Prezentace aplikace PowerPoint - Laboratoř experimentální medicíny

DNA microarrays
Josef Srovnal, Michaela Špenerová,
Lenka Radová, Marián Hajdúch,
Vladimír Mihál
Laboratoř experimentální medicíny při Dětské klinice LF UP a FN Olomouc
Cíle
Seznámit posluchače s:
1. Technologií DNA microarrays a jejími možnostmi
2. Klinickými aplikacemi
3. Projekty řešenými v LEM Dětské kliniky FN Olomouc
RNA - transkriptom
DNA
RNA
Protein
RNA – genová exprese
Analýza genové exprese
1. Northern Blotting
2. RT-PCR
3. Multi-well array
4. Microarrays
Technologie microarrays –
platforma Affymetix
• high-density oligonucleotide arrays
• photolitography
• 28 869 genes
• 26 probes per gene (25mer)
• 764 855 probes
• Many controls
Možnosti microrrays –
platforma Affymetrix
Analýzy:
Gene arrays
miRNA arrays
SNP
Cytogenetic arrays
Exon arrays
Tilling arrays
Affymetrix GeneChip
GeneChip Human Gene/Exon 1.0 ST Array – Whole Transcript
Workflow
1. Výběr vzorku
2. Izolace RNA, Quality control
3. Příprava microarrays
4. Scanning
5. Statistická analýza
Výběr vzorku
1. Čerstvá tkáň, buňky, FFPE
2. Buněčné linie – testování léčiv
3. Pacientské vzorky – response, prognóza, léčba
Izolace RNA
1. Fenol-chloroformová metoda (TRI reagent)
2. Izolační kolony (Qiagen)
Kvantifikace RNA
Nanodrop ND 1000
1.
2.
3.
4.
5.
6.
Malý objem vzorku: 1μl
Velký rozsah měření: 2-3700ng/μl (dsDNA)
Není nutno vzorky ředit
Opětné použití vzorku
Celé spektrum: 220 – 750nm
Rychlost, jednoduchost
www.nanodrop.com
Kvalita RNA
Agilent 2100 Bioanalyzer
www.home.agilent.com
Agilent 2100 Bioanalyzer
Lab-on-a-chip Technology
Výhody Agilent 2100 Bioanalyzeru:
Jediná platforma pro elektroforetické (DNA, RNA, proteiny) i
cytometrické (buňky) aplikace
Maximální omezení manuální práce
Minimální nároky na objem vzorků (1-4ul)
Rychlé výsledky (všech 10-12 vzorků proměřeno do 30 minut)
Přesné, opakovatelné a reprodukovatelné výsledky
Automatický průběh analýz a sběru dat
Snadné vyhodnocení, porovnávání a archivace digitálně uložených
dat
Unikátní nástroj: RIN (RNA Integrity Number) - přesné určení
kvality RNA
www.home.agilent.com
RNA Integrity Number - RIN
RIN 1
RIN 2
RIN 4
RIN 6
RIN 7
RIN 8
RIN 9
RIN 10
Příprava microarrays
1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
cDNA syntéza
In vitro transkripce (IVT)
Purifikace cRNA
cDNA syntéza
Purifikace cDNA
Fragmentace
Značení
8. Hybridizace
9. Promývání a barvení
10. Skenování
Hybridization Oven 645
64 cartridges
Fluidic Station
Washing and staining
GeneChip Scanner 7G
with Autoloader
• high stability
• high throughput
• high speed
• low variability
• temperature-controlled
• 48 samples
Scanning
Scanning
Statistické analýzy
1. Unsupervised clustering: Hierarchical clustering.
Tato analýza umožní počáteční identifikaci a strukturalizaci
vzájemně podobných (blízkých) objektů, a to na podkladě
matematicky definovaném měření jejich vzájemné
vzdálenosti (podobnosti).
2. Supervised discriminatory gene classifiers:
T-test, Mann-Whitney U-test, ANOVA, Pearson correlation.
Tyto analýzy umožní vzájemně korelovat výsledky a stanovit
jejich statistickou významnost.
3. Supervised machine learning classifiers:
Support vector machines. Tato metoda umožní
kategorizovat vzorky do již známých fenotypů (uplatnění při
validaci předchozích metodik a v predikci)
Statistické analýzy
Heatmap
Clustering dle
(např. 100) genů,
které se statisticky
nejvýznamněji liší
mezi vybranými
skupinami
Klinické aplikace
1.
Screening potencionálních molekul
Nové terapeutické cíle
Nové prediktivní a prognostické markery
2.
Analýza buněčných pochodů
Změny genové exprese v závislosti na exp.
podmínkách či terapii
Identifikace molekulárních drah
3.
Klasifikace
Nové molekulární subtypy
Prospektivní identifikace pacientů např. good
respondérů
Klinické aplikace
Pilotní studie
Gene expression patterns of breast carcinomas distinguish tumor
subclasses with clinical implications
Therese Sørlie, Charles M. Perou et al:PNAS, 2001
Breast cancer:
Luminal A,B,C
Basal -like
Normal breast-like
ERB2+
Klinické aplikace
Pilotní studie
Distinct types of diffuse large B-cell lymphoma identified by gene
expression profiling
Ash A. Alizadeh, Michael B. Eisen, et al.: Nature, 2000
DLBCL – nejčastější NHL, 40% pacientů má dobrou prognózu
• Germinal centre B-like DLBCL – 5let 76% OS
• Activated B-like DLBCL – 5 let 16% OS
Řešené projekty v LEM DK
EHP/Norsko - Posílení výzkumné infrastruktury pro
individualizaci léčby chronicky nemocných dětí
IGA MZ ČR
Molekulární podstata odpovědi na glukokortikoidy u dětí s
ALL
Cílem je identifikace profilů genové exprese, vztahující se k
chemorezistenci k jednotlivým cytostatikům s cílem eliminovat
interindividuální variabilitu v metabolismu, farmakokinetice,
farmakogenetice a vylučování cytostatik.
Pozitivní/negativní prediktory chemorezistence - nové léčebné
protokoly.
Řešené projekty v LEM DK
IGA MZ ČR NR/9076-4
Genomické profilování v predikci odpovědi na
chemoradioterapii u pacientů s lokálně pokročilým
karcinomem konečníku
Řešené projekty v LEM DK
223 genes vs. 20 arrays
Red – non-responder
Blue - responder
Řešené projekty v LEM DK
153 genes vs. 20 arrays
Blue - day 1
Red - day 14
Geny MDM4 a OCT4
Chemoradioterapie
Řešené projekty v LEM DK
Analýza exprese genů zapojených do mechanismu
účinku protinádorových léčiv - inhibitory
aurorakináz, buněčná linie HCT 116
Závěry
1. DNA microarrays - široké experimentální a
klinické aplikace
2. Dostupná metodika
3. Spolupráce
Děkuji za pozornost
Projekt byl podpořen grantem z Islandu,
Lichtenštejnska a Norska v rámci
Finančního mechanismu EHP (CZ0099)
Posílení výzkumné infrastruktury pro
individualizaci léčby chronicky
nemocných dětí.