současné trendy výzkumu buněčných mechanismů nocicepce

Pùvodní práce
SOUÈASNÉ TRENDY VÝZKUMU BUNÌÈNÝCH
MECHANISMÙ NOCICEPCE
PRESENT TRENDS IN THE STUDY OF CELLULAR
MECHANISMS OF NOCICEPTION
VIKTORIE VLACHOVÁ, LADISLAV VYKLICKÝ
Fyziologický ústav AV ÈR, Praha
SOUHRN
Nové poznatky ve výzkumu mechanismù bolesti, které jsou získávány na bunìèné a molekulární úrovni prostøednictvím moderních
elektrofyziologických technik, mohou otevøít nové smìry léèby bolesti selektivním pùsobením na receptory nocicepce. Tato práce informuje
o nìkterých souèasných pøístupech výzkumu periferních mechanismù nocicepce na úrovni jednotlivých senzorických neuronù, vèetnì izolovaných
neuronù v tkáòové kultuøe.
Klíèová slova: nocicepce, primární senzorické neurony, tkáòové kultury, algogeny, horko
SUMMARY
The modern electrophysiological techniques are suitable for the study of cellular and molecular mechanisms of nociception in isolated and
cultured sensory neurones. This review presents examples of the effects of algogens and noxious heat on a distinct group of small sensory neurones
in culture that fulfil criteria to play a role of nociceptors in vivo. It is suggested that better understanding of the mechanisms of nociception may
be useful in the search for new drugs in the treatment of pain.
Key words: nociception, dorsal root ganglion neurones, cell cultures, algogens, noxious heat
Úvod
Akutní bolest je posledním varováním organismu pøed
hrozícím nebezpeèím poškození tkánì fyzikálními nebo chemickými prostøedky. Varovné signály vyvolávají ve slabých
aferentních vláknech skupiny C nebo Aδ vzruchovou aktivitu,
která vstupuje do centrální nervové soustavy (CNS) a vyvolá
obrannou reakci organismu doprovázenou bolestí. Bolest tak
pøedstavuje subjektivní doprovod nocicepèního dráždìní,
a proto o její kvalitì a intenzitì mùže podat zprávu pouze
èlovìk. Není však žádný dùvod k domnìnce, že by bolest
existovala pouze u èlovìka. Všechny behavoirální studie se
shodují v tom, že bolest existuje u všech obratlovcù. Obranné
reakce na nocicepèní podnìty, které jsou pro èlovìka bolestivé, lze pozorovat u všech živoèichù vèetnì bezobratlých, jako
je napøíklad hmyz nebo èervi. Proto lze struktury, které slouží
nocicepci, považovat za nejprimitivnìjší senzorický orgán, který je významný z hlediska zachování života a integrity jedince.
Vzhledem k tomu, že bolest je nejèastìjším pøíznakem onemocnìní a mùže pøetrvávat i po jeho vyléèení, je bolest odpradávna ve støedu lékaøského zájmu. K poznávání mechanismù, které se pøi vzniku bolesti uplatòují, pøispívají prakticky
všechny lékaøské disciplíny vèetnì základního lékaøského výzkumu. To dokazuje nesèetná vìdecká literatura ve specializovaných mezinárodních èasopisech a sbornících, které jsou
publikovány Mezinárodní asociací pro studium bolesti. Z této
literatury vyplývá, že centrálním mechanismùm bolesti se vìnuje podstatnì více pozornosti než mechanismùm, které se
uplatòují na jejím vzniku, tj. na úrovni nervových zakonèení
specializovaných k detekci podnìtù, jež bolest vyvolávají.
Mnohem vzácnìji se objevují práce, které poznatky v oblasti
studia mechanismù bolesti shrnují a jsou pøístupné nejen úzce
8
specializovaným odborníkùm, ale i širší lékaøsky orientované
veøejnosti. Pøíkladem takového díla je èeský pøeklad monografie D. Albe-Fessardové Bolest (Albe-Fessard, 1998). Monografie shrnuje souèasné poznatky o nervových mechanismech bolesti a odráží celosvìtové trendy jejího výzkumu.
Avšak i v ní je patrno, že periferní mechanismy nocicepce
jsou pojaty pouze okrajovì.
Tento pøehled se pokouší tyto základní údaje doplnit o
nìkteré novìjší poznatky o mechanismech nocicepce, které
vyplynuly ze studia aktivity jednotlivých nervových vláken u
savcù vèetnì èlovìka a na izolovaných orgánech in vitro. Navíc informuje o nìkterých nových pøístupech výzkumu nocicepce na úrovni jednotlivých senzorických neuronù v tkáòové
kultuøe, které pomocí moderních elektrofyziologických technik umožòují její studium na bunìèné a molekulární úrovni.
Mìøení jednotkové aktivity pomalu vedoucích
aferentních vláken u zvíøat
Uplynulo témìø tøi ètvrtiny století od doby, kdy se neurofyziologùm poprvé podaøilo registrovat aktivitu z jednotlivých
aferetních vláken obratlovcù. Bylo to pøedevším proto, že do
výzkumu byly zavedeny zcela nové elektrofyziologické techniky, pøedevším osciloskop a zesilovaèe, jež umožnily registrovat velmi slabé elektrické signály vznikající v nervových
vláknech pøi vzruchové aktivitì. Pionýry v této oblasti byl
E. D. Adrian, jemuž se dostalo Nobelovy ceny v roce 1932,
a jeho mladší spolupracovník Y. Zottermann z Karolinska Institutet ve Stockholmu. I když se dlouho nedaøilo registrovat
vzruchovou aktivitu z pomalu vedoucích aferentních vláken
skupiny Aδ a C, bylo zøejmé, že bolestivé podnìty, jako je
bolestivé stisknutí nebo pálení, musí vyvolávat vzruchovou
BOLEST 1/99
nebo obdobnými materiály až blízko jejich hrotu. Pravdìpodobnì se žádnou jinou technikou nebylo provedeno tolik neúspìšných pokusù jako na zaèátcích lidské mikroneuronografie (Handwerker, 1996). Jak se dalo pøedvídat, ukázalo se být
snadnìjším registrovat nervovou aktivitu ze silnì myelinizovaných nervových vláken než ze slabých, nemyelinizovaných
vláken (Hagbarth a Vallbo, 1967). Avšak již prvé práce ukázaly, že mikroneuronografie je u èlovìka schùdná, protože nezpùsobuje vážnìjší poškození nervu manipulací elektrodou
pøi hledání vláken, která vykazují fyziologicky oèekávanou
aktivitu, a lze ji využít i pro registraci vzruchové aktivity
v nejslabších nervových vláken (Vallbo, 1991). Další vývoj pak
potvrdil, že nocicepèní signalizaci zajišují pøedevším C-vlákna. Mikroneuronografie významnì obohatila naše poznatky
o vztahu intenzity podnìtu a bolesti a o hyperalgezií a rùzných formách dysestezie, které nelze získat v pokusech na
zvíøatech (Torebjörk a Hallin, 1970; Hallin a Torebjörk, 1970;
Van Hees a Gybels, 1972). Uvedené studie též ukázaly, že je
nutné pøedpokládat, že neexistuje pouze jeden typ polymodálních nociceptorù, nebo odpovìdi vykazují znaènou variabilitu, pokud jde o citlivost k rùzným typùm dráždìní fyzikálními nebo chemickými prostøedky. Rovnìž byly zjištìny
znaèné rozdíly subjektivních vjemù pøi stimulaci jednotlivých
nervových vláken pomocí pozdìji zavedené techniky mikrostimulace elektrickým proudem (Vallbo et al., 1984; Torebjörk
et al., 1996).
Dá se pøedpokládat, že mikroneuronografie v dohledné
dobì pomùže i pøi objasnìní fyziologické úlohy tzv. „mlèících“ nociceptorù, které odpovídají na mechanické nebo tepelné dráždìní až po pøedchozím podráždìní algogeny (Schmidt
et al., 1995).
Disociované neurony zadních koøenù míšních
v tkáòové kultuøe jako model ke studiu bunìèných
a molekulárních mechanismù nocicepce
Nemyelinizovaná aferentní vlákna vytváøejí v periferii volná zakonèení, která jsou kryta Schwannovou pochvou. Jejich
prùmìr je zpravidla menší než 1 µm (obr. 1). Jde o rozmìry
tak malé, že vlákna jsou experimentálnì nedostupná pro vyu-
Mikroneuronografie, technika umožòující registraci
jednotlivých nervových vláken èlovìka
O bolesti mùže informovat pouze èlovìk, a proto bylo
nutné vyvinout takovou elektrofyziologickou techniku, která
by pøi rùzných podnìtech periferního dráždìní umožòovala
korelaci mezi nervovými projevy a subjektivním vjemem. Takovou technikou je mikroneuronografie, která pøedstavuje
nejnároènìjší klinicky využitelnou metodu pro studium bolesti. I když pionýrské práce, které umožnily registrovat vzruchovou aktivitu jednotlivých nervových vláken na èlovìku, byly
provedeny pomocí bipolárních „háèkových“ elektrod na vypreparovaných nervech vlastních experimentátorù (Hensel
a Boman, 1960), bylo od samého zaèátku jasné, že tímto zpùsobem cesta k širšímu využití nepovede. Slibnìjším pøístupem
se zdála být jednoelektrodová technika, která byla vyvinuta
v Uppsale, pøí níž se vyšlo ze zkušeností získaných v experimentálním neurofyziologickém výzkumu pøi snímání jednotkové aktivity v centrálním nervovém systému. Pro svoji mechanickou odolnost to byly pøedevším elektrolyticky
zbroušené wolframové elektrody, které byly izolovány lakem
BOLEST 1/99
Obr. 1: Volné nervové zakonèení tvoøené nemyelinizovaným aferentním
vláknem krytým Schwannovou pochvou (kùže èlovìka, podle Cauna,
1980).
9
Pùvodní práce
aktivitu právì v tìchto vláknech. Pravdìpodobnì Zottermannova práce z roku 1939 je prvou publikací, která to dokazuje
pøímo (Zotterman, 1939).
V této dobì se stejnou problematikou v Edinburgu zaèal
zabývat A. Iggo, kterému se podaøilo identifikovat aktivitu
v jednotlivých C-vláknech a prokázat jejich pomalou rychlost
vedení (< 1 m/s), (Iggo, 1959; Iggo, 1958). Tyto nálezy byly
o nìco pozdìji plnì potvrzeny E. R. Perlem a jeho spolupracovníky, jimž se podaøilo intracelulárnì registrovat aktivitu
z tìl senzorických neuronù ve spinálních gangliích, která pøichází jednotlivými C-vlákny (Bessou et al., 1971).
Metodické pøístupy vypracované na anestezovaných zvíøatech umožnily studovat nocicepci pøedevším pùsobením
fyzikálních podnìtù, jako je tlak a horko. Velmi obtížnì však
šlo zkoumat vliv chemických látek, jež u èlovìka vyvolávají
bolest (algogeny), jako jsou napøíklad slabé kyseliny, capsaicin, bradykinin a prostaglandiny. Studium uvedených chemických látek umožnily až izolované nervovì-orgánové preparáty. Techniku izolace testis ve spojení s horním spermatickým
nervem u psa zavedli do neurofyziologického výzkumu japonští neurofyziologové Kumazawa a Mizumura v roce 1980
(Kumazawa a Mizumura, 1980). Ve spermatickém nervu lze
pomìrnì snadno izolovat jednotlivá nervová vlákna a registrovat z nich vzruchovou aktivitu pøi dráždìní oblasti, kterou
inervují. Ukázalo se, že asi 90 % tìchto vláken odpovídá vzruchovou aktivitou na všechny nocicepèní podnìty: mechanické, chemické i tepelné, a lze je proto považovat za polymodální nociceptory. Jiným významným typem preparátu
urèeným pro studium vlastností nociceptorù byl nervovì kožní preparát mladých krys, u nìhož je izolovaná kùže inervována n. suralis. Tento experimentální model byl navržen P. W.
Reehem (Reeh, 1986) a jeho skupinou v Erlangenu, je intenzivnì využíván ke studiu interakce bolest vyvolávajících podnìtù a analgetik. Preparát je uložen v komùrce a omýván roztokem, který umožòuje mnohahodinové pøežití a studium jak
chemických látek, tak pøesnou lokalizaci mechanických nebo
tepelných podnìtù. N. suralis ovšem obsahuje i velké množství myelinizovaných vláken, která slouží jiným modalitám
kožního èití, a proto ke studiu nocicepce lze využít pouze
nervová vlákna s pomalou rychlostí vedení.
Pùvodní práce
žití moderních elektrofyziologických technik umožòujících
výzkum vlastností membránových receptorù a iontových kanálù. Tyto receptory a iontové kanály pøedstavují komplexní
bílkovinné struktury zabudované v plazmatické membránì
bunìk, které pøi své aktivaci umožòují tok iontù ve smìru jejich elektrochemického gradientu, a øídí tak frekvenci vzruchové aktivity pøicházející do míchy jako základní informace.
Nìkteré iontové kanály se otevírají pøi zmìnì napìtí, tj. zmìnì membránového potenciálu, jiné se aktivují úèinkem chemické látky, která se naváže na specifické vazebné místo proteinového komplexu, èímž zmìní jeho konformaci a umožní
otevøení iontového kanálu a tok iontù. V bunìèné membránì
existují rovnìž specifické receptory, které pøi navázání chemické látky (mediátoru) aktivují intracelulární procesy, jež
mohou funkci iontových kanálù ovlivòovat z vnitøní strany
(pro bližší informaci viz Hille, 1992; Aidley a Stanfield, 1996;
Vyklický a Vyskoèil, 1993). I když nelze vlastnosti tìchto proteinù studovat na nervových zakonèeních pøímo, nikdy nebylo pochyb o jejich existenci a vysoké specifiènosti.
Pro další výzkum mechanismù nocicepce se ukázaly být
rozhodujícími poznatky molekulární biologie, z nichž vyplynulo, že všechny bílkoviny se vytváøejí složitým procesem transkripce DNK na RNK a její translace na bílkoviny. Pøi tomto
procesu je využíváno 20 aminokyselin pøedstavujících základní
elementy, jejichž sekvence rozhoduje o funkci proteinu (Watson et al., 1988). Proces transkripce a translace se odehrává
v jádøe a bunìèném tìle, odkud se bílkoviny dostávají axonovým transportem na místo svého urèení, kde plní svou fyziologickou funkci in vivo. Dalo se proto pøedpokládat, že v podmínkách tkáòových kultur se iontové kanály a receptory
senzorických neuronù funkènì exprimují i v jejich bunìèném
tìle. Velikost tìl tìchto neuronù je dostaèující k tomu, aby
jejich vlastnosti mohly být studovány moderními elektrofyziologickými technikami.
Prvou prací, která z tìchto pøedpokladù vyšla, byla studie
Baccagliniho a Hogana (Baccaglini a Hogan, 1983), kteøí
využili tkáòových kultur pøipravených z neuronù ganglií zadních koøenù míšních a klasickou technikou intracelulárního
snímání mìøili zmìny membránového potenciálu po aplikaci
rùzných chemických látek. V této práci jako první zjistili, že
capsaicin (8-methyl-N-vanillyl-6-nonenamid, látka obsažená
v rùzných druzích pálivé papriky) depolarizuje pouze nìkteré
malé senzorické neurony a vyvolává v nich vzruchovou aktivitu. Toto zjištìní je vedlo k názoru, že senzorické neurony
v tkáòové kultuøe mohou být vhodným modelem pro studium
bunìèných mechanismù nocicepce. Trvalo však øadu let než
byl tento názor pøijat, ponìvadž mnoho neurofyziologù se
obávalo, že bude obtížné odlišit neurony, které pøedstavují
nociceptory od neuronù, které by in vivo sloužily jiným modalitám èití, napøíklad propriocepci nebo epikritickému èití. Existovaly i obavy, že podmínky kultivace mohou proces exprese
bílkovinných struktur pozmìnit nepøedvídatelným zpùsobem
(viz Vyklický a Knotková, 1996).
Dramatický vývoj výzkumu molekulárních mechanismù
nocicepce, který následoval a který probíhá v souèasnosti, byl
umožnìn zavedením techniky terèíkového zámku, patch-clamp
technique (Hamill et al., 1981), za niž E. Neher a B. Sakmann
byli v roce 1991 ocenìni Nobelovou cenou. Významným pøínosem pro další výzkum pøedstavoval i vývoj technik, které
umožòují rychlou aplikaci chemických látek kolem vyšetøovaného neuronu. Velikost neuronu a jeho citlivost na capsaicin
10
se staly hlavním vodítkem pøi identifikaci nociceptorù mezi
neurony izolovanými z ganglií zadních koøenù míšních, které
jsou pìstovány v podmínkách tkáòových kultur. V dalším jsou
uvedeny nìkteré pøíklady výsledkù tohoto výzkumu.
Capsaicinový receptor
Capsaicin, tato pozoruhodná, organismu cizí látka, která
pùsobí selektivní aktivaci skupiny nociceptivních neuronù,
zaèali intenzivnì studovat maïarští neurofyziologové G. Jancso, A. Jancso-Gabor a J. Szolczanyi na systémové úrovni
(viz Szolcsanyi, 1991). Z jejich studií vyplynulo, že capsaicin
je velmi intenzivním algogenem, který u èlovìka vyvolává palèivou bolest a experimentálnì mùže vést k degeneraci malých
senzorických neuronù pøedevším u mladých jedincù (pro pøehled viz Fitzgerald, 1983).
Capsaicin, aplikován již v koncentraci nižší než 1 µM,
vyvolává asi u 70 % malých senzorických neuronù v tkáòové
kultuøe (< 25 µm v prùmìru ) membránový proud, který je
nesen kationty vèetnì vápníku. Velké neurony jsou ke capsaicinu zcela necitlivé, jsou zato vysoce citlivé na kyselinu
γ-amino-máselnou (GABA), jež je klasickým inhibièním mediátorem (obr. 2). Tyto dva typy odpovìdí se znaènì liší
i svými kinetickými charakteristikami; aktivace odpovìdí vyvolaných capsaicinem je podstatnì pomalejší než nástup odpovìdi vyvolané aplikací GABA (Vlachová a Vyklický, 1993).
Membránové proudy vyvolané capsaicinem jsou neseny kationty, jejichž tok za fyziologických okolností smìøuje dovnitø
buòky. V dùsledku toho vzniká depolarizace, která pøi dosažení jisté úrovnì vyvolává vzruchovou aktivitu. Ta se podle zákona „vše, nebo nic“ pøenáší po celém neuronu do míchy.
Opakovaná nebo dlouhotrvající aplikace capsaicinu vede
k desenzitizaci, tzn. že další odpovìï je nižší než odpovìï
pøedchozí. Pøíèina vzniku desenzitizace capsaicinového receptoru (lépe „tachyfylaxe“, nebo jde o jev prakticky nevratný)
Obr. 2: Membránové proudy vyvolané rychlou aplikací GABA
a capsaicinu (CAPS), zaznamenané technikou „patch clamp“
v konfiguraci snímání proudu z celé buòky na dvou odlišných
senzorických neuronech v téže tkáòové kultuøe. A. Záznam odpovìdí
z vìtšího unipolárního neuronu (prùmìr 30 µm). B. Záznam z malého
bipolárního neuronu (10 µm x 20 µm). Membránový potenciál -50 mV.
Trvání aplikace látek je vyznaèeno vždy silnou horizontální èarou nad
záznamem (Vlachová a Vyklický, 1993).
BOLEST 1/99
ho pH 7,3 až na hodnotu 5,5) (Lindahl, 1961). Mediátory
zánìtu nehrají svoji roli pouze pøi zánìtu, je dobøe známo, že
tyto látky plní významnou úlohu v celé øadì fyziologicky významných funkcí. Nelze se proto divit, že pro každý z nich
existuje nìkolik receptorù, jejichž molekulární struktura byla
již identifikována a existují pro nì specifické blokátory. Pro
bradykinin existují nejménì dva receptory, pro serotonin sedm
a pro prostaglandiny nejménì dva. Protony jsou ve svých
úèincích málo specifické, nebo svým pozitivním nábojem
mohou mìnit terciární strukturu mnoha proteinù vèetnì iontových kanálù. Tyto uvedené specifické receptory až na malé
výjimky pùsobí prostøednictvím druhých poslù a nìkteré z nich
jsou funkènì exprimovány i na neuronech izolovaných
z ganglií zadních koøenù míšních.
Zjistilo se, že mediátory zánìtu mohou významnì aktivovat capsaicinový receptor pouze ve vzájemné kombinaci, a to
ještì v podmínkách kyselého prostøedí, v nìmž se rovnìž
znaènì zvyšuje úèinnost capsaicinu. Na obrázku 4 jsou ukázány membránové proudy (A) a depolarizace neuronu (B) vyvolané aplikací mediátorù zánìtu. Ze záznamù je patrné, že
kombinace mediátorù zánìtu (bradykinin, serotonin a prostaglandin E2) v kyselém prostøedí vyvolává výrazný membránový proud a významnou depolarizaci neuronu. Ze záznamu je
rovnìž patrné, že pøítomnost kyselého prostøedí výraznì facilituje i úèinek capsaicinu. Mediátory zánìtu spoleènì pùsobí
Obr. 3: Membránová topologie vaniloidního receptoru VR1 získaná
analýzou hydrofobních vlastností. Protein je uspoøádán v šesti doménách
procházejících membránou a obsahuje jednu neúplnou hydrofobní
smyèku umístìnou mezi 5. a 6. transmembránovou doménou.
Hydrofilní segment s aminoskupinou NH2 (N) obsahuje tøi ankyrinové
domény (A). (C) Øetìzec aminokyselin obsahující karboxylovou
skupinu COOH (Caterina et al., 1997).
Capsaicin je pro lidský organismus cizorodou látkou. Pro
cizorodou látku však pøíroda ve své historii žádný receptor
nevytvoøila. Dalo se proto pøedpokládat, že pro tento receptor musí existovat endogenní mediátory, které se tvoøí
v samotném organismu. Vzhledem k charakteru bolesti, kterou capsaicin vyvolává, pøicházely v úvahu pøedevším mediátory zánìtu, které se uvolòují do okolí z poranìné tkánì. Jde
pøedevším o bradykinin, serotonin a prostaglandiny. Vedle
tìchto látek významnou úlohu pøi vzniku bolesti hrají i protony, nebo se zjistilo, že v exsudátech vznikajících pøi zánìtlivých procesech mùže být pH znaènì sníženo (z fyziologickéBOLEST 1/99
Obr. 4: Odpovìdi vyvolané mediátory zánìtu a capsaicinu na neuronu
zadních koøenù míšních v tkáòové kultuøe. Prùmìr neuronu: 22 µm.
A. Membránové proudy vyvolané aplikací mediátorù zánìtu
a capsaicinu v následujícím poøadí zleva doprava, v závorce vždy
s uvedenou hodnotou pH: extracelulární roztok (ECS, pH 6,1),
prostaglandin E2 (PE2, pH 7,3), PE2 (pH 6,1), mediátory zánìtu:
bradykinin 10 µM, serotonin 5-HT 10 µM a PE2 1 µM (IM, pH 7.3), IM
(pH 6,1), ECS (pH 6,1), capsaicin 6 µM (CAPS, pH 7,3), CAPS (pH
6,1). B. Zmìny membránového potenciálu vyvolané výše uvedenými
látkami aplikovanými ve shodném poøadí a na stejném neuronu jako
v A. Klidový membránový potenciál -62 mV. Horizontální plné èáry
nad záznamy indikují trvání aplikace uvedených látek, nevyplnìné
èáry oznaèují pH 6,1 (Vyklický et al., 1998a).
11
Pùvodní práce
byla vysvìtlena aktivací fosfatázy 2B (kalcineurin), jež je enzymem, který defosforyluje nìkteré intracelulární proteiny
vèetnì té èásti capsaicinového receptoru, která smìøuje dovnitø buòky (Docherty et al., 1996). Opakovanou nebo dlouhotrvající aplikací navozená desenzitizace capsaicinového
receptoru je jedním z možných mechanismù analgetického
úèinku capsaicinových náplastí používaných v tradièní medicínì k léèení nìkterých forem benigní bolesti.
V roce 1997 se podaøilo molekulárnì genetickými metodami založenými na principu PCR (polymerázové øetìzové
reakce) capsaicinový receptor identifikovat (Caterina et al.,
1997). Autoøi vyšli z pøedpokladu, že komplementární DNA
kódující capsaicinový receptor urèuje obecnì citlivost ke capsaicinu. Zpùsob, kterým se podaøilo z rozsáhlé knihovny komplementárních DNA capsaicinový receptor identifikovat, spoèíval v jeho charakteristické vysoké propustnosti pro vápník.
Buòky transfekované jednotlivými klony cDNA podrobili autoøi mikroskopickému fluorescenènímu zobrazení a jako pozitivní byl vybrán klon, který pøi aplikaci capsaicinu vyvolal znaèné zvýšení koncentrace vápníku uvnitø buòky. Takto
naklonovaný receptor byl oznaèen jako vaniloidní receptor
podtypu 1, VR1. Protein je tvoøen 838 aminokyselinami uspoøádanými do šesti transmembránových domén a jedné neúplné hydrofobní smyèky (obr. 3). Není bez zajímavosti, že ve
struktuøe VR1 byly nalezeny významné homologie se skupinou vápníkových iontových kanálù, jež se otevírají pøi vyèerpání zásob vápníku z endoplazmatického retikula. Tento typ
iontových kanálù se úèastní na pøenosu svìtelných podnìtù
a byl dosud identifikován ve svìtloèivných buòkách sítnice
mouchy Drosophila.
Pùvodní práce
na capsaicinový receptor (obr. 5), protože jejich úèinek lze
blokovat capsazepinem, který je kompetitivním antagonistou
capsaicinu (Vyklický et al., 1998a). Tyto nálezy ukazují, že
bradykinin, serotonin a prostaglandin vedle svého pùsobení
na specifické receptory pøedstavují endogenní mediátory pùsobící na capsaicinovém receptoru. Jejich potence aktivovat
tento receptor je však podstatnì nižší, než je tomu u capsaicinu.
Obr. 5: Kompetitivní antagonista capsaicinu, capsazepin, inhibuje
membránové proudy vyvolané kombinací mediátorù zánìtu, ale
neinhibuje mebránové proudy vyvolané kyselým prostøedím.
A. Capsazepin blokuje zvýšení odpovìdi vyvolané aplikací mediátorù
zánìtu (bradykinin, 5-HT a PE2) v kyselém prostøedí pH 6,1. Capsazepin
(ZP) byl aplikován v koncentraci 10 µM and 3 µM, jak je uvedeno.
B. Capsazepin blokuje membránové proudy vyvolané mediátory zánìtu
a capsaicinem, neblokuje však odpovìdi vyvolané zmìnou pH na 5,5.
Úèinek capsazepinu byl testován vždy jako první, aby se pøedešlo
desenzitizaci zpùsobené opakovanou aplikací dané látky.
ZP, capsazepin (6 µM), CAPS, capsaicin (5 µM). (Vyklický et al.,
1998a).
Membránové receptory senzorických neuronù
aktivované tepelným podnìtem
Bolest po popálení je klinickým problémem zejména pro
svoji bezprostøední krutost a sekundární úèinky. Bolest, která
vzniká pøi zvyšování teploty nad úroveò, pøi níž mùže dojít
k poškození tkánì, je posledním varováním organismu. Obranné reakce na potenciálnì poškozující horko vznikají nejen u
všech obratlovcù, ale i u primitivních organismù. Dá se proto
pøedpokládat, že existuje specifický protein urèený pro detekci teploty, která ohrožuje organismus. Práh pro bolest vyvolanou zvyšováním teploty se mìøí obtížnì, nebo nervová zakonèení jsou uložena v kùži hloubìji, kde aplikované teplo
12
mùže být odvádìno krví. Existuje však dobrá shoda mezi neurofyziology, že nejnižší teplotou, kterou lze bolest vyvolat, je
43-45 oC. Pøi opakované aplikaci teploty, kterou bylo dosaženo prahu bolesti, nebo po lehkém popálení se tento práh snižuje, takže bolest mùže být vyvolána i nižší teplotou - za normálních okolností fyziologickou. Bolest vyvolaná horkem
mùže být znaènì zvýšena pøítomností algogenù. Tyto poznatky
vyplynuly z psychofyziologických pokusù na èlovìku i
z experimentù provedených na nervovì orgánových preparátech in vitro (Kress a Reeh, 1996; Kumazawa, 1996).
Hlubší analýzu procesù, které se odehrávají v nociceptorech pøi pùsobení horka, umožnily až pokusy na izolovaných
neuronech zadních koøenù míšních. Rychlým zvýšením teploty extracelulární tekutiny omývající neuron na hodnotu, která by byla èlovìkem pociována jako bolestivá (∼49 °C), se
podaøilo Cesareovi a McNaughtonovi (1996) zjistit membránové proudy, které jsou zpùsobeny tokem kationtù, vèetnì
Ca2+, do nitra buòky. Takový typ membránového proudu se
vyskytuje výluènì na malých senzorických neuronech. Uvedený poznatek byl záhy doplnìn Kirschsteinem a spol. (1997),
kteøí zjistili, že tyto „teplotnì senzitivní“ neurony jsou citlivé
rovnìž na capsaicin. Zùstalo však otevøenou otázkou, zda jde
o stejný typ iontových kanálù, které se aktivují horkem i capsaicinem, nebo zda jde o dva typy odlišných receptorù (iontových kanálù) exprimovaných na neuronech stejného typu.
Charakteristickým rysem bílkovin je nízká stabilita konformace jejich terciární struktury, která je za fyziologických okolností udržována „slabými“ vazbami: vodíkovými mùstky, van
der Waalsovými silami atd. Termodynamickou stabilitu vazeb
biologicky aktivních bílkovin lze kvantifikovat vyjádøením
hodnoty relativního zvýšení aktivity pøi zvýšení teploty
o 10 oC, tzv. teplotním koeficientem Q10. Zmìny membránového proudu jsou pøímým odrazem termodynamických vlastností iontových kanálù, proto elektrofyziologická technika
terèíkového zámku je velmi vhodným experimentálním pøístupem k mìøení teplotní závislosti nervových bunìk. Mìøení,
která dovolila charakterizovat vlastnosti bílkovinných struktur odpovìdných za membránový proud vyvolaný horkem,
vyžadovala novou techniku umožòující aplikovat v bezprostøedním okolí neuronu roztoky rùzného složení pøi stejnì
definovaném prùbìhu teploty (Dittert et al., 1998). Touto
technikou se podaøilo ukázat, že membránový proud u senzorických neuronù v tkáòové kultuøe citlivých na capsaicin vykazuje práh pøi dosažení teploty kolem 43 °C a prudce vzrùstá
až do teploty 52 °C. V tomto teplotním intervalu je membránový proud charakterizován vysokým teplotním koeficientem Q10, což ukazuje na významné konformaèní zmìny proteinu, jenž se na vzniku membránového proudu podílí
(Vlachová et al., 1998; Vyklický et al., 1998b).
Jak je patrno z obrázku 6, zvýšením teploty z 24 °C až na
42 °C je vyvolána jen malá zmìna membránového proudu.
V zobrazení, ve kterém je logaritmus absolutní hodnoty membránového proudu vynesen v závislosti na pøevrácené hodnotì absolutní teploty (tzv. Arrheniova závislost), lze nalézt
smìrnici, která v nižším teplotním intervalu (26-36 °C) vykazuje nízké hodnoty teplotního koeficientu (Q 10 = 2,4). To
znamená, že iontové kanály, které jsou aktivované pøi zvýšení
teploty v tomto intervalu, vykazují termodynamickou stabilitu
typickou pro mnoho jiných proteinù. V pøípadì aktivace iontových kanálù jde o zvýšení vodivosti, èi pravdìpodobnosti
jejich otevøení. V intervalu vyšších teplot, tj. 43-51 oC, smìrniBOLEST 1/99
Obr. 6: Membránové proudy vyvolané teplem na malých senzorických
neuronech v tkáòové kultuøe. A. Technika rychlého øízení teploty
roztokù aplikovaných na neuron v tkáòové kultuøe. Princip techniky
spoèívá v ohøevu spoleèného výtoku svazku 10 kapilár napojených
k nádobám naplnìným testovacími roztoky. Topným elementem je
platinová vrstva pokrývající spoleènou kapiláru výtoku, která je elektricky
spojená s øídící jednotkou (sonda). Stejnosmìrný proud urèený pro
øízení ohøevu (HC) je generován externì. Teplota roztokù protékajících
výtokovou kapilárou je registrována miniaturním termoèlánkem
umístìným ve výtokové kapiláøe (TC 1) (Dittert et al., 1998).
B. Membránový proud snímaný z malého senzorického neuronu
v tkáòové kultuøe, který byl vyvolán lineárnì rostoucím tepelným
podnìtem. Prùbìh teploty extracelulárního roztoku omývajícího neuron
je zobrazen vždy nad záznamem proudu. Membránový potenciál -60 mV.
Neuron byl citlivý na capsaicin. C. Arrheniova závislost (logaritmus
absolutní hodnoty normalizovaného membránového proudu vynesen
v závislosti na pøevrácené hodnotì absolutní teploty) membránového
proudu uvedeného v B. Teplotní koeficient byl stanoven na lineárních
úsecích Arrheniovy závislosti (prázdné symboly) a prùseèík regresních
pøímek (teèkovaná èára) lze považovat za prahovou teplotu pro vyvolání
„horkem indukovaného membránového proudu“ (42 °C, oznaèeno
šipkou). Hodnota teplotního koeficientu, Q10 = 25, svìdèí o vysoké
teplotní citlivosti senzorického neuronu. D. Membránový proud snímaný
z neuronu necitlivého na capsaicin. Postupné zvyšování teploty vede
k vyvolání jen malých proudových zmìn (< 100 pA). E. Arrheniova
závislost membránového proudu uvedeného v D. Teplotní citlivost
neuronu je charakterizována jen nízkými hodnotami teplotního
koeficientu (Q10 = 1,9 a 3,9)
BOLEST 1/99
Jestliže je neuron vystaven vyšší teplotì, než je teplota
„varovnᓠ(tj. nad 52 °C), dochází k nevratným zmìnám proteinových struktur zodpovìdných za vznik membránového
proudu. Po jediném tepelném stimulu, který dosahoval 55 °C,
je následující proudová odpovìï podstatnì menší, zato ji lze
vyvolat již pøi podstatnì nižší teplotì (obr. 7). U velkých neuronù, které jsou necitlivé na capsaicin, lze pøi zvýšení teploty
až nad 53 °C pozorovat pouze proudy, které vykazují nízký
teplotní koeficient Q10 (∼ 2). To dokazuje, že vedle receptorù
pro algogeny jsou nociceptory ve své membránì vybaveny
komplexní bílkovinou, receptorem, který je aktivován tepelnými podnìty, které dosáhly nocicepèní hodnoty tj. více než
43 °C. Jedna ze souèasných hypotéz pøedpokládá, že tento
„teplotnì citlivý receptor“ je tvoøen nìkolika podjednotkami, jež se z komplexu uvolòují pøi potenciálnì poškozující teplotì a aktivují specifickou skupinu kationtových kanálù.
V nižších teplotách se podjednotky ochotnì opìt shlukují,
ale tato vlastnost vytváøet komplex se mùže nevratnì ztratit
po vystavení membrány neuronu nadmìrnì vysoké teplotì.
Uvolnìné podjednotky pak mohou aktivovat pøíslušné iontové kanály pøi teplotách nižších (Vyklický et al., 1998b).
Nové metodické pøístupy pro studium nocicepce odhalují
bohatost a zároveò vysokou specifiènost proteinových struk-
Obr. 7: Úèinek poškozujícího horka na proudovou odpovìï neuronu.
A. První proudová odpovìï je vyvolána aplikací teploty dosahující 55 °C
(teèkovaná èára) na senzorický neuron v tkáòové kultuøe. Maximální
odpovìdi bylo dosaženo pøi 53 °C, další zvýšení teploty již vyvolaný
proud nezvyšovalo. Membránový potenciál -60 mV. B. Následující
proudová odpovìï je pøi stejném teplotním podnìtu vyvolána již pøi nižší
teplotì, maximální dosažená hodnota proudu je však podstatnì menší.
C. Arrheniova závislost proudových odpovìdí uvedených v A a B. Zatímco
nejvyšší hodnota Q10 = 33,7 stanovená pro první záznam A (plné symboly)
dokazuje vysokou teplotní citlivost neuronu, záznam B (nevyplnìné
symboly) je charakterizován v širokém teplotním intervalu 25-47 °C
pouze hodnotou Q10 = 2,1.
13
Pùvodní práce
ce Arrheniovy závislosti prudce stoupá a blíží se k hodnotì
Q10 = 25. Tato vysoká hodnota teplotního koeficientu svìdèí
o velké teplotní citlivosti membránových struktur, charakteristické jen pro uvedenou skupinu „teplotnì citlivých“ neuronù. Vznik membránového proudu vyvolaného tepelným podnìtem je procesem rychlým a do znaèné míry reverzibilním
(viz obr. 6 B).
Pùvodní práce
tur, které jsou v ní zapojeny. Tyto struktury se nevyskytují
u senzorických neuronù, které slouží jiným modalitám èití,
jako je propriocepce nebo epikritické èití. Spíše lze hledat
analogii v jiných senzorických orgánech, napøíklad receptorech pro zrak v sítnici, nebo receptorech pro èich a chu.
I ty jsou souèástí senzorických orgánù, které umožòují rychlou orientaci a adaptaci organismu ke zmìnám a potenciálnímu nebezpeèí zevního prostøedí. Tyto senzorické orgány umožòují pøenos informace na urèitou, nìkdy i znaènou,
vzdálenost. Receptory pro nocicepci jsou však výjimeèné
tím, že na rozdíl od ostatních senzorù zprostøedkovávají
informaci až pøi bezprostøedním nebezpeèí destrukce organismu.
Literatura
1. Aidley DJ, Stanfield PR. Ion Channels. Molecules in Action. Cambridge: Press Syndicate of the University of Cambridge 1996:307.
2. Albe-Fessard D. Bolest. Mechanismy a základy léèení. Praha: Grada
Publishing, 1998:224.
3. Baccaglini PI, Hogan PG. Some rat sensory neurons in culture express characteristics of differentiated pain sensory cells. Proc Natl Acad
Sci USA 1983;80:594-598.
4. Bessou P, Burgess PR, Perl ER, Taylor CB. Dynamic properties of
mechanoreceptors with unmyelinated C fibers. J Neurophysiol 1971;
34:116-131.
nerves in human subjects. J Neurophysiol 1960;23:564-578.
16. Hille B. Ionic Channels of Excitable Membrane. 1992, Sunderland, Massachusetts: Sinauer Associates, Inc., 2nd edition 1992:607.
17. Iggo A. Cutaneous heat and cold receptors with slowly conducting
(C) afferent fibres. Q J Exp Physiol 1959;44:362-370.
18. Iggo A. The electrophysiological identification of single nerve fibres, with particular reference to the slowest conducting vagal afferent
fibres in the cat. J Physiol (Lond) 1958;142:110-126.
19. Kirschstein T, Busselberg D, Treede RD. Coexpression of heatevoked and capsaicin-evoked inward currents in acutely dissociated rat
dorsal root ganglion neurons. Neurosci Lett 1997;231:33-36.
20. Kress M, Reeh PW. Chemical excitation and sensitization in nociceptors. In: Belmonte C and Cervero F, eds. Neurobiology of nociceptors, New York: Oxford University Press. 1996:258-297.
21. Kumazawa T. Sensitization of polymodal nociceptors. In: Belmonte C and Cervero F, eds. Neurobiology of nociceptors, New York:
Oxford University Press. 1996:325-345.
22. Kumazawa T, Mizumura K. Mechanical and thermal responses of
polymodal receptors recorded from the superior spermatic nerve of
dogs. J Physiol (Lond) 1980;299:233-245.
23. Lindahl O. Experimental skin pain. Acta Physiol Scand 1961;51:
1-90.
24. Reeh PW. Sensory receptors in mammalian skin in an in vitro
preparation. Neurosci Lett 1986;66:141-146.
5. Caterina MJ, Schumacher MA, Tominaga M, Rosen TA, Levine JD,
Julius D. The capsaicin receptor: a heat-activated ion channel in the
pain pathway. Nature 1997;389:816-824.
25. Schmidt R, Schmelz M, Forster C, Ringkamp M, Torebjörk E,
Handwerker H. Novel classes of responsive and unresponsive C nociceptors in human skin. J Neurosci 1995;15:333-341.
6. Cauna N. Fine morphological characteristics and microtopography
of the free nerve endings of the human digital skin. Anat Rec 1980;
198:643-656.
26. Szolcsanyi J. Perspectives of capsaicin-type agents in pain therapy
and research. In: Winston C V Parris ed. Contemporary Issues in
Chronic Pain Management.: Kluwer Academic Publishers, Boston,
Dordrech, London 1991:97-122.
7. Cesare P, McNaughton P. A novel heat-activated current in nociceptive neurons and its sensitization by bradykinin. Proc Natl Acad Sci
USA 1996;93:15435-15439.
8. Dittert I, Vlachová V, Knotková H, Vitasková Z, Vyklický L, Kress
M, Reeh PW. A technique for fast application of heated solutions of
different composition to cultured neurones. J Neurosci Methods 1998;
82:195-201.
9. Docherty RJ, Yeats JC, Bevan S, Boddeke HW. Inhibition of calcineurin inhibits the desensitization of capsaicin-evoked currents in cultured dorsal root ganglion neurones from adult rats. Pflügers Arch 1996;
431:828-837.
10. Fitzgerald M. Capsaicin and sensory neurones-a review. Pain 1983;
15:109-130.
11. Hagbarth KE, Vallbo AB. Mechanoreceptor activity recorded percutaneously with semi- microelectrodes in human peripheral nerves.
Acta Physiol Scand 1967;69:121-122.
12. Hallin RG, Torebjörk HE. Afferent and efferent C units recorded
from human skin nerves in situ. A preliminary report. Acta Soc Med
Uppsal 1970;75:277-281.
13. Hamill OP, Marty A, Neher E, Sakmann B, Sigworth FJ. Improved patch-clamp techniques for high-resolution current recording from
cells and cell-free membrane patches. Pflügers Arch 1981;391:85-100.
14. Handwerker HO. Sixty years of C-fiber recordings from animal and
human skin nerves: historical notes. Prog Brain Res 1996;113:39-51.
15. Hensel H, Boman KKA. Afferent impulses in cutaneous sensory
14
27. Torebjörk HE, Hallin RG. C-fibre units recorded from human sensory nerve fascicles in situ. A preliminary report. Acta Soc Med Ups
1970;75:81-84.
28. Torebjörk HE, Schmelz M, Handwerker HO. Functional properties
of human cutaneous nociceptors and their role in pain and hyperalgesia. In: Belmonte C and Cervero F, Neurobiology of nociceptors. New
York: Oxford University Press. 1996:349-369.
29. Vallbo AB. Microneurography - How it started. In: Stalberg E and
Torebjörk HE: Clinical Neurophysiology at the University Hospital,
Uppsala, Sweden (1958-1991). 1991:31-38.
30. Vallbo AB, Olsson KA, Westberg KG, Clark FJ. Microstimulation
of single tactile afferents from the human hand. Sensory attributes
related to unit type and properties of receptive fields. Brain 1984;107:
727-749.
31. Van Hees J, Gybels JM. Pain related to single afferent C fibers from
human skin. Brain Res 1972;48:397-400.
32. Vlachová V, Vitásková Z, Kabát M, Vyklický L. Heat-induced membrane currents in small sensory neurones. Europ J Neurosci 1998;10:
80.
33. Vlachová V, Vyklický L. Capsaicin-induced membrane currents in
cultured sensory neurons of the rat. Physiol Res 1993;42:301-311.
34. Vyklický L, Knotková H. Can sensory neurones in culture serve as
a model of nociception? Physiol Res 1996;45:1-9.
35. Vyklický L, Knotková-Urbancová H, Vitasková Z, Vlachová V,
Kress M, Reeh PW. Inflammatory mediators at acidic pH activate
BOLEST 1/99
investigation on cutaneous sensory nerve. J Physiol (Lond) 1939;95:1-28.
36. Vyklický L, Vlachová V, Vitásková Z, Kabát M. The effects of
algogens on membrane currents induced by noxious heat in sensory
neurones from newborn rats. J Physiol (Lond) 1998;511P:125P.
RNDr. Viktorie Vlachová, CSc.
Fyziologický ústav AV ÈR
Vídeòská 1083
142 20 Praha 4
37. Vyklický L, Vyskoèil F. Molekulární podstata dráždivosti nervového systému. Èeskoslovenská fyziologie 1993;41:69-142.
38. Watson JD, Tooze J, Kurtz DT. Rekombinantní DNA. Krátký kurs.
Praha: Academia. 1988:293.
39. Zotterman Y. Touch, pain and tickling. An electrophysiological
BOLEST 1/99
MUDr. Ladislav Vyklický, DrSc.
Fyziologický ústav AV ÈR
Vídeòská 1083
142 20 Praha 4
15
Pùvodní práce
capsaicin receptors in cultured sensory neurons from newborn rats. J
Neurophysiol 1998;79:670-676.