla dosáhne
horního okraje desky. Po vyjmutí desky označte tužkou místo, kam až
rozpouštědlo doputovalo a pak ji vysušte. Na základě znalosti struktury
hlavních barviv obsažených v listech rostlin a vlastností mobilní fáze
přiřaďte barevné zóny jednotlivým barvivům. Svou volbu zdůvodněte.
Nejvíce zastoupenými pigmenty v rostlinnách jsou: chlorofyl a, chlorofyl b, βkaroten
(oranžový), lutein (žlutý), v menší míře (tudíž hůře prokazatelné pomocí TLC) pak
feofytin, lutein-5,6-epoxid, violaxanthin, neoxanthin.
Úloha 7. pH A PUFRY
/ 30
Kw = [H+][OH-]
Míra disociace vody je závislá pouze na teplotě:
Kw25°C ~ 10-14 mol2 l-2
Kw0°C ~ 10-15 mol2 l-2
Dle poměru [H+] a [OH-] pak rozdělujeme roztoky na
kyselé
neutrální
zásadité
[H+] > [OH-]
[H+] = [OH-]
[H+] < [OH-]
VODÍKOVÝ EXPONENT (pH)
pH je definováno jako záporná hodnota dekadického
logaritmu aktivity vodíkových iontů v daném
roztoku. Ve zředěných vodných roztocích lze
hodnotu aktivity aproximovat hodnotou molární
koncentrace, pak platí:
Kw
pH = − log[H + ] = − log
[OH − ]
Jelikož pH vodných roztoků závisí na míře disociace
vody, závisí také na teplotě (např. pro neutrální
roztok je pH25°C = 7.0 ; pH0°C = 7.5)
KYSELINY A ZÁSADY
Zjednodušeně lze říci, že kyselina je částice schopná odštěpovat proton
a zásada (báze) částice schopná odštěpovat hydroxidový aniont (přesněji
řečeno proton vázat). Sílu kyselin a zásad lze charakterizovat disociační
konstantou, která udává poměr mezi disociovanými a nedisociovanými
molekulami (umocněnými na stechiometrické koeficienty) - např. pro
kyselinu octovou:
CH3COOH ↔ H+ + CH3COOKA =
[ H ] ⋅ [CH COO ] = 1.75 ⋅ 10
+
3
−
[ CH 3COOH]
−5
pK A = − log K A = 4.76
O silné kyselině hovoříme v případě, že hodnota KA je vysoká (>10-2) –
např. pro HCl: KHCl = 1.3 · 106, tedy pKHCl = - 6.1. Rovnováha je
posunuta zcela na stranu produktů (HCl → Cl- + H+), silná kyselina je
tedy ve vodném roztoku úplně disociována. Jinými slovy, kolik bylo
původně kyseliny, tolik vzniklo vodíkových kationtů, tj. rovnovážná
koncentrace vodíkových kationtů se rovná analytické koncentraci
kyseliny chlorovodíkové cHCl, tudíž platí:
pH = -log cHCl
(Vodíkové kationty vzniklé v důsledku disociace vody neuvažujeme, neboť koncentrace
vodíkových iontů takto vzniklých je proti koncentraci HCl obvykle velmi malá a disociace
HCl navíc disociaci vody potlačuje.)
Pro roztoky silných zásad platí pro výpočet pOH (záporný logaritmus
koncentrace iontů OH-) stejný vztah jako pro výpočet pH u roztoků
kyselin; z pOH pak vypočteme pH na základě platnosti iontového
součinu, tj. při 25 °C:
pH + pOH = 14.
V případě slabé kyseliny (tj. KA<<10-2)
disociuje pouze velmi malé množství
molekul kyseliny, prakticky 100 %
molekul
se
v roztoku
vyskytuje
v nedisociované formě.
Ve vyjádření disociační konstanty tedy můžeme
rovnovážnou koncentraci nedisociované kyseliny
[CH3COOH]
nahradit
původní
analytickou
koncentrací kyseliny octové (cA). Dále je zřejmé, že
disociací vzniká stejný počet molekul konjugované
báze jako vodíkových kationtů, tedy že se jejich
rovnovážné koncentrace rovnají: [CH3COO-] = [H+].
Rovnice
pro
rovnovážnou
konstantu
tedy
zjednodušíme na tvar:
KA =
[H + ] =
K A .[HA]
[A − ]
pH = pK A + log
3
−
[ CH3COOH]
+ 2
cA
[ ]
Pro roztoky slabých zásad platí pro výpočet pOH
stejné vztahy jako pro výpočet pH u roztoků kyselin;
kyselou disociační konstantu KA je však ve vztazích
nutno nahradit analogickou konstantou KB,
charakterizující odštěpení hydroxidového aniontu
(přijetí protonu).
[A − ]
[HA]
kde pKA je záporný dekadický logaritmus disociační konstanty kyseliny, [A -] je
koncentrace soli (disociované formy kyseliny) a [HA] je koncentrace
(nedisociované) kyseliny. Tato rovnice nejspolehlivěji platí pro pufry, u nichž
poměr koncentrace kyseliny a soli není příliš vzdálen od jedné.
Přidá-li se k roztoku slabé kyseliny a její soli, např. kyseliny octové a octanu
sodného, malé množství kyseliny chlorovodíkové, vytvoří se podle zákona
disociace sloučenin nová iontová rovnováha: z části octanu sodného se vytvoří
nedisociovaná kyselina octová (protože je tato kyselina slabá) a pH roztoku se
změní jen nepatrně; přidání zásady naopak způsobí disociaci části kyseliny
octové a pH rovněž nedozná patrné změny.
[H + ].[A − ]
[HA]
+
Z rovnice pro rovnovážnou konstantu pak
(vyjádřením [H+] a logaritmováním) získáváme
rovnici pro výpočet pH slabé kyseliny:
1
pH = − log H + = − log K A ⋅ c A = ( pK A − log c A )
2
PUFRY
V chemické praxi je často třeba poměrně přesně nastavit pH roztoku a současně
zaručit, aby se požadovaná hodnota pH během pokusu co nejméně měnila.
Tomuto účelu vyhovují roztoky obsahující slabou kyselinu či slabou zásadu
v kombinaci s jejich solí. Takové roztoky se nazývají pufry či tlumivé roztoky.
O hodnotě pH pufru rozhoduje poměr, v němž byla slabá kyselina či báze
smíchána se svou solí. Pro výpočet pH pufru tvořeného slabou kyselinou a její
solí platí Hendersonova-Hasselbachova rovnice, kterou lze jednoduše odvodit
jakožto záporně vzatý logaritmus koncentrace H + vyjádřené z rovnice
disociační konstanty slabé kyseliny (KA) :
KA =
[H ] ⋅ [CH COO ] = [H ]
Titrace 0.01 M octové kyseliny
0.01 M hydroxidem sodným
pH
IONTOVÝ SOUČIN VODY
Molekuly H2O v čisté vodě i jakémkoli roztoku částečně
disociují na H+ (lépe řečeno H3O+) a OH-. Rovnovážný stav
při disociaci vody je popsán disociační konstantou nazývanou
iontový součin vody:
Přídavek NaOH
[počet ekvivalentů]
Příklady pufrů:
pKA (25°C)
Pufr
HCl/KCl
- 6.1
citrát (pK1)
3.13
citrát (pK2)
4.76
citrát (pK3)
6.40
glycin (pK1)
2.35
glycin (pK2)
9.78
bikarbonát (pK1)
6,36
Tris / HCl
8.06
Rozmezí pH
1.1-2.2
2.2-6.5
3.0-6.2
5.5-7.2
2.2-3.6
8.8-10.6
7,4 (krev)
7.5-9.0
/ 31
FOSFÁTOVÝ PUFR
Kyselina fosforečná H3PO4 je trojsytná kyselina se třemi
disociačními konstantami, která je tedy schopná tvořit pufr účinný
ve třech oblastech pH (viz obr.)
V biochemické praxi pro oblast pH 5.8–8.0 a stejně tak i jakožto
nejdůležitější intracelulární pufr v biologických systémech je
využívána reakce
H2PO4- + H2O
HPO42- + H3O+
pKA = 7.21
PŘÍPRAVA PUFRŮ
V následující tabulce jsou uvedeny příklady postupu přípravy pufru tvořeného roztokem slabé kyseliny a její soli.
Postupy založené na výpočtu poměru složek pufru bez experimentálního ověření skutečného pH umožňují dosáhnout
pouze přibližné hodnoty pH, neboť při výpočtech aktivitu uvažujeme rovnu koncentraci - skutečná aktivita vodíkových
kationtů však může být nižší (zvláště u koncentrovanějších roztoků).
Výpočet
Postup
Vypočteme navážku slabé kyseliny odpovídající celkové
koncentraci pufru.
→
Navážku kyseliny doplníme vodou na cca 60 % výsledného objemu, titrujeme
silnou bází obsahující protiiont (= slabou kyselinu částečně neutralizujeme)
do požadovaného pH, doplníme vodou a překontrolujeme pH.
Vypočteme navážku slabé kyseliny odpovídající celkové
koncentraci pufru, vypočteme navážku její soli odpovídající
celkové koncentraci pufru
→
Připravíme roztok kyseliny i roztok soli téže koncentrace jako bude mít
výsledný pufr. Roztok složky o pH bližším požadovanému pak titrujeme
roztokem složky druhé, případně poměr objemů obou roztoků pro dané pH
najdeme v tabulkách.
Pomocí pKa daného pufru vypočítáme z HendersonHasselbachovy rovnice potřebné látkové množství kyseliny a
soli v pufru o daném pH, které následně přepočítáme na
navážku obou látek.
→
Obě látky navážíme a doplníme vodou na výsledný objem.
MĚŘENÍ pH
pH-metr sestává v podstatě ze dvou elektrod (měrné a
referentní) a voltmetru. V jedné trubici, kterou nazýváme
"kombinovanou elektrodou", jsou zároveň umístěny obě
elektrody, měrná skleněná i referentní neboli srovnávací
(elektroda II. druhu, nejčastěji elektroda argentchloridová či
kalomelová). Do měřeného roztoku tedy ponořujeme systém
dvou elektrod.
Ve styku s roztokem musí být tzv. diafragma (většinou těsně nad
skleněnou baničkou, vodivě spojuje referentní elektrodu s měřeným
roztokem), ale zároveň hladina roztoku uvnitř elektrody nesmí být níže než
hladina měřeného roztoku. Důležité je elektrodu před a po ponoření do
jakéhokoliv roztoku omýt destilovanou vodou (proudem ze střičky) a jemně
osušit buničinou. Elektrodu vždy, když s ní nepracujeme, ponoříme do
ukládacího pufru, neboť nesmí vyschnout. Dalším důležitým pravidlem při
měření pH je zajistit, aby byl měřený roztok pomalu míchán.
pH-metr neměří přímo hodnotu pH, ale napětí (v mV) mezi oběma výše
popsanými elektrodami, které je závislé na koncentraci vodíkových iontů
v měřeném roztoku. Abychom se tedy použitím pH-metru dostali přímo
k požadovanému údaji o pH, musíme přístroj kalibrovat. K tomu slouží
většinou 2 standardní (komerčně dodávané) pufry, které volíme dle oblasti
pH, ve které budeme pracovat (pH 7 + pH 4 nebo pH 7 + pH 10). Přístroj
v modu „kalibrace“ změří napětí na elektrodách ponořených do
kalibračního pufru, přiřadí k tomuto údaji pH a ze dvou hodnot si pak
vytvoří jakousi kalibrační křivku. Při každém měření pak podle této křivky
přiřadí naměřené hodnotě napětí odpovídající pH.
ACIDOBAZICKÉ INDIKÁTORY
U některých organických látek dochází v závislosti na pH prostředí ke změnám v uspořádání dvojných vazeb
v molekule, které se projeví změnou zabarvení roztoku. Takovým látkám říkáme acidobazické indikátory (viz tabulka
níže). Barevné přechody indikátorů jsou v praxi nejčastěji využívány pro acidobazické titrace (tj. k určení obsahu
kyseliny nebo hydroxidu v analyzovaném vzorku), případně mohou sloužit k orientačnímu určení pH roztoku
(lakmusový papírek - proužek papíru napuštěný lakmusem, což je směs přírodních barviv z různých lišejníků,
univerzální indikátorový papírek - přesnější, více barevných přechodů).
/ 32
Funkční
Zbarvení forem
oblast pH kyselá
zásaditá
thymolová modř
1.2 - 2.8 červené
žluté
methylová žluť
2.9 - 4.0 červené
žluté
methyloranž
3.1 - 4.5 červené
žluté
methylčerveň
4.4 - 6.3 červené
žluté
bromthymol. modř 6.0 - 7.6
žluté
modré
fenolftalein
8.2 - 10.0 bezbarvé červenofialové
thymolftalein
9.3 - 10.5 bezbarvé
modré
Indikátor
ROSTLINNÁ BARVIVA
Rozmanité zabarvení rostlin je způsobeno obsahem zejména 3 typů barviv: chlorofyly (zelená), karotenoidy (červená,
oranžová, žlutá) a ve vodě rozpustné flavonoidy. Barva flavonoidů se mění v závislosti na pH: v kyselém a neutrálním
prostředí jsou bezbarvé, v alkalickém žluté či oranžové. Deriváty flavonoidů anthocyaniny (červené v kyselém
prostředí, modré v alkalickém) jsou spolu s dalšími pigmenty obsaženy například v červeném zelí a cibuli, černém
rybízu, borůvkách, brusinkách, třešních, červeném víně či červených květech růže.
Kontrolní otázky
1. Která z látek ve fosfátovém pufru (Na2HPO4 + NaH2PO4) vystupuje jako slabá kyselina a která jako její sůl? Jak
tlumí fosfátový pufr změny pH při příidávání HCl resp. NaOH (uveďte reakce)?
2. a) Z Henderson-Hasselbachovy rovnice vypočítejte poměr koncentrací Na2HPO4 a NaH2PO4 v pufru o pH = 7.
Záporný dekadický logaritmus disociační konstanty H2PO4- je 6.7.
b) Jaké jsou tedy dílčí koncentrace obou složek v 0.1M fosfátovém pufru o pH = 7? („Koncentrací fosfátového
pufru“ rozumíme součet molarit obou fosfátů v roztoku)
c) S využitím těchto údajů vypočtěte navážky Na 2HPO4.12H2O (358.14 g/mol) a NaH2PO4.2H2O (156.01 g/mol),
jejichž rozpuštěním ve 70 ml destilované vody získáte 0.1M pufr o pH = 7.
3. Závisí pH roztoku na jeho koncentraci u silné kyseliny / slabé kyseliny / pufru ?
Pracovní postup
Chemikálie a vzorky: červené zelí (cibule), NaH2PO4.2H2O (156.01 g/mol), 1M NaOH, 1M HCl, 0.1M Na2HPO4, 0.1M
NaH2PO4, kalibrační roztoky k pH-metru
Přístroje a pomůcky: automatické pipety + špičky (200 μl, 1 a 5 μl), kádinky (150 ml), odměrné válce (10, 50 a 100 ml),
zkumavky, stojánek na zkumavky, nálevka, vata, kruh na nálevku, stojan, skleněná tyčinka, nůž, krájecí prkénko,
univerzální indikátorový pH papírek, pH metr, magnetická míchačka, míchadlo, předvážky, elektrický vařič
U veškerých výpočtů v této úloze uvažujte aktivitu rovnou koncentraci.
1. Za asistence vyučujícího kalibrujte pH-metr (dle návodu přiloženého u přístroje).
S kombinovanou elektrodou je nutno zacházet velmi opatrně!
2. Příprava sodnofosfátového pufru o pH 7.0
a) Příprava 0.1M pufru navážením NaH2PO4 a úpravou pH
Vaším úkolem je připravit 70 ml pufru o koncentraci 0.1 mol/l.
• vypočtěte, kolik NaH2PO4.2H2O je nutno navážit, aby vznikl 0.1M roztok o objemu 70 ml
• kalibrujte kádinku s magnetickým míchadlem na objem 70 ml
• odvažte NaH2PO4.2H2O (navážku zaznamenejte), převeďte do kádinky s cca 50 ml vody
• za stálého míchání opatrně upravte pH roztoku přidáváním NaOH (přidávejte kapátkem 1M
roztok, můžete použít i pevný). Před posledním přídavkem NaOH doplňte pufr na požadovaný
objem (bez elektrody), poté teprve upravte pH na zcela přesnou hodnotu.
Diskutujte jak a proč je takto vzniklý pufr schopen tlumit výkyvy pH po přidání HCl či NaOH.
b) Připrava 0.01M pufru ředěním 0.1M pufru
Připravte 50 ml sodnofosfátového pufru o pH 7.0 o koncentraci 0.01 mol/l ředěním 0.1M pufru
připraveného v předchozím úkolu (zanedbejte směšovací objem). Ověřte pH výsledného roztoku.
Zamyslete se nad tím, je-li možné upravit pH pufru vychýlené do zásadité oblasti tak, aby nebylo
ovlivněno složení pufru, tj. aby zůstala zachována koncentrace obou fosfátů a v roztoku nebyla
přítomna žádná nadbytečná složka (objem roztoku bude pochopitelně větší).
3. Pufrační kapacita 0.1M a 0.01M pufru
Porovnejte pufrační kapacitu 0.1M a 0.01M pufru v kyselé nebo zásadité oblasti (dle zadání
/ 33
vyučujícího; vyhodnoťte společně s výsledky paralelní skupiny). Do úzké 100ml kádinky odměřte
přesně 50 ml pufru, vložte míchadlo, kádinku umístěte na magnetickou míchačku a zapněte mírné
míchání. Do pufru opatrně ponořte elektrodu pH-metru a po ustálení zaznamenejte počáteční
hodnotu pH. Za stálého míchání postupně přidávejte automatickou pipetou po 50 μl 1M HCl nebo
1M NaOH a po každém přídavku zaznamenávejte pH – vždy vyčkejte do ustálení hodnoty. Titraci
ukončete po přidání deseti přídavků. (Výsledné roztoky nevylévejte.)
Vyhodnocení:
Určete/vypočítejte:
•jaké je teoretické pH samotné vody při 25ºC?
•jaké je pH roztoku vzniklého smísením 50 ml H2O a 50 μl 1M HCl?
•jaké je pH roztoku vzniklého smísením 50 ml H2O a 50 μl 1M NaOH?
Z experimentálních dat sestrojte
1)graf závislosti pH obou pufrů (0.1M a 0.01M pufru) na objemu přidané HCl.
2)graf závislosti pH obou pufrů na objemu přidaného NaOH.
Do obou grafů pro přídavek 0 μl a 50 μl příslušného činidla uveďte také teoretické hodnoty pro vodu, tj. jaké
hodnoty pH by byly teoreticky naměřeny při titraci "0M pufru“ o pH = 7.
Jak se liší průběh křivky 0.1M a 0.01M pufru při použití stejného činidla? Jak se liší průběh křivky pro 0.01M pufr
v kyselé a zásadité oblasti - liší se přidaný objem HCl a NaOH, který již způsobí skokovou změnu pH? Jak lze tento jev
vysvětlit?
4. pH indikátory
5 až 6 g rostlinného materiálu nařežte na jemné kousky (můžete také použít lžičku borůvkového či
višňového džemu), převrstvěte v kádince 50 ml vody a vařte 10 minut. Po ochlazení výluh
přefiltrujte (přes vatu). Je možné také použít přímo džus z brusinek, černého rybízu či červené víno.
Do popsaných zkumavek připravte vždy 2 ml následujících roztoků:
(a) roztok HCl o c(a) = 1 mol/l - vypočítejte hodnotu pH(a) tohoto roztoku
(b) roztok HCl o pH(b) = 2 - vypočítejte koncentraci HCl (c (b)); připravte ředěním 1M HCl
(c) roztok NaOH o c(c) = 1 mol/l; pH(c) = ?
(d) roztok NaOH o pH(b) = 12 c(d) = ? (připravte ředěním 1M NaOH)
(e) pufr připravený smísením 0.1M NaH2PO4 a 0.1M Na2HPO4 v poměru 1 : 1; pH(e) = ?
(f) pufr připravený smísením 0.1M NaH2PO4 a 0.1M Na2HPO4 v poměru 1 : 9; pH(f) = ?
(g) pufr připravený smísením 0.1M NaH2PO4 a 0.1M Na2HPO4 v poměru 9 : 1; pH(g) = ?
(h) pufr připravený smísením 0.1M NaH2PO4 a 0.1M Na2HPO4 v poměru 1 : 99; pH(h) = ?
(i) pufr připravený smísením 0.1M NaH2PO4 a 0.1M Na2HPO4 v poměru 99 : 1; pH(i) = ?
(j) výsledný roztok získaný titrací 0.01M pufru 1M HCl, uveďte naměřené pH (j)
(k) výsledný roztok získaný titrací 0.01M pufru 1M NaOH, uveďte naměřené pH (k)
(l) destilovaná voda
(m) voda z vodovodu
HCl je silná kyselina a NaOH silný hydroxid – v roztoku zcela disociují; pro fosfátový pufr uvažujte
pKA = 6.7
pH ve zkumavkách a), d) a e) ověřte univerzálním indikátorovým papírkem. Barevnou změnu papírku
zaznamenejte. Do každé zkumavky přikápněte několik kapek rostlinného extraktu a promíchejte.
Vyhodnocení: Seřaďte zkumavky (a) - (k) dle vzrůstajícího pH. Zabarvení rostlinného indikátoru
v jednotlivých zkumavkách společně s příslušným pH zaznamenejte do přehledné tabulky. Na
základě získané barevné škály se pokuste ze zabarvení rostlinného extraktu odhadnout pH
destilované vody a vody z vodovodu; svůj odhad porovnejte s naměřenou hodnotou. Diskutujte
hodnoty pH destilované vody a vody z vodovodu. Zamyslete se také nad tím, zda by opravdu bylo
možno všechny z roztoků (e) až (k) v praxi využít jako pufry.
Úloha 8. "STANOVENÍ BÍLKOVIN"
/ 34
BÍLKOVINY (PROTEINY) tvoří základní součást každé živé buňky, kde plní rozmanité funkce: enzymovou
katalýzu, transport sloučenin (např. hemoglobin v krvi), pohyb, oporu kostry, imunitní obranu, regulaci, kontrolu růstu a
diferenciace buněk atd. Skládají se z aminokyselinových monomerních jednotek, každá molekula bílkoviny obsahuje
více než 100 aminokyselinových zbytků spojených navzájem peptidovými vazbami. Všechny bílkoviny se v podstatě
skládají pouze z 20 různých aminokyselin, jejichž přesné pořadí, tj. primární struktura bílkovin, do značné míry
předurčuje uspořádaní bílkoviny v prostoru neboli konformaci. Aminokyseliny jsou monomerními jednotkami peptidů
(2 až 99 aminokyselinových zbytků, jsou to tedy oligomery až polymery) a bílkovin (více než 100 aminokyselinových
zbytků spojených navzájem peptidovými vazbami, tj. velké polymery o molekulové hmotnosti 10 000 – 1 000 000 Da i
více).
Stanovení bílkovin, přesněji řečeno stanovení celkové hmotnostní koncentrace proteinů v roztoku, je jedním ze
základních a nejčastějších úkonů, s nimiž se setkáváme v biochemické laboratoři. Ve většině případů jsou v roztoku
přítomny bílkoviny různého složení a struktury a ke stanovení "celkové bílkoviny" se používají metody empirické, při
nichž je nezbytné měření současně provést i se standardem - provést kalibraci. Heterogenita bílkovin s sebou současně
přináší potíže při kalibraci stanovení, neboť vlastnosti (zastoupení jednotlivých aminokyselin) měřené směsi bílkovin a
standardu se mohou odlišovat. Obvykle se jako standard pro tento účel používá hovězí sérový albumin (BSA – "bovine
serum albumin"). Chyba způsobená odlišností v chování standardu a skutečně stanovované bílkoviny se obecně ještě
zvyšuje, stanovujeme-li koncentraci v roztocích čistých bílkovin, kdy se mohou výrazněji projevit individuální rozdíly.
Výsledek stanovení je zvykem udávat v g·l-1 nebo mg·ml-1.
Stanovení koncentrace bílkoviny v roztoku ještě nic nevypovídá o míře biologické aktivity takového roztoku bílkoviny.
Proto se kromě koncentrace bílkoviny stanovuje posléze také biologická aktivita (enzymová, imunologická a podobně záleží na konkrétním proteinu).
ZÁKLADNÍ PRINCIPY METOD „STANOVENÍ BÍLKOVIN“:
stanovení obsahu
dusíku
stanovení počtu
peptidových vazeb
stanovení obsahu
aromatických aminokyselin
stanovení obsahu
jednotlivých aminokyselin
Kjeldahlova metoda
UV spektrometrie při 215 nm
Biuretová metoda
UV spektrometrie při 280 nm
Folinova metoda
Xantoproteinová reakce
Polarografické
stanovení SH-skupin (Cys)
Folinova metoda (Tyr)
UV spektrofotometrie
Výhodou měření absorpce UV záření je, že se jedná o velice rychlou a nedestruktivní metodu.
UV spektrofotometrie při 215 nm. Peptidová vazba charakteristicky absorbuje záření o vlnové délce 215 nm, pro
roztoky s koncentrací 0.1 g.l-1 platí přibližně A215 = 1.5. V této oblasti záření absorbuje i celá řada jiných látek, čímž
stanovení ruší, proto se v praxi tato metoda v podstatě nevyužívá.
UV spektrofotometrie při 280 nm. Za absorpci v této oblasti jsou zodpovědné zejména aminokyseliny tryptofan a
tyrosin, v menší míře pak také cystein. Pro čistý protein o známém aminokyselinovém složení lze vypočítat extinkční
koeficient ε280 = (nTrp ∙ 5500 + nTyr ∙ 1490 + nCys ∙ 125) mol-1·l·cm-1. Stanovení koncentrace směsi proteinů na základě
absorpce při 280 nm je komplikováno značnými rozdíly v zastoupení uvedených aminokyselin v jednotlivých
bílkovinných molekulách. Orientačně se uvažuje, že koncentraci 1 g.l-1 odpovídá přibližně A280 = 1, ale v albuminu je
zastoupení absorbujících aminokyselin nízké, takže absorbance roztoku o koncentraci 1 g.l-1 je pouze 0.68. Ideální je
tuto metodu využít orientačně či relativně (tam, kde nás nezajímá přesná hodnota koncentrace, ale jen například její
změna).
VIS spektrofotometrie
Fotometrické metody jsou velmi oblíbené, protože nejsou náročné na přístrojové vybavení. V oblasti viditelného světla
však samotné bílkoviny zpravidla záření neabsorbují, využívá se proto tvorby barevných komplexů bílkovin s různými
činidly. Koncentraci těchto komplexů pak již lze stanovit spektrofotometricky a je úměrná množství proteinů v roztoku.
Biuretová metoda je založena na reakci Cu2+ (stabilizovaných jako vínanový komplex)
v alkalickém prostředí s bílkovinou. Vzniká fialový komplex Cu2+ iontů se čtyřmi
dusíky z peptidových (amidových) vazeb (viz obr. ►) se silnou absorpcí světla
v oblasti 540 – 560 nm.
Název metody je odvozen od „biuretu“, což je triviální název pro sloučeninu, která vzniká zahříváním
močoviny - v této látce je také přítomna amidová vazba CONH analogická peptidové vazbě v proteinech.
2 H2N-CO-NH2
↔
H2N-CO-NH-CO-NH2
+ NH3
močovina
biuret
Folinova metoda využívá faktu, že hydroxyfenolová skupina tyrosinu redukuje
fosfomolybdenany na molybdenovou modř (absorbující při 725 nm).
Na analogických principech jsou založeny i další metody, například Lowryho metoda (kombinace biuretové a Folinovy
metody) nebo metoda využívající bicinchoninové kyseliny.
Metoda dle Bradfordové využívá toho, že při vazbě Coomassie Brilliant Blue G 250 s bílkovinou dochází k posunu
absorpčního maxima tohoto barviva ze 465 na 595 nm.
/ 35
Kontrolní otázky
1.
2.
3.
4.
Nakreslete strukturním vzorcem oligopeptid složený z následujících aminokyselin v jakémkoli pořadí:
glycin (Gly), glutamin (Gln) , tyrosin (Tyr).
Ve strukturním vzorci oligopeptidu z 1. kontrolní otázky vyznačte funkční skupiny, které absorbují při 280 nm,
a funkční skupiny, které po reakci s biuretovým činidlem způsobují absorpci při 550 nm.
Připravíte-li roztok 1.5 mg/ml tetrapeptidu Gly-Tyr-Trp-Cys a roztok 1.5 mg/ml tetrapeptidu Gly-Ala-Gly-Ala,
bude se lišit jejich absorpce při 280 nm a při stanovení biuretovou metodou? Uvědomte si, zda bude v obou
roztocích stejná látková koncentrace tetrapeptidů.
Jaká je koncentrace bílkovin v neznámém vzorku, byla-li koncentrace naředěného vzorku 5 mg/ml? Vzorek
byl naředěn následujícím způsobem: v poměru 1 : 4 a následně ještě osmkrát.
Pracovní postup
Chemikálie a vzorky: vaječný bílek, BSA, biuretové činidlo
biuretové činidlo: 1.5 g CuSO4.5H2O a 6 g vínanu sodno-draselného rozpustit v 500 ml vody (možno zahřát). Přidat 300 ml 10% NaOH a doplnit
vodou na 1000 ml, přidat 1 g KI (inhibice redukce Cu). Skladovat v tmavé plastové láhvi
Přístroje a pomůcky: automatické nebo skleněné pipety (1, 2 a 5 ml) + špičky nebo nástavec, Erlenmeyerova baňka,
zkumavky, stojánek na zkumavky, skleněná tyčinka, nálevka, kruh na nálevku, stojan, vata, křemenné kyvety, skleněné
nebo plastové kyvety, spektrofotometr (UV a VIS)
Stanovení koncentrace bílkovin - UV spektroskopie, biuretová metoda
Vaším úkolem je určit koncentraci bílkovin ve vaječném bílku. Pro stanovení bílek v baňce
protřepejte s pětinásobným množstvím vody. Roztok bílku filtrujte přes malý smotek vaty ve
skleněné nálevce.
Pro přípravu kalibrační křivky odezvy standardu na biuretové činidlo použijte hovězí sérový
albumin (BSA). Připravte zásobní roztok BSA v destilované vodě o koncentraci 10 mg/ml a dále
postupuje v ředění „dvojkovou“ řadou (tj. 1:1) tak, abyste v jednotlivých zkumavkách získali po
2 ml roztoků BSA v destilované vodě o koncentracích 10 až 0.313 mg/ml. Při ředění vždy pipetujte
nejdříve rozpouštědlo (vodu), poté přidávejte ředěný roztok.
Pro orientační stanovení vhodného ředění vašeho vzorku (tj. v rozmezí kalibračních roztoků)
porovnejte absorbanci vašeho vzorku vaječného bílku se standardem (BSA) o koncentraci
1.25 mg/ml (kalibrační roztok č. 4). Absorbanci měřte při vlnové délce 280 nm oproti destilované vodě.
Vzorek bílku nařeďte tak, aby jeho absorbance byla srovnatelná s uvedeným kalibračním roztokem.
Orientačně vypočítejte koncentraci bílkovin ve vaječném bílku vyplývající z tohoto stanovení.
K 1 ml všech připravených vzorků, tj. vhodně naředěnému vzorku bílku (3 stejné vzorky pro
3 paralelní stanovení), kalibračním roztokům (z připravených zásobních roztoků odeberte po 1 ml
do čistých suchých zkumavek) a ke vzorku kontrolnímu (1 ml destilované vody, 2 paralelní
stanovení) přidejte 1 ml biuretového činidla (nepipetujte přímo ze zásobní lahve!) a nechte
zkumavky inkubovat 30 minut ve tmě za laboratorní teploty.
Množství proteinu ve vašich vzorcích budete vyhodnocovat spektrofotometricky při vlnové délce
550 nm. Z hodnot naměřených pro kontrolní vzorek a vzorky standardu sestrojte na milimetrový
papír kalibrační křivku. Pokud je absorbance vzorku bílku o neznámé koncentraci mimo rozsah
kalibrační křivky, je třeba celé stanovení zopakovat za použití jiného ředění. Z kalibrační křivky
odečtěte hodnoty koncentrace bílkovin ve všech paralelních vzorcích a vypočtěte průměrnou
hodnotu koncentrace bílkovin ve vaječném bílku (=neředěném) včetně směrodatné odchylky.
Porovnejte výsledek získaný pomocí UV spektroskopie a biuretové metody. Diskutujte rozdílnost
získaných výsledků (principy metod a možné zdroje chyb).
Úloha 9. IZOLACE ROSTLINNÉ DNA, SPEKTRA BIOCHEMICKY VÝZNAMNÝCH LÁTEK
/ 36
Úloha 9. IZOLACE ROSTLINNÉ DNA,
SPEKTRA BIOCHEMICKY VÝZNAMNÝCH LÁTEK
NUKLEOVÉ KYSELINY
Deoxyribonukleové kyseliny (DNA) představují základní genetický materiál většiny živých organismů - uchovávají a
předávají základní genetickou informaci. Ribonukleové kyseliny (RNA) se bezprostředně podílejí na různých fázích
biosyntézy bílkovin. Základem molekuly nukleových kyselin je nerozvětvený polynukleotidový řetězec, sestavený ze
základních stavebních článků – nukleotidů. Každý nukleotid se skládá ze tří složek – heterocyklické dusíkaté báze,
pentosy (ribosy/deoxyribosy) a kyseliny fosforečné.
DNA se nejčastěji vyskytuje ve formě pravotočivé dvojšroubovice (DNA-B), kde jsou 2 řetězce tvořené zbytky
deoxyribosy a kyseliny fosforečné zatočeny ve spirálách kolem centrální osy a dovnitř šroubovice potom směřují
jednotlivé báze. Řetězce jsou uspořádané v opačné
orientaci a jsou vzájemně vázány vodíkovými můstky
mezi bázemi adeninem a tyminem (A-T) a mezi
cytosinem a guaninem (C-G). DNA se v jádře buňky
vyskytuje jakožto vysoce strukturně uspořádaný
nukleoproteinový
komplex
zvaný
chromatin.
Dvojšroubovice
DNA
je
“omotána”
kolem
8 molekul histonů (bazické proteiny) za vzniku útvarů
zvaných nukleosomy. Nukleosomy jsou („obtočením”
okolo histonu H1) uspořádány do spiralizované
solenoidní struktury. Solenoidy jsou dále uspořádány do
smyček, jejichž pravidelné uspořádní vytváří základní
segment chromozomu. Lidské chromozomy jsou (v
kondenzované podobě) dlouhé cca 200 µm, celková
délka samotné DNA je pak u člověka asi 2 m.
IZOLACE DNA
Pro izolaci nukleových kyselin je k dispozici celá řada metod, zahrnujících následující 3 kroky:
1. desintegrace a lyze buněk, tj. rozrušení biologických membrán a případně buněčných stěn tak, aby se buněčný
obsah včetně nukleových kyselin z buněk uvolnil do roztoku. Toho lze dosáhnout mechanicky, s využitím detergentů,
enzymovou hydrolýzou, alkalickou hydrolýzou, osmotickým šokem nebo kombinací uvedených metod. U eukaryotních
buněk lze dále využít různých centrifugačních metod pro izolaci pouze jaderné nebo mitochondriální DNA.
2. odstranění kontaminujících biomolekul (především proteinů, polysacharidů a RNA), kterého lze dosáhnout
extrakcí (tradiční „fenol-chloroformová extrakce“), chromatografickými metodami (adsorpce na silikát) a/nebo
s využitím enzymů, které tyto molekuly degradují (RNasy, proteasy – např. proteináza K, enzym štěpící bílkoviny
včetně histonů vázaných na DNA).
3. separace DNA z roztoku, která se provádí nejčastěji precipitací podchlazeným isopropylalkoholem nebo ethanolem.
Precipitaci DNA napomáhá přítomnost NaCl v roztoku zejména díky vysolovacímu efektu (tj. vlastní solvatací odnímá
molekuly vody ze solvatačního obalu DNA). Alkohol pak váže další molekuly vody a konečně způsobí precipitaci
DNA, jež ztratila svůj hydratační obal.
Izolace DNA z rostlinného materiálu s využitím enzymové hydrolýzy
Lyzační roztok pro izolaci DNA obsahuje tři nezbytné složky:
1. NaCl, které udržuje iontovou sílu nezbytnou pro setrvání DNA ve formě dvojšroubovice (jinak by došlo
k oddělení obou vláken DNA).
2. EDTA (ethylendiamintetraacetát) chelatuje dvojmocné ionty (Mg2+ a Ca2+), které jsou nezbytné pro funkci
DNas, tedy enzymů štěpících DNA. Tyto ionty tak nejsou pro DNasy dostupné.
3. Aniontový detergent (např. dodecylsulfát sodný - SDS) funguje jednak jako detergent "rozpouštějící"
biologické membrány a zároveň váže pozitivně nabité proteiny interagující s DNA, čímž způsobuje uvolnění
DNA do roztoku.
Inkubace při teplotě 55-60 °C způsobí parciální denaturaci proteinů a zefektivní působení detergentu. Denaturované
proteiny a další pevné složky roztoku poté oddělíme centrifugací. Z vodné fáze je následně možné vysrážet DNA
pomocí vychlazeného alkoholu.
/ 37
SPEKTROFOTOMETRIE V UV OBLASTI
Obecný úvod ke spektrofotometrickým metodám najdete v úloze 4.
Pro zjištění čistoty a koncentrace nukleových kyselin se rutinně používá
absorpční spektroskopie v UV oblasti. Nukleové kyseliny absorbují UV
záření o vlnové délce 260 nm, bílkoviny pohlcují světlo o vlnové délce
280 nm. Preparát DNA považujeme za dostatečně čistý, dosahuje-li poměr
A260/A280 hodnoty spadající do intervalu 1.8 - 2.0. Pro vyhodnocení
kontaminace DNA dalšími látkami (např. fenolem, detergenty) se uvádí
poměr A280/A230. Absorbance A260 = 1 odpovídá koncentraci DNA ve vzorku
c = 50 μg/ml. Většinou se absorbance DNA koriguje na absorbanci pozadí
při 320 nm (A260 –A320 nm).
Kontrolní otázky
1.V jaké formě se DNA v buňce vyskytuje a kde je lokalizována?
2.Nakreslete strukturní vzorce bazí A, T, C a G. Kolika vodíkovými můstky jsou páry A-T a C-G vázány?
3.Za jakých okolností může dojít k rozvolnění dvojšroubovice DNA?
4.Jaké kyvety se používají pro měření absorbance v UV oblasti?
5.Pokuste se zjistit, při jakých vlnových délkách charakteristicky absorbují bílkoviny (aminokyseliny – tyrosin,
tryptofan) a nukleové kyseliny (nukleotidy).
Pracovní postup
Chemikálie a vzorky: zmražená cibule, ledový isopropylalkohol, ethanol, Na2EDTA, NaCl, enzymový prací prášek, led,
BSA, tyrosin, adenosin (příp. adenin), 1M HCl, 0.1M NaOH
Přístroje a pomůcky: skleněné pipety (2, 5, 10 a 25 ml) + nástavec, kádinka (150 ml), odměrný válec (50 ml), skleněná
tyčinka, zkumavky, centrifugační zkumavky, stojánek na zkumavky, baňka se širokým zábrusem, nůž, krájecí prkénko,
třecí miska s tloučkem, Pasteurova pipeta, špejle, špachtle, polystyrenová krabice, předvážky, centrifugační kyvety,
chlazená centrifuga, UV spektrofotometr, křemenné kyvety, analytické váhy, vodní lázeň (55 – 60 °C)
1. Izolace DNA
Nejdříve dejte chladit čistý isopropylalkohol a 75% ethanol a zapněte chlazení centrifugy.
Připravte 50 ml roztoku o složení
0.05 M Na2EDTA (Mr = 372.24)
0.5 M
NaCl (Mr = 58.44)
Rostlinný materiál o hmotnosti asi 10 g nařežte na drobné kousky, velmi důkladně rozetřete ve třecí
misce s 1 g pracího prášku a převeďte do kádinky spolu s 50 ml připraveného roztoku NaCl/EDTA.
Inkubujte 20 minut při 55-60 °C, přičemž několikrát opatrně promíchejte. Při práci s DNA se
vyvarujte manipulace, která by vlákna DNA uvolněná do roztoku mohla zlámat (intenzivní míchání,
vortexování atd.).
Po inkubaci směs ochlaďte na ledu (drcený led v polystyrenové krabici) a následně přelijte do
centrifugačních kyvet. Kyvety umístěte do centrifugačních pouzder a proveďte jejich dokonalé
vyvážení. Centrifugujte 10 min při 4 °C v centrifuge Janetzki K-23, 3000 RPM. Skleněnou pipetou
opatrně odeberte horní vodnou fázi (supernatant) do baňky se širokým zábrusovým uzávěrem a po
stěně přilijte přibližně stejný objem ledového (-20 °C) isopropylalkoholu. Promíchejte pomalým
převrácením baňky, ponechte stát na ledu a pozorujte vytvářející se bílá vlákna srážené DNA. Po
několika minutách srážení namotejte DNA na tyčinku či špejli – kružte však v roztoku velice
opatrně a pomalu, aby nedošlo k jejímu poškození.
Část DNA přeneste do zkumavky s 5 ml vychlazeného 75% ethanolu, několikerým opatrným
převrácením obsah zkumavky promíchejte a centrifugujte 5 min za výše uvedených podmínek.
Peletu rozpusťte v destilované vodě a proměřte absorpční spektrum v rozsahu vlnových délek 230
až 330 nm (viz 2. úkol).
/ 38
2. UV spektra biochemicky významných látek
Navažte vzorky
•bílkoviny: přesně asi 1 až 2 mg; např. BSA, lysozym, trypsin
•aromatické aminokyseliny: cca 0.1 mg*); tryptofan či tyrosin
•nukleotidu či nukleosidu: cca 0.1 mg*); např. adenin, adenosin.
*
Navažovat přesně lze až množství ≥ 1 mg, zde však zcela přesná koncentrace není tak podstatná.
Vzorky rozpusťte ve 2 ml destilované vody. Rozpouštění tyrosinu můžete napomoci přidáním
několika kapek zředěného louhu – např. 0.1M NaOH - rozpouští se lépe v bazickém prostředí.
Rozpouštění adeninu ve vodě můžete naopak pomoci přidáním několika kapek 1M HCl.
Spektrofotometr nastavte na měření spekter v oblasti od 220 do 330 nm s krokem po 1 nm. Pro UV
oblast je nutné použít kyvety z křemenného skla nebo ze speciálních plastů, které měření v UV
oblasti neruší vlastní absorpcí. Jako referenční vzorek vždy použijte destilovanou vodu. Poté ve
stejné kyvetě, ve které byl měřen „blank“, proměřte absorpční spektrum výše uvedených vzorků.
Jestliže absorbance v oblasti vlnových délek nad 250 nm přesáhuje hodnotu cca 1.6, vzorek zřeďte
(výslednou koncentraci uveďte do protokolu). Jaké jsou vlnové délky absorpčních maxim
charakteristické pro jednotlivé vzorky (zaznamenejte společně s příslušnou hodnotou absorbance).
Následně proměřte spektrum vzorku vámi izolované rostlinné DNA (z úkolu 1). Zaznamenejte
hodnoty absorbance při vlnových délkách 260 (nukleové kyseliny), 280 (proteiny) a 320 nm
(pozadí/zákal). Je-li absorbance při 260 nm větší než cca 1.5, vzorek nařeďte. Určete koncentraci
DNA (ze vztahu A260-A320 = 1 ↔ c = 50 μg/ml) a následně také kontaminaci vzorku proteiny jakožto
poměr absorbancí A260/A280 s korekcí na pozadí, tj. (A260-A320)/(A280-A320).

Obsah

Transkript

Podobné dokumenty

Český jazyk a literatura

Úvod do obecné chemie

Příklady a úlohy z obecné a anorganické chemie

Úvod do proteomiky

SYNTÉZA PEPTID Ů NA PEVNÉ FÁZI A KOMBINATORIÁLNÍ

Metody monitorování životního prostředí - FMMI

Stavební materiály - 4

Emulze: Příprava a stabilizace

Teoretický úvod a návod - Ústav lékařské biochemie

5. Experimenty v mikrovlnné troubě

OBSAH -Úvod do chemie -Chemické prvky -Směsi

Dietní vláknina a esenciální složky potravy

LT / LR - Infrasensor sro

I / Úloha č. 1: Ebulioskopie

Úloha č. 1: Ebulioskopie

61_dvorak_s191-194 173KB Oct 08 2012 04:04:38 PM

Vážení nákladních vozidel na krajské úrovni po novele

Stanovení Fe UV-VIS spektroskopií

Aerosoly - Centrum pro výzkum toxických látek v prostředí

Laboratorní příručka Oddělení laboratoře

spektrofotometrické stabovení so4 ve vodách - HGF