Monoclonal Antibody to CD63, FITC conjugated (CD63 FITC)

V
C
Monoclonal Antibody to CD63, FITC conjugated
(CD63 FITC)
Cat. No. / Kat. č.: ED7031
ENGLISH
5. Reagent provided
The reagent contains mouse monoclonal antibody against
human CD63 antigen (clone MEM-259) which was purified by
affinity chromatography and labeled with Fluorescein
isothiocyanate (FITC). The labeled antibody is diluted in an
optimal concentration in phosphate buffered saline (PBS)
containing 15mM sodium azide and 0.2% (w/v) high-grade
protease free Bovine Serum Albumin (BSA) as a stabilizing
agent. The content of a vial (2 ml) is sufficient for 100 tests.
1. Specification
Specificity
Fluorochrome
Clone
Isotype
Content
Usage
λ excitation
Emission maximum
Human CD63
FITC
MEM-259
Mouse IgG1
100 tests, 2 ml
20 µl per test
488 nm
525 nm
6. Storage
Store vial in the dark at 2-8°C. Do not freeze.
2. Intended use
7. Precautions
The reagent CD63 FITC permits identification and enumeration
of cell populations expressing human CD63 antigen in whole
blood using flow cytometry. This reagent is widely used for
investigation of allergen induced activation of basophils.
Intended for professional use only.
Do not use after expiration date stamped on vial label.
Avoid prolonged exposure to light.
The content of the vial must not freeze.
Avoid contamination of the reagent.
Any non-performance of staining protocol may produce
false results.
ƒ The reagent contains sodium azide (NaN3) which is highly
toxic in pure form. However, the concentration in the
reagent (15mM) is not considered as hazardous. When
disposing the reagent, flush the sink with large volume of
water to avoid accumulation of explosive metal-azide
in plumbing.
ƒ Blood samples are considered as potentially infectious
and must be handled with care. Avoid all contact of the
sample with the skin, eyes and mucosa.
ƒ
ƒ
ƒ
ƒ
ƒ
ƒ
3. Principle
This test is based on specific binding of monoclonal antibody to
the antigenic determinant expressed on the surface of
leukocytes. The monoclonal antibody is labeled with
fluorochrome which is excited via laser beam from a flow
cytometer during analysis. Subsequent emission of light from
fluorochromes of each cell is collected and analyzed by a flow
cytometer. The fluorescence intensity differences enable
separation of cell subsets based on expression of analyzed
antigen.
Specific staining of blood cells is performed by incubation of
blood samples with the reagent followed by a lysis of red blood
cells. Afterwards, unaffected leukocytes are subjected to
analysis by a flow cytometer.
8. Necessary material not supplied
Material necessary for collection of peripheral blood, test tubes
for staining of blood samples (e.g. 12 × 75 mm), automatic
pipettes with disposable tips, vortex mixer, centrifuge,
commercial lysing solution, phosphate buffered saline (PBS),
flow cytometer.
4. Specificity
The antibody MEM-259 reacts with CD63 (LAMP-3, lysosomeassociated membrane protein-3), a 40-60 kDa glycoprotein of
tetraspanin family, and is present in late endosomes,
lysosomes and secretory vesicles of various cell types. It is also
present in the plasma membrane, usually following cell
activation. Hence, it has become a widely used basophil
activation marker.
9. Staining protocol
1.
2.
1/5
Collect peripheral blood in a sterile tube with an
anticoagulant (e.g. Heparin, EDTA).
Add 20 µl CD63 FITC reagent to a test tube.
ED7031_EN_CZ_SK_090729
Add 100 µl of blood sample to the tube. Vortex the
tube.
4. Incubate the tube for 20-30 minutes at room
temperature in the dark.
5. Perform lysis of red cells using lysing solution. It is
recommended to use a commercial lysing solution
containing formaldehyde as a fixative. Follow the
instructions of the lysing solution manufacturer.
6. Centrifuge the tube for 5 minutes at 300 g.
7. Remove supernatant and resuspend pellet with
3-4 ml of PBS.
8. Centrifuge the tube for 5 minutes at 300 g.
9. Remove supernatant and resuspend pellet with 0.3 –
0.5 ml of PBS.
10. Analyze the sample immediately using a flow cytometer
or store sample at 2-8°C in the dark and analyze within
24 hours provided that cells were fixed.
2. Použití
3.
Reagencie CD63 FITC je In vitro diagnostický zdravotnický
prostředek, který je určený pro identifikaci a počítání CD63
pozitivních buněk v lidské periferní krvi pomocí průtokové
cytometrie. Tato reagencie je často používána pro vyšetření
aktivace bazofilů po stimulaci alergenem.
3. Princip
Tento test je založen na specifické vazbě monoklonální
protilátky na antigen, který je exprimovaný na povrchu
leukocytů.
Monoklonální
protilátka
je
konjugovaná
s fluorescenční značkou. Během analýzy vzorku průtokovým
cytometrem je detekována fluorescence jednotlivých buněk.
Rozdíly v intenzitě fluorescence buněk umožňují separovat
skupiny leukocytů na základě rozdílné exprese analyzovaného
antigenu.
10. Data analysis
Specifické barvení leukocytů probíhá v periferní krvi. Po
inkubaci vzorku se značenou protilátkou jsou červené krvinky
odstraněny pomocí lyze a leukocyty jsou analyzovány
průtokovým cytometrem.
Analyze the sample stained with CD63 FITC using a flow
cytometer. Make appropriate plots and gates to analyze
populations expressing human CD63 antigen.
Example data show an analysis of blood sample from patient
with the allergy to bee venom. The test sample (figure 1) was
stained using CD63 FITC and CD203c PE after the stimulation
with bee venom extract and interleukin-3. The control sample
(figure 2) was not stimulated with the allergen.
4. Specificita
Monoklonální protilátka MEM-259 reaguje s lidským CD63
antigenem (LAMP-3, lysosome associated membrane protein3), 40-60 kDa glykoproteinem, který je přítomen na
endozomech, lysozomech a sekrečních váčkách mnoha typů
buněk. Tento antigen se také objevuje v plazmatické membráně
po buněčné aktivaci. Díky tomu se tento antigen používá jako
aktivační marker bazofilů.
11. Limitations
ƒ Flow cytometer may produce false results if the device
has not been aligned and maintained appropriately.
ƒ Data may be incorrectly interpreted if fluorescent signals
were compensated wrongly or if gates were positioned
inaccurately.
ƒ Blood samples from abnormal patients may exhibit
abnormal values of positive cells.
ƒ Red blood cells from abnormal patients may be resistant
to lysis using lysing solutions.
ƒ In case of hyperleukocytose sample, it is recommended to
dilute blood sample with PBS to obtain leukocyte density
approximately 5 × 106 leukocytes/ml.
ƒ Blood samples should be stained and analyzed within 24
hours from the blood collection.
5. Popis reagencie
Reagencie obsahuje myší monoklonální protilátku proti
lidskému antigenu CD63 (klon MEM-259), která byla
purifikována a označena fluorescein izothiokyanátem (FITC).
Značená protilátka byla naředěna na optimální koncentraci do
stabilizačním roztoku, který obsahuje PBS (pH 7,4), 0,2%
hovězí sérový albumin a 15mM NaN3. Obsah vialky (2 ml
reagencie) odpovídá provedení 100 testů.
6. Skladování
Vialku s reagencií uchovávejte v temnu při teplotě 2-8 °C. Doba
použitelnosti reagencie je vyznačena na štítku vialky.
ČESKY
1. Specifikace produktu
Specificita
Fluorochrom
Klon
Izotyp
Obsah
Použití
λ excitace
Emisní maximum
7. Upozornění
CD63
FITC
MEM-259
Myší IgG1
100 testů, 2 ml
20 µl na test
488 nm
525 nm
ƒ
ƒ
ƒ
ƒ
ƒ
ƒ
ƒ
2/5
Výrobek je určen pro profesionální uživatele.
Nepoužívejte reagencii po uplynutí doby použitelnosti.
Reagencii nevystavujte dlouhodobému působení světla.
Obsah vialky nesmí zmrznout.
Chraňte obsah vialky před kontaminací.
Nedodržení postupu měření může ovlivnit výsledky testu.
Reagencie obsahuje azid sodný (NaN3), který je v čistém
stavu vysoce toxický, avšak koncentrace, která je v této
reagencii (15 mM), není již považována za nebezpečnou.
ED7031_EN_CZ_SK_090729
Při likvidaci reagencie obsahující azid splachujte velkým
množstvím vody.
ƒ Krevní vzorky jsou považovány za potenciálně infekční
materiál a proto s nimi musí být náležitě nakládáno.
Vyvarujte se kontaktu vzorků s pokožkou, očima
a sliznicemi.
ƒ Červené krvinky některých abnormálních pacientů mohou
být rezistentní k lyzi pomocí lyzačních roztoků.
ƒ V případě krevního vzorku s abnormálně vysokým počtem
leukocytů je třeba vzorek naředit pomocí PBS na hodnotu
kolem 5 × 106 leukocytů na ml.
ƒ Krevní vzorky by neměly být skladovány déle než 24
hodin před barvením.
8. Potřebné vybavení a materiál, který není
dodáván
SLOVENSKY
Nezbytný materiál pro odběr periferní krve, vhodné zkumavky
pro barvení buněk (např. 12 × 75 mm), sada pipet
s jednorázovými špičkami, centrifuga, vortex, lyzační roztok,
pufr PBS, izotypová kontrola, průtokový cytometr.
1. Špecifikácia produktu
Špecifičnosť
Fluorochróm
Klon
Izotyp
Obsah
Použitie
λ excitácia
Emisné maximum
9. Postup barvení
1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
8.
9.
1.
Odeberte periferní krev do sterilní odběrové zkumavky
obsahující antikoagulant (např. Heparin, EDTA).
Pipetujte 20 µl reagencie CD63 FITC do zkumavky.
Přidejte 100 µl promíchané periferní krve a směs
promíchejte pomocí vortexu.
Inkubujte zkumavku 20-30 minut v temnu za
laboratorní teploty.
Proveďte lyzi červených krvinek pomocí lyzačního
roztoku. Je doporučeno používat komerční lyzační
činidlo, které obsahuje formaldehyd fixující buňky.
Postupujte podle návodu výrobce lyzačního činidla.
Centrifugujte zkumavku 5 minut při 300 g.
Odstraňte supernatant a resuspendujte sediment
pomocí 3-4 ml PBS.
Centrifugujte zkumavku 5 minut při 300 g.
Odstraňte supernatant a resuspendujte sediment
pomocí 0,3-0,5 ml PBS.
Analyzujte vzorek ihned po obarvení pomocí
průtokového cytometru. V případě že byl vzorek
fixovány formaldehydem, je možné vzorek uskladnit
v temnu při 2-8°C a analyzovat do 24 hodin.
CD63
FITC
MEM-259
Myšie IgG1
100 testov, 2 ml
20 µl na test
488 nm
525 nm
2. Použitie
Reagencia CD63 FITC je In vitro diagnostický zdravotnícky
prostriedok, ktorý je určený na identifikáciu a počítanie CD63
pozitívnych buniek v ľudskej periférnej krvi pomocou prietokovej
cytometrie. Táto reagencia je často používaná na vyšetrenie
aktivácie bazofilov po stimulácii alergénom.
3. Princíp
Tento test je založený na špecifickej väzbe monoklonovej
protilátky s antigénom, ktorý je exprimovaný na povrchu
leukocytov. Monoklonová protilátka je konjugovaná
s fluorescenčnou značkou. V priebehu analýzy vzorky
prietokovým cytometrom sa zaznamená fluorescencia
jednotlivých buniek. Rozdiely v intenzite fluorescencie
jednotlivých buniek umožňujú separáciu skupín leukocytov na
základe rozdielnej expresie analyzovaného antigénu.
10. Analýza dat
Obarvený vzorek analyzujte průtokovým cytometrem.
Naměřená data zobrazte ve vhodném grafu a buněčné
populace rozdělte pomocí regionů tak, aby bylo možné spočítat
procentuelní zastoupení CD63 pozitivní populace.
Špecifické značenie leukocytov prebieha v periférnej krvi. Po
inkubácii vzorky s označenou protilátkou sú červené krvinky
odstránené pomocou lýzy a leukocyty sú analyzované
prietokovým cytometrom.
Uvedená vzorová data představují analýzu krve pacienta
s alergií na včelí jed. Testovací vzorek (obrázek 1) byl
stimulován pomocí extraktu ze včelího jedu a interleukinem-3
a poté obarven protilátkami CD63 FITC a CD203c PE.
Obrázek 2 představuje kontrolní vzorek, který nebyl stimulován
alergenem.
4. Špecifičnosť
Monoklonová protilátka MEM-259 reaguje s ľudským CD63
antigénom (LAMP-3, lysosome associated membrane protein3), 40-60 kDa glykoproteínom, ktorý je prítomný na
endozómoch, lyzozómoch a sekrečných váčkoch mnohých
typov buniek. Tento antigén sa tiež objavuje v plazmatickej
membráne po bunkovej aktivácii. Vďaka tomu sa tento antigén
používa ako aktivačný marker bazofilov.
11. Omezení metody
ƒ Průtokový cytometr může poskytovat špatné hodnoty,
pokud není dobře seřízen a udržován.
ƒ Data mohou být špatně interpretována, pokud jsou
fluorescenční signály špatně kompenzované, případně
pokud jsou regiony buněk špatně umístěné.
ƒ Krevní vzorky od abnormálních pacientů mohou
vykazovat abnormální hodnoty procent pozitivních buněk.
3/5
ED7031_EN_CZ_SK_090729
10. Vzorky analyzujte na prietokovom cytometri ihneď po
označení. V prípade, že vzorky boli fixované
formaldehydom, je možné tieto vzorky uskladniť
v temne pri 2-8°C a analyzovať do 24 hodín.
5. Popis reagencie
Reagencia obsahuje myšiu monoklonovú protilátku proti
ľudskému antigénu CD63 (klon MEM-259), ktorá bola
purifikovaná a označená fluorescein izotiokyanátom (FITC).
Označená protilátka bola nariedená na optimálnu koncentráciu
do stabilizačného roztoku, ktorý obsahuje PBS (pH 7,4),
0,2% hovädzí sérový albumín a 15mM NaN3. Obsah fľaštičky
(2 ml reagencie) odpovedá uskutočneniu 100 testov.
10. Analýza dát
Označené vzorky analyzujte prietokovým cytometrom.
Namerané dáta zobrazte vo vhodnom grafe a bunečné
populácie rozdeľte pomocou regiónov tak, aby bolo možné
spočítať percentuálne zastúpenie CD63 pozitívnych buniek.
6. Skladovanie
Uvedené vzorové dáta predstavujú analýzu krvi pacienta
s alergiou na včelí jed. Testovacia vzorka (obrázok 1) bola
stimulovaná extraktom zo včelieho jedu a interleukinom-3
a označená pomocou protilátok CD63 FITC a CD203c PE.
Obrázok 2 predstavuje kontrolnú vzorku, ktorá nebola
stimulovaná alergénom.
Fľaštičku s reagenciou uschovávajte v temne pri teplote 2-8 °C.
Doba použiteľnosti reagencie je vyznačená na štítku fľaštičky.
7. Upozornenie
Výrobok je určený pre profesionálnych užívateľov.
Nepoužívajte reagenciu po uplynutí doby použiteľnosti.
Reagenciu nevystavujte dlhodobému pôsobeniu svetla.
Obsah fľaštičky nesmie zmrznúť.
Chráňte obsah fľaštičky pred kontamináciou.
Nedodržanie postupu merania môže ovplyvniť výsledky
testu.
ƒ Reagencia obsahuje azid sodný (NaN3), ktorý je v čistom
stave vysoko toxický, avšak koncentrácia prítomná v tejto
reagencii (15 mM) už nieje považovaná za nebezpečnú.
Pri likvidácii reagencie obsahujúcej azid splachujte
umývadlo veľkým množstvom vody.
ƒ Krvné vzorky sú považované za potenciálne infekčný
materiál a preto sa s nimi musí zaobchádzať opatrne.
Vyvarujte sa kontaktu vzoriek s pokožkou, očami
a sliznicami.
ƒ
ƒ
ƒ
ƒ
ƒ
ƒ
11. Obmedzenia metódy
ƒ Prietokový cytometer môže poskytovať nepresné
výsledky, ak nieje dobre nastavený a udržiavaný.
ƒ Dáta môžu byť zle interpretované, ak sú fluorescenčné
signály nedostatočne kompenzované alebo ak sú regióny
buniek zle umiestnené.
ƒ Krvné vzorky od abnormálnych pacientov môžu vykazovať
abnormálne percentuálne hodnoty pozitívnych buniek.
ƒ Červené krvinky niektorých abnormálnych pacientov môžu
byť rezistentné voči lýze pomocou lyzačných roztokov.
ƒ V prípade krvnej vzorky s abnormálne vysokým počtom
leukocytov je potrebné vzorku nariediť pomocou PBS na
hodnotu približne 5 × 106 leukocytov na ml.
ƒ Krvné vzorky by nemali byť skladované dlhšie ako 24
hodín pred značením.
8. Potrebné vybavenie a materiál, ktorý sa
nedodáva
ENGLISH / ČESKY / SLOVENSKY
Materiál potrebný na odber periférnej krvi, vhodné skúmavky
pre značenie buniek (napr. 12 × 75 mm), sada pipiet
s jednorázovými špičkami, centrifúga, vortex, lyzačný roztok,
PBS tlmivý roztok, prietokový cytometer.
Example data / Vzorové vyhodnocení / Vzorové
vyhodnotenie
9. Postup značenia
1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
8.
9.
Odoberte periférnu krv do sterilnej odberovej skúmavky
obsahujúcej antikoagulant (napr. Heparín, EDTA).
Pipetujte 20 µl reagencie CD63 FITC do skúmavky.
Pridajte 100 µl premiešanej periférnej krvi a zmes
premiešajte pomocou vortexu.
Skúmavku inkubujte 20-30 minút v temne pri
laboratórnej teplote.
Zlyzujte červené krvinky pomocou lyzačného roztoku.
Odporúča sa používať komerčné lyzačné činidlo, ktoré
obsahuje formaldehyd a fixuje bunky. Postupujte podľa
návodu od výrobcu lyzačného činidla.
Centrifugujte skúmavku 5 minút pri 300 g.
Odstráňte supernatant a resuspendujte sediment
pomocou 3-4 ml PBS.
Centrifugujte skúmavku 5 minút pri 300 g.
Odstráňte supernatant a resuspendujte sediment
pomocou 0,3-0,5 ml PBS.
Fig. 1: Sample from patient with allergy to bee venom, stained using
CD63 FITC and CD203c PE after the stimulation with bee venom
extract and IL-3.
Obr. 1: Vzorek krve pacienta s alergií na včelí jed, obarvený pomocí
CD63 FITC a CD203c PE, po stimulaci extraktem včelího jedu a IL-3.
Obr. 1: Vzorka krvi pacienta s alergiou na včelí jed, označená pomocou
CD63 FITC a CD203c PE, po stimulácii extraktom včelieho jedu a IL-3.
4/5
ED7031_EN_CZ_SK_090729
Explanation of symbols / Vysvětlení symbolů /
Vysvetlenie symbolov
h
M
i
X
l
Fig. 2: Control sample from patient with allergy to bee venom, stained
using CD63 FITC and CD203c PE without the stimulation with the
allergen.
Obr. 2: Kontrolní vzorek krve pacienta s alergií na včelí jed, obarvený
pomocí CD63 FITC a CD203c PE, bez stimulace alergenem.
Obr. 2: Kontrolná vzorka krvi pacienta s alergiou na včelí jed, označená
pomocou CD63 FITC a CD203c PE, bez stimulácie alergénom.
8°C
2°C
g
H
In Vitro Diagnostic Medical Device
In vitro diagnostický zdravotnický prostředek
In vitro diagnostický zdravotnícky prostriedok
Catalog number
Katalogové číslo
Katalógové číslo
Manufacturer identification
Výrobce
Výrobca
Consult the manual before use
Viz návod k použití
Viď návod na použitie
Sufficient for N test
Lze použít pro N testů
Postačujúce na vykonanie N testov
Store within temperature limits
Rozmezí skladovacích teplot
Rozmedzie skladovacích teplôt
Batch code
Číslo šarže
Use by
Použitelné do
Použiteľné do
References / Literatura / Literatúra
Manufacturer / Výrobce / Výrobca
Lin D, Kamsteeg EJ, Zhang Y, Jin Y, Sterling H, Yue P, Roos
M, Duffield A, Spencer J, Caplan M, Wang WH: Expression of
tetraspan protein CD63 activates protein tyrosine kinase (PTK)
and enhances the PTK-induced inhibition of ROMK channels. J
Biol Chem. 2008 Jan 22
EXBIO Praha, a.s.
Nad Safinou II 366
252 42 Vestec, Czech Republic
Tel: +420 261 090 666
Fax: +420 261 090 660
E-mail: [email protected]
http://www.exbio.cz
Kwon MS, Shin SH, Yim SH, Lee KY, Kang HM, Kim TM,
Chung YJ: CD63 as a biomarker for predicting the clinical
outcomes in adenocarcinoma of lung. Lung Cancer. 2007
Jul;57(1):46-53.
Cerny J, Feng Y, Yu A, Miyake K, Borgonovo B, Klumperman J,
Meldolesi J, McNeil PL, Kirchhausen T.: The small chemical
vacuolin-1 inhibits Ca(2+)-dependent lysosomal exocytosis but
not cell resealing. EMBO Rep. 2004 Sep;5(9):883-8. Erratum in:
EMBO Rep. 2005 Sep;6(9):898.
Israels SJ, McMillan-Ward EM: CD63 modulates spreading and
tyrosine phosphorylation of platelets on immobilized fibrinogen.
Thromb Haemost. 2005 Feb;93(2):311-8.
Grützkau A, Smorodchenko A, Lippert U, Kirchhof L, Artuc M,
Henz BM: LAMP-1 and LAMP-2, but not LAMP-3, are reliable
markers for activation-induced secretion of human mast cells.
Cytometry A. 2004 Sep;61(1):62-8.
Mantegazza AR, Barrio MM, Moutel S, Bover L, Weck M,
Brossart P, Teillaud JL, Mordoh J: CD63 tetraspanin slows
down cell migration and translocates to the
endosomal-lysosomal-MIICs route after extracellular stimuli in
human immature dendritic cells. Blood. 2004 Aug
15;104(4):1183-90.
Pfistershammer K, Majdic O, Stöckl J, Zlabinger G, Kirchberger
S, Steinberger P, Knapp W: CD63 as an activation-linked T cell
costimulatory element. J Immunol. 2004 Nov 15;173(10):60008.
5/5
ED7031_EN_CZ_SK_090729