Xtallography

Roentgenova krystalografie
X-ray Crystallography
- Krystal
- Roentgenovo záření
- Difrakce, rozptyl
- Strukturní analýza
- Strukturní model
William Henry Bragg a Max von Laue
Max von Laue – Nobelova cena za fyziku in 1914 (difrakce)
W.H. Bragg a W. Lawrence Bragg - Nobelova cena za fyziku 1915 (NaCl)
W.H.B
M.v.L.
SCHEMATIC ILLUSTRATING BRANCHES OF MODERN
CRYSTALLOGRAPHY, THEIR APPLICATIONS, AND THE
RELATION OF CRYSTALLOGRAPHY TO THE NATURAL
SCIENCES
“Heart”of this
scheme
Strukturní analýza malých molekul
Difrakce na krystalech – měření intenzit
Redukce dat.
Matematické výpočty
Elektronová hustota.
Atomy – jejich polohy
Geometrie molekul.
Chemické vazby.
Tepelné kmity atomů
Standardní schéma
RTG krystalografie je experimentální technika, která využívá difrakce Xpaprsků na krystalech. Na základě difrakčního obrazce získaného z
periodického uspořádání molekul nebo atomů v krystalu, je možné
rekonstruovat elektronovou hustotu a tím určit uspořádání atomů.
Data
Processing
Structure
Solution and
Refinement
X-ray source
X-ray preparation
Diffraction
Detection
Výběr a montáž krystalu
Velikost
- Asi mezi 0.1 – 0.5 mm
Tvar
- Musí být monokrystal (single crystal)
- čím kulatejší, tím lepší
Mosaicita
Goniometrická hlavička
umožní aby krystal zůstal
v paprsku RTG záření v
každé orientaci
Experimentální data
Vlnová délka: λ
Mřížkové parametry: a, b, c, α, β, γ
Symetrie: možné prostorové grupy
Orientace krystalu, krystalové plochy
Intenzity: (h, k, l), I, σ(I), 2θ, profil
Empirická absorpce
Hustota krystalu
Chemické složení, sekvence
Redukce, korekce, konverze na (h, k, l), F
Určování struktur
• Teorie u proteinové krystalografie
• Počítačové programy SHELXS, SHELXL,
SIR (Il millione), SnB
• Grafika ORTEP, MERCURY, DIAMOND
• Polohy atomu, teplotní kmity
• Meziatomové vzdálenosti, úhly, torzní uhly
• Vodíkové vazby
Struktura [Co(cmasp)(en)]
monoclinic_H-M Cc, Z 4
(x, y, z),(x, -y, z+1/2)
(x+1/2, y+1/2, z)
(x+1/2, -y+1/2, z+1/2)
a=11.626(1)
α=90.0
b=14.546(1)
β=122.4(1)
c=10.056(1)
γ= 90.0
Co1 O6
1.885(2)
O6 Co1 O2
90.16(8)
N14 Co1 O2 C2 156(4)
D
H
A D-H
H...A
D...A
D-H...A symm
O11 H11W O5 0.95(7) 1.84(2) 2.742(5) 156.21 5_555
Deformační hustoty
Neutronová difrakce - jádra
RTG difrakce – elektrony
Deformační (rozdílová)
hustota – elektronová
hustota chemické vazby.
Nejpřesnější a
nejkvalitnější analýzy
Proteinová krystalografie
• Co je (bio)makromolekulová krystalografie
• Bernal → Strukturní genomika
Penicilín, vitamín B12, DNA, proteiny,
tRNA,viry, ribosomy.
• Krystalografie. Molekulová biologie a
genetika. Přístrojová technika, elektronika,
počítače.
• Drug design.
A Brief History of Macromolecular Diffraction
1895: W. C. Roentgen discovers X rays.
1912: Max von Laue discovers X-ray diffraction by crystals.
1913: W. L. Bragg reports the crystal structure of NaCl, providing the
first experimental evidence for the absence of salt "molecules".
1949-57: Dorothy Crowfoot Hodgkin et al. solved the structures of
penicillin (1949) and vitamin B-12 (1957).
1958: Structures of myoglobin (Kendrew) and hemoglobin (Perutz).
1965: Structure of the first enzyme (lysozyme) by Phillips et al.
1974: Transfer RNA structure determined by Klug and Rich.
1985: Photosynthetic reaction center (first membrane protein) by Huber.
1990s: Structures of the ribosome (Steitz, Ramakrishnan, Noller)
(Nobel p. – 2009]
Structures of ion channels (MacKinnon)
Protein
model I
Protein
model II
Protein
model III
t-RNA
30S r-RNA
50S r-RNA
B-DNA
Nucleosome
Protein structure determination
Crystallization
Purified
protein
Phase problem
Crystal
X-ray
Diffraction
Electron
density
Biological interpretation
3D structure
První krok: Krystalizace
- přírodní materiál & genové inženýrství
- protein: purifikace, koncentrace 10mg/ml
- pH, srážecí roztoky PEG, NaCl, (NH4)2SO4
- nativní krystal, 30-80% voda
- difuzní kanály
- izomorfní deriváty [HgI4]2-, UO22+, Xe
- selenometionín, RbBr
- buňky 5-10 nm, 20-100nm
- flash cooling, cryocrystallography,
cryoprotectant
- magie, umění
- velikost 0.1 mm
Proteinové
krystaly
Sperm whale myoglobin
See Hampton Research: http://www.hamptonresearch.com) their
Photo Gallery.
Kryo-metoda
Druhý krok: RTG difrakce
Experimentální uspořádání
Monochromatické záření
nebo několik vlnových
délek, případně
polychromatické záření
Zdroj RTG
Páry kapalného N2
beam stop
detektor
goniometr
Difraktometrie- experiment
- Synchrotronové zdroje. Konvenční RTG zdroje.
- Monochromátory
- RTG kolimace, fokusace, zrcadla
- Difraktometr
- Detektory klasická fotografie
imaging plate (1980)
charge-coupled device (CCD, 1990)
- Kryosystem (chlazení)
- Software na sběr dat (Data Collection)
- DENZO, MOSFILM
Výhody Synchrotronů
• Vysoká Intensita
– Bílé RTG záření – x 106
– Monochromatizované – x 102-5
• Více dat z radiačně citlivých krystalů
– Rozklad zářením závisí na
• Celkové radiační dávce – ta se nemění
• Na čase účinku volných radikálů
– čas je kratší při intensivní expozici
• Rozlišení blízkých difrakčních stop
– Větší molekuly Æ jemnější stopy
• Virusy, ribozomy…
• Nastavitelné λ → určování fází pomocí"MAD".
Filters,Monochromators Collimators
and Mirrors
To obtain the best results, the X-ray beam used
in the diffraction experiment should all be of a
single wavelength and they should be as parallel
as possible. To accomplish this in practice, we
use filters, monochromators and collimators.
More information can be found at:
http://www.msg.ku.edu/~xraylab/no
tes/xray.html
Filters.
• Absorption depends on wavelength
– Overall: µm ∝ λ3.
– Discontinuities a.k.a. “absorption edges”
• Just enough energy to expel e- from orbital
• Same wavelengths as characteristic lines
• Absorption edges depend on atomic number.
– Kα Ni (At#28) slightly less than Kα Cu(At#29)
– CuKβ at maximum of Ni μm.
– CuKα near minimum.
• Ni foil allows CuKα at ~100 x intensity of any
other wavelength.
Monochromators.
• Crystals: nλ = 2dsinθ (Bragg's law).
• Consider
– (1) polychromatic incident beam
– (2) single reflection.
•
•
•
•
Direction of diffraction (2θ) ∝ λ
Narrow window → highly monochromatic.
Inefficient: I(1 reflection) << I(incident).
Stable single crystal commonly graphite.
Collimation.
•
•
•
•
•
X-rays diverge from source.
A collimator is a tube with smaller tubes (0.5 mm) that attempts to
reduce the dispersion of the X-ray beam and limits the diameter of the
beam.
Fine || beam required for spatial resolution of diffraction pattern.
Collimator: 2 pinholes mounted in long cylinder
– Prealigned.
Slits: 1 pair horizontal; 2nd pair vertical.
– Adjustable, but requires alignment.
Mirrors.
•
•
•
•
Reflect off "bent" mirrors.
Divergent beam → || or convergent.
Focus at sample or detector.
Low refractive index → beam nearly || mirror (1/3°).
– Filtering: Can be set close to critical angle, so that Kα reflected,
but Kβ refracted (lost).
• One mirror to focus horizontally, one vertically.
– Until 15 years ago… Alignment difficult
• only when fine, intense beam needed (e.g. viruses).
• Modern optics
– Multilayer coated lenses
– Alignment stable
– Now in many laboratories
Difraktometr
Lab
Detektory RTG záření
RTG záření může být detekováno pomocí různých zařízení
(http://xdb.lbl.gov/). Pro většinu použití, hlavní rozdíl mezi různými
detektory je daný počtem reflexí, které mohou být měřeny v daném
čase.
Bodové detektory mohou měřit pouze jednu reflexi v daném čase a k
vůli tomuto nedostatku se už nepoužívaní v běžné krystalografii. Tento
nedostatek se projevuje v dlouhých časech měření od několika dní do
několika týdnů.
Plošné detektory mohou měřit mnoho reflexí současně a proto se jim
dává přednost v rutinním sběru dat. Příkladem takových detektorů jsou
CCD, „Image Plates“, a také RTG-film (v minulosti).
Detektory
Difrakční
snímek
Diffraction
image
Diffuse scattering
(from the fibre loop)
Water ring
Direct beam
Beam stop
reciprocal lattice
(this case hexagonal)
Reflections (h,k,l) with I(h,k,l)
Increasing resolution
DNA vlákno
Sběr dat. Data collection
Pomalá rotace
(oscilace) krystalu
okolo osy,
měření jednoho
„image“ na každý
~1o rotace.
~ 100 images with
~100-1000 reflections each
= ~ 104 – 105 reflections
Extreme – 106 reflections
Indexování a integrace
1.
2.
3.
4.
Přiřazení indexů h,k,l
každé reflexi
Určení intensity
každé reflexe
Integrace
Odečtení pozadí
h=8
k = 12
l = 13
I = 12345 -> F = 111.2
Kvalita. Krystalografické rozlišení
1.2 Å
2Å
3Å
- Resolution dmin = λ/(2sin θmax)
- R-factor = Σ [|Fobs| - |Fcal|]/|Fobs|
(0.15-0.25 dobrá zhoda)
Třetí krok: Určení Fází
• Difraktovaný paprsek:
– Amplituda a fáze
• Oba údaje potřebujeme na
rekonstrukci krystalové
struktury:
– Amplituda: odmocnina intensity
– Fáze?
Každá reflexe nese informaci o
všech atomech
Strukturní faktory F(hkl) a elektronová hustota
ρ(xyz) jsou propojeny přes
Fourieru Transformaci
v
1
ρ ( x, y, z ) = ∑ F (hkl) exp{−2πi(hx + ky + lz )}
V hkl
v
F (hkl ) = V
∫ ∫ ∫ ρ ( x, y, z) exp{2πi(hx + ky + lz)}dxdydz
unit cell
Fázový Problém
• Pokud známe αhkl a strukturní faktory F(hkl) potom:
v
1
ρ ( x, y, z ) = ∑ F (hkl ) exp{−2πi(hx + ky + lz )}
V hkl
v
1
= ∑ F (hkl ) exp{iα hkl }exp{−2πi (hx + ky + lz )}
V hkl
• můžeme počítat elektronovou hustotu ρ(x,y,z)
– do elektronové hustotu stavíme 3D atomový model
• Bohužel, αhkl neznáme na začátku řešení struktury!
Strukturní faktory a Fourier Transformace
Kevin Cowtan – Fourier duck
Krystal a FT
How important are these phases ??
•
Fourier transform photo’s of Karle
(top left) and Hauptman (top right)
(two crystallography pioneers)
•
Combine amplitudes FK
with phase αH and
inverse-fourier transform
•
Combine amplitudes FH
with phase αK and
inverse-fourier transform
(Taken from: Randy J. Read)
FK, αK
FK, αH
FH, αH
FH, αK
Jak můžeme řešit fázový problém?
• Přímé metody. Direct Methods
– malé molekuly až po menší proteiny
• Patterson Methods
– malé molekuly až po menší proteiny small molecules. Metoda
těžkého atomu. Použití v metodách MIR, SAD, MAD …
• Diferenční methody s využitím těžkých atomů
–multiple isomorphous replacement (MIR). Izomorfní záměna
–anomalous scattering (AS). Anomální roztyl
–combinations (SIRAS,MIRAS)
• Differenční methody s využitím několika vlnových délek
–Multiple wavelength anomalous diffraction (MAD)
–single wavelength anomalous dispersion (SAD)
• Použití homologické structury
–molecular replacement AMORE. Molekulové nahrazování
• Fázování v nízkém rozlišení. Elektronová difrakce
Direct Methods
- Ab initio needs atomic resolution data (d < 1.2 Å)
- Density modification
- Random phases
- Shake-and-Bake (SnB)
- Half Bake (SHELXD, SHELXE)
- Structure seimiinvariants SIR
- Pattterson based methods (XFPA, SIR)
- ACORN (York, UK)
Pattersonova funkce I
P(r)= Σ|F|2.cos(2πH.r)
- Čtverce strukturních faktorů (žádné fáze)
- mezi-atomové vektory místo poloh atomů
- Funkce je centro-symetrická
-A.L. (Lindo) Patterson (1934)
-David Harker. Symmetry. Harker sections
-Dorothy Wrich. Image theory
-Martin Buerger. Implication theory.
-Martin Buerger. Image-seeking function
-W.N. Lipscomb. SMF symmetry minimum function
Pattersonova funkce II
Pattersonova funkce obsahuje meziatomové vektory.
N atomů davá N2 vektorů, z kterých N je v počátku
2
1
23
21
31
3
13
32
12
Krystal
Patterson
11, 22, 33 – v počátku
Molecular replacement
Molekulová náhrada
AMoRe (Automatic Molecular Replacement)
PHASER
Homologous protein
Rotační funkce
Translační funkce
Rafinace
Determination of
the Orientation
• Patterson
• Compare
– Vectors w/in molecule
– Vectors between
molecules
• “Self-vectors” shorter
– Depend only on internal
structure
– Not on position w/in unit
cell
– Orientation depends on
molecular orientation
Crystal
Patterson
Orientation from
Patterson. Overlap
• Rotate Patterson
– Assess overlap
• Rotate again
– Is the overlap better?
• Repeat for all
orientations
– Stepping over 3 angles
Patterson
MIR - Patterson methods
Localization of heavy atoms
Isomorphous Replacement difference Patterson
(FPH-FP)2
P - protein, PH - protein with heavy atoms
Anomalous Scattering difference Patterson
(F+-F-)2
F(h,k,l), F(-h,-k,-l)
Multiple isomorphous replacement
•
•
•
•
•
•
•
•
•
•
1. Soak a heavy atom (U, Hg, Pt, Au, Ag…) into your crystal
2. Hope that (a) the heavy atom is specifically binding to a few positions on the
protein and (b) the binding does not change the protein conformation or crystal
cell parameters (‘isomorphism’)
3. Collect a new diffraction data set from the derivatized crystal -> FPH1
4. Repeat for at least one another derivative -> FPH2
5. Then there is a computation procedure that yields an estimate
of protein (‘native’) phases:
FP (native protein crystal)
FPH1 (derivative 1)
-> φP (estimate)
FPH2 (derivative 2)
6. Do a Fourier synthesis with FP and φ P
Fázování
IR
FP
FH
FP+FH=FPH
FPH
Fázování
MIR
f” (electrons)
6
Δf (electrons)
Anomalous scattering
0
0
• Se K edge
• 30 electrons
– Max 30%
change
-10
1.0
0.98
0.97 λ(Å)
Multi-wavelength Anomalous
Dispersion (MAD)
Se, Hg, Yb, Ho, etc…
XAFS – x-ray absorption fine structure, measure by fluorescence
intensity off of protein crystal as a function of x-ray energy
Heavy Atom Structure Factors
• Imaginary f” rotates structure
factor
anti-clockwise
• FH(+h) ≠ FH(-h)
– Different directions
• FPH(+) = FP + FH(+)
≠ FPH(-) = FP + FH(-)
– Friedel’s law breaks
• Can use |FPH(+)|, |FPH(-)| as 2
derivatives
– As slightly different
– As know αP(+) = -αP(-)
i
f”
Fanom(+)
ΔF
Fregular(+)
R
Fanom(-)
Fregular(-)
Anomální
rozptyl
Poslední krok: Mapa elektronové hustoty
• Výpočet mapy elektronové-hustoty
– Metoda FFT
• Možnost postavit proteinovou strukturu:
– Rozlišení ~5Å:
• Pozorujeme pouze Alfa-spirálu
– Rozlišení ~3Å:
• Vidíme hlavní řetězec, a některé boční řetězce
– Rozlišení ~2Å:
• Obyčejně dostatečné na postavení modelu
– Rozlišení ~1Å:
• Atomy jsou diskrétní koule
Model (Model building)
Mapy elektronové hustoty
- 5.5 Å α-spirála
- 3.5 Ǻ tryptofán, tyrozín
- 2.0-2.5Å Cα-N-CO-Cα
-.1.2 Å atom
- hlavní řetězec, aminokyseliny,
- počítačová grafika FRODO, O, Coot, Quanta
- ARP/wARP
2
2
Vypřesnění modelu (Refinement) Rfree ∑ w Fo − Fc
(
- CNS (XPLOR), REFMAC, SHELXL
- reciproký prostor, reálny prostor
- fixovaná geometrie, energie
)
2
Building a protein model
• Find structural elements:
– α-helices, β-strands
• Fit amino-acid sequence
Building a protein model
• Find structural elements:
– α-helices, β-strands
• Fit amino-acid sequence
Effects of resolution on electron
density
d=4Å
Note: map calculated with perfect phases
Effects of resolution on electron
density
d=3Å
Note: map calculated with perfect phases
Effects of resolution on electron
density
d=2Å
Note: map calculated with perfect phases
Effects of resolution on electron
density
d=1Å
Note: map calculated with perfect phases
Map fitting as a function of resolution
1.0Å
2.5Å
3.0Å
4.0Å
At 1.0Å, there is no problem fitting individual atoms (and the N atom is
bigger than the carbons). At 2.5Å the ring is easily fitted, at 3.0Å less
easily, and at 4Å the fit is very uncertain.
The size of the fitted objects depends on the resolution:
*
High resolution: atoms
*
Medium resolution: residues, side-chains
*
Low resolution: secondary structure elements, molecules
Solvent. Tlumivý roztok.
Protein
Solvent
Mapa elektronové hustoty v 4 Å rozlišení
Skeleton
Refinement. Upřesňování
• Cíl: získat spolehlivý model proteinové struktury pro daná
difrakční data. Měníme postupně parametry struktury
(souřadnice atomů) aby shoda mezi experimentálními
intenzitami a vypočítanými z modelu byla co nejlepší.
Etarget = wgeometry Egeometry + wX −ray EX −ray
Musí vypadat jako protein
(constrains)
musí fitovat naše data
Refinement process
• Bad phases
→ poor electron density map
→ errors in the protein model
• Interpretation of the electron density map
→ improved model
→ improved phases
→ improved map
→ even better model
… iterative process of refinement
Refinement programs
•
Least-squares
(
M = ∑ whkl Fo − Fc
2
)
2 2
hkl
•
Maximum likelihood
•
•
REFMAC (CCP4)
CNS (XPLOR)
M = ∑ whkl ( Fo − Fc )
2
hkl
•
Real space refinement
M = ∑ whkl ( ρ o − ρ c )
2
hkl
R-factor, Rfree-factor
Vážený a konvenční R-faktor. Kriteria správnosti. Čím menší tím lepší.
⎡ ∑ w(F − F
wR = ⎢
2
wF
⎢⎣
∑ o
2
o
•
•
•
•
) ⎤⎥
1/ 2
2 2
c
⎥⎦
R=
∑| F
obs
hkl
(hkl ) − kFcalc (hkl ) |
∑| F
obs
(hkl ) |
hkl
Test sada is se vytvoří náhodným výběrem 5 až 10% reflexí. Tato se
použije pouze na výpočet R(free).
Zbývající reflexe, Pracovní sada, se použije na vlastní rafinaci
struktury.
Rfree may not exceed Rwork too much (~5%)
Rwork must be lower than ~resolution*10 %
Ilustrace, verifikace, analýza
- RASMOL, MOLSCRIPT
SwissPDBViewer, Raster3D
- PROCHECK
- Ramachandran plot
Software. Academic.
CCP4
www.ccp4.ac.uk
PDB - Protein Database
www.rcsb.org/pdb
Validation
•
•
•
•
Free R-factor (cross validation)
– Number of parameters/
observations
Ramachandran plot
Chemically likely (WhatCheck,
PROCHECK)
– Hydrophobic inside,
hydrophilic outside
– Binding sites of ligands,
metals, ions
– Hydrogen-bonds satisfied
– Chemistry in order
Final B-factor values
Art I
Art
II
Výpočet struktur - shrnutí
Redukce dat
Fázování strukturních faktorů
Výpočet elektronové hustoty, DM, obálka,
skeleton
Budování modelu
Rafinace struktury, váhy, maximum likelihood
Verifikace
Sumár
Protein crystals
• Regular arrays of protein molecules
• ‘Wet’: 20-80% solvent
• Few crystal contacts
• Protein crystals contain active protein
• Enzyme turnover
• Ligand binding
Example of crystal packing
Problematic proteins
•
Multiple domains
•
Similarly, floppy ends may
hamper crystallization:
change construct
•
Membrane proteins
Flexible
hydrophilic
Lipid
bilayer
hydrophobic
hydrophilic
•
Glycoproteins
Flexible and heterogeneous!!
Examples of crystal packing
Acetylcholinesterase
~68% solvent
β2 Glycoprotein I
~90% solvent
(extremely high!)
Molekuly života
Remarks
• Time consuming
• Don’t work for all proteins
– But if do, favored over NMR
• H-atoms don’t scatter much (too few
electron)
• Usual resolution ~2Å