BasoFlowEx Kit

V
C
BasoFlowEx® Kit
(100 tests / testů / testov)
Cat. No. / Kat. č.: ED7043
ENGLISH
4. Precautions

1. Intended use
The BasoFlowEx® Kit is intended for flow cytometry
examination of IgE-mediated allergic reactions via the
analysis of CD63 antigen surface exposure on basophils in
human heparinized whole blood upon allergen stimulation.
Commercially available allergens (e.g. used for prick tests) can
be used for stimulation.



2. Introduction
The crucial point in allergy diagnostics is to determine the
causal allergen. Reliability of the commonly used method of the
skin prick test (SPT) is low and this test can promote the
patient’s allergy disease. Hence in vitro tests, such as detection
of specific IgE in serum (sIgE), or analysis of basophil activation
markers, are advisable. Although specificity of sIgE detection is
sufficient for most allergens, its sensitivity is usually about 75%
only. Moreover, for food and drug allergens both sensitivity and
specificity of sIgE detection is much lower. By contrast, the
basophil activation test (BAT) shows very high specificity and
also high sensitivity, including many problematic allergens.

3. Principle






The BAT assay is based on in vitro stimulation of basophils
using sensitizing allergen and subsequent flow cytometry
analysis of externalized CD63 antigen exposition on basophil
surface after degranulation. If there is sufficient quantity of
allergen-specific IgE molecules bound to the basophil cell
surface high-affinity FcRI receptors, allergen molecules
crosslink the receptors leading to full activation of the basophil.
As a consequence, cytoplasmatic granules containing the CD63
transmembrane protein fuse with the plasma membrane and
release inflammatory mediators. Therefore the CD63 antigen is
exposed as a marker of basophil activation (degranulation). The
exposed CD63 antigen is detected by monoclonal antibody
staining (clone MEM-259, FITC labeled). The basophil
population is identified by staining using anti-CD203c
monoclonal antibody (clone NP4D6, R-phycoerythrin (PE)
labeled). A positive control sample is stimulated using a
monoclonal antibody against IgE molecule which mimics the
allergen crosslinking process of IgE molecules on the basophil
surface and using a chemotactic peptide N-formyl-Met-Leu-Phe
(fMLP) which activates basophils via fMLP receptor (FPR1).
Intended for In Vitro Diagnostic use in laboratories outside
USA and Canada. This CE-IVD kit is in conformity with the
European In Vitro Diagnostic Medical Device Directive
98/79/EC.
Blood must be collected into a tube containing
heparin. Anticoagulants EDTA and citrate negatively
affect the results of analysis.
Blood samples must be treated within 8 hours after
collection if stored at room temperature.
Stained samples must be analyzed within 2 hours after
staining.
The flow cytometer should be calibrated on a routine basis
using fluorescent microbeads to ensure stable sensitivity
of detectors.
Do not use reagents after expiration date stated on vial
labels.
Avoid Staining Reagent (ED7043-3) prolonged exposure
to light.
Avoid contamination of reagents.
Aeroallergens (pollen, mites, dust) may contaminate open
tubes in laboratory and cause an increased background
release.
Any non-performance of assay procedure may produce
false results.
Blood samples are considered as potentially infectious
and must be handled according to local regulations.
Warning: The Lysing Solution (ED7043-4) contains
formaldehyde and methanol.
Danger
H-phrases
H302+H312+H332: Harmful if swallowed, in contact with skin or
if inhaled.
H317: May cause an allergic skin reaction.
H351: Suspected of causing cancer.
P-phrases
P270: Do not eat, drink or smoke when using this product.
P280: Wear protective gloves / protective clothing / eye
protection / face protection.
P301+P312: IF SWALLOWED: Call a POISON CENTER or
doctor/physician if you feel unwell.
P302+P352: IF ON SKIN: Wash with plenty of soap and water.
1/10
ED7043_EN_CZ_SK_150506
P305+P351+P338: IF IN EYES: Rinse cautiously with water for
several minutes. Remove contact lenses, if present and
easy to do. Continue rinsing.
P501: Dispose of contents/container to authorized facility for
dangerous wastes.
1.
Add in the tube of:
 allergen-stimulated sample - 10 l of allergen,
 negative control sample - nothing,
 positive control sample - 10 l of Stimulation Control.
2. Add 100 l of Stimulation Buffer into all tubes.
3. Add 100 l of heparinized whole blood into all tubes and
vortex gently.
4. Incubate tubes at 37 °C for 15 minutes in water bath or
25 minutes in air incubator.
5. Add 20 l of Staining Reagent into all tubes, vortex gently,
and incubate for 20 minutes at 2-8 °C or on ice.
6. Add 300 l of Lysing Solution into all tubes, vortex gently,
and incubate for 5 minutes at room temperature.
7. Add 3-4 ml of demineralized water into all tubes, vortex
gently, and incubate for 5-10 minutes at room temperature
until the red blood cells are lysed.
8. Centrifuge tubes for 5 minutes at 300x g.
9. Remove the supernatant and resuspend the pellet in 0.20.4 ml of PBS buffer.
10. Analyze samples using a flow cytometer within 2 hours
after staining.
5. Reagents provided




ED7043-1 Stimulation Buffer – 5 lyophilized vials,
1 vial is intended for stimulation of 20 tubes.
ED7043-2 Stimulation Control – 2 lyophilized vials,
1 vial is intended for stimulation of 25 positive controls.
ED7043-3 Staining Reagent – 1 vial containing 2 ml of
premixed antibody cocktail: anti-CD63, FITC labeled +
anti-CD203c, PE labeled.
ED7043-4 Lysing Solution – 30 ml.
6. Necessary material not supplied









Allergens (e.g. for prick tests)
Suitable 5ml test tubes for blood staining
(e.g. 12 × 75 mm)
PBS buffer
Ultrapure demineralized water
Automatic pipettes with disposable tips
Vortex mixer
Thermostat able to incubate test tubes at 37 °C
Centrifuge with rotor suitable for test tubes
Flow cytometer - blue laser excitation at 488 nm, light
emission at 525 nm (FITC) and 575 nm (PE)
9. Flow cytometric analysis
Analyze stained samples using flow cytometer. In order to
analyze sufficient number of basophils (>200), acquire 50,000100,000 events per sample. Compensate your data (FITC and
PE channels) prior to or after the acquisition.
Visualize compensated data on the side-scatter (SSC) versus
fluorescence intensity in PE channel (FL2) dot-plot. Set the gate
for basophil population (CD203c positive, SSC low) as shown in
figure 1. The gate must be set individually for each sample.
Then plot the gated basophils as a histogram shown in figures
2a,b,c where the X-axis represents fluorescence intensity in
FITC channel (FL1). Set the gate for non-stimulated basophils
(CD63dim) using the negative control sample. Then calculate the
percentage of activated basophils (CD63bright) in the allergenstimulated samples and positive control sample.
7. Storage
Store the BasoFlowEx® Kit at 2-8 °C. Expiration date is stated
on a vial labels and on the box.
8. Assay procedure
Use heparinized whole blood for examination. Prepare reagents
according to the following instructions.
10. Interpretation of results
Individuals are considered as allergic to the tested allergens
when the percentage of activated basophils exceeds the cut-off
value. Recommended cut-off values for allergen groups are as
follows:
Preparation of reagents before assay
1. Reconstitute lyophilized Stimulation Buffer using 2 ml of
demineralized water. Store the unused volume of the
buffer at 2-8 °C up to 5 days. Alternatively, the buffer can
be aliquoted, frozen once, and stored at ≤ -20 °C for later
use. Avoid repeated freeze/thaw cycles.
2. Reconstitute lyophilized Stimulation Control using
0.25 ml of demineralized water. Store the unused volume
of the reagent at 2-8 °C up to 30 days. Alternatively, the
reagent can be aliquoted, frozen once, and stored at
≤ -20 °C for later use. Avoid repeated freeze/thaw cycles.
3. Other reagents (Staining Reagent, Lysing Solution) are
ready to use.
Inhalant and food allergens
Hymenoptera venoms
Drugs
≥15 %
≥10 %
≥5 %
If the positive control sample shows activation of basophils
< 20 %, the allergen-stimulated samples cannot be interpreted.
11. Expected values
Average number of activated basophils measured in 20
positive control samples is listed below. In theory, the number
of activated basophils in allergen-stimulated sample may vary in
the range of 0-100 %.
Assay procedure
For the examination of one blood sample prepare the test tubes
for negative control, positive control and for samples to be
stimulated with different allergens. Various commercially
available allergens may be used for stimulation, e.g. prick test
allergens at suitable dilution (1-10x). Prepare samples
according to following procedure:
Parameter
Activated basophils
2/10
Mean (%)
77.3
SD
19.4
CV (%)
25.1
ED7043_EN_CZ_SK_150506
Repeatability and Reproducibility of the assay was
determined from the data measured by five operators using six
sensitizing allergens in two parallels on one blood sample under
the same experimental conditions. Using Analysis of variance
the following parameters were calculated:
CVrepeatability
CVreproducibility
ČESKY
1. Použití soupravy
BasoFlowEx® Kit je určený pro testování alergické reakce
zprostředkované protilátkami IgE analýzou expozice proteinu
CD63 na povrchu bazofilů po jejich stimulaci alergenem v lidské
periferní krvi s heparinem pomocí průtokové cytometrie.
Stimulaci je možné provádět pomocí komerčně dostupných
alergenů (např. určených pro kožní testy).
= 2.4 %
= 3.4 %
Specificity and Sensitivity of the assay was determined by
comparison of BasoFlowEx® Kit with two competitor BAT tests
commercially available on the market. The comparison was
performed in routine clinical laboratory on 100 tests.
Parameter
Sensitivity (%)
Specificity (%)
BasoFlowEx
vs.
Comp. A
96.6
82.9
BasoFlowEx
vs.
Comp. B
85.9
79.3
2. Úvod
Klíčovým bodem v diagnostice alergií je co nejpřesnější
stanovení příčinného alergenu. Běžně užívaná metoda kožních
testů (SPT) se vyznačuje nízkou spolehlivostí a kromě toho
může u pacientů vyvolat zhoršení alergického onemocnění.
Proto je žádoucí využívat testy in vitro, jako je detekce
specifických protilátek IgE v séru (sIgE) či analýza aktivačních
markerů bazofilů. Specificita stanovení sIgE je v případě většiny
alergenů dostatečně vysoká, ale senzitivita bývá pouze kolem
75%, kromě toho u některých alergenů (zejména potravin
a léků) je senzitivita i specificita detekce sIgE podstatně nižší.
Oproti tomu se test aktivace bazofilů (BAT) vyznačuje nejen
velmi vysokou specificitou, ale i vysokou senzitivitou, a to
i v případě řady problematických antigenů.
Comp. B
vs.
Comp. A
94.7
69.2
12. Limitations





Blood sample may contain insufficient amount of
basophils.
Basophils in some blood samples are not susceptible to
stimulation.
Reliability of the assay depends on the quality of the
allergen.
Flow cytometer may produce false results if the device
has not been aligned and maintained appropriately.
Data may be incorrectly interpreted if fluorescent signals
were not-correctly compensated or if gates were set
inaccurately.
3. Princip
Principem testu je vyvolání aktivace bazofilů in vitro
v přítomnosti senzibilizujícího alergenu a následné měření
expozice aktivačního znaku bazofilů (proteinu CD63) na
buněčném povrchu pomocí monoklonální protilátky metodou
průtokové cytometrie.
Pokud je ve vzorku přítomno dostatečné množství alergenně
specifických molekul IgE, které jsou navázané na povrchu
bazofilů prostřednictvím vysokoafinitního receptoru FcRI,
přidaný alergen způsobí přemostění receptorů, které vede
k plné aktivaci bazofilů spojené s procesem vylití obsahu
zánětlivých mediátorů z cytoplazmatických granulí vně buňky
(degranulaci). Degranulace má mimo jiné za následek expozici
transmembránového proteinu cytoplazmatických granulí CD63
na povrch bazofilů. Ten je následně detekován monoklonální
protilátkou anti-CD63 (klon MEM-259) konjugovanou s FITC.
Populace bazofilů je ve směsi leukocytů identifikována
monoklonální
protilátkou
anti-CD203c
(klon NP4D6)
konjugovanou s PE. Pozitivní kontrolu představuje vzorek, ve
kterém jsou bazofily aktivované monoklonální protilátkou antiIgE, která zastupuje stimulační účinek specifického alergenu,
a chemotaktickým peptidem N-formyl-Met-Leu-Phe (fMLP),
který aktivuje bazofily přes fMLP receptor (FPR1).
4. Upozornění




3/10
Souprava je určena pro In vitro diagnostiku a vyhovuje
požadavkům NV 453/2004 Sb., které je harmonizováno s
evropskou směrnicí pro In vitro diagnostické zdravotnické
prostředky 98/79/EC.
Krev musí být odebrána do zkumavky s heparinem.
Antikoagulanty EDTA a citrát ruší stanovení.
Vzorky krve zpracujte nejdéle do 8 hodin po odběru za
předpokladu, že jsou skladovány za laboratorní teploty.
Vzorky analyzujte nejpozději do 2 hodin po obarvení.
ED7043_EN_CZ_SK_150506







6. Potřebné vybavení a materiál, který není
dodáván
Průtokový cytometr pravidelně kalibrujte pomocí
fluorescenčních kuliček, aby byla zajištěna stabilní citlivost
detektorů.
Nepoužívejte reagencie po uplynutí doby použitelnosti.
Staining Reagent (ED7043-3) nevystavujte dlouhodobému
působení světla.
Chraňte obsah vialek soupravy před kontaminací.
Během barvení vzorků chraňte obsah zkumavek před
kontaminací vzdušnými alergeny (pyly, prachové částice),
které mohou falešně zvýšit počet aktivovaných bazofilů.
Nedodržení postupu měření může ovlivnit výsledky testů.
Pracujte výhradně v ochranných rukavicích a při práci
dodržujte správné postupy pro zacházení s potenciálně
infekčním materiálem.









Varování: reagencie Lysing Solution (ED7043-4) obsahuje
formaldehyd a metanol.
Alergeny (např. pro kožní testy)
Vhodné 5ml zkumavky pro barvení buněk
(např. 12 × 75 mm)
Fosfátový pufr (PBS)
Ultračistá demineralizovaná voda
Sada automatických pipet s jednorázovými špičkami
Vortex
Termostat umožňující inkubovat zkumavky při 37 °C
Centrifuga s rotorem pro zkumavky
Průtokový cytometr - excitace modrým laserem 488 nm,
emise záření při 525 nm (FITC) a při 575 nm (PE)
7. Skladování soupravy
Nebezpečí
BasoFlowEx® Kit skladujte při teplotě 2-8 °C. Doba
použitelnosti je vyznačena na jednotlivých reagenciích i na
krabici soupravy.
8. Postup testu
H-věty
H302+H312+H332: Zdraví škodlivý při požití, při styku s kůží
a při vdechování.
H317: Může vyvolat alergickou kožní reakci.
H351: Podezření na vyvolání rakoviny.
Vyšetření se provádí v plné krvi odebrané do zkumavky
s heparinem. Reagencie připravte podle následujících instrukcí.
Příprava reagencií před měřením
1. Lyofilizovaný stimulační pufr (Stimulation Buffer) před
použitím rekonstituujte pomocí 2 ml demineralizované
vody. Nespotřebované množství stimulačního pufru je
možné skladovat v lednici (2-8 °C) nejdéle 5 dní,
případně zamrazit při ≤ -20 °C po vhodných alikvotech
pro další použití. Vyvarujte se opakovaného zamrazování
a rozmrazovaní roztoku.
2. Lyofilizovaný stimulant pozitivní kontroly (Stimulation
Control) před použitím rekonstituujte pomocí 0,25 ml
demineralizované vody. Nespotřebované množství
stimulantu je možné skladovat v lednici (2-8 °C) nejdéle
30 dní, případně zamrazit při ≤ -20 °C po vhodných
alikvotech pro další použití. Vyvarujte se opakovaného
zamrazování a rozmrazovaní roztoku.
3. Ostatní reagencie (Staining Reagent, Lysing Solution)
jsou připravené pro okamžité použití.
P-věty
P270: Při používání tohoto výrobku nejezte, nepijte ani nekuřte.
P280: Používejte ochranné rukavice / ochranný oděv /
ochranné brýle / obličejový štít.
P301+312: PŘI POŽITÍ: Necítíte-li se dobře, volejte
TOXIKOLOGICKÉ INFORMAČNÍ STŘEDISKO nebo
lékaře.
P302+352: PŘI STYKU S KŮŽÍ: Omyjte velkým množstvím
vody a mýdlem.
P305+351+338: PŘI ZASAŽENÍ OČÍ: Několik minut opatrně
vyplachujte vodou. Vyjměte kontaktní čočky, jsou-li
nasazeny, a pokud je lze vyjmout snadno. Pokračujte ve
vyplachování.
P501: Odstraňte obsah/obal v autorizovaném místě sběru
nebezpečných odpadů.
Postup testu
Pro vyšetření jednoho vzorku krve je třeba připravit negativní
kontrolu, pozitivní kontrolu a potřebný počet zkumavek
stimulovaných testovanými alergeny. Pro stimulaci je možné
použít různé komerční alergeny, např. vhodně ředěné (1-10x)
alergeny používané pro kožní testy. Vzorky připravte podle
následujícího postupu:
5. Obsah soupravy




ED7043-1 Stimulation Buffer – 5 kusů vialek
obsahujících lyofilizovaný stimulační pufr, jedna vialka je
určená pro stimulaci 20 zkumavek.
ED7043-2 Stimulation Control – 2 kusy vialek
obsahujících lyofilizovaný stimulant pozitivní kontroly,
jedna vialka je určená pro stimulaci 25 pozitivních
kontrolních vzorků.
ED7043-3 Staining Reagent – 1 vialka obsahující 2 ml
koktejlu protilátek: anti-CD63 značená FITC +
anti-CD203c značená PE.
ED7043-4 Lysing Solution – lahvička s lyzačním
roztokem, 30 ml.
1.
2.
3.
4.
4/10
Do zkumavek určených pro:
 alergenem stimulovaný vzorek napipetujte
10 l alergenu,
 negativní kontrolní vzorek nepipetujte nic,
 pozitivní kontrolní vzorek napipetujte 10 l
rekonstituovaného stimulantu (Stimulation Control).
Do všech zkumavek napipetujte 100 l rekonstituovaného
stimulačního pufru (Stimulation Buffer).
Do všech zkumavek napipetujte 100 l krve s heparinem
a zkumavky promíchejte pomocí vortexu.
Zkumavky inkubujte při teplotě 37 °C po dobu 15 minut ve
vodní lázni nebo 25 minut v inkubátoru.
ED7043_EN_CZ_SK_150506
Poté do všech zkumavek napipetujte 20 l koktejlu
protilátek (Staining Reagent), zkumavky promíchejte
pomocí vortexu a inkubujte 20 minut v lednici při 2-8 °C
nebo na ledu.
6. Poté přidejte 300 l lyzačního roztoku (Lysing Solution),
zkumavky promíchejte pomocí vortexu a inkubujte 5 minut
při laboratorní teplotě.
7. Do zkumavek přidejte 3-4 ml demineralizované vody,
promíchejte pomocí vortexu a inkubujte přibližně 5-10
minut při laboratorní teplotě, dokud nedojde k lyzi
červených krvinek.
8. Centrifugujte zkumavky 5 minut při 300 g.
9. Odstraňte supernatant a resuspendujte sediment pomocí
0,2-0,4 ml pufru PBS.
10. Vzorky změřte průtokovým cytometrem nejpozději do
2 hodin od obarvení.
Opakovatelnost a reprodukovatelnost měření byla
stanovena duplicitním měřením šesti sensitizujícími alergeny
nezávisle pěti operátory na jednom vzorku krve za stejných
experimentálních podmínek. Metodou analýzy rozptylů byly
stanoveny
následující
parametry
opakovatelnosti
a reprodukovatelnosti měření:
5.
CVopakovatelnost
CVreprodukovatelnost
= 2,4 %
= 3,4 %
Specificita a Senzitivita metody byla stanovena srovnávacím
měřením soupravy BasoFlowEx® Kit se dvěma komerčně
dostupnými BAT soupravami (A, B). Srovnání bylo provedeno
v rutinním provozu klinické laboratoře na 100 vzorcích.
Parametr
Senzitivita (%)
Specificita (%)
9. Analýza průtokovým cytometrem
Obarvené vzorky analyzujte průtokovým cytometrem. Jelikož by
mělo být analyzováno minimálně 200 bazofilů, změřte
cytometrem 50.000-100.000 událostí od každého vzorku.
Proveďte kompenzaci fluorescenčních signálů naměřených dat
(FITC a PE kanál).
Naměřená data zobrazte v grafu side-scatter (SSC) versus
intenzita fluorescence v PE kanálu (FL2) a ohraničte vhodným
regionem populaci bazofilů, které jsou CD203c pozitivní a mají
nízký SSC, jak je znázorněno na obrázku 1 (kvůli odlišné
expresi CD203c u nestimulovaného a stimulovaného vzorku je
třeba umístění regionu upravit pro každý vzorek zvlášť). Poté
zobrazte ohraničené bazofily v histogramu, kde na ose X je
vynesena intenzita fluorescence ve FITC kanálu (FL1), jak je
znázorněno na obrázcích 2a,b,c. Pomocí negativní kontroly
nastavte region odpovídající CD63dim populaci, která
představuje neaktivované bazofily. Poté spočítejte procentuelní
zastoupení aktivovaných bazofilů, které jsou CD63bright,
v jednotlivých alergenem stimulovaných vzorcích a u pozitivní
kontroly.
BasoFlowEx
vs.
Souprava A
96,6
82,9
BasoFlowEx
vs.
Souprava B
85,9
79,3
Souprava B
vs.
Souprava A
94,7
69,2
12. Omezení metody





Některé vzorky krve nemusí obsahovat dostatečné
množství bazofilů.
Bazofily některých krevních vzorků není možné aktivovat
stimulantem pozitivní kontroly.
Spolehlivost testu závisí na kvalitě použitého alergenu.
Průtokový cytometr může poskytovat špatné hodnoty,
pokud není dobře seřízen a udržován.
Data mohou být špatně interpretována, pokud jsou
fluorescenční signály špatně kompenzované, případně
pokud jsou regiony buněk špatně umístěné.
10. Vyhodnocení testu
Při hodnocení testu je třeba brát v úvahu hranici pozitivity testu
pro jednotlivé skupiny alergenů, kterou by si měla ustanovit
každá laboratoř. Hraniční hodnota pozitivity testu bývá obyčejně
nastavena následovně:
inhalační a potravinové alergeny
jed blanokřídlého hmyzu
léky
≥15 %
≥10 %
≥5 %
Hodnocení testu není možné provést, pokud pozitivní kontrola
vykazuje méně než 20 % aktivovaných bazofilů.
11. Očekávané hodnoty
Průměrná hodnota počtu aktivovaných bazofilů změřených
v pozitivních kontrolách 20 krevních vzorků je uvedena
v následující tabulce. Počet aktivovaných bazofilů u vzorků
stimulovaných alergenem se může teoreticky pohybovat
v rozmezí 0-100 %.
Parametr
Aktivované bazofily
Průměr (%)
77,3
SD
19,4
CV (%)
25,1
5/10
ED7043_EN_CZ_SK_150506
SLOVENSKY

1. Použitie súpravy


BasoFlowEx® Kit je určený na testovanie alergickej reakcie
sprostredkovanej protilátkami IgE analýzou expozície
proteínu CD63 na povrchu bazofilov po ich stimulácii alergénom
v ľudskej periférnej krvi s heparínom pomocou prietokovej
cytometrie. Bazofily je možné stimulovať pomocou komerčne
dostupných alergénov (napr. určených na kožné testy).


2. Úvod

Kľúčovým bodom pri diagnostikovaní alergií je čo najpresnejšie
stanovenie príčinného alergénu. Bežne používaná metóda
kožných testov (SPT) sa vyznačuje nízkou spoľahlivosťou,
a okrem toho môže u pacienta vyvolať zhoršenie stavu
alergického ochorenia. Preto je dôležité využívať možnosť
testovania in vitro, ako je detekcia špecifických protilátok IgE
v sére (sIgE), či analýza aktivačných markerov bazofilov.
Špecifičnosť stanovenia sIgE je v prípade väčšiny alergénov
dostatočne vysoká, ale senzitivita býva zväčša iba okolo 75%,
okrem toho u niektorých alergénov (hlavne u potravín a liekov)
je senzitivita i špecifičnosť detekcie sIgE podstatne nižšia.
Oproti tomu test aktivácie bazofilov (BAT) sa vyznačuje nielen
veľmi vysokou špecifičnosťou, ale aj vysokou senzitivitou, a to
aj v prípade množstva problematických antigénov.

Varovanie: reagencia Lysing Solution (ED7043-4) obsahuje
formaldehyd a metanol.
Nebezpečenstvo
H-vety
H302+H312+H332: Zdraviu škodlivý pri požití, pri kontakte
s pokožkou a pri vdýchnutí.
H317: Môže vyvolať alergickú kožnú reakciu.
H351: Podozrenie na vyvolanie rakoviny.
3. Princíp
Princípom testu je vyvolanie aktivácie bazofilov in vitro
v prítomnosti senzibilizujúceho alergénu a následné meranie
expozície aktivačného znaku bazofilov (proteínu CD63) na
bunečnom povrchu pomocou monoklonálnej protilátky metódou
prietokovej cytometrie.
P-vety
P270: Pri používaní výrobku nejedzte, nepite ani nefajčite.
P280: Noste ochranné rukavice/ochranný odev/ochranné
okuliare/ochranu tváre.
P301+312: PO POŽITÍ: Pri zdravotných problémoch volajte
Národné toxikologické informačné centrum alebo lekára.
P302+352: PRI KONTAKTE S POKOŽKOU: Umyte veľkým
množstvom vody a mydla.
P305+351+338: PO ZASIAHNUTÍ OČÍ: Opatrne niekoľko minút
oplachujte vodou. Ak používate kontaktné šošovky a je to
možné, odstráňte ich. Pokračujte vo vyplachovaní.
P501: Zneškodnite obsah/nádobu v autorizovanom mieste
zberu nebezpečných odpadov.
V prípade, že je vo vzorke krvi prítomné dostatočné množstvo
alergén-špecifických molekúl IgE, ktoré sú naviazané na
povrchu bazofilov prostredníctvom vysokoafinitného receptoru
FcRI , spôsobí pridaný alergén premostenie receptorov, ktoré
vedie k plnej aktivácii bazofilov spojenej s procesom vyliatia
obsahu zápalových mediátorov z cytoplazmatických granulí
vnútri bunky (degranulácii). Degranulácia má okrem iného za
následok aj expozíciu transmembránového proteínu
cytoplazmatických granulí CD63 na povrchu bazofilov. Ten je
následne detekovaný monoklonálnou protilátkou anti-CD63
(klon MEM-259) konjugovanou s FITC. Populácia bazofilov je v
zmesi leukocytov identifikovaná monoklonálnou protilátkou antiCD203c (klon NP4D6) konjugovanou s PE. Pozitívnu kontrolu
predstavuje vzorka, v ktorej sú bazofily aktivované
monoklonálnou protilátkou anti-IgE, ktorá zastupuje stimulačný
účinok špecifického alergénu, a chemotaktickým peptidom
N-formyl-Met-Leu-Phe (fMLP), ktorý aktivuje bazofily cez fMLP
receptor (FPR1).
5. Obsah súpravy




4. Upozornenie




Prietokový cytometer pravidelne kalibrujte pomocou
fluorescenčných guličiek, aby bola zaistená stabilná
citlivosť detektorov.
Nepoužívajte reagencie po uplynutí doby použiteľnosti.
Staining Reagent (ED7043-3) nevystavujte dlhodobému
pôsobeniu svetla.
Chráňte obsah fľaštičiek zo súpravy pred kontamináciou.
V priebehu značenia vzorky chráňte obsah skúmaviek
pred kontamináciou alergénmi prítomnými vo vzduchu
(pele, prachové častice), ktoré môžu falošne zvýšiť počet
aktivovaných bazofilov.
Nedodržanie postupu merania môže ovplyvniť výsledky
testov.
Pracujte výhradne v ochranných rukaviciach a pri práci
dodržujte správne postupy pri zaobchádzaní s potenciálne
infekčným materiálom.
Súprava je určená pre In vitro diagnostiku a vyhovuje
požiadavkám európskej smernice pre In vitro diagnostické
zdravotnícke prostriedky 98/79/EC.
Krv musí byť odobratá do skúmavky s heparínom.
Antikoagulanty EDTA a citrát rušia stanovenie.
Vzorky krvi spracujte najneskôr do 8 hodín od odberu.
Vzorky analyzujte najneskôr do 2 hodín od značenia.

6/10
ED7043-1 Stimulation Buffer – 5 kusov fľaštičiek
obsahujúcich lyofilizovaný stimulačný roztok, jedna
fľaštička je určená na stimuláciu 20 skúmaviek.
ED7043-2 Stimulation Control – 2 kusy fľaštičiek
obsahujúcich lyofilizovaný stimulans pozitívnej kontroly,
jedna fľaštička je určená na stimuláciu 25 pozitívnych
kontrolných vzoriek.
ED7043-3 Staining Reagent – 1 fľaštička obsahujúca
2 ml koktailu protilátok: anti-CD63 označená FITC +
anti-CD203c označená PE.
ED7043-4 Lysing Solution – fľaštička s lyzačním
roztokom, 30 ml.
ED7043_EN_CZ_SK_150506
6. Potrebné vybavenie a materiál, ktorý sa
nedodáva









5.
Potom do všetkých skúmaviek napipetujte 20 l koktailu
protilátok (Staining Reagent), skúmavky premiešajte
pomocou vortexu a inkubujte 20 minút v chladničke pri
2-8°C alebo na ľade.
6. Potom pridajte 300 l lyzačného roztoku (Lysing
Solution), skúmavky premiešajte pomocou vortexu
a inkubujte 5 minút pri laboratórnej teplote.
7. Do každej skúmavky pridajte 3-4 ml demineralizovanej
vody, premiešajte pomocou vortexu a inkubujte približne
5-10 minút pri laboratórnej teplote, pokým nedôjde k lýze
červených krviniek.
8. Centrifugujte skúmavky 5 minút pri 300 g.
9. Odstráňte supernatant a resuspendujte sediment
pomocou 0,2-0,4 ml tlmivého roztoku PBS.
10. Vzorky analyzujte prietokovým cytometrom najneskôr do
2 hodín od označenia.
Alergény (napr. na kožné testy)
Vhodné 5ml skúmavky na značenie buniek
(napr. 12 × 75 mm)
Fosfátový tlmivý roztok (PBS)
Ultračistá demineralizovaná voda
Sada automatických pipiet s jednorázovými špičkami
Vortex
Termostat umožňujúci inkubovať skúmavky pri 37 °C
Centrifúga s rotorom pre skúmavky
Prietokový cytometer - excitácia modrým laserom 488 nm,
emisia žiarenia pri 525 nm (FITC) a pri 575 nm (PE)
7. Skladovanie súpravy
9. Analýza prietokovým cytometrom
BasoFlowEx® Kit skladujte pri teplote 2-8 °C. Doba
použiteľnosti je vyznačená na jednotlivých reagenciách a na
krabici súpravy.
Označené vzorky analyzujte prietokovým cytometrom.
Vzhľadom k tomu, že počet analyzovaných bazofilov by mal byť
minimálne 200, je nutné cytometrom analyzovať 50.000100.000 udalostí z každej vzorky. Vykompenzujte signály
nameraných udalostí z jednotlivých fluorescenčných kanálov.
8. Postup testu
Vyšetruje sa v plnej krvi odobratej do skúmavky s heparínom.
Reagencie pripravte podľa nasledujúcich inštrukcií.
Namerané dáta vyobrazte v grafe side-scatter (SSC) proti
intenzite fluorescencie v PE kanálu (FL2) a ohraničte vhodným
regiónom populáciu bazofilov, ktoré sú CD203c pozitívne
a majú nízky SSC, tak ako je to znázornené na obrázku 1 (kvôli
odlišnej expresii CD203c u nestimulovanej a stimulovanej
vzorky je nutné upraviť umiestnenie regiónu pre každú vzorku
zvlášť). Potom vyobrazte ohraničené bazofily v histograme, kde
na ose X je vynesená intenzita fluorescencie vo FITC kanále
(FL1), tak ako je to znázornené na obrázkoch 2a,b,c. Pomocou
negatívnej kontroly nastavte región odpovedajúci CD63dim
populácii, ktorá predstavuje neaktivované bazofily. Potom
spočítajte percentuálne zastúpenie aktivovaných bazofilov,
ktoré sú CD63bright, v jednotlivých alergénom stimulovaných
vzorkách a u pozitívnej kontroly.
Príprava reagencií pred značením
1. Lyofilizovaný stimulační roztok (Stimulation Buffer) pred
použitím rozpustite pomocou 2 ml demineralizovanej
vody. Nevyužité množstvo stimulačného roztoku je možné
skladovať v chladničke (2-8 °C) po dobu 5 dní, poprípade
zamraziť pri ≤ -20 °C v alikvotných množstvách na ďalšie
použitie. Vyvarujte sa opakovanému zamrazovaniu
a rozmrazovaniu roztoku.
2. Lyofilizovaný stimulans pozitívnej kontroly (Stimulation
Control) pred použitím rozpustite pomocou 0,25 ml
demineralizovanej vody. Nevyužité množstvo stimulans je
možné skladovať v chladničke (2-8 °C) po dobu 30 dní,
poprípade zamraziť pri ≤ -20 °C v alikvotných množstvách
na ďalšie použitie. Vyvarujte sa opakovanému
zamrazovaniu a rozmrazovaniu roztoku.
3. Všetky ďalšie reagencie (Staining Reagent, Lysing
Solution) sú pripravené na okamžité použitie.
10. Vyhodnotenie testu
Pri hodnotení testu je nutné brať v úvahu hranicu pozitivity testu
pre jednotlivé skupiny alergénov, ktorú by si malo ustanoviť
každé laboratórium zvlášť. Hraničná hodnota pozitivity testu
býva obyčajne nastavená nasledovne:
Postup testu
Na vyšetrenie jednej vzorky krvi je nutné pripraviť negatívnu
kontrolu, pozitívnu kontrolu a potrebný počet skúmaviek
stimulovaných testovanými alergénmi. Na stimuláciu je
možné použiť rôzne komerčné alergény, napr. vhodne
nariedené (1-10x) alergény používané na kožné testy. Vzorky
pripravte podľa nasledujúceho postupu:
1.
2.
3.
4.
inhalačné a potravinové alergény
jed blanokrídleho hmyzu
lieky
≥15 %
≥10 %
≥5 %
Test nie je možné hodnotiť v prípade, že pozitívna kontrola
vykazuje menej ako 20 % aktivovaných bazofilov.
Do skúmaviek určených pre:
 vzorku stimulovanú alergénom napipetujte
10 l alergénu,
 negatívnu kontrolnú vzorku nepipetujte nič,
 pozitívnu kontrolnú vzorku napipetujte 10 l
rozpusteného stimulans (Stimulation Control).
Do všetkých skúmaviek napipetujte 100 l rozpusteného
stimulačného roztoku (Stimulation Buffer).
Do všetkých skúmaviek napipetujte 100 l krvi
s heparínom a skúmavky premiešajte pomocou vortexu.
Skúmavky inkubujte pri teplote 37°C po dobu 15 minút vo
vodnom kúpeli alebo 25 minút v inkubátore.
11. Očakávané hodnoty
Priemerná hodnota počtu aktivovaných bazofilov
nameraných v pozitívnych kontrolách 20 krvných vzoriek je
uvedená v nasledujúcej tabuľke. Počet aktivovaných bazofilov
sa môže u vzoriek stimulovaných alergénom teoreticky
pohybovať v rozmedzí 0-100 %.
Parameter
Aktivované bazofily
7/10
Priemer (%)
77,3
SD
19,4
CV (%)
25,1
ED7043_EN_CZ_SK_150506
Opakovateľnosť a reprodukovateľnosť merania bola
stanovená duplicitným meraním šiestich senzitizujúcich
alergénov nezávisle piatimi operátormi na jednej vzorke krvi pri
rovnakých experimentálnych podmienkach. Metódou analýzy
rozptylov
boli
stanovené
nasledujúce
parametre
opakovateľnosti a reprodukovateľnosti merania:
CVopakovateľnosť
CVreprodukovateľnosť
= 2,4 %
= 3,4 %
Špecifičnosť a Senzitivita metódy bola stanovená
porovnávacím meraním súpravy BasoFlowEx® Kit s dvomi
komerčne dostupnými BAT súpravami (A, B). Porovnanie bolo
uskutočnené v rutinnom behu klinického laboratória na 100
vzorkách.
Parameter
Senzitivita (%)
Špecifičnosť (%)
BasoFlowEx
vs.
Súprava A
96,6
82,9
BasoFlowEx
vs.
Súprava B
85,9
79,3
Súprava B
vs.
Súprava A
94,7
69,2
12. Obmedzenia metódy





Niektoré vzorky krvi nemusia obsahovať dostatočné
množstvo bazofilov.
Bazofily niektorých krvných vzoriek nieje možné aktivovať
pomocou stimulans pozitívnej kontroly.
Spoľahlivosť testu závisí od kvality použitého alergénu.
Prietokový cytometer môže poskytovať nepresné hodnoty,
ak nieje správne nastavený a udržiavaný.
Dáta môžu byť zle interpretované v prípade, že signály
z fluorescenčných kanálov nie sú správne
skompenzované alebo ak sú regióny buniek zle
umiestnené.
8/10
ED7043_EN_CZ_SK_150506
ENGLISH / ČESKY / SLOVENSKY
13. Example data / Vzorové vyhodnocení /
Vzorové vyhodnotenie
Fig. 1 Delimitation of basophil population (CD203cpos/ SSClow).
Obr. 1 Ohraničení populace bazofilů (CD203cpos/ SSClow).
Obr. 1 Ohraničenie populácie bazofilov (CD203cpos/ SSClow).
Fig. 2a Histogram of allergen-stimulated basophils.
Obr. 2a Histogram populace bazofilů po stimulaci alergenem.
Obr. 2a Histogram populácie bazofilov po stimulácii alergénom.
Fig. 2a Histogram of negative control basophils.
Obr. 2a Histogram populace bazofilů negativní kontroly.
Obr. 2a Histogram populácie bazofilov negatívnej kontroly.
.
Fig. 2c Histogram of positive control basophils.
Obr. 2c Histogram populace bazofilů pozitivní kontroly.
Obr. 2c Histogram populácie bazofilov pozitívnej kontroly.
9/10
ED7043_EN_CZ_SK_150506
14. References / Literatura / Literatúra
Sainte-Laudy J, Sabbah A, Vallon C, Guerin JC (1998) Analysis
of anti-IgE and allergen induced human basophil activation by
flow cytometry. Comparison with histamine release. Inflamm
Res. 47(10): 401-408
Sanz ML, Sánchez G, Gamboa PM, Vila L, Uasuf C, Chazot M,
Diéguez I, De Weck AL (2001) Allergen-induced basophil
activation: CD63 cell expression detected by flow cytometry in
patients allergic to Dermatophagoides pteronyssinus and
Lolium perenne. Clin. Exp. Allergy 31(7): 1007-1013
Erdmann SM, Heussen N, Moll-Slodowy S, Merk HF, Sachs B
(2003) CD63 expression on basophils as a tool for the
diagnosis of pollen-associated food allergy: sensitivity and
specificity. Clin. Exp. Allergy 33(5): 607-614
Ebo DG, Hagendorens MM, Bridts CH, Schuerwegh AJ, De
Clerck LS, Stevens WJ (2004) In vitro allergy diagnosis: should
we follow the flow? Clin. Exp. Allergy 34(3): 332-339
Valent P, Hauswirth AW, Natter S, Sperr WR, Bühring HJ,
Valenta R (2004) Assays for measuring in vitro basophil
activation induced by recombinant allergens. Methods 32(3):
265-270
15. Explanation of symbols / Vysvětlení symbolů
/ Vysvetlenie symbolov
16. Manufacturer / Výrobce / Výrobca
EXBIO Praha, a.s.
Nad Safinou II 341
252 42 Vestec, Czech Republic
Tel: +420 261 090 666
Fax: +420 261 090 660
E-mail: [email protected]
http://www.exbio.cz
10/10
ED7043_EN_CZ_SK_150506