Exprese rekombinantních proteinů v E. coli

Exprese rekombinantních proteinů v E. coli
Přednáška:
TEORIE
exprese rekombinantních proteinů
purifikace
ifik
proteinů
t i ů
detekce
PRAXE
Exprese rekombinantních proteinů
+
=
Exprese rekombinantních proteinů
Expresní systémy
Prokaryotní
y
- Bakteriální
Eukaryotní
y
- Kvasinkové
- Hmyzí
- Savčí
Exprese rekombinantních proteinů
Exprese v E.
E coli
Výhody
- Jednoduchost
- Vysoký výtěžek
- Rychlost
- Nízká
Ní ká cena
Nevýhody
- Chybí
posttranslační
modifikace
Exprese rekombinantních proteinů
Exprese v E coli
Exprese v E. coli
INZERT
EXPRESNÍ VEKTOR
EXPRESNÍ BUŇKY
Exprese rekombinantních proteinů
INZERT
Met
Kódující sekvence
Restrikční místo
Mett = methionin
M
thi i (počátek
( čát k translace)
t
l
)
Stop = stop kodon (ukončení translace)
His – tag = hexahistidinová kotva (wb
(wb, purifikace)
His-tag
His
tag Stop
Restrikční místo
Exprese rekombinantních proteinů
EXPRESNÍ VEKTOR
Exprese rekombinantních proteinů
EXPRESNÍ BUŇKY
- BL21 star
- Rosseta
- Origami
KOMPATIBILNÍÍ s
p
vektorem
expresním
Exprese rekombinantních proteinů
INDUKCE EXPRESE
Exprese rekombinantních proteinů
POSTUP
Inzert
+
expresní vektor
BL 21
star
t
transformace
f
k lti
kultivace
50 – 250ml
4 hod.
Exprese rekombinantních proteinů
Kultivace ve velkém
– FERMENTOR –
1litr, 24 hod.
Exprese rekombinantních proteinů
Exprese v E.
E coli
CYTOSOL
- Rozpustné
proteiny
INKLUZNÍ TĚLÍSKA
- Nerozpustné
proteiny
- Chybí disulfidické můstky
Purifikace proteinů
AFINITNÍ CHROMATOGRAFIE
A
B
C
Ni2+
Ni2+
Ni2+
Ni2+
Ni2+
Směs proteinů
Ni2+
Specifická vazba
na kolonu
Ni2+
Ni2+
Ni2+
Ni2+
Ni2+
D
Ni2+
Ni2+
Ni2+
Promytí – odstranění
nespecifických
proteinů
Ni2+
Ni2+
Eluce - vytěsnění
proteinu z vazby
Purifikace proteinů
AFINITNÍ CHROMATOGRAFIE
X
Histidin
Imidazol
Purifikace proteinů
INKLUZNÍ TĚLÍSKA
B-PER Protein extraction reagent (Thermo)
Detekce
SDS – PAGE (Commassie blue)
WESTERN BLOT (Anti –His primární Ab)
HMOTNOSTNÍ SPEKTROMETRIE