doc. Ing. P.Šebo, CSc. - New Concepts in Making Better

Nové typy očkovacích látek
pro prevenci infekcí a
imunoterapii nádorů
P. Šebo
Mikrobiální orgán člověka
nosíme si sebou cca. 1013 našich vlastních buněk a na 1014 mikroorganismů
kůţe 1012
nos 108
Staph. aureus
Staph. aureus
Staph. epidermidis
Staph. epidermidis
Ps. aeruginosa
Diphtheroids
Propionibacterium
acnes
Streptococci
Toto souţití s mikroflórou občas naruší
vetřelci
Anaerobes
Toto ustálené souţití s mikroflórou občas naruší vetřelci
ústní dutina 1010
Strep. mutans
Por. Gingivalis plus
cca. 700 druhů
patogenní mikroorganismy
patogenní infekční mikroorganismy
nosohltan, hrtan a jícen
Staph. epidermidis
–
Haem. influenzae
Neisseria spp.
vybavené pro manipulaci s imunitou hostitele
Strep. Pneumoniae
Strep. pyogenes speciálně vybavené pro přeţití v hostiteli
ţaludek 104
Hel. pylori přenos
po přemnoţení
vyvolají poškození a případný
8
močová trubice nějakou
a vagína 10 dobu odolávají imunitnímu systému
střeva 1014 ~220g
Staph. epidermidis
Bacteroides spp.
Streptococci
Bifidobacter spp.
Lactobacilli
po přemnoţení vyvolají poškození
a přenos
Bacillus
spp.
Veillonella
Eubacteria
etc.
Ruminococcus albus
cca. 1000 druhů
(Wilson et al, 2002)
1010
Nejefektivnější je infekcím předcházet
• Zlepšením ţivotních podmínek a hygienických návyků
• Čištění vody, odpadové hospodářství, výživa, bydlení
• Bezpečnějšími potravinami
• Chladový řetězec, pasteurizace, omezení kontaminace
• Kontrolou přenašečů
• Komárů, vší, much a přenašečů zoonos
• Omezením promiskuity a pouţitím kondomů…
• Léčbou a prevencí infekcí
– Chemoterapie infekcí (antibiotika)
– Očkovací látky
Cílem očkování je manipulace adaptivního
imunitního systému
• zaloţený na obrovském repertoáru individuálních klonů B a T lymfocytů,
vzniklých reorganizací genů a somatickými mutacemi, z nichţ kaţdý receptor
nese unikátní, specifický receptor (BCR or TCR)
• Rozpustnými receptory adaptivního systému jsou protilátky
• Adaptivní systém je “předvídavý”, klonální, “předimenzovaný”
klonální expanze B lymfocytů
Aktivace T lymfocytů
peptid
lymfocyt
endocytóza
jádro
kříţová
prezentace
lymfocyt
„Otec“ dnešních očkovacích látek
Louis Pasteur
(1822 – 1895)
Nebyl první, ale první pochopil a vědecky ukázal, ţe oslabené
nebo zabité mikroorganismy lze pouţít pro prevetivní očkování
( s cílem předejít infekci nebo omezit její dopad)
První vakcíny byly ţivé atenuované mikroorganismy:
• Pasteur nebyl první - po tisíciletí bylo známo, ţe ti co přeţili infekci se zřídka nakazili znovu.
• variolizace – vdechování prášku z usušených puchýřů pravých (černých) neštovic v Indii
doloţeno jiţ cca. 1000 let před n. l., v Číně vpichování hnisu z puchýřků do kůţe…
• 1796 – Edward Jenner, pouţil kravské neštovice (virus vakcínie) pro očkování proti
pravým neštovicím, kráva = vacca latinsky >>>
•
Vaccine – vakcína
L. Pasteur - 1880 vakcína proti slepičí choleře, 1881 antrax, 1885 – vzteklina
• 1927 – BCG – Bacillus Calmette-Guérin – M. bovis pasáţované na bramborovém médiu
• Po 2. světové válce – spalničky, příušnice, zarděnky, Adenovirus, plané neštovice ,tyfus
• 1957 – ţivá atenuovaná vakcína proti poliomyelitidě – Sabin
• Československo byla první země světa kde byla vymýcena poliomyelitida - doc. Slonim
(USOL)
Stojíme na ramenou velikánů
(1843 – 1910)
(1863 – 1933)
(1872 – 1961)
Ţivá vakcína z oslabeného Mycobacterium bovis
(BCG Pasteur) pro kalmetizaci
Zavedení kalmetizace umoţnilo ve vyspělejších zemích vymýtit miliární
(systemickou formu) tuberkulózy u dětí a významně omezilo šíření TB
Vakcína proti poliomyelitídě
1955 inaktivovaná Salkova a 1960 atenuovaná Sabinova vakcína
Orální vakcína Alberta Sabina byla masivně testována v SSSR kolem roku 1960
Chumakovem a poté masově nasazena po celém světě v kampani SZO
Československo se v roce 1961 stalo první zemí na světě, kde byl
přerušen proces šíření divokých poliovirů v populaci a poliomyelitida zde
byla eradikována vakcínou vyvinutou týmem doc. Slonima v ÚSOL Praha
Jonas Salk
Albert Sabin
Velkou roli sehrály téţ inaktivované a
podjednotkové vakcíny
• 1896 - Tyfus, Cholera,
1897 - Mor
• 1926 – černý kašel
1936 – chřipka
• Po 2. světové válce – poliomyelitida (1952 Salk ), vzteklina, encephalitis, hepatitis A
• 1960s-1970s – eradikace pravých neštovic – program pro SZO vymýšlel prof. Karel Raška
Purifikované proteiny, konjugované a rekombinantní vakcíny
• 1923 – záškrt, 1927 tetanus (difterický a tetanický toxoid)
• po 1940 - DPT vakcína – první kombinovaná očkovací látka – záškrt, tetanus, pertuse)
Klíčový úspěch vakcinačních programů
eradikace neštovic (virem vakcínie) – podíl prof. Karla Rašky ve SZO
200 – 300 milionů mrtvých
~10% úmrtnost
počet zemí s výskytem pravých neštovic
biologická zbraň pro hubení indiánů
odolnějšími dobyvateli z Evropy
Pokles počtu zemí s výskytem
pravých neštovic mezi lety
1950-1976
počátek
eradikační
kampaně SZO
rok
Očkování inaktivovanou celobuněčnou pertusovou
vakcínou bývalo velmi účinné…
masově nasazena
celobuněčná vakcína
pokles skupinové imunity
a zhoršení kvality
používané vakcíny
zavedena
bezbuněčná
vakcína
Klasické vakcíny předběhly
poznání imunitního systému:
• Připraveny čistě empiricky z celých bakteriálních buněk a virů
• Dodnes patří k nejúčinnějším vakcínám díky spektru obsažených
antigenů
• Jistá míra vedlejších účinků vedlejších a mnohdy zveličovaných účinků
(obsah endotoxinu, reverze poliovirů, automunita?).
Individuální bezpečnost na úkor ochrany populace???
Aktuální výzvy ve vývoji vakcín
• Malárie - P. falciparum – nová generace vakcín v klinických testech
• Tuberkulóza - 2 mld. latentně infikovaných – běţí klinické testy
• AIDS – 35 milionů HIV-pozitivních – zatím beznadějné?
• Chlamydia pneumoniae
• infekční mononukleóza – EBV a téţ CMV
………………………………………………………………………………………………………
• Imunoterapeutické vakcíny proti alergiím,
autoimunitě
• T-buněčné
vakcíny pro imunoterapii rakoviny
slibné, první vakcína na léčbu nádorů prostaty registrovaná v USA
Nové vakcíny staví na pokroku
molekulární biologie,
genomiky
a
buněčné imunologie
Nové koncepty (1):
•
Nová adjuvans – soli hliníku, MPL, olejové suspenze PolyICLC – aktivují
inflamasom anebo signalizují přes TLR ligandy (poly I:C + polylysin)
•
konjugace málo imunogenního kapsulárního polysacharidu s proteiny
(Hemophilus, Neisseria meningitidis C, Streptococcus pneumonieae)
•
rekombinantní pseudovirové částice (HPV, HBV)
•
orální a intranasální atenuované a enkapsulované vakcíny (rotavirus,
Salmonella, Shigella, poxvirus, adenovirus, intranasální chřipková vakcína)
•
rekombinantní podjednotky vakcín, např. gdPT pouţitý v italské vakcíně
Typické podjednotky polyvalentních vakcín
Toxoidy (chemicky nebo geneticky inaktivované bakteriální toxiny
Pertusový toxin
LT
Cholerový toxin
Tetanový toxin
Difterický Toxin
Podjednotkové vakcíny
např:
• rekombinantní pseudovirální částice (HPV, HBV)
• směs purifikovaných antigenů v pediatrické hexavakcíně (DTPH + polio + HBV)
VLP = pseudovirální (virus-like particle) částice
lidského papiloma viru 16 (HPV16)
Nové koncepty (2):
-
polyvalentní vakcíny –
od 1.1. 2009: INFANRIX hexa™ - Diftérie, Tetanus, Pertuse, Hepatitis B,
Polio, a Haemophilus influenzae typ b
• reverzní vakcinologie – ochranné antigeny hledány v genomových
sekvencích
• DNA vakcíny a genetická, aţ genomická vakcinace
•
Systémy pro cílenou prezentaci antigenů na dendritických buňkách
pro detekci latentních infekcí a imunoterapii nádorových
onemocnění
Genomika umoţnila vznik reverzní vakcinologie
(R. Rappuoli et al. – Chiron/Novartis Vaccines, Siena)
Reverzní vakcinologie
Neisseria meningitidis
séroskupiny B
Reverzní vakcinologie
570 ORFs, potenciálně kódujících
~350 proteinů produkováno v E.coli,
povrchové proteiny
a pouţito k imunizaci myší
2,200,000
1
2,100,000
200,000
2,000,000
IHT-C
IHT-A
100,000
exprese
a
purifikace
300,000
1,900,000
400,000
1,800,000
500,000
IHT-B
1,700,000
Purifikované
proteiny
600,000
1,600,000
700,000
1,500,000
800,000
1,400,000
Objeveno 91 nových
povrchových proteinů
900,000
1,300,000
1,200,000
1,000,000
1,100,000
Identifikováno
28 nových antigenů
indukujících
baktericidní protilátky
Polysacharidová kapsula
Vnější membrána
Periplasmatický prostor
Cytoplasmatická membr.
Cytolasmatický prostor
Kapsula
PorA
PorB
Opa
Opc
LPS
Pili
imunizace
T-buněčné vakcíny pro prevenci
infekcí a terapii nádorů
Dvě dráhy prezentace antigenů:
cesta k protinádorovým vakcínám
maturace B lymfocytů
aktivovaný
pomocný
CD4+
T lymfocyt
produkce protilátek
a
cytokinů
aktivovaný
cytotoxický
CD8+
T lymfocyt
Endoplazmatické
Reritkulum
TCR
Zabíjení
infikovaných
a nádorových buněk
endogenní proteiny
antigeny virů, intraculárních bakterií a parazitů
Nádorové antigeny
Jak dopravit antigen do cytosolu prezentujících buněk a
stimulovat CD8+ cytoxické T lymfocyty?
DNA/RNA aplikace in vivo
• DNA a RNA vakcíny – i.d./s.c./i.m. nebo
ex vivo aplikace na APC a transfer do těla
(zatím jenom pro zvířata)
transfekce
mRNA
adoptivní
přenos
dendritické
buňky
• dendritické buňky maturované a nabité antigeny in vitro pro imunoterapii
nádorů (Provenge = první registrovaná vakcína na rakovinu prostaty – 2010)
• Intracelulární baktérie - uvolňující rekombinantní antigeny (atenuovaná Listerie,
Salmonella, BCG…)
• Atenuované rekombinantní viry produkující antigeny (např. vakcínie, adenovirus)
• Liposomové preparace peptidů
• Proteiny pronikající do buněk (Tat, bakteriální toxoidy - dCyaA (Procervix)
• protilátky s geneticky (nebo chemicky) připojeným antigenem, které rozeznávající
endocytické receptory dendritických buněk (R. Steinman – Celldex Therapeutics)
antigenní fuze se streptavidinem (v komplexu s biotinylovanou směřovací protilátkou?)
DNA vakcíny
Rekombinantní: mohou být multivalentní (Ulmer et al. Science 259, 1745-48, 1993)
například virová RNA je přeloţena do
cDNA a sekvenována, klonována
podle
sekvence jsou
syntetizovány
geny pro
antigeny
a ty jsou
vloţeny do
plazmidu
plazmidová
DNA je
purifikovaná
chromatografií
purifikovaná DNA
tvoří vakcínu
DNA vakcíny byly objeveny náhodou
kontrolním pokusem. Fungují na principu
produkce a prezentace antigenu vlastními buňkami
příjemce. Výborně fungují u myší. U lidí zatím není
ţádná schválená a vývoj stál firmy cca.
1 mld. USD…
Dendritické buňky maturované a nabité antigeny z
lyzátu nádorových buněk in vitro
Vyuţití antigenních fuzí se sreptavidinem pro dopravu
antigenů ke prezentaci na MHC molekulách
endocytický receptor
endocytóza of
mAb-SA-Ag
komplexů
komplex mAb-SA-Ag
signalizace
Recyklující
receptory
raný /pozdní
endosom
MHC I
+
peptid
dissociace
Lysosom
štěpení SA-Ag
MHC II
endoplazmatické
retikulum
MHC I
Golgi
MHC II
peptid
CD4+
T
buňka
Staněk et al. 2012, Mol. Biotechnol. 51:221-232, WO/2011/077258
CD8+
T
buňka
kříţově
prezentační
organela
dCyaA toxoid jako nástroj pro dopravu antigenů
do cytosolu prezentujících buněk
AC
Vložený antigen
(z viru, bakterie,
parazita, nádoru)
Repeats
Ag
M 2 integrin
CD11b/
CD18
Ag
AC Ag
Ag
Repeats
Ag
buňka prezentující antigeny
endocytóza
?
translokace
Endozóm
Proteazóm
?
Transportér peptidů vyštěpených
proteazómem z antigenů
Endoplazmatické
retikulum
MHC-I peptid
MHC-I
glykoprotein
MHC II
MHC-II
glykoprotein
Golgi
CD8+
T lymfocyt
CD4+
T lymfocyt
Immunotherapie nádorů vyvolaných u myší buňkami
transformovanými E6 a E7 onkogeny HPV16:
kombinovaná terapie dCyaA-E7 and MVA-E7 vakcínami
200
PBS + PBS
CyaA336/E7 + PBS
7/7
*P=0.03
150
7/8
n.s. P=0.2
100
2
area [mm
Tumor
(mm] 2)
nádoru
velikost
PBS + CyaA336/E7
5/8
50
0
200
CyaA336/E7 +
MVA-SigE7LAMP
150
0/8
MVA-SigE7LAMP +
CyaA336/E7
***P<0.0001
2/8
CyaA336/E7 +
CyaA336/E7
2/8
***P=0.0006
**P=0.003
100
50
0
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
0
10
20
30
40
50
60
70
80
4
after administration
6x10 TC-1 cells
dnyDays
po injekci
6 x 104 TC-1 of
nádorových
buněk
Macková et al. (2006) Cancer Immun. Immunother. 55, 39-46
90
Společnost Genticel Sarl z Toulouse vyvíjí na bázi toxoidu CyaA vakcíny pro
imunoterapii nádorů děloţního čípku (nyní probíhá klinická fáze I.)
www.genticel.com
the adenylate cyclase CyaA
Děkuji za pozornost !
rád zodpovím Vaše dotazy
Stav ‘technologie’ po 20-ti letech práce
•
ověření konceptu v myších
– specifické CTL CD8+ and CD4+ T buněčné odpovědi
•
Ochranná imunita proti virům (LCMV)
– Ochranná imunita proti Plasmodium berghei (myší malárie)
– Imunoterapie experimentálních nádorů vyvolaných HPV16
– polyvalentní buněčná imunitní odpověď - několik antigenů v různých místech
(US Patent No. 5,503,829, No. 5,679,784, No. 5,935,580
EU Patent application No. 03291486.3, US Prov 03495, 6094 (2003) )
•
•
Mnoho preklinických dat z in vitro a in vivo modelů
Připravená toxikologická studie
•
Běţí fáze I&II klinické testy na pacientech s:
– melanomy – the 6th EU RP projekt THERAVAC (Ludwig Institute)
– nádory děloţního čípku (HPV16) - BT Pharma S.A. Toulouse France
•
•
Vylepšení detekce latentní infekce Mycobacterium tuberculosis u lidí a skotu
Další diagnostické moţnosti u jiných infekcí a rakoviny
přehled: Šimšova et al. (2004). Int. J. Med. Microbiol., 293, 571-576.
dACT umoţňuje indukci buněčných imunitních
odpovědí proti cizorodým antigenům
Antigeny CD8+
OVA
LCMV
Apa, Cfp
gp120
E7
CSP
Melanomy
ESAT-6, CFP10
TB-10.4
Antigeny CD4+
MalE
MAGE
ESAT-6, CFP10
TB-10.4
Ag85A
Slušně nás to živí….
Sebo et al., 1995, Infect. Immun.
Fayolle et al., 1996, J. Immunol.
Saron et al., 1997, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A.
Osicka et al., 2000, Infect. Immun.
Fayolle et al., 2001, J. Virol.
Loucka et al., 2002, Infect. Immun.
Schlecht et al., 2004, J. Immunol.
Mackova et al., 2006, Cancer Immunol. Immunother.
Tartz et al., 2006, Infect. Immun.,
Wilkinson et al. 2005 Infect Immun.
Anderson et al. 2006 Am. J. Crit. Care Resp. Med.
Majlessi et al., 2006, Infect. Immun.,
Hervas-Stubs et al., 2006, Infect Immun
HIV, LCMV in vitro
HIV
Ochrana před LCMV in vivo
Mapování permisivních míst
polyvalentní CTL opdpověď
CD4+ T odpovědi
Mechanismus
Imunoterapie nádorů
očkování proti malárii (myší)
Vylepšení tuberkulosního testu
Vylepšení tuberkulosního testu
IFN a imunita proti MTB
IFN a imunita proti MTB
Nedávno registrované nové vakcíny
Hexavalentní pediatrická vakcína
- od 1.1. 2009: INFANRIX hexa™
- Diftérie, Tetanus, Pertuse, Hepatitis B, Polio, a Haemophilus influenzae typ b
- pro imunizaci kojenců ve 2., 4. a 6. měsíci ţivota
Rotavirová vakcína (orální), intranasální chřipková vakcína
- RotaTeq™, Rotarix™, FluMist
MMR-Varicella
- zarděnky, příušnice, spalničky + plané nešovice
s poněkud spornou nákladovou efektivitou:
Pneumokoková konjugovaná vakcína
- Prevenar™ (heptavalentní, různé serotypy)
Meningokoková kojugovaná vakcína
- MENVEO™ (serotypy A, C, Y and W135)
Vylepšení diagnostiky pomocí stanovení uvoňovaného IFN (IGRA)
detekce paměťových T lymfocytů zbylých po latentní infekci
předchozí asymptomatická infekce (LTBI nebo CMV)
jsou přítomny specifické T lymfocyty – jejich detekce ve vzorku krve
buňka
prezentující
antigen
paměťová
T buňka
specifická
pro daný
antigen
Detekce IFN-γ
• ELISA
• cytometrií
• qPCR
buňka
prezentující
antigen
APC buňky
prezentují
antigen T
buňkám
aktivovaná T
buňka
produkuje
IFN
pokud dotyčný byl infikován má antigen-specifické
T buňky, takţe dojde k imunologické synapsi a aktivaci
Cílená doprava antigenů do prezentujících buněk
• Pomocí:
 derivátů adenylátcyklázového toxoidu
 antigenů fúzovaných se streptavidinem
v komplexech s biotinylovanou směřující protilátkou
Účel:
• sníţit potřebný objem krve
• zkrátit čas stanovení
• eliminovat neurčité výsledky
• sníţit detekční limit
Habilitační řízení Ing. Petra Šeba, CSc., 12.04.2012, FPBT VŠCHT Praha
Odpovědi oponentům habilitační práce:
Doc. RNDr. Jan Konvalinka, CSc. nevznesl žádný dotaz.
Prof. RNDr. Stanislav Zadražil, DrSc.: „Jaký je současný stav v metodologii produkce cizorodých rekombinantních proteinů bakteriální
buňkou z hlediska poměru produkt - výtěžek v denaturovaném a „nativním“ stavu; skutečnost, která sehrála centrální úlohu
v experimentální práci autora?”
Odpověď: Od roku 1990, kdy byl rekombinantní AC toxin poprvé produkován v bakterii Escherichia coli, došlo k velmi významnému
rozvoji metod produkce rekombinantních proteinů v bakteriích. Kromě E. coli je veřejně dostupných, nebo na výběr u
specializovaných dodavatelských firem, i široká škála produkčních kmenů Gram-negativních i Gram-pozitivních bakterií. Tyto kmeny
byly zpravidla upraveny pomocí genové manipulace tak, aby v nich bylo možno produkovat rekombinantní proteiny jak velmi
majoritně v rozpustné frakci v cytosolu, tak vystavené na bakteriálním povrchu, posttranslačně modifikované například glykozylací ,
či přímo sekretované do média kmeny deficientními v produkci proteáz.
Přesto zůstává nejoblíbenějším, tradičním a mnohdy i ekonomicky nejvýhodnějším expresním organismem pořád bakterie E. coli. K
dispozici jsou dnes především osvědčené kmeny E. coli ze skupiny B, například BL21(λDE3), které lze dále upravovat vkládáním genů
pro expresi chaperonů.
Nejjednodušší pak je nadprodukovat rekombinantní protein do nerozpustných inkluzních tělísek ve výtěžcích dosahujících někdy až
70% celkového buněčného proteinu (v průmyslově optimalizovaných kmenech a médiích). Tato technologie velmi usnadňuje
následnou purifikaci proteinu po separaci a promytí inkluzních tělísek. Po jejich solubilizaci denaturačním činidlem a
optimalizovaném refoldování produkovaného proteinu, lze takové proteiny poté purifikovat do vysoké čistoty s velmi vysokým
výtěžkem. Tento způsob přípravy používáme i v případě našeho toxinu s výhodou již 20 let. Lepší způsob přípravy toxinu schopného
pronikat do buněk zatím vynalezen nebyl. Jeho výhodou je, že tím získáváme formu rozvinutého proteinu analogického sekrečnímu
intermediátu toxinu, který je v denaturačním roztoku velmi stabilní při skladování ve zmraženém stavu po mnoho let. Vyředění
denaturačního roztoku s toxinem do buněčné suspenze pak vede k svinutí aspoň části molekul toxinu do funkční konformace,
podobně jako po sekreci toxinu z bakteriální buňky kanálem o průměru pouhého 1 nm, kterým toxin musí procházet v rozvinuté
"lineární" formě.
Pokud je potřeba některý rekombinantní protein produkovat do rozpustné cytosolické frakce bakteriálních buněk, protože jej
například nelze úspěšně refoldovat do biologicky nebo enzymaticky aktivní podoby, lze toho dnes již zpravidla dosáhnout ko-expresí
vhodného chaperonu v bakteriálních buňkách a především snížením kultivační teploty. Dále může pomoci i přídavek různých činidel
do kultivačního média, například betainu.
Asi nejúspěšnější rutinní strategií v tomto směru je použití kmene E. coli BL21 Gold, jeho varianty Arctic Express, ve kterém jsou po
indukci IPTG spolu s produkovaným proteinem syntetizovány též chaperony Cpn60 a Cpn10, produkované přirozeně při chladovém
šoku bakteriálních buněk. Ty pak umožňují zpravidla úspěšně produkovat v rozpustné formě i velmi “obtížné” proteiny při
kultivačních teplotách 4-12 °C, byť někdy s nepříliš vysokým výtěžkem.
Doc. RNDr. Ivan Rychlík, Ph.D. -3 dotazy:
1. Podle habilitační práce usuzuji, že v podstatě veškerá práce byla vykonána s ACT exprimovaným v E. coli, včetně
připravených mutantů s definovanými bodovými mutacemi. Zkoušeli jste se někdy vrátit k Bordetella sp., tedy připravit
stejné mutanty v původním hostiteli sledovat vliv těchto mutací na virulenci tohoto patogena?
Odpověď: Ano, tento typ experimentů jsme zahájili před 1,5 rokem a jsou předmětem disertační práce Ing. Karolíny
Baslerové. Tyto experimenty začaly být technicky schůdné poté, co jsme v roce 2006 získali velmi efektivní genetický
systém pro alelickou výměnu na chromozomu B. pertussis, vyvinutý dr. Scottem Stibitzem z CEBR FDA. Daný systém
umoţňuje efektivně vnášet do genomu B. pertussis bodové neznačené (marker-less) mutace, takţe nyní můţeme otestovat
vliv aminokyselinových záměn v proteinu CyaA na virulenci bakterie. Dalším, hlavním důvodem bylo, ţe jsme v roce 2009
popsali první kombinaci substitucí E570Q+K860R v proteinu CyaA (Osičková et al., 2010), která vede k zásadnímu sníţení
póro-tvorné (hemolytické) aktivity CyaA, aniţ by došlo k ovlivnění kapacity toxinu translokovat AC doménu do CD11b+
buněk a zvyšovat v nich hladinu intracelulárního cAMP. Doposud totiţ veškeré dostupné mutanty postrádali buďto jenom
enzymatickou AC aktivitu, nebo jak enzymatickou, tak hemolytickou aktivitu. To nám umoţnilo nyní jako prvním otestovat
příspěvek hemolytické aktivity CyaA k virulenci B. pertussis. Sledovali jsme rovněţ kolonizační schopnosti v myším modelu.
Výsledky, které budeme brzy publikovat, ukazují, ţe selektivní odstranění hemolytické aktivity vede ke sníţení virulence
bakterie, tedy ke sníţení LD50 o jeden řád, zatímco nehemolytické bakterie podané v niţších dávkách, kolonizují myši
stejně úspěšně jako nemutované bakterie. Hemolytická aktivita tedy nehraje roli v kolonizaci a ovlivňuje pouze
prozánětlivou reakci myšího imunitního systému.
2. K poznatkům, které nakonec vedou k aplikaci základního výzkumu do farmaceutické praxe došlo během pobytu
habilitanta ve Francii. Z toho vyplývá, ţe v případě komerční realizace by podíly z prodeje šly do Francie, nikoli do České
republiky. Je to tak pravda?
Odpověď: Je to pravda částečně, neb oponent správně konstatuje, ţe primární patentová přihláška na pouţitý systém
dopravy antigenů, ze které pak vycházely další aplikace, byla podaná v roce 1993, kdy jsem byl zaměstnancem Institut
Pasteur. Veškerá práva a výnosy z této přihlášky tak patří Institut Pasteur, který následně technologii licencoval firmě
Genticel Sarl. Nicméně, od mého návratu do MBÚ v roce 1995 jsme podali společně s francouzskou laboratoří Dr. Leclerc
další 4 mezinárodní patentové přihlášky. Jedna z nich, z roku 2003, je nyní součástí patentového portfolia licencovaného
firmou Genticel a pokud bude jimi vyvíjený preparát uveden na trh, budou mít MBÚ a čeští spoluautoři nárok na příslušné
podíly na čistých výnosech z prodeje preparátu. Čili, doufejme, ţe něco přijde i do ČR. Zatím v tomhle ohledu vypadá
slibněji situace u jiné společné patentové přihlášky, rovněţ se týkající studovaného toxinu.
3. Habilitant uvádí, že testování ACT při nádorové terapii bylo zahájeno v lednu 2011. Jsou po prvním roce
testování k dispozici již nějaké předběžné výsledky? Jak se připravuje ACT pro aplikaci lidem když autor uvádí,
že po expresi v E. coli se musí solubilizovat v 8M močovině?
Odpověď: Solubilizace, purifikace a skladování ACT v 8 M močovině nepředstavuje problém z hlediska
klinické aplikace. Naopak umoţňuje dosáhnout vysokou koncentraci proteinu, aniţ by došlo k jeho precipitaci a
následně jej z 8 M roztoku močoviny lyofilizovat a skladovat v podobě prášku ve stabilní formě i při pokojové
teplotě. Před injekci do kůţe nebo subkutánně se pak ředěním fyziologickým roztokem zředí močovina pod
denaturační koncentraci na méně neţ 0,8 M, ale typicky aţ na 80 mM a takový roztok se injikuje. Močovina je
biogenní látka, je netoxická, ve tkáních se rychle vyředí a je vyloučen z organismu. Kaţdopádně pro regulační
autoritu povolující klinické testy tento postup nepředstavoval ţádný problém.
Pokud jde o klinické studie, v současnosti probíhají dvě studie:
První je organizovaná firmou Genticel, s preparátem určeným pro imunoterapii nádorů děloţního čípku,
respektive eradikaci HPV-infikovaných epiteliálních buněk čípku. Zatím se jedná o čistou studii bezpečnosti
preparátu ve fázi I., která je prováděna na zdravých neinfikovaných dobrovolnicích a zároveň je sledováno
navození imunitní odpovědi na úrovni protilátek a buněčné imunity. Po roce lze sdělit pouze to, ţe preparát
vyrobený ve schématu cGMP jiţ byl podán několika desítkám dobrovolnic. Jakékoliv další informace jsou
předmětem obchodního tajemství firmy Genticel a do doby zveřejnění oficiálních, vyhodnocených a
validovaných výsledků klinické studie firmou Genticel, nelze je nijak komentovat.
Druhá klinická studie probíhá na klinice St. Luc v Bruselu. Z etických důvodů jde o sloučenou studii fáze I. a
IIa., s preparátem určeným pro imunoterapii metastazujícího melanomu u terminálně nemocných pacientů s
haplotypem HLA.A2., u kterých selhala jakákoliv předchozí léčba. V této studii se ověřuje jak bezpečnost, tak
imunitní odpověď navozená daným preparátem, tak jeho případný terapeutický uţitek pro pacienta. Studie byla
zahájená v lednu roku 2011 a postupně jsou do ní zařazováni indikovaní pacienti, kterých je ovšem relativně
málo a tak zařazení všech plánovaných 27 pacientů do studie potrvá několik let. Ve studii bude testováno
opakované podávání i postupné zvyšování dávky. Ohledne dosud získaných výsledků platí totéţ co u
předchozí studie. Do ukončení celé studie a kompletního vyhodnocení všech získaných dat, nelze sdělovat
ţádné dílčí výsledky a nemám souhlas sponzora klinické studie k tomu, abych mohl k probíhající studii cokoliv
dalšího veřejně říct.