Real-Time PCR Microarrays

Real-Time PCR
Microarrays - mikročipy
Ondřej Lenz, Ph.D.
Real-Time PCR

klasická PCR detekovaná v reálném čas

detekce = fluorescenční značení
a) nespecifické – interkalující barvičky

b) specifické – TaqMan, Molecular
Beacons, ...

a) nespecifické značení:
b) specifické značení - TaqMan:
b) specifické značení – Molecular Beacons:
b) specifické značení – Eclipse probe:
b) specifické značení - Donor-Akceptor:
Výstup:
Křivka tání – jen SybrGreen:
Microarrays - Mikročipy
• plastový povrch
• potaženo polymerem
• próby = syntetické ssDNA
• Hybridizující sekvence “targets”
• fluorescenční značení =
Cy3-primer
• Hybridizace
• Detekce – fluor. scanner
Targets – značení sekvencí
• radioaktivně (dříve)
• fluorescenční barvička
• přímé značení
• nepřímé značení
• biotinylovaná NK, zlaté částice, magnetické částice
Targets – fluorescenční značení

přímé značení – značené dNTP (fluoresc. barvička)
značený primer (fluoresc. barvička)

nepřímé značení – modifikované dNTP + doznačení po
PCR reakci
Targets – fluorescenční značení

přímé značení – značené dNTP (fluoresc. barvička)
značený primer (fluoresc. barvička)
Targets – fluorescenční značení

nepřímé značení – modifikované dNTP + doznačení po
PCR reakci
Další techniky značení

sekundární hybridizace
Další techniky značení

příklad ne-fluorescenčního značení:
Techniky zesílení signálu

zesílení – zvýšení počtu značícího prvku (fluoresc.
barvičky)
Kde začíná budoucnost?
PNA mikročipy:
• vyšší specifita a lepší
vazebná kinetika
• rezistentní vůči
proteázám a nukleázám
• lépe prochází
membránami
• jen do 18nt, drahé
[Převzato z kapitoly 5 „NEW METHODS IN DRUG DEVELOPMENT,
BIOCHEMISTRY - DR. JAKUBOWSKI“, na
http://employees.csbsju.edu/hjakubowski/classes/ch331/bind/oldrugdevel.html]
Kde začíná budoucnost?
Optické mikročipy:
• snímá se přesně
jen místo próby
• 1cm2 ~ 103 prób
Kde začíná budoucnost?
Kelvin nanoprobe:
• využití u DNA i
proteinových čipů
• elektrické napětí mezi
dvěma kovy
• bez značení!
• zatím ve vývoji
[Převzato z http://www.chem.utoronto.ca/staff/THOMPSON/research.html]