Exprese rekombinantních proteinů

Exprese rekombinantních proteinů
Exprese rekombinantních proteinů je proces, při kterém můžeme pomocí různých expresních
systémů vytvořit protein odvozený od konkrétního genu, nebo části genu. Tento protein lze
purifikačním systémem oddělit od nežádoucích nečistot a získat tak čistý produkt. Čistý
protein můžeme následně použít k různým účelům v oboru molekulární biologie, imunologie
apod. Existuje několik typů expresních systémů, které můžeme rozdělit na dvě hlavní třídy,
eukaryotní a prokaryotní.
Prokaryotní expresní systémy: bakteriální
 Bakteriální expresní systém je v běžné praxi nejznámější a nejpoužívanější systém pro
expresi rekombinantních proteinů. Jeho výhodou je především jednoduchost, a vysoký
výtěžek exprimovaného proteinu. Samotná exprese není finančně, ani časově náročná
(24 hodin). Od bakteriálního expresního systému ovšem nesmíme vyžadovat vysoké
nároky na kvalitu proteinu. Přesněji řečeno, systém neumožňuje postranslační
modifikace, což může ovlivnit terciální strukturu proteinu. V bakteriích lze také
exprimovat protein omezené velikosti, maximální molekulová hmotnost proteinu se
pohybuje kolem 150 kDa. Proteiny jsou v bakteriích exprimovány buď do cytosolu,
nebo se hromadí v inkluzních tělískách. Typ exprese závisí zejména na struktuře
rekombinantního proteinu a nelze ho cíleně ovlivnit. Dle typu exprese je tedy nutné
zvolit správný druh purifikace proteinu.
Eukaryotní expresní systémy: kvasinkové, hmyzí, savčí
 Kvasinkový systém je v oboru druhým nejpoužívanějším expresním systémem.
Nároky na obtížnost a finanční dostupnost se výrazně neliší od bakteriálního systému,
je jen třeba počítat s delším časovým plánem. V kvasinkovém systému lze také na
rozdíl od bakterií produkovat protein větší než 150 kDa. V kvasinkách navíc probíhají
postranslační modifikace, potřebné pro formování proteinu do přirozené struktury.
Nevýhodou je hlavně nízký výtěžek produktu. Kvasinky produkují rekombinantní
protein buď do cytosolu, nebo sekretoricky do růstového média. Typ exprese lze
ovlivnit správným výběrem exrpesního vektoru.
 Exprese proteinu v buňkách hmyzu je specializovaný typ exprese, kdy je nutné
pracovat ve striktně aseptickém prostředí. Exprse rekombinantního proteinu je náročná
na praktické provedení, čas i finanční porstředky. Také výtěžek exprese se pohybuje
ve velice nízkých koncentracích. Výhodou systému je výroba proteinu v buňkách
mnohobuněčného organismu.
 Savčí expresní systém je velice podobný systému hmyzímu. Ke kultivaci savčích
buněk ovšem potřebujeme speciální inkubátor, který zajistí specifickou hladinu
kyslíku a oxidu uhličitého. Proto se tento expresní systém používá pouze ve
specializovaných laboratořích.
Exprese rekombinantního proteinu v E. coli
V úvodním odstavci jsou uvedeny základní informace o bakteriálním expresním systému.
Následující text se zaměří na konkrétní problematiku exprese v E. coli, dále principy exprese
a purifikace rekombinantních proteinů.
Inzert:
Inzert je lineární molekula DNA, která nese sekvenci nukleotidů kódující rekombinantní
protein. Inzert je specificky upravený pro zaklonování do expresního vektoru tak, že jsou na
koncích sekvence proteinu přidaná restrikční místa kompatibilní s expresním vektorem.
Pomocí restrikčních endonukleáz lze pak jednoduše vytvořit ligační přesahy a zaklonovat
inzert do vektoru. Inzert musí nést sekvenci pro začátek transkripce (methionin) a stop kodon
pro ukončení transkripce. Dále by měl inzert obsahovat specifickou signální sekveni, pomocí
které lze exprimovaný protein následně identifikovat a přečistit.
Obrázek 1: Schéma komponent inzertu
Expresní vektory:
Expresní vektor je plasmid (kruhová molekula DNA), speciálně upravený pro expresi
rekombinantních proteinů v bakteriích. Expresní vektor je složen z několika základních
sekvencí důležitých pro integraci inzertu, selekci bakteriálního klonu a expresi proteinu (viz
obrázek).
Obrázek 2: Expresní vektor
Komponenty expresního vektoru:
 T7 promotor (T7 promoter) je sekvence vektoru, na kterou specificky nasedá
transkripční enzym T7 RNA polymeráza, která je zodpovědná za transkripci inzertu.
T7 RNA polymeráza není bakteriální enzym, ale pochází z bakteriofága λ, což
zajišťuje vazebnou specificitu pouze na jednom úseku DNA – expresním vektoru.
 T7 počátek transkripce (T7 transkription start) je místo, kde začíná T7 RNA
polymeráza syntetizovat mRNA inzertu.
 His Tag sekvence (His Tag coding sequence) je úsek DNA kódující histidinovou
kotvu užitečnou pro detekci a purifikaci proteinu (viz dále). Pokud His tag sekvenci
z nějakého důvodu nechceme, či nepotřebujeme, lze ji jednoduše z vektoru vyštěpit
restrikčními endonukleázami.
 Klonovací místo (Multiple cloning site) je místo na vektoru, kam lze zaklonovat
inzert. Tento úsek vektorové DNA obsahuje několik specifických sekvencí pro různé
restrikční endonukleázy a tím plní funkci univerzálního klonovacího místa.
 T7 terminátor (T7 terminator) je místem pro ukončení transkripce inzertu.
 LacI sekvence (LacI coding sequence) je gen, který kóduje lac represor. Lac represor
je protein, který se bez přítomnosti IPTG (isopropyl-beta-D-thiogalaktopyranosid)
váže na DNA vektoru do blízkosti T7 promotoru a blokuje tak aktivitu T7 RNA
polymerázy. V opačném případě se represor na molekuli IPTG naváže, což umožní T7
RNA polymeráze nasednout na promotor a zahájit transkripci (viz obrázek 3).
 pBR322 počátek replikace (pBR322 origin) je sekvence důležitá pro replikaci
plasmidu během kultivace bakteriální kultury.
 bla kódující sekvence (bla coding sequence) je gen, který kóduje resistenci
k ampicilinu. Pomocí resistence k antibiotiku lze v médiu obohaceném ampicilinem
snadno selektovat bakteriální klony, které obsahují expresní vektor.
Expresní buňky: BL21, Rosseta, Origami
 BL21 jsou geneticky modifikované kmeny E. coli, které mají genom speciálně
upravený tak, abychom mohli cíleně ovlivnit a načasovat expresi rekombinantního
proteinu. Klíčocou roli zde hraje gen lacI, který kóduje lac represor, a gen DE3, který
nese informaci pro syntézu T7 RNA polymerázy zodpovědnou za transkripci inzertu.
Lac represor nasedá na lac promotor (promotor genu DE3), blokuje tím syntézu T7
RNA polymerázy a transkripce rekombinantního proteinu na vektoru neprobíhá.
Pokud je v buňce přítomen IPTG, váže na sebe lac represor, který se uvolní z vazby na
lac promotor a umožní tím syntézu T7 RNA polymerázy (viz obrázek 3).
 Rosseta jsou expresní buňky odvozené od kmenu BL21. Tyto buňky mají navíc
upravené t-RNA kodony pro syntézu proteinů tak, aby snáze probíhala syntéza
eukaryotních genů v prokaryotním systému.
 Origami B je expresní kmen odvozený od kmene BL21, který zároveň přejímá výhod
kmene Origami a usnadňuje tak tvorbu disulfidických můstků cílového proteinu.

Obrázek 3: Schéma principu indukce exprese rekombinantního proteinu
Expresní média a kultivační podmínky:
Kultivace expresních buněk bakteriálního systému probíhá v LB mediu za standardních
podmínek (37°C, 200 – 220rpm), za přítomnosti IPTG a antibiotika. Pokud exprese probíhá
pouze v termostatu, je doporučeno kultivovat bakterie v malém množství média (1/4 objemu
kultivační baňky) po dobu 4 – 6 hodin (Stationary phase). Po delší inkubaci v médiu začnou
ubývat živiny, hromadí se odpadní látky a klesá schopnost dělení a přežívání bakterií (Death
phase). Dále se zpomaluje exprese proteinu, který může být navíc poškozen stresovým stavem
umírajících bakterií.
Obrázek 4: Růstová křivka bakteriální kultury
Pro zvýšení výtěžku exprese se doporučuje použít pro kultivaci speciální přístroj – fermentor,
který na základě měření pH, O2, CO2 a živin upravuje podmínky pro růst bakterií tak, aby
bylo možné exprimovat rekombinantní protein po dobu 24 hodin za konstatních podmínek.
Obrázek 5: Fermentor
Systémy purifikace proteinů: Afinitní chromatografie, purifikace z inkluzních
tělsíek
 Afinitní chromatografie je metoda, která umožňuje ze směsi proteinů oddělit relativně
čistou frakci jediného proteinu, nebo přpíbuzných proteinů. Principem metody je
vazba purifikovaného proteinu na ligand ukotvený na koloně, promytí nežádoucích
nenavázaných proteinů a uvolnění purifikovaného proteinu do čisté fáze.
V laboratorní praxi se při purifikaci nejvíce osvědčil systém založený na interakci
iontu kovu (Ni2+, Zn2+, Cu2+) s histidinem (hexahistidinová kotva). Na
chromatografické koloně tak dochází k vazbě proteinu označeného hexahistidinovou
kotvou na částice kovu (ligand), který je pevnou součástí výplně kolony (agarózy). Po
důkaldném vymytí nenavázané proteinové frakce mobilní fází následuje pomocí
imidazolu uvolnění histidinové kotvy z vazby. Jelikož imidazol vykazuje vyšší afinitu
k částicím kovu, vytěsní svou vazbou histidinovou kotvu a purifikovaný protein je
následně uvolněn do eluční fáze.
Obrázek 6: Kolonka na afinitní chromatografii
Tato metoda umožňuje purifikaci proteinů buď za nativních nebo denaturačních
podmínek. Za nativních podmínek lze purifikovat rozpustný protein, který se nachází
v cytosolu bakterií. Purifikovaný protein si za nativnívch podmínek uchová přirozenou
strukturu a aktivitu, což má výhodu pro následné využití proteinu. Denaturační
podmínky lze zvolit za situace, že je rekombinantní protein nerozpustný a bakterie ho
ukaládá do struktur zvaných inkluzní tělíska. Nerozpustný protein poznáme jeho
přítomností v lyzovaném bakteriálním peletu.
 Purifikace z inkluzních tělsíek je poměrně elegantní purifikační metoda vhodná
především v případě, pokud zjistíme, že je sledovaný protein nerozpustný a bakterie
ho shromažďuje v inkluzních tělískách. Principem je několikanásobná lýze
nakultivovaného buněčného materiálu. Při první lýze bakteriální kultuy se po
centrifugaci uvolní do supernatantu jako odpadní produkt proteiny cytosolu.
Opětovnou lýzou a centrifugací ve speciálních pufrech získáme samostatná inkluzní
tělíska a následně čistý protein. Známým lyzačním pufrem je komerčně vyráběný BPER (bacterial protein extractin reagent, Pierce), který ovšem může odradit vysokou
cenou. Pro izolaci proteinu z inkluzních tělísek ve větší míře se proto vyplatí použít
běžný protokol dostupný na webu, nebo v odborné literatuře.
Jelikož se pro purifikaci proteinů ve většině protokolů používají koncentrované roztoky solí a
jiných nežádouích chemikálií, je třeba proteinový vzorek před vlastním využitím dialyzovat
proti vhodnému pufru (např. PBS). Dále je důležité protein správně uskladnit. Typy
uskladnění proteinů nabízí obrázek 7 (Pierce).
Obrázek 7: Skaldování proteinů
Detekce: SDS-page, western blot, hmotnostní spektrometrie
 K detekci exprese rekombinantního proteinu je možné použít základních metod pro
práci s proteiny a to SDS-page elektroforézu a western blot analýzu. Principy obou
metod jsou probírány v kurzu Základní metody molekulární biologie.
 Speciální kapitolou analýzy proteinů je hmotnostní spektrometrie. Pomocí této metody
lze velice přesně identifikovat sledovaný protein z roztoku, nebo elektroforetického
gelu a ověřit tak jeho identitu porovnáním s databází, nebo známou sekvencí proteinu.
Analýza proteinu hmotnostní spektrometrií je ovšem poměrně finančně náročná a lze
ji provádět pouze na specializovaných pracovištích.