MH/CCD region 1

Valášková Iveta
Flodrová Eva
[email protected]
[email protected]
Oddělení lékařské genetiky, FN Brno, Černopolní 9, Brno
Mnoho z nás bude argumentovat, že zabránění bolesti
představuje jednu z nejzákladnějších lidských potřeb.
Proto je těžké uvěřit, že neuběhla ani dvě století od příchodu inhalační anestezi
Průkopničtí lékaři začátku 19.století museli překonat
náboženské, sociální a etické hranice,
aby se anestezie stala běžnou procedurou, jakou je dnes.
Je smutnou ironií, že tato život ochraňující léčba u části pacientů
akutně způsobuje smrt.
Louise Glover, 2002
život pacienta bezprostředně ohrožující komplikace celkové anestez
potenciálně letální farmakogenetická choroba
manifestuje se
na základě geneticky podmíněné dispozice s autozomálně
dominantní dědičností
po expozici tzv. vyvolávajících substancí.
Epidemiologie
MH se může manifestovat u všech lidských ras,
ve všech věkových skupinách
a také u některých zvířecích druhů
Incidence genetické dispozice
1 : 10 000 – 1 : 20 000
Klinická incidence
je udávána různě podle sledovaných skupin populac
1 : 40 000 – 60 000 u anestezií dospělých s použitím vyvolávajících substanc
1 : 10 000 – 15 000 u dětí
1 : 250 000 pro všechny věkové skupiny
všechny užívané anesteziologické postupy.
Patofyziologické aspekty
•je hypermetabolická odpověď vnímavého
organismu
na přítomnost vyvolávajících látek
•hereditární defekt intracelulárního kalciového metabolismu
Patofyziologické aspekty
•je hypermetabolická odpověď vnímavého
organismu
na přítomnost vyvolávajících látek
Triggersubstance substance vyvolávající u MHS pacientů rozvoj MH - krize
Látky běžně užívané k úvodu a vedení celkové anestezie.
volatilní čili prchavá anestetika - všechny halogenové uhlovodíky jako halotan,isoflura
desfluran, sevofluran
depolarizující svalová relaxancia -zejména sukcinylcholin
Experimentálně potvrzen 4chloro-m-cresol,
-látka se stabilizačními účinky
-přidává se k některým farmaceutickýmpreparátů
např.sukcinylcholinu, heparinu,
stoupající a klesající množství kalcia
způsobuje svalové kontrakce a
relaxace
•kontrakce svalu
uvolnění Ca2+ do myoplasmy
•relaxace svalu
resorbce Ca2+ do ER
ATPdependentní
rozhodující význam pro homeostázu kalci
ryanodinový receptor
kalcium uvolňující kanál
na sarkoplasmatickém retikulu
Detail receptorového propojení ve svalové buňce
extracelulární prostor
dyhydropyridinový receptor (DHPR)
cytoplasma
Ca2+
vazebný protein FKBP12
Ca2+
ryanidinový receptor (RYR1)
terminální cysterna SR Dihydropyridinový receptor
membrána SR
sarkoplasmatické retikilum (SR)
zajišťuje funkční spojení
povrchu buňky se
sarkoplasmatickým retikulem
a následnou aktivaci RYR1
a uvolnění Ca2+ do myoplasmy
Podstata onemocnění
Za hlavní příčinu je považována
porucha funkce ryanodinového receptoru RYR1
sval se změněnou funkcí RYR1
vnímavý sval
při kontaktu s triggersubstancí
vzniká nekontrolované uvolňování Ca2+ ze SR s poruchou jeho
zpětného vychytávání
Kontakt vnímavého svalu
(tj. se změněnou funkcí RYR1)
s triggersubstancí
1.
Vlna depolarizace z nervosvalové ploténky
vyvolá drobný únik Ca2+ z TT
2.
Aktivace DHPR
3.
Aktivace RYR1- uvolňování Ca2+ ze SR
4.
RYR1 zůstává po aktivaci v otevřeném stavu
porucha zpětného vychytávání Ca2+
5.
Vzestup hladiny Ca2+ v cytoplasmě
zvýšená intacelulární koncetrace Ca2+
6.
Zvýrazněná a dlouhotrvající interakce
kontraktilních proteinů svalového vlákna
aktinu a myozinu bez následné relaxace
Nastává protahovaná svalová kontrakce
7.
Při snaze o zpětné přečerpání Ca2+
do SR dramatický vzrůstá aerobní,
později anaerobní metabolismus
Extrémní nároky na kyslík
Nadprodukce CO2
Nadprodukce tepla
zvýšená teplota svalu znamená nižší potřebu Ca2+pro
reakci aktinu a myosinu
toxická koncentrace Ca2+ brzdí oxidativní fosforylaci
v mitochondriích tzn. tvorbu ATP potřebnou pro
resorpci Ca2+
Ryanodinové receptory
rodina intracululárních kalcium uvolňujících kanálů
nacházejí se v různých tkáních a buněčných typech
RYR1
19q12.1-13.2
exprese –skeletální svalstvo
RYR2
1q42.1-43
exprese –srdeční sval
RYR3
15q14- 15
exprese – mozkové tkáně
hladké svalstvo
RYR1
exprimován ve skeletálním svalstvu
makromolekulární komplex 2,5 MDa
složen ze 4 podjednotek o 565kD
5038 AK
lokalizace: membránový protein
Myoplasmatická doména (4000 AK)
• struktura vytvářející spojovací gapy mezi SR a T-tubulem
• je pravděpodobně v interakci s cytoplasmatickým regionem
dihydropyridinového receptoru
Transmemmbran-lumenální doména (1000AK)
• vápník uvolňující kanál
• je modulován Ca2+, Mg2+, ATP a calmodulinem
RYR1 gene
106 EXONS
160 kb
2 6
11 12
14 15
17
39
40
45
46
102
5´
3´
cDNA
15301 bp
NH2
COOH
RYR1 protein
Transmembrane /
lumenal RYR1 domain
Myoplasmatic RYR1 domain
MH/CCD region 1
MH/CCD region 2
MH/CCD region 3
COOH
NH2
C35R
G341R
R163
G248R
Y522S R614C
R533H R614L
R552W
I403M
R471C
R552W
T2206M
T2206R
R2163C
R2163PR
2163H
V2168M
A2350T
G2434R
R2435H
R2435L
R2452W
R2454C
R2454H
R2458C
R2458H
L4793P
Y4796C
R4825C
T4826I
R4861H
G4891R
R4893W
I4898T
G4899R
G4899Q
A4906V
R4914G
Mutace genu RYR1
•více než 50% MH rodin a většina CCD rodin
•detekováno 60 mutací - nukleotidových substitucí
- malé delece
jsou nahromaděny ve třech regionech genu RYR1 :
MH/CCD region 1 : N-terminalní AK 35 -614
MH/CCD region 2 : centrálně lokalizované AK 2163 - 2548
MH/CCD region 3 : C-terminální
MH/CCD region 1
MH/CCD region 2
MH/CCD region 3
COOH
NH2
C35R
G341R
R163
G248R
Y522S R614C
R533H R614L
R552W
I403M
R471C
R552W
T2206M
T2206R
R2163C
R2163PR
2163H
V2168M
A2350T
G2434R
R2435H
R2435L
R2452W
R2454C
R2454H
R2458C
R2458H
L4793P
Y4796C
R4825C
T4826I
R4861H
G4891R
R4893W
I4898T
G4899R
G4899Q
A4906V
R4914G
MH kauzální RYR1 mutace
Exon
2
6
9
11
12
14
15
17
17
39
39
39
40
44
44
45
45
46
46
100
101
101
102
Nucleotide
103T>C
487C>T
742G>A
1021G>A
1209C>G
1565A>C
1654C>T
1840C>T
1841G>T
6487C>T
6488G>A
6502G>A
6617C>T
7048G>A
7124G>A
7300G>A
7304G>A
7372C>T
7373G>A
14387A>G
14512C>G
14582G>A
14693T>C
Aminoacid
C35R
R163C
G248R
G341R
I403M
Y522S
R552W
R614C
R614L
R2163C
R2163H
V2168M
T2206M
A2350
G2375A
G2434R
R2435H
R2458C
R2458H
T4796C
L4838V
R4861H
I4898T
Phenotype
MHS
MHS and/or CCD
MHS
MHS
CCD
MHS and/or CCD
MHS
MHS
MHS
MHS
MHS and/or CCD
MHS
MHS
MHS
MHS
MHS
MHS and/or CCD
MHS
MHS
CCD
MHS
CCD
MHS and/or CCD
•Předoperační diagnostika
•In vitro kotrakční test (IVCT)
•Molekulárně genetická diagnostika
- scoring
- scanning na DNA i RNA (cDNA)
• Složitá
• Riziko nelze předem spolehlivě vyloučit
• Stanovení rodinné anamnézy (úmrtí v souvislosti s anestezií,
myopatie, rabdomyolýza, trismus po kofeinu, nespecifikované
metabolické vady, nejasná úmrtí kojenců nebo klidová elevace
svalových enzymů)
• Individuální diagnostika (potíže během předchozích operací např.
pooperační ztuhlost svalů, tachykardie, tmavá moč, teplota atd.)
• Další možné příznaky (rabdomyolýza mimo anestezii
v souvislosti s horkem nebo tělesnou zátěží, nespecifikované
svalové bolesti, u dítěte dosavadní psychomotorický vývoj,
zvýšená teplota při námaze, trismus po kofeinu, kofole, čokoládě
nebo černém čaji)
• Přidružená onemocnění (některé muskuloskeletální abnormality a
myopatie, např. defekt struktury či metabolismu svalové buňky)
Drastický zásah do organismu (odběr až 25 cm svalového vlákna)
vzorek svalové tkáně získané otevřenou biopsií
Limitace 30 kg (důležitost molekulárně genetické analýzy u dětí)
vystaven působení klasických spouštěčů
halotanu a kofeinu ve stoupajících koncetracích
měřena velikost kontrakce svalového vlákna
sval s dispozicí k MH
se kontrahuje zřetelně více
a při nižších koncentracích než zdravý sval
•MH vnímavé jedince (MHS - MH susceptible)
•MH nevnímavé jedince (MHN – MH non-susceptible)
•skupinu jedinců nejasného statutu (MHE – MH
equivocal)
u nichž je přítomna reakce pouze na jeden ze
spouštěčů.
Komplikace:
•diskordance mezi MH susceptibilitou and RYR1 mutacemi
potřeba nezávislého důkazu, že kandidátní MH mutace je patogenní
Kauzální MH mutace ( může být použita k prediktivnímu gegnetickému testování)
•
genetická charakterizace - aspekty evoluční konzervace
- kosegregace mutace s chorobou v nejméně 2 rodinách
- absence u 100 zdravých kontrol (<1%)
•
funkční charakterizace -rekombinantní in vitro exprese na definovaném
genetickém pozadí
-zkouška funkce RYR1 s charakterizovanou mutací
v ex vivo tkáních
Komplikace:
•mutace v proteinech, které jsou v interakci s RYR1
mohou způsobovat deficienci Ca2+ regulačního systému
fenotyp podobný nebo identický jako MH
Klasifikace mutací asociovaných s MHS
Klasifikace
Protein
MHS1
ryanidinový receptor RYR1
MHS2
sodíkový kanál v membráně buněk skelet.svalstva
MHS3
podjednotka alfa2/delta DHPR
MHS4
neznámý
MHS5
podjednotka alfa1 DHPR
MHS6
neznámý
Lokalizace
19q13.1
17q11.2-q24
7q21-q22
3q13.1
1q32
5p
Komplikace:
• nízká incidence každé RYR1 mutace
• rozsáhlost RYR1 genu
106 exonů, 160 kb
•
Naše strategie cDNA mutační analýzy genu RYR1
RNA
RT
cDNA
PCR
1
2
3
4
1 - 9 cDNA fragmenty
délka 600 -700bp
5
6
7
SEKVENACE
8
9
15000
14700
14400
7500
7200
6900
6300
6600
6000
5700
substituce ( missense / nonsense )
malé delece
5400
1800
1500
1200
900
600
300
RYR1 cDNA sekvence
distribuce RYR1 mutací
Naše strategie DNA mutační analýzy genu RYR1
DNA
PCR
9
11
15
44
SEKVENACE
9, 11, 15, 44, 100, 102 exony RYR1 genu
100
102
15000
14700
14400
7500
7200
6900
6300
6600
6000
5700
substituce ( missense / nonsense )
malé delece
5400
1800
1500
1200
900
600
300
RYR1 DNA sekvence
distribuce RYR1 mutací
cDNA scanning
hot spot regionů RYR1 genu
1 2 3 4 5 6 7 8 9 M
PCR produkty analyzovaných
RYR1 cDNA segmentů 1-9
Elfo: 5% PAG, barveno stříbrem
hmot. marker 100 bp DNA Ladder
Chromatogram cDNA segment 9 (670 bp)
Algoritmus molekulárně genetického vyšetření MHS jedinců a členů
jejich rodin
Tkáň svalu
MHS jedinec
(IVCT)
Izolace RNA
příbuzný
Periferní krev
Izolace DNA
cDNA
cDNA scanning
hot spot regionů RYR1 genu
neidentifikována
mutace
identifikována
nová mutace
!
?
DNA scanning
exonů RYR1 genu
DNA scoring
RYR1 mutací
identifikována
kauzální mutace
HURÁ
potvrzení
mutace na
úrovni DNA
Vyšetření MHS rodiny
R248H
non
diagnostikováni jako MHS užitím IVCT
identifikace MH mutace cDNA sekvenační analýzou
potvrzení mutace na DNA úrovni
Naše nová strategie
Scoring RYR1 kauzálních mutací
Analýza teploty tání (Real-time PCR)
Scanning RYR1 genu
Hi-Res Melting
sekvenování
Real-time PCR exonu 17 genu RYR1
[C1840T]+ [C1840T]
[C1840T]+ [non]